Séance TUTORAT 3 24/11/2016

Transcription

1 Séance TUTORAT 3 24/11/2016

2 Programme M. Heydel Transcription Traduction Techniques exploration ADN M. Masson.

3 TRANSCRIPTION en 5 et 3, régions UTR untraslated region = régions transcrites mais non traduites région codante àdébut : AUG (Méthionine) àfin : codon STOP (UAA, UAG ou UGA) la transcription permet la synthèse d ARNm à partir d ADN l ARN COMPLEMENTAIRE, ANTIPARALLELE du brin matrice, et MONOBRIN la transcription se fait dans le sens 5-3

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6 TRADUCTION ARNm protéine A chaque codon (triplet de nucléotides) de l ARNm, on associe un AA par le CODE GENETIQUE non-chevauchant (lecture des codons à la suite) quasi-universel dégénéré (à chaque AA correspondent plusieurs codons) Traduit de 5 vers 3 Protéine synthétisée de N-ter vers C-ter

7 ARNt Extrémité 5 P = phosphorylée Extrémité 3 OH avec CCA comme 3 derniers AA Boucle anticodon : complémentaire et antiparallèle de l AA correspondant Activation dans le CYTOPLASME

8 ARNr Association à protéines complexe ribonucléoprotéique 1. Positionnement du 1er ARNt en P 2. Nouvel ARNt en A 3. Liaison entre les 2 AA en A (activité peptidyl-synthase de l ARNr) 4. Déplacement d un cran vers site E de l ARNt désacylé (activité translocase de l ARNr) sortie ARNt désacylé

9 TECHNIQUES EXPLORATION ADN Electrophorèse Elle permet de faire migrer des FRAGMENTS d ADN ou d ARN Gel d agarose Séparation selon poids moléculaire PM (ADN chargé donc va migrer vers l anode, chargée +!) Plus les fragments sont petits, plus ils vont migrer loin Vitesse varie selon PM, voltage, teneur en agarose du gel

10 Méthode de Sanger Elle permet de retrouver la séquence d un brin d ADN 1 amorce complémentaire du brin d ADN en 3 Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase L ADN polymérase ajoute soit des dntp, soit des ddntp qui ont la propriété de stopper l élongation après incorporation On obtient ainsi différents fragments de tailles différentes On les sépare par ELECTROPHORESE selon leur PM Et on lit par ELECTROPHOREGRAMME le dernier ddntp incorporé et ainsi reconstruire la séquence

11 PCR Elle permet d amplifier une séquence PRECISE d ADN double brin L ADN est d abord dénaturé 2 amorces complémentaires de chaque brin d ADN sont hybridées Puis polymérisation et amplification exponentielle à la séquence cible est obtenue au bout du 3è cycle Répétition d un cycle de 3 étapes : dénaturation, hybridation, élongation Différentes températures pour les différentes étapes : Dénaturation ADN à 94 Hybridation amorces entre 50 et 65 Elongation par les polymérases à 72

12 Southern Blot Elle permet de déterminer la position d une certaine séquence dans un brin d ADN Transfert des différents fragments du brin préalablement fragmentés et séparés par électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose Fixation de l ADN puis dénaturation On l hybride avec la sonde, complémentaire de la séquence recherchée

13 M. Masson

14 Les eicosanoïdes Ce sont des dérivés oxygénés d AG polyinsaturés à 20 atomes de C. On distingue : -Les prostaglandines formées via les cyclooxygénases. -Les leucotriènes et les lipoxynes formées par les lipoxygénases.

15 Les prostaglandines

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18 Les leucotriènes Les leucotriènes. Ils sont synthétisés via la voie de la 5-lipoxygénase. - L acide arachidonique donne les leucotriènes de série 4. - L EPA donne les leucotriènes de série 5. - L acide eicosatriènoïque donne les leucotriènes de série 3. Ils ont des effets biologiques très importants : - Pro inflammatoires (migration et prolifération lymphocytaire ainsi que sécrétion de cytokines pro-inflammatoires) - Pro agrégants plaquettaires - Vasodilatateurs - Bronchoconstricteurs

19 La Réplication

20 Définition Processus de duplication de l ADN permettant d obtenir 2 molécules d ADN double brin. Réplication physiologique : semi-conservative. Les origines de réplication : propagent de manière BIdirectionnel formation de bulles de réplication. Synthèse : - Orientée de 5 vers 3. - Semi discontinue pour le brin indirect. - Continue pour le brin direct.

21 Mécanisme Procaryote : ADN polymérase I, II et III. Eucaryote : ADN polymérase alpha, delta et epsilon. ADN poly I : - Fragment de Klenow = activité exonucléasique ADN polymérase. - Activité exonucléasique 5 3. ADN poly III : enzyme principal de la réplication. - Activité exonucléasique ADN polymérase.

22 Mécanisme 1 ère étapes : topoisomérase = relaxation de l ADN super enroulée. Topoisomérase 1 : coupe un seul brin. Topoisomérase 2 : coupe les deux brins. 2 ème étape : séparation des brins par l hélicase. 3 ème étape : biosynthèse d une amorce ARN par la primase. 4 ème étape : synthèse de nucléotides par l ADN poly III. 5 ème étape : élimination des amorces et fermeture des brèches par l ADN poly I et la ligase (activité exonucléasique 5 3 )

23 Conditions Une matrice d ADN simple brin et complémentaire. Il faut que le nucléotide ajouté soit complémentaire pour que la polymérase l ajoute. (adénine/thymine et cytosine/guanine). Possibilités de correction sur épreuve de l ADN Pol I et III grâce à son activité exonucléasique 3 5. Des extrémités 3 OH libre afin que le nucléotides suivant puisse être incorporé.

24 Lésions et réparations de l ADN

25 Lésions Modifications spontanée de la structure des acides nucléiques Modifications par rayonnements et radiations Modifications par agents chimiques Modifications par des agents intercalant Lésions oxydatives Mécanisme - Formes tautomères - Hydrolyse - Désamination - Rayons UVs - Radiations ionisantes - Acide nitreux - Alkylation - Cis-platine Anthracyclines = intercalation entre des bases nucléotidiques -Haute fréquence -Oxydations des bases - Perte de bases Exemple Tautomère Adénine/ guanine Désamination Cytosine/uracile Rayons UVs : Dimères de pyrimidine Radiations : Rupture des liaisons simple ou double brin Acide nitreux Désamination Alkylation Méthylation des guanines++ Cis-platine Pontage ADN : anticancéreux Distorsion et décalage des nucléotides par une insertion - 8 OH guanine - 8 oxo guanine Fonction différente.

26 Réparations Mésappariements Excision de Excision de Réparation direct Réparation par Réparation sujette post réplication bases nucléotides recombinaison à erreur uth :méthylation Elimination Excinucléase très rare Anomalies post Polymérase trans utl :liaison entre les 2 de la base réplicatives lésionnelles : mutation uts :mésappariement

27 Applications Xérodermie pigmentaire : déficit du système de réparation par excision de nucléotides Cancer colorectal : déficit de correction des mésappariements post réplicatifs

28 Recombinaisons

29 Recombinaison homologue Crossing over : échange de segments d ADN lors de la méiose. Mécanisme de Holliday : - Clivage - Envahissement réciproque - Ligature des brins formant la jonction de Holliday. Réparations par recombinaisons de l ADN.

30 Recombinaisons spécifiques Intégration d ADN virale dans le génome par une intégrase. Recombinaisons de gènes codant pour les immunoglobulines : Les sites spécifiques VDJ sont reconnus par RAG1 et RAG2 qui entrainent des réarrangements de gènes. - Un anticorps disposent de 4 chaines polypeptidiques. - Présence de FaB qui sert dans la reconnaissance de l antigène VARIABLE. - Présence de Fc qui sert de propriétés effectrices des anticorps CONSTANT.

31 Les immunoglobulines 2 types de chaines légères : kappa et lambda. 5 types de chaines lourdes : gamma, alpha, Mu, delta et epsilon. Chaines légères : - Segment V-J-C avec V (région variable), J (jonction) et C (région constante). Chaines lourdes : - Segment V-D-J-C où D (autre région variable).

32 Commutation de classe C est le fait de changer le segment C sur un anticorps. Cependant, il n y a pas de changement dans la reconnaissance de l antigène.