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1 Méthodes et stratégies de diagnostic virologique

2 Méthodes virologiques courantes Méthodes directes : détecter l agent infectieux ou l un de ses composants - infectiosité : culture - protéines virales : réactions immuno-enzymatiques - acides nucléiques viraux : biologie moléculaire hybridation, amplification, séquençage Méthodes indirectes : détecter la réaction immunitaire de l hôte sérologies virales

3 Quels prélèvements pour le diagnostic? Sérologies virales Biologie moléculaire : PCR, séquençage Sérum Détection d antigènes Transport à 4 C (ou température ambiante, rapidement) - Tubes EDTA - Écouvillons (virocult) - Tubes stériles : LCR, urine, LBA - Biopsies non fixées

4 Qualité - Norme iso (Accréditation des Laboratoires de Biologie Médicale ) - Bon sens et prudence : contact téléphonique avec le laboratoire partenaire * vérifier les conditions * prévenir de l'expédition d'un tube «précieux»

5 Non conformité : Mme M M Renseignements cliniques : leucémie aiguë Nature du prélèvement sur écouvillon : prélèvement inguinal PCR demandées : Grippe A Grippe B VRS

6 Sérologies virales But : mise en évidence d un contact Intérêts : automatisation, rapidité, sensibilité / spécificité (ELISA) Limite : sensibilité moindre aux âges extrêmes croisements antigéniques? Ac ELISA Chémiluminescence tubes unitaires HIV, HTLV, HCV, HBV, HAV CMV, EBV, HSV, VZV, rubéole, B19, rougeole, oreillons

7 Biologie moléculaire : PCR, séquençage PCR en temps réel : HIV, HBV, HCV «charges» CMV, EBV, HHV6, BKV, AdV HSV, VZV, Grippe, Séquençage : HIV, HCV, HBV Pas de tube hépariné

8 Biologie moléculaire But : détecter ou caractériser le génome viral dans un prélèvement. Hybridation : détection HPV oncogènes Amplification génique : PCR en temps réel (tous virus) Applications qualitatives (diagnostic) et quantitatives (suivi sous traitement anti-viral) Séquençage : mutations de résistance et génotype (HIV, HBV,HCV) Limites : - Risques de contamination pour les techniques PCR - Aucune preuve du caractère infectieux ou du lien de causalité (viroses persistantes)

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10 Détection d antigènes? Ag HSV avant accouchement But : détection de la présence du virus en forte quantité Intérêt : rapidité (20 minutes à 3 heures) Limites : manque de sensibilité, lecture subjective Rotavirus

11 Cultures virales But : démonstration du caractère infectieux du virus Intérêt : technique de référence (phénotype d une souche) Limites : lenteur : 3 semaines pour les négatifs virus non ou mal cultivables

12 Une petite idée des prix Sérologie VIH : B54 Western blot VIH : B160 Sérologie HSV IgM + IgG : B50 Ag Rotavirus dans les selles : B20 Charge VIH : B220 Charge VHC : B220 ADN HPV : B140 Génotypage VIH : B1100 Grippe A : BHN930

13 Exemples par syndrome

14 Hépatite aiguë HAV -Transaminases - Sérologies virales : HAV : IgM + IgG- HEV Profils sérologiques classiques HEV : IgM+ IgG- HBV : Ag HBs+ IgM anti HBc+ Hépatite B aiguë Huraux et al, Traité de virologie Médicale, ESTEM, Paris, 2003

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16 Hépatite chronique Phase de tolérance immunitaire clairance immunitaire porteur inactif ADN HBV : Ag HBs+ Ac anti HBc+ Delta? Hépatite B chronique Marqueurs sériques VHC HCV : Ac anti HCV+ ARN + ARN VHC sérique ARN VHC sérique Ac anti-vhc Transaminases mois ans Hépatite aiguë Hépatite chronique

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19 Vaccination HBV : Ac anti-hbs > 10 UI/mL Ac anti HBc négatifs HAV : IgG anti HAV positives

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21 Infection par le VIH 1) Diagnostic de contact avec le virus : sérologie + WB (un seul test ELISA suffit car Ac + Ag) confirmation sur 2ème prélèvement +++ 2) Suivi : - charge VIH (ARN quantitatif) et CD4 : 3/an - résistance au traitement : mutations de résistance (génotype de résistance) dans les gènes viraux codant transcriptase inverse, protéase, gp41, gp120, intégrase

22 Primo-infection par le VIH-1 ARN VIH-1 Ac anti VIH-1 Ag p24 J0 J11-12 J14-15 J20-21 J28-29 Fenêtre sérologique

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24 Infections respiratoires aiguës Privilégier les prélèvements directs : écouvillon nasal ou pharyngé, LBA pour recherche directe d antigènes et/ou PCR Enfant : VRS Influenza Métapneumovirus humain Rhinovirus Adulte en réanimation : HSV CMV Influenza Rhinovirus Personne âgée : Influenza VRS Immunodéprimé : + HHV6, EBV, VRS Seconde intention, si justification clinique +++ : VZV, Parainfluenzae, Adenovirus, Coronavirus, Bocavirus, rougeole, virus émergents

25 Grippe A, B VRS A, B Rhinovirus Metapneumovirus Virus parainfluenza (4) Bocavirus Adenovirus Coronavirus (3)

26 Infection virale pendant la grossesse rubéole (0-18 SA) CMV (1er trimestre) VZV (1er trimestre et péri-natal) parvovirus B19 (2ème trimestre) période périnatale : HSV, HIV, HBV Virologie : sérum = sérologies (IgG, IgM, avidité) liquide amniotique = PCR Suivi échographique Consultation de diagnostic anténatal + + +

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28 Première intention : Méningite, encéphalite LCR : PCR HSV (et entérovirus) Seconde intention? (contexte) : PCR LCR VZV, CMV, HHV6, EBV : possible impact thérapeutique Adénovirus, Parvovirus B19, JCV...

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30 Fièvre de retour du voyageur Sérologies et/ou PCR (ancienneté des symptômes) : dengue, chikungunya, West Nile PCR : MERS Coronavirus (péninsule arabique), grippe AH7N9 (Chine) Ebola Fiche descriptive détaillée pour envoi au CNR : fièvre jaune

31 CHAAMI Femme de 48 ans Antécédents : retour de voyage en Arabie Saoudite Signes cliniques : fièvre à 39.5 C, toux, diarrhée modérée Virus? Prélèvement? Méthode diagnostique?

32 Autre prélèvement?

33 Autre virus?

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35 Gastro-entérite aiguë rotavirus, adénovirus, calicivirus Intérêt du diagnostic? mesures d isolement selles : tests Ag immuno-enzymatiques unitaires pour adénovirus et rotavirus PCR multiplex +++

36 Sérologie EBV lors d un syndrome mononucléosique

37 Accident d'exposition au Sang Patient source Patient exposé 1) Infection VIH? sérologie rapide (4h) 1) Traitement anti-rétroviral précoce et durant 1 mois si PS infecté VIH puis diagnostic classique 2) VHC? 3) VHB? 2) Accident du travail et sérologies initiales (sans urgence) 3) Suivi pendant 6 mois anti-vih 7 mois si traitement

38 Rodin, Le Secret Analyse clinique clé de voûte du diagnostic Diagnostic virologique

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40 PRINCIPE DE LA PCR ARN ADN transcription inverse (RT) dénaturation de l ADN synthèse d ADN hybridation des amorces sens et anti-sens 35 à 45 cycles : production exponentielle du fragment encadré par les amorces

41 Principe du séquençage nucléotidique selon SANGER didéoxynucléotides

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