Protéomique Séance 1 Introduction aux données de protéomique et aux outils de recherche

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1 Protéomique Séance 1 Introduction aux données de protéomique et aux outils de recherche Mathieu Courcelles BCM Mars 2009

2 BCM2003-H09 Protéomique Démonstrateur: Mathieu Courcelles Questions? Via le tutorat en ligne (http://www.agorabcm.com/) Disponibilités sur rendez-vous ( )

3 Horaire Séance 1 Introduction aux données de protéomique et aux 26 Mars outils de recherche Remise devoir 3a Séance 2 Phosphoprotéomique: À la recherche des 2 Avril modifications post-traductionnelles Distribution devoir 3b Séance 3 Mise en contexte des identifications 9 Avril Remise devoir 3b Questions sur le projet

4 Applications de la protéomique Étudier le protéome à petite (une ou quelques protéines) ou grande échelle (centaines à milliers en même temps). Comprendre la signalisation cellulaire, le développement. Modifications post-traductionnelles (phosphorylation, acétylation/méthylation, ubiquitination, glycosylation, etc). Isoformes et mutations. Biomarqueurs pour cancer et maladies (analyse quantitative)

5 Expérience typique de protéomique Extraction des protéines Digestion Trypsique Mélange de peptides MS HPLC Analyse des données Identification / Quantification Chromatographie liquide et spectrométrie de masse

6 Comment fonctionne un spectromètre de masse Vidéos Agilent TOF Agilent Q-TOF FT-ICR

7 MS Survey Scan Séquençage de peptides Intensité relative masse / charge (m/z) Data dependent analysis

8 MS Survey Scan Séquençage de peptides Intensité relative 1. Isolation d un ion masse / charge (m/z)

9 MS Survey Scan Séquençage de peptides Intensité relative 1. Isolation d un ion 2. Fragmentation masse / charge (m/z)

10 MS Survey Scan Séquençage de peptides Intensité relative 1. Isolation d un ion 2. Fragmentation masse / charge (m/z) MS/MS Scan

11 Identifications des peptides MS/MS dataset (milliers) Interprétation automatisé des spectres Identification des peptides/protéines MS/MS Scan

12 Détection des peptides (MassSense) Détection des ions peptidiques dans les données brutes pour extraire leur intensité Légende: Basse Itensité Haute Intensité MS Survey Scan BIN

13 Détection des peptides (MassSense) Région agrandite On peut voir différents ions peptidiques. BIN

14 Détection des peptides (MassSense) H 1,2 C 12,13 N 14,15 O 16,17,18 S 32,33,34,36 Profile isotopique BIN

15 Détection des peptides (MassSense) m/z = 1/z Sommet d intensité et charge BIN

16 Détection des peptides (MassSense) Liste de peptides avec leur valeurs -m/z -temps de rétention -intensité BIN

17 Format de fichiers Données brutes (format binaire propriétaire).wiff (Agilent).raw (dossier) (Micromass MassLynx).raw (ThermoFinnigan Xcalibur) Liste de pics.pkl (Micromass MassLynx).mgf (Mascot generic format).dta (Sequest).mzData (XML) (HUPO Proteomics Standards Initiative (PSI) ).mzxml (Institute for Systems Biology ).mzml (effort pour combiner.mzdata et.mzxml)

18 Pré-traitement des spectres MS/MS Détermination de la charge du peptide précuseur Ajustement de la masse du précuseur Simplification du spectre pour faciliter l interprétation automatisé (ratio signal/bruit). Qualité des spectres MS/MS Ex: Mascot distiller, Proteome Discoverer

19 Interprétation des spectres MS/MS Séquençage de novo (comparable à la méthode manuelle). Peaks, VEMS, PepNovo, LutefiskXP, AUDENS, NovoHMM Recherche d ions MS/MS Mascot, Sequest, OMSSA, X!Tandem, PepSplice Empreintes de masse peptidiques Mascot, Profound, MS-Fit, Aldente, VEMS Comparaison de spectres X!Hunter, BiblioSpec, Bonanza, SpectraST

20 Interprétation des spectres MS/MS Données sur ESILBAC: /UDEM/COURS_BAC/BCM2003/dbcm2003/Proteomique/tp1_data Mascot http auth: usager: CHM3101, mot de passe: johnfenn usager: p0xxxxxx, mot de passe: temp2003 Peaks Online X! Hunter

21 Peptide Mass Fingerprint Trypsin Digest

22 Peptide Mass Fingerprint MS

23 Peptide Mass Fingerprint

24 Protein Sequence Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG

25 Protein Sequence Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG

26 Peptide Masses GLSDGEWQQVLNVWGK VEADIAGHGQEVLIR LFTGHPETLEK HGTVVLTALGGILK KGHHEAELKPLAQSHATK GHHEAELKPLAQSHATK YLEFISDAIIHVLHSK HPGDFGADAQGAMTK ALELFR

27 Peptide Mass Fingerprint ALELFR LFTGHPETLEK HGTVVLTALGGILK HPGDFGADAQGAMTK VEADIAGHGQEVLIR GLSDGEWQQVLNVWGK GHHEAELKPLAQSHATK YLEFISDAIIHVLHSK KGHHEAELKPLAQSHATK

28 Séquençage de novo

29 Mascot - Recherche d ions MS/MS Utilise d abord l empreinte de masse comme dans PMF. Cherche dans la base de données de protéines les peptides possibles pour les masses correspondantes. Valide l identification avec les ions fragments.

30 X!Hunter Comparaison de spectres Spectre à interpréter Déterminer le % d identité Base de données de spectres annotés

31 Synthèse des méthodes d interprétation des spectres MS/MS Séquençage de novo (comparable à la méthode manuelle). Peaks, VEMS, PepNovo, LutefiskXP, AUDENS, NovoHMM Recherche d ions MS/MS Mascot, Sequest, OMSSA, X!Tandem, PepSplice, Zcore Empreintes de masse peptidiques Mascot, Profound, MS-Fit, Aldente, VEMS Comparaison de spectres X!Hunter, BiblioSpec, Bonanza, SpectraST

32 Références Mascot Perkins. D., Pappin D., Creasy D., Cottrell J. (1999) Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20(18), Peaks Ma B, Zhang K, Hendrie C, Liang C, Li M, Doherty-Kirby A, Lajoie G (2003) PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 17(20), X!Hunter Craig R., Cortens J. C., Fenyo D., and Beavis R. C. (2006) Using annotated peptide mass spectrum libraries for protein identification. J. Proteome. Res. 5(8),

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