L3 CBPS Biochimie Structurale. Partie «Acides nucléiques»

Transcription

1 Partie «Acides nucléiques»

2 ITRDUCTI Les acides nucléiques ont été caractérisés chimiquement au début du 0 ème siècle. Les acides nucléiques, AD et AR, sont constituées de nucléotides qui sont les briques élémentaires de la transmission de l information génétique. Ils jouent également un rôle fondamental dans le métabolisme sous forme di- et tri-phosphorylée ainsi que dans la transmission de l information dans la cellule (AMPc et MPc).

3 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

4 ucléotides : - base azotée Phoebus Levene sucre - acide phosphorique

5 sortes de bases azotées hétérocycliques bases pyrimidiques (noyau pyrimidine) bases puriques (noyau purine)

6 bases pyrimidiques bases puriques cytosine (C) C 3 thymine (T) 5-méthyl-uracile uracile (U) adénine (A) guanine ()

7 Il existe des bases pyrimidiques modifiées (chez les phages etc ) ainsi que des analogues synthétiques de ces bases (utilisés en thérapeutique anti-tumorale - 5-FU par exemple) C C méthylcytosine 5-hydroxyméthylcytosine X = F, Cl, Br, I X 5-halogéno-uracile Inhibiteur du métabolisme des nucléotides

8 Beaucoup d autres purines existent : acide urique, caféine C 3 caféine C 3 théophylline théobromine C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 - acide urique (goutte)

9 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

10 Les bases azotées absorbent dans l U.V. Absorbance 0 Ac.ucl. Protéines A 60 A 80 =,8 Longueur d onde (nm) U T C A λmax (nm) ε (M -.cm - ) Moyenne «Qualité» de l acide nucléique Quantité d acide nucléique D.. 60nm = solution d AD double brin à 50 µg/ml

11 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

12 Tautomérie : équilibre impliquant la migration de protons Équilibre amino-imino (cytosine) Équilibre énol-cétone (thymine-uracile) ,99% 0,0% Ces espèces moléculaires sont en équilibre en solution : équilibre fortement déplacé vers la forme amino. En solution forme cétone prédominante quelque soit le solvant (faux pour certaines bases substituées).

13 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

14 La répartition des électrons à la surface des bases azotées n est pas uniforme d où des molécules polarisées. +0,9-0,49 C 3 / -0,45 +0, +0, -0,4-0,65-0,5 R T/U R C +0, +0, -0,4-0,55-0,5 +0, +0, -0,4 +0, -0,5 A -0,5-0,64 R -0,55 R

15 Les densités de charges déterminent les positions et les orientations des liaisons hydrogène. La liaison est directionnelle i.e. l interaction est optimale quand les 3 atomes sont dans l axe (possibilité également avec un angle : interaction plus faible). δ + δ - Les flèches bleues et roses expliquent la complémentarité A=T et ΞC. Plusieurs possibilités de liaisons existent : dans la nature, seules certaines interactions sont retrouvées. A côté de l appariement classique A=T et ΞC, il existe des couples =A ou =T.

16 L équilibre énol-cétone modifie totalement les liaisons hydrogène possibles. R T/U C 3 / R T/U C 3 / -0,65 +0, -0, R C 6 +0, -0,4 devient l équivalent de C on peut alors avoir T

17 L équilibre énol-cétone modifie totalement les liaisons hydrogène possibles. C 3 / C 3 / R T/U R T/U l hydrogène peut se positionner d un côté ou de l autre

18 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

19 sortes de sucres C C D-ribose C C 4 C D-désoxyribose ( -désoxyribose) C AR AD pentoses sous forme furanique (5 atomes dans le cycle)

20 acide phosphorique : 3 P 4 pk a = pk a = 7 pk a = 0 - P - - Les différentes fonctions acides ont des pk a avec des valeurs très disparates.

21 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

22 Liaison acide phosphorique-sucre : phosphoester P - - C 4 3 / P - C 4 3 /

23 Liaison base-sucre nucléoside C C / / n obtient une liaison carbone-azote : liaison -glycosidique

24 nucléotides pyrimidiques P C P C C désoxycytosine--monophosphate (dcmp) désoxythymidine--monophosphate (dtmp)

25 nucléotides puriques P C P C désoxyadénosine--monophosphate (damp) désoxyguanosine--monophosphate (dmp)

26 MECLATURE type de base base azotée nucléoside nucléotide purine purine pyrimidine pyrimidine pyrimidine adénine (AD/AR) guanine (AD/AR) thymine (AD) uracile (AR) cytosine (AD/AR) adénosine guanosine thymidine uridine cytidine adénylate guanylate thymidylate uridylate cytidylate Le préfixe désoxy- ou désoxyribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du désoxyribose. Le préfixe ribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du ribose.

27 A- STRUCTURES PRIMAIRES I- Bases puriques et pyrimidiques - Structure - Propriétés physico-chimiques a- Absorption U.V. b- Tautomérie c- Densités de charge et liaisons hydrogène II- ucléosides et nucléotides - Structure des sucres et de l acide phosphorique - Structures et nomenclature 3- exemple de l ATP

28 Dans les cellules les nucléosides sont retrouvés sous forme mono, diet triphosphates. liaisons anhydride d acide pka = 7 liaison phosphoester P P P adénine adénosine AMP ou adénylate ATP C ADP La valeur du pka de la nde fonction acide du dernier acide phosphorique est de 7 : à p 7, 50% forme ATP 4-, 50% forme ATP glycosidique

29 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

30 Il existe sortes d acides nucléiques : Les acides ribonucléiques (AR) : ribose + phosphate + bases A, U,, C. Les acides désoxyribonucléiques (AD) : désoxyribose + phosphate + bases A, T,, C. L enchainement des nucléotides constitue la structure primaire de l acide nucléique. Les nucléotides sont liés les uns aux autres par une liaison phosphodiester. Les acides nucléiques ont, pour la plupart, une structure secondaire et une structure tertiaire qui leur confère une fonction biologique.

31 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

32 P - C--P--C C 3 C 4 3 P C Liaison phosphodiester ptppapc P TAC ou TgAC ou tgac Thymine (T) C P uanine () 5 4 C Adénine(A) 4 3 Cytosine (C) P P P P T A C

33 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

34 Complémentarité des bases nombre de A = nombre de T nombre de C = nombre de une chaîne d AD polya s hybride avec une chaîne d AD polyt une chaîne d AD poly s hybride avec une chaîne d AD polyc Appariement de Watson et Crick : A T C

35 Francis Crick ( 004) James Watson obel : 50 ans après la découverte de la structure de l AD

36 Les deux chaines d acides nucléiques sont antiparallèles. Les chaînes de phosphate et de sucre sont à l extérieur de la structure. Les bases azotées sont à l intérieur et forment des liaisons hydrogène entre elles.

37 AD B grand sillon Vue de dessus 0 pb 3,4 nm phosphate petit sillon

38 Les acides nucléiques sont retrouvés sous forme de divers types d hélices Vues de dessus AD A,8 nm AD B AD-A AD-B AD-Z AD Z Atomes des sucres Atomes des phosphates Atomes des bases

39 Caractéristiques des différents types d hélices retrouvés dans les acides nucléiques élice A élice B élice Z Sens de l hélice Diamètre Résidus par tour Ecart entre pb Pas de l hélice Rotation de l hélice par résidu Inclinaison normale des bases vers l axe de l hélice droit droit gauche,6 nm,0 nm,8 nm 0 (6 dimères) 0,6 nm 0,34 nm 0,37 nm,8 nm 3,4 nm 4,5 nm (par dimère) 0 6 7

40 AD-A AD-B AD-Z

41 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

42 Il existe 8 modes d associations entre les bases. Les plus fréquents, et les plus stables, sont les paires A=T et ΞC de Watson et Crick. Appariement de Watson-Crick 7 kcal/mole 7 kcal/mole T C A D autres appariements, plus ou moins stables, interviennent notamment dans les phénomènes transitoires liés à la dynamique des systèmes : paires de oogsteen.

43 Appariement de oogsteen U U A A Paire de oogsteen A=U Paire de oogsteen A=U «inverse» Les formes tautomères permettent des appariements rares (imino, A*=C, A*=A, *ΞT, ΞT*). Il en est de même avec la protonation.

44 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

45 Les paires T=A et CΞ sont isomorphes (même forme) : cela donne des unités rectangulaires aux dimensions identiques parfaitement empilables. 0 Å 5 Å 3,4 Å Les paires purine-purine () sont trop larges alors que celles pyrimidine-pyrimidine (CC) sont trop étroites. Les interactions verticales d empilement jouent un rôle important dans la stabilité des acides nucléiques double brin. purine purine pyrimidine purine > > pyrimidine pyrimidine

46 AD B squelette 36 paires de base sucres phosphates Les moments dipolaires d une base se trouvent au dessus de la partie aromatique polarisable de la base du dessous : interaction de nature dipôle-dipôle induit + effet hydrophobe.

47 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

48 AD B L interaction avec l eau stabilise les structures II aires des acides nucléiques d au moins façons : - réduction des répulsions électrostatiques phosphatephosphate proches dans l espace - exposition des groupes hydrophiles (phosphates, sucres) à l extérieur. Les phosphates sont exposés à 00% alors que les bases sont masquées à 80%. Les interactions avec l eau se font à principalement avec les phosphates et les sucres. n trouve des réseaux d eau structurés dans les sillons majeurs et mineurs de l AD.

49 AD B Les ions divalents (Mg +, Cu + ) peuvent respectivement stabiliser ou déstabiliser l AD. - =P--C Mg + - -P--C Le magnésium transforme une répulsion -/- en (+/-) : stabilisation de l hélice (augmentation de la température de fusion de l AD). Le cuivre se lie avec les bases ( et ) : déstabilisation de l AD (diminution de la température de fusion de l AD).

50 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

51 n retrouve de l eau fortement liée à l AD (cristal liquide). Une molécule se lie à un sillon de l AD en chassant les molécules d eau (cas de certains antibiotiques qui s insèrent dans un des sillons de l AD). D autres antibiotiques s intercalent entre les bases. n se sert au laboratoire de la propriété de certaines molécules à s intercaler entre les bases des acides nucléiques pour les visualiser sur gel ou les quantifier (qpcr) : la molécule la plus connue est le bromure d éthidium. étropsine (rouge) 3 + Br - C -C 3 Daunomycine (rouge) bromure d éthidium (BET)

52 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

53 Dénaturation/Renaturation de l AD Densité optique 60 nm %C = 30% %C = 50% %C = 70% Applications : southern/northern blot Puce AD Empreintes génétiques Tm=63 C Tm=70 C Température ( C) Tm=80 C

54 B- STRUCTURES SPATIALES Introduction I- Aspects descriptifs (rappels de L/L) - Enchainement des nucléotides : la liaison phosphodiester - Structure de l hélice d AD II- Interactions - Liaisons hydrogène - Isomorphisme et énergies d empilement 3- Interactions avec l eau et les sels minéraux 4- Interactions AD petites molécules III- Aspects dynamiques - Dénaturation renaturation d AD (fusion) - Respiration de l AD

55 A des températures inférieures au Tm, l AD double brin est globalement stable. Cependant, il se produit des dissociations sur un nombre limité de paires de bases. Ces dissociations sont dues à des transitions syn-anti (rotations de bases au dessus du sucre) ou bien à des transitions dans la forme du cycle furanique du sucre. Ce type de phénomènes est rapide (0-6 sec environ) et permet les interactions entre molécules, insertions d intercalants, transitions locales AD B-AD Z, etc

56 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

57 Les mono- et diesters phosphorique sont très stables vis-à-vis de l hydrolyse acido-basique. Ceci est essentiel pour le rôle biologique qu ils jouent dans l AD, l AR, les phospholipides. Cette stabilité est due à la charge négative portée par l oxygène (fonction acideaupk a le plus faible) qui contrarie les réactions d addition ou de substitution nucléophile.

58 Cas particulier important : la sensibilité de l AR à l hydrolyse alcaline P--C =P- - -C B B P--C P - B 3 - =P =P- - L AR est donc sensible à l hydrolyse alcaline et pas l AD. application : élimination des contaminants AR dans une préparation AD

59 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

60 Les liaisons -glycosidiques sont plus sensibles à l hydrolyse acide que les liaisons phosphodiesters. Les liaisons ribose-purine (A,) sont beaucoup plus sensibles que les liaisons ribose-pyrimidine (U,C). In vivo qu'est-ce qui cause une dépurination? Effet de la chaleur ou d'un environnement localement plus acide. La vitesse de dépurination dans une cellule humaine a été estimée : 0 - sec - /paire de base dépurinations/jour/cellule. Système de réparation : endonucléases apuriniques/apyrimydiques In vitro une dépurinisation sélective est possible. da,d ra,r 0, M Cl, 00 C, 30 min M Cl, 00 C, h

61 Propriété de la fonction imino-amine en conditions acides R adénosine 8 9 pk a =3, R 8 formes mésomères R 8 vrai aussi pour cytidine et guanosine

62 La liaison -glycosidique entre désoxyribose et base purique est facilement clivée en milieu acide : présence d un hydrogène porté par l azote 3 de la base purique P C 9-3 MAXAM ILBERT 4 + C P catalyse intramoléculaire + phosphosucre + base

63 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

64 Les bases azotées sont des molécules polaires et ne sont pas chimiquement inertes. Les bases A,,C,T,U ont des atomes nucléophiles et d autres électrophiles : réactions transitoires ou définitives (alkylations) avec de nombreuses substances. Un certain nombre de modifications chimiques vont pouvoir entraîner des mutations qui pourront devenir définitives lors d une réplication ultérieure de l AD.

65 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

66 Sites d attaques nucléophiles C 4 C 6 /C C R C R 8 6 uracile/thymine C adénine C 4 C R cytosine C 6 C R guanine 8 C 8

67 FRMES MESMERES uracile/thymine 3 4 /C /C /C 3 R R R Il pourra y avoir addition nucléophile sur la double liaison C 5 -C 6.

68 EFFET MUTAEE DU BISULFITE S - 3 C U + C R 3 R S= S= U R R R S= Le bisulfite est utilisé dans la conservation des vins de table et jus de fruits (E). S= R 3 S=

69 Désamination C U ATAATACTATAA TACTTACTACTCATT ATAATAUTATAA TACTTACTAACTCATT réplication ATAATACTATAA TACTTACTACTCATT réplication réplication ATAATAUTATAA TACTTACTACTCATT ATAATAUTATAA TACTTACTAACTCATT ATAATATTATAA TACTTACTAACTCATT ATAATACTATAA TACTTACTACTCATT ATAATACTATAA TACTTACTACTCATT

70 EFFET MUTAEE DE L ACIDE ITREUX ( ) C U et A Cytosine Uracile Adénine Adénine ypoxanthine Cytosine Le nitrate de sodium, a 3, est utilisé comme conservateur (E5) dans l'industrie agro-alimentaire (salaisons, viandes fumées, charcuterie ). Dans l'estomac le nitrate de sodium est transformé en acide nitreux.

71 DERADATI DES PYRIMIDIES PAR YDRAZILYSE R thymine C C R R C 3 MAXAM ILBERT --C- R 3 + C Cela marche aussi pour U et C. En présence de acl M seules les cytosines seront dégradées.

72 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

73 Il s agit de rayonnements γ, β et des rayons X : énération d espèces réactives de l oxygène et de radicaux libres oxydation des bases et enchaînement de réactions radicalaires (coupures de brins d AD ). Utilisation 6 7 en radiothérapie (traitement de certains cancers : R adénine os, cerveau, prostate ) hydroxyadénine Marche aussi avec R

74 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

75 Sites d attaques électrophiles R 6 uracile/thymine /C R adénine R cytosine R guanine 8 7

76 Le benzopyrène est une molécule présente dans l'environnement (fumée de cigarettes, incinérateurs ) qui va être métabolisée en BPDE (monooxygénase, Cyt P450) et va réagir avec les guanines de l'ad. benzo(a)pyrène chaîne cytosine chaîne guanine chaîne guanine benzo(a)pyrène diol époxyde (BPDE)

77 Cis platine (cis diamino-dichloro-platine II) Pt II Cl 7 Cl Le cis platine peut ponter deux guanines par leur 7 dans un même brin : molécule utilisée en chimiothérapie.

78 iodure de méthyl : C 3 -I diméthylsulfate S Réactivité avec 7 >> A > 3 C et 3 T C 3 - -C 3 méthylnitrosourée (MU) C 3 éthylnitrosourée (EU) C -C 3

79 diméthylsulfate S C 3 - -C 3 Rupture de la liaison -glycosidique C 3 MAXAM ILBERT guanine R +

80 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

81 Le séquençage de l AD a permis et permet à la biologie de progresser rapidement dans l acquisition de nouvelles connaissances. Il existe méthodes de séquençage de l AD. Méthode chimique Maxam & ilbert BEL 980 Méthode enzymatique Sanger BEL 980 Walter ILBERT (93- ) Frederick SAER (98- )

82 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

83 Méthode chimique : Allan Maxam et Walter ilbert Méthode développée au début des années 970. Le principe de la méthode repose : - sur le marquage radioactif du brin d AD à séquencer (permet une identification par autoradiographie) - de coupures spécifiques mais incomplètes (une coupure par molécule) - séparation des fragments par électrophorèse (PAE)

84 Principe P Marquage au Traitement par enzyme de restriction P 3 3 P 3 «ros morceau» «Petit morceau» 4 types de traitements chimiques P 3

85 3 P C A T A T C A T C diméthyl sulfate hydrolyse acide (C 88%) hydrazine hydrazine/acl M méthylation des dépurination sélective +A dégradation des pyrimidines T+C PIPERIDIE M dégradation spécifique C MDIFICATI CIMIQUE AVEC TRES FAIBLE REDEMET ( MDIFICATI PAR MLECULE D AD) CUPURE AU IVEAU DES BASES MDIFIEES U ABSETES

86 Réaction de β élimination R -P--C C= -P-- R pipéridine R -P--C C= -P-- R - R -P- + + = C 3 -P-- C= R coupure de l AD

87 3 P C A T A T C A T C +A T+C C C C C A C A C AT C AT C A T C AT C A T C A T A C A T A C ATAT C ATAT C A T AT C AT A T C AT A T C A T AT C AT A T C AT A T C A T A T C A T A T C A T A T C AT A T C AT A T C C A T A T C C A T A T C A C A T A T C A C AT A T C A T C AT A T C A T C A T A T C A T C A T A T C A C T A T A T C A T C AT A T C A T C A T A T C A T C

88 3 P C A T A T C A T C SEPARATI DES FRAMETS D AD PAR PAE 3 C T A C T A T A C +A T+C C - +

89 Foot printing protéine 3 Foot print

90 Foot printing : Dase I ydrolyse acide ydrazinolyse Protéine (nm)

91 C- REACTIVITE CIMIQUE I- Liaisons phosphodiester et -glycosidique - Liaison phosphodiester/cas particulier des AR - Liaison -glycosidique II- Induction de mutations - Réactivité des bases azotées vis-à-vis de nucléophiles - Action des rayonnements ionisants 3- Réactivité des bases azotées vis-à-vis d électrophiles D- SEQUEÇAE DE L AD I- Méthode chimique : Maxam et ilbert II- Méthode enzymatique : Sanger

92 Méthode enzymatique : Sanger Méthode également développée au début des années 70. Le principe de la méthode "manuelle" repose : - sur l utilisation de l AD polymérase I - d un oligonucléotide complémentaire de la partie d AD à identifier (amorce) - d un mélange de dtps (datp,dctp,dttp, dtp) dont un sera radioactif (α ). - d un ddtp (didésoxyribonucléoside triphosphate) Cette méthode a servi au séquençage du génome humain.

93 -C B -C B 3 C A T A T C A T C A T C 3 C T A C T A C C C T A C AD à séquencer AD polymérase I amorce complémentaire (large excès) mélange des 4 dtps (dont radioactif) 3 C A T A T C A T C 3 amorce ddtp différent selon le tube 3 C T A C T A C C C T A C

94 3 CATC A T C A T C 3

95 dd A C dd A C C C T A C dd A C T A C CC C C T A C A T C dd T A C dd T A C C C T A C dd T A C T A C C C T A C dd dd dd dd dd dd C TT A C CC TT A C C CC T A C CT A CCC T A C C C TT A C TT A CCC TT A C dd TT A C TT A C CC C C TT TA C dd dd T A C 3 C T A C T A C C C T A C A T C Séquence du brin complémentaire C T A C T A C C C T A C

96 Lecture du brin complémentaire de vers 3 Autoradiogramme d un gel de séquence d AD (polyacrylamide) 400 bases / gel

97 séquençage automatisé de l AD ACIDES UCLEIQUES amorce AD de séquence inconnue AD polymérase 4 dtps 4 ddtps fluorescents dénaturation Fragments d AD fluorescents obtenus par copie de l AD de séquence inconnue migration de l AD Fragments d AD fluorescents sont séparés par électrophorèse capillaire détecteur faisceau laser laser éléctrophorégramme après traitement informatique