Abderrahman Maftah Professeur à l université de Limoges. Jean-Michel Petit Professeur à l université de Limoges

Transcription

1 de biologie moléculaire ours + QM/QR Abderrahman Maftah rofesseur à l université de Limoges JeanMichel etit rofesseur à l université de Limoges Raymond Julien rofesseur émérite à l université de Limoges e édition

2 Les illustrations de cet ouvrage ont été réalisées par Sébastien ARI. Directeur d ouvrage Raymond JULIE Dunod, aris, 007, 011, 01 rue Laromiguière, 700 aris ISB

3 Table des matières 1 Structure de l AD et de l AR Les composants des acides nucléiques 1 La structure des nucléotides La structure des polynucléotides 1. La structure en double hélice de l AD La règle de hargaff et les appariements complémentaires Les différentes formes d AD 8 Dissociation et réassociation des brins d AD 9 Les surenroulements de l AD Le nucléosome, la chromatine et les chromosomes 1 La structure du nucléosome 1 La structure et le remodelage de la chromatine 1 La structure des chromosomes et le cycle cellulaire 1 1. La structure des génomes 19 Qu estce qu un génome? 19 La taille des génomes 19 Les génomes viraux 1 Les génomes procaryotes 1 Les génomes eucaryotes 1 Les génomes d organites 1. Les différents types d AR Structure et fonction Qu estce qu un AR non codant? Qu estce que l AR interférence? oints clefs 7 QM QR 8 Réponses 9

4 IV Biologie moléculaire Réplication, réparation, recombinaison et transposition de l AD 1.1 Les mécanismes de réplication de l AD 1 La chimie de synthèse cellulaire des polydésoxyribonucléotides L action de l AD polymérase La fourche de réplication Les autres enzymes et protéines de la réplication Les différentes AD polymérases 8 Les différentes étapes de la réplication 9. Les erreurs de réplication de l AD et leur réparation Les altérations de la structure de l AD Les mécanismes de réparation. Les détériorations environnementales de l AD et leur réparation 8 L hydrolyse spontanée et les détériorations physicochimiques 8 Les agents intercalants 9 La réparation des détériorations 9. La recombinaison et la transposition de l AD Les mécanismes de recombinaison homologue La recombinaison en des sites spécifiques et la transposition 9 oints clefs 7 QM QR 8 Réponses 70 La transcription de l AD 7.1 Les mécanismes de la transcription 7 Les AR polymérases 7 Les différentes étapes de la transcription 7. La transcription chez les bactéries 7 Les promoteurs bactériens 7 Le démarrage de la transcription 77 La phase d allongement 77 L arrêt de la transcription 79

5 Table des matières V. La transcription chez les eucaryotes 80 Les promoteurs eucaryotes et la polymérase II 80 Le démarrage : facteurs de transcription et complexe médiateur 81 Les phases d allongement et d arrêt 8 Les modifications des transcrits 8 Les deux autres polymérases eucaryotes 87. L épissage de l AR 88 Le mécanisme général 88 Le splicéosome 91 L épissage alternatif et sa régulation 91 Exemples de rôles biologiques de l épissage alternatif 9. L «editing des transcrits» 9 oints clefs 97 QM QR 99 Réponses 100 La traduction des AR messagers 10.1 Le code génétique 10 Le code génétique est dégénéré 10 Le code a été établi expérimentalement 10 Le code est lu sur l AR messager dans le sens 10 Les codons ne sont pas chevauchants 107 Les mutations modifiant le sens des codons 107 Le code génétique est universel 109. Les principaux acteurs de la traduction 109 Les AR messagers 110 Les AR de transfert 110 Le ribosome 11. La traduction des AR messagers bactériens 118 Le démarrage (initiation) de la traduction 118 L étape d allongement (élongation) de la chaîne polypeptidique 10 L arrêt de la synthèse (terminaison) 1

6 VI Biologie moléculaire. La traduction des AR messagers eucaryotes 1 Le démarrage de la traduction eucaryote 1 Les étapes d allongement et d arrêt de la traduction eucaryote 1 Traduction et demivie des AR messagers eucaryotes 1 oints clefs 19 QM QR 10 Réponses 1 Régulation de l expression des gènes 1.1 rincipes généraux 1 Les protéines régulatrices : activateurs et répresseurs 1 Le recrutement des AR polymérases 1 Autres exemples de facteurs de régulations 17. Régulation chez les procaryotes 18 L exemple historique : l opéron lactose 18 Autres exemples 1 La régulation complexe du cycle vital du bactériophage l 17. Régulation chez les eucaryotes 1 Les régulateurs transcriptionnels 1 Le contrôle des régulateurs transcriptionnels 17 Le contrôle de l épissage alternatif des transcrits AR 10. Régulation traductionnelle de l expression des gènes eucaryotes 11 Éléments de structure des AR messagers influençant la traduction 11 Le contrôle général par la phosphorylation des facteurs de démarrage 1 Les mécanismes spécifiques de régulant l attachement du ribosome à l AR messager 1 Les mécanismes de régulation plus tardifs 1 Les mécanismes de régulation de la traduction par les microar 17

7 Table des matières VII L irrésistible ascension de l AR comme régulateur de l expression des gènes 170 oints clefs 17 QMQR 17 Réponses 177 Techniques de biologie moléculaire La création de molécules d AD recombinant 179 ouper l AD : les enzymes de restriction 179 Ligaturer l AD 181. Les vecteurs de clonage 18 Les plasmides 18 Les vecteurs viraux 187 Les cosmides 187 Les chromosomes artificiels bactériens 188 Les vecteurs pour levures 188 Les vecteurs pour les eucaryotes supérieurs 190. Les banques d AD 190 Les banques d AD génomique 190 Les banques d AD complémentaire 191. Les techniques d analyse de l AD 191 Le séquençage des acides nucléiques 191 Les nouvelles techniques de séquençage 19 Application au séquençage de l AR 197 Application à la métagénomique 199 Une nouvelle révolution dans le séquençage 01 La réaction de polymérisation en chaîne (R) 0 La R quantitative en temps réel 0 Les techniques d hybridation des acides nucléiques 0 Les techniques de localisation des sites de liaison à l AD 07. Le criblage de cellules recombinées 10 riblage par R 10 riblage à l aide de sites de restriction 11

8 VIII Biologie moléculaire. Les applications de la technologie de l AD recombinant 11 La mutagenèse 11 Le système doublehybride 1 Transfert et expression de gènes eucaryotes chez les procaryotes 1 Transfert et expression de gènes dans les levures 18 Génie génétique et cellules eucaryotes supérieures 19 Utilisation de vecteurs rétroviraux pour la transfection des cellules 0 Les gènes rapporteurs et études des séquences promotrices 0 Un nouvel outil remarquable d ingénierie des génomes : le système RISRas 9 oints clefs 8 QMQR 0 Réponses Glossaire Index

9 1 Structure de l AD et de l AR LA BJETIFS 1.1 Les composants des acides nucléiques 1. La structure en double hélice de l AD 1. Le nucléosome, la chromatine et les chromosomes 1. Les différents types d AR Définir les structures chimiques des acides nucléiques, notamment celle de la double hélice de l AD Étudier les assemblages complexes auxquels participe l AD (nucléosome, chromatine) Répertorier d un point de vue structural et fonctionnel les différents types d AR 1.1 LES MSATS DES AIDES ULÉIQUES Les acides nucléiques (AD et AR) sont des macromolécules composées d un enchaînement d unités structurales appelées nucléotides. e sont donc des polynucléotides. À l état libre, chaque nucléotide est constitué : d une base (Fig. 11), qui peut être une purine (composée de deux hétérocycles azotés) ou une pyrimidine (un seul hétérocycle azoté) ; d un pentose (ose à cinq atomes de carbone, Fig. 1) ; d un à trois groupes phosphate (Fig. 1). Les atomes des bases ( et ) portent les chiffres 1 à pour les pyrimidines et 1 à 9 pour les purines, alors que les atomes du pentose portent les chiffres 1 à. Le signe prime ajouté à ces derniers les distingue de ceux des bases. L ose, par son carbone 1, établit une liaison glycosidique avec l azote 1 des pyrimidines ou l azote 9 des purines. ar son carbone, il forme une liaison ester avec un premier groupe phosphate (désigné pour cette raison phosphate a). e dernier peut former des liaisons anhydride d acide (Fig. 1) avec des groupes phosphate b et g ou des liaisons ester avec un groupe porté par le carbone du pentose précédent (Fig. 1).

10 hapitre 1 Structure de l AD et de l AR L union d une base et d un pentose s appelle un nucléoside. Dès qu un groupe phosphate est présent, l ensemble est désigné par le terme nucléotide. Il en résulte toute une nomenclature dont un exemple est donné (Fig. 1). Figure 11 Structures chimiques des bases puriques (Adénine, Guanine) et des bases pyrimidiques (ytosine, Thymine, Uracile) des acides nucléiques AD et AR. Des formes méthylées peuvent aussi être rencontrées (méthyl cytosine). ytosine ( oxo, aminopyrimidine) Thymine (méthyluracile) 1 1 Uracile (, dioxopyrimidine) 1 Adénine ( aminopurine) Guanine ( amino, oxopurine) méthylcytosine 1

11 1.1 Les composants des acides nucléiques ' ' βdribose 1' ' ' 1' ' ' βddésoxyribose Figure 1 Les deux pentoses respectifs de l AR et de l AD. γ β α ' ' ' 1' Base (A) Désoxyribonucléoside (da) Figure 1 Structure détaillée d un désoxyribonucléoside triphosphate. En remplaçant la lettre A (Adénine) par les lettres G,, T/U et le désoxyribose par le ribose, la nomenclature est généralisable à tous les nucléotides de l AD et de l AR. La structure des nucléotides Désoxyribonucléoside monophosphate (dam) Désoxyribonucléoside diphosphate (dad) Désoxyribonucléoside triphosphate (dat) Dans l AD, l ose est le désoxyribose (Fig. 1) et les nucléotides sont des désoxyribonucléosides monophosphates (Fig. 1). Ils ne comportent qu un seul groupe phosphate (le phosphate a) ; Les bases puriques de l AD sont l adénine et la guanine. Les bases pyrimidiques de l AD sont la cytosine et la thymine (Fig. 11).

12 hapitre 1 Structure de l AD et de l AR a) A A ' ' T T ' ' LYMÉRASE γ β α ' ' 1' ' ' γ β + pyrophosphate b) A T A T ' ' ' LYMÉRASE ' ' ' + γ β pyrophosphate Figure 1 rincipe de la formation d un brin d AD par la polymérisation des nucléotides. oter que le brin matrice qui est normalement copié n est pas ici représenté. a) représentation développée ; b) représentation simplifiée. Dans l AR, l ose étant un ribose (Fig. 1), les nucléotides sont des ribonucléosides monophosphates avec un seul groupe phosphate également. Dans l AR, l uracile remplace la thymine. Dans l AD, la cytosine peut être méthylée sur le carbone pour donner la méthylcytosine (Fig. 11). Les cytosines méthylées sont souvent présentes

13 1. La structure en double hélice de l AD dans des régions de séquences AD riches en répétition de nucléotides à guanine et cytosine (les îlots à dinucléotides pg). La structure des polynucléotides La structure d un polynucléotide (polymère de nucléotides) repose sur la formation d un nombre parfois élevé (plusieurs millions) de liaisons phosphodiester entre les nucléotides constitutifs (Fig. 1). haque liaison phosphodiester s établit entre le groupe du carbone d un pentose et le groupe porté par le carbone du pentose suivant. est la liaison phosphodiester. Il en résulte que l orientation du polynucléotide se trouve définie par la position du groupe phosphate libre du premier nucléotide, généralement le phosphate porté par le carbone, et par le groupe libre porté par le carbone du dernier nucléotide. n dit ainsi que le polynucléotide est orienté dans le sens vers (Fig. 1, voir aussi Fig. 1). 1. LA STRUTURE E DUBLE ÉLIE DE L AD La règle de hargaff et les appariements complémentaires L AD est un acide nucléique bicaténaire, c estàdire constitué de deux brins associés par des liaisons hydrogène entre les bases. Les liaisons hydrogène s établissent toujours entre une purine de l un des brins et une pyrimidine de l autre brin. Dans cet appariement complémentaire, l adénine (A) est toujours associée à la thymine (T) par deux liaisons hydrogène et la guanine (G) interagit avec la cytosine () grâce à trois liaisons hydrogène (Fig. 1). Règle d Erwin hargaff. Le nombre de thymines est égal au nombre d adénines et celui des cytosines au nombre de guanines. Ainsi, dans l AD, la quantité des purines (A+G) est égale à celle des pyrimidines (+T). ar contre le rapport A+T sur G+ varie selon l origine de l AD (Tableau 11). Le principe d appariement complémentaire des bases a une grande valeur pratique : il permet au biologiste de déterminer avec exactitude la séquence nucléotidique d un brin d AD dès lors qu il connaît celle du brin complémentaire, qu il s agisse d un brin AD ou d un transcrit AR (voir chap. ). L orientation d un brin d AD est définie par la présence des groupes chimiques phosphate et portés par les carbones et des deux désoxyriboses extrêmes (Fig. 1 a). Dans la double hélice, les