APPORTS DU NGS DANS L UTILISATION DES THERAPIES CIBLEES ANTITUMORALES. Emmanuel KHALIFA Unité de Pathologie Moléculaire 13/05/2016
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1 APPORTS DU NGS DANS L UTILISATION DES THERAPIES CIBLEES ANTITUMORALES Emmanuel KHALIFA Unité de Pathologie Moléculaire 13/05/2016
2 LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
3 LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
4 LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
5 QUELQUES DEFINITIONS ADN: polymère constitué d une suite de nucléotides de 4 sortes A/T/G/C 1 gène: segment d ADN correspondant à une unité fonctionnelle Exons: fragments retenus par le processus d épissage de l ARN Introns: fragments excisés par le processus d épissage de l ARN Les exons sont porteurs des régions codantes du génome
6 QUELQUES DEFINITIONS ADN: polymère constitué d une suite de nucléotides de 4 sortes A/T/G/C 1 gène: segment d ADN correspondant à une unité fonctionnelle Exons: fragments retenus par le processus d épissage de l ARN Introns: fragments excisés par le processus d épissage de l ARN INTERET DE SEQUENCER LES REGIONS EXONIQUES: INTERPRETATION PLUS FACILE Les exons sont porteurs des régions codantes du génome
7 QUELQUES DEFINITIONS Exome: totalité des exons du génome humain (1% soit 75 millions de nucléotides) GÉNOME Génome: totalité de l ADN humain (3 milliards de nucléotides) Surtout constitué de régions intergéniques non codantes Gènes Transcriptome: ensemble des ARN issus de la transcription des gènes du génome Variable en fonction des tissus et du temps Exons Séquençage génétique: Détermination de l ordre d enchaînement des nucléotides d un fragment d ADN donné Mutation: variation pathogène de la séquence nucléotidique
8 TYPES DE MUTATIONS DETECTEES PAR LE SCREENING MOLECULAIRE MICROLESIONS MACROLESIONS MUTATIONS PONCTUELLES COPY NUMBER VARIANT (CNV) GENES DE FUSION EML4 ALK
9 DES TECHNIQUES CONVENTIONNELLES DE SEQUENCAGE AU NGS
10 Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase
11 Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases
12 Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases
13 Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases Débit de séquençage limité
14 Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases Débit de séquençage limité Faible sensibilité de détection Cellularité tumorale faible Hétérogénéité intratumorale
15 Apports du NGS dans le screening moléculaire tumoral
16 SEQUENCAGE MASSIF EN PARALLELE (NEXT GENERATION SEQUENCING) Parallélisation et massification du séquençage Multiplexage Miniaturisation Débit+++ Moindre coût Ion torrent Illumina Puissance des outils de la bioinformatique En un temps limité, compatible avec le temps clinique Plusieurs types de NGS Approche ciblée (panel de gènes) Approche globale (exome, Whole Genome Etude de l expression (RNA seq)
17 SEQUENCAGE MASSIF EN PARALLELE (NEXT GENERATION SEQUENCING) Parallélisation et massification du séquençage Multiplexage Miniaturisation Débit+++ Moindre coût Ion torrent Illumina Puissance des outils de la bioinformatique En un temps limité, compatible avec le temps clinique Plusieurs types de NGS Approche ciblée (panel de gènes) Approche globale (exome, Whole Genome Etude de l expression (RNA seq)
18 ETAPES CLES DU NGS
19 ENRICHISSEMENT PAR PCR MULTIPLEX: PREPARATION DE LA LIBRAIRIE Chaque couple d amorce permet l amplification d un fragment d intérêt
20 AMPLIFICATION CLONALE But: amplification sert à rendre les brins «détectables» au moment du séquençage
21 AMPLIFICATION CLONALE ION TORRENT But: amplification sert à rendre les brins «détectables» au moment du séquençage
22 REACTION DE SEQUENCAGE
23 ION TORRENT: PYROSEQUENCAGE REACTION DE SEQUENCAGE
24 ANALYSE BIOINFORMATIQUE Conversion des données brutes en informations pertinentes pour le choix thérapeutique Notion de pipeline Pabinger et al, 2012
25 Pabinger et al, 2012 ANALYSE BIOINFORMATIQUE
26 ANALYSE BIOINFORMATIQUE Profondeur de lecture: Nombre de fois qu un nucléotide est lu à une position donnée Pabinger et al, 2012
27 ANALYSE BIOINFORMATIQUE Profondeur de lecture: Nombre de fois qu un nucléotide est lu à une position donnée Pabinger et al, 2012 Couverture: Pourcentage de la région ciblée réellement séquencée à une profondeur donnée
28 ANALYSE BIOINFORMATIQUE Pabinger et al, 2012 Annotation: Nomenclature Consultation de bases de données en ligne Consultation de logiciel bioinformatique Tri des variants Par valeur théranostique Par type de gène Par nature de variant
29 AVANTAGES DU NGS EN ONCOLOGIE Exhaustivité du screening Détection de mutation à faible pourcentage Economie de matériel biologique
30 APPLICATIONS EN ROUTINE CLINIQUE
31 AMM DES ANTI EGFR DANS LES CANCERS COLORECTAUX METASTATIQUES ET LES ADENOCARCINOMES BRONCHIQUES Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research panel v2 Panel de 22 gènes Gènes impliqués dans l oncogénèse les plus fréquemment mutés Régions porteuses des hot spots mutationnels Screening dans le cadre de l AMM des anti EGFR (KRAS, NRAS, EGFR)
32 AMM DES ANTI EGFR DANS LES CANCERS COLORECTAUX METASTATIQUES ET LES ADENOCARCINOMES BRONCHIQUES Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research panel v2 Panel de 22 gènes Gènes impliqués dans l oncogénèse les plus fréquemment mutés Régions porteuses des hot spots mutationnels Screening dans le cadre de l AMM des anti EGFR (KRAS, NRAS, EGFR) Gènes ciblables dans les essais cliniques de médecine personnalisée Gènes impliqués dans des mécanismes de résistance
33 APPLICATIONS EN RECHERCHE CLINIQUE
34 ESSAIS DE TYPE UMBRELLA (NGS+++) Test d un panel prédéfini de thérapies ciblées Essais guidés par la génomique tumorale Etude du profil génomique tumoral Thérapies commercialisées hors AMM Thérapies non commercialisées Un type histologique Plusieurs types histologiques Un type histologique Non randomisés SAFIR01 (Unicancer) (clos) Randomisés MOST (Centre Léon Bérard), SHIVA (Institut Curie) (clos) SAFIR02 Lung (Unicancer) SAFIR02 Breast (Unicancer)
35 PROGRAMMES DE SCREENING MOLECULAIRE Carte d identité de la tumeur Techniques de haut débit Enrichissement d essais de phase I/II avec des patients porteurs d une cible moléculaire adéquate Accélérateur du développement des thérapies ciblées Schwaederle et al, J Clin Oncol, 2015
36 PROGRAMME BIP (BERGONIE INSTITUTE PROFILING)
37 Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Mise à disposition de matériel tumoral Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN
38 Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Délai moyen: 9 semaines Activité multipliée par 6 entre 2013 et Rendement du screening: 20% Mise à disposition de matériel tumoral Base de données clinico-biologique Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN
39 ENJEUX DU SCREENING DANS LES ESSAIS DE MEDECINE PERSONNALISEE EN CANCEROLOGIE
40 Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Absence d altération moléculaire ciblable Mise à disposition de matériel tumoral Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN NO
41 NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants)
42 NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants) NGS Oncomine ADN: Mutations + CNV
43 NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants) NGS Oncomine ADN: Mutations + CNV ARN: Transcrits de fusion/anomalies d épissage
44 Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Absence d altération moléculaire ciblable Mise à disposition de matériel tumoral Mauvaise réponse au traitement malgré une approche personnalisée Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN NO
45 Screening large et multidimensionnel Priorisation des mutations «pilotes» ou «drivers»
46 CAS CLINIQUE
47 Mme A 2007: Diagnostic d un carcinome du sein lobulaire invasif ER+, RP-, HER2- (T2N0M0) Chimiothérapie néoadjuvante Mastectomie avec curage axillaire Radiothérapie/Hormonothérapie Mai 2010: Détection de métastases hépatiques Echec de plusieurs lignes de chimiothérapie dont 9 mois capecitabine Mai 2014: Soumission du dossier en RCP moléculaire Biopsies des métastases hépatiques
48 LISTE DES VARIATIONS GENETIQUES RETROUVEES EN NGS
49 VISUALISATION DES READS SUR L EXON 21 DE HER2
50 PREDICITION BIOINFORMATIQUE DE PATHOGENICITE DE LA L869Q Elaboration d un score de pathogénicité «in silico»
51 HER2: RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE
52 HER2: RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE
53 PROBLEME AUCUNE ETUDE FONCTIONNELLE NI CLINIQUE NE PROUVE QUE L869Q EST UNE MUTATION ACTIVATRICE DE ERBB2
54 HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes
55 HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q ERBB2 EGFR EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes
56 HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q ERBB2 EGFR 861 EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes L869Q interprétée comme une mutation probablement activatrice de ERBB2/HER2 869
57 TRAITEMENT PAR TKI ANTI ERBB2: LAPATINIB Très bonne réponse tumorale pendant 18 mois Case report renforçant la thèse d un effet activateur de la L869Q Grellety et al, Annals of Oncology, 2016
58 TAKE HOME MESSAGES Le NGS et les autres technologies de haut débit mèneront à une médecine de plus en plus personnalisée Evolution exponentielle des capacités de séquençage Penser assez tôt au screening moléculaire en vue d essais cliniques de médecine personnalisée
59 MERCI DE VOTRE ATTENTION
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