UNIVERSITÉ DES SCIENCES AGRICOLES ET MÉDECINE VÉTÉRINAIRE DE BUCAREST THÈSE DE DOCTORAT

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1 UNIVERSITÉ DES SCIENCES AGRICOLES ET MÉDECINE VÉTÉRINAIRE DE BUCAREST 2014 THÈSE DE DOCTORAT LE CONTRÔLE DE CERTAINES ZOONOSES TRANSMISSIBLES DES ANIMAUX DE COMPAGNIE DIRECTEUR DE THÈSE: Prof. Univ. Dr. Doina DANEŞ CANDIDAT AU DOCTORAT: Adrian UNGUREANU MOTS-CLÉS: leptospirose, la borréliose de Lyme, la collecte d'échantillons biologiques non invasive, la surveillance active, la confirmation du diagnostic. RÉSUMÉ Les zoonoses sont des maladies infectieuses qui peuvent être transmises de l'animal à l'homme et vice versa. Ces maladies sont causées par des bactéries, virus, parasites, champignons et prions qui sont portés par les animaux et les insectes. Certains agents pathogènes zoonotiques avoir une histoire de centaines d'années (par exemple: Peste, l'anthrax, la salmonellose, leptospirose), tandis que d'autres ont une histoire plus récente (ex:. Fièvre hémorragique à virus Ebola, l'encéphalite du West Nil, la maladie de Lyme). Les maladies telles que la leptospirose sont contactés que l'homme des animaux, la transmission interhumaine est pratiquement insignifiante. Les maladies transmises par les tiques, comme la maladie de Lyme et Rocky fièvre pourprée des montagnes crée de graves problèmes de santé, y compris les pays à système de santé très développé comme les États-Unis, forçant les centres nationaux de contrôle des maladies (CDC) à travailler en étroite collaboration avec les communautés locales pour développer des moyens novateurs pour contrôler et améliorer le diagnostic. La thèse de doctorat avec le titre «Le contrôle de certaines zoonoses transmissibles des animaux de compagnie» a eu comme principaux objectifs: (1) l élaboration d une procédure de contrôle d une zoonose transmissible dans des abris pour les animaux de compagnie sur le territoire de la Roumanie ; (2) l évaluation de la prévalence d une zoonose transmissible dans des abris pour les animaux de compagnie sur le territoire de la Roumanie ; (3) l évaluation de 1

2 la perception des médecins vétérinaires praticiens par rapport à la stratégie de contrôle qui doit être appliquée à une zoonose rare chez les animaux de compagnie. Les objectifs secondaires dérivés des trois objectifs susmentionnés sont: (a) l optimisation d une méthode de diagnostic qui peut être utilisée dans la surveillance active d une zoonose chez les animaux de compagnie des abris ; (b) l élaboration d une méthode innovatrice de prélèvement non invasif des échantillons biologiques nécessaires à la surveillance active d une zoonose dans des abris pour les animaux de compagnie ; (c) l évaluation de la prévalence d une zoonose transmissible dans quatre abris pour les animaux de compagnie ; (d) la réalisation d une interview téléphonique basée sur un questionnaire - l évaluation de la perception des médecins vétérinaires praticiens par rapport à la stratégie de contrôle qui doit être appliquée à une zoonose rare chez les animaux de compagnie ; (e) l évaluation de la valeur diagnostique de certaines méthodes utilisées dans des cabinets vétérinaires de Roumanie pour une zoonose rare chez les animaux de compagnie. La thèse est structurée en deux parties, en concordance avec les règles de technorédaction de L École Postdoctorale. Dans la Première partie, intitulée Étude bibliographique, on présente les connaissances actuelles concernant la pathologie infectieuse à potentiel zoonotique chez les chiens, et dans la deuxième partie, intitulée Recherches personnelles, on présente les méthodes de travail, les résultats, les discussions et les conclusions. Dans l introduction on présente le contexte épidémiologique qui a été à la base de la formulation du titre et des objectifs principaux et secondaires, énoncés antérieurement, afférents à ces recherches. La première partie est précédée d un chapitre introductif où on présente le contexte dans lequel on a choisi le titre de la thèse et on a établi le but et les objectifs de celle-ci. Cette partie est structurée en cinq chapitres qui traitent des éléments de pathologie infectieuse et de contrôle de ceux-ci chez les animaux de compagnie. Le chapitre premier, intitulée «Zoonoses majeures ou communes des chiens de compagnie», présente d une manière synthétique, en sous-chapitres distincts, les zoonoses : la peste, la vibriose (l infection à Campylobacter jejuni), l infection à Bartonella henselae, la maladie de Lyme, la psittacose, la rage, la salmonellose et la schigellose. Le chapitre 2, intitulée «D autres zoonoses des chiens de compagnie», présente d une manière synthétique, en sous-chapitres distincts, les zoonoses : l anthrax, la brucellose, la colibacillose, l ehrlichiose, l infection à Hantavirus, la leptospirose, la fièvre Q, la fièvre 2

3 pourprée des montagnes Rocheuses, l infection au streptocoque, la tularémie, la tuberculose, la toux de chenil, la fièvre streptobacillaire et la fièvre West Nile. Le chapitre 3, intitulé «La leptospirose», synthétise les connaissances actuelles concernant l étiologie, l épidémiologie (la réceptivité, les facteurs qui influencent la réceptivité, le mode de transmission, la dynamique épidémiologique), la pathogenèse, des aspects cliniques et lésionnels de l infection leptospirosique chez les animaux de compagnie et chez les humains (la période d incubation, les signes et les lésions associés aux infections leptospirosiques chez les animaux, les signes et les lésions associés aux infections leptospirosiques chez les humains, le pronostic), le diagnostic différentiel de la leptospirose, le diagnostic de confirmation (l isolement et l identification des leptospires et le diagnostic immunologique), la prophylaxie et le combat de la leptospirose chez les animaux de compagnie. Le chapitre 4, intitulé «La borréliose», synthétise les connaissances actuelles concernant l étiologie, les particularités épidémiologiques, la pathogenèse, les aspects cliniques et lésionnels de la borréliose chez les animaux de compagnie et chez les humains (la période d incubation, les signes cliniques associés à la borréliose chez les animaux et chez les humains), le diagnostic différentiel et de confirmation (l isolement et l identification des leptospires et le diagnostic immunologique), la prophylaxie et le combat de celle-ci. La deuxième partie comprend les chapitres 5-12 où on présente les recherches personnelles. Le chapitre 5 présente le déroulement des recherches, le chapitre 6 présente les animaux, les matériels et les méthodes utilisés dans la recherche scientifique, et les chapitres 7-12 présentent les résultats, les discussions, les conclusions et les recommandations des principales activités afférentes aux objectifs proposés dans la présente recherche doctorale. Le chapitre 5 présente les cadres naturels, organisationnel et institutionnel dans lesquels se sont déroulées les recherches. La thèse de doctorat a été réalisée comme partie du projet POSDRH/107/1.5/S/76888 «Bourses doctorales à l appui de l activité de recherche dans le domaine agronomique et de la médecine vétérinaire», projet cofinancé du Fonds Social Européen par le Programme Opérationnel Sectoriel pour le Développement des Ressources Humaines , domaine majeur d intervention : 1.5 «Programmes doctoraux et postdoctoraux à l appui de la recherche», axe prioritaire n o 1 «L éducation et la formation professionnelle à l appui de la croissance économique et du développement de la société basée sur la connaissance», bénéficiaire : l Université de Sciences Agronomiques et de Médecine Vétérinaire de Bucarest. Les animaux examinés pour cette recherche ont été de la zone sud-est de la Roumanie, l examen clinique, lésionnel et les investigations de laboratoire 3

4 ont été réalisés dans les Cliniques Universitaires de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Bucarest, dans le Laboratoire de recherche de la discipline Maladies infectieuses et médecine préventive de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Bucarest. Le chapitre 6 présente les animaux, les matériels et les méthodes utilisées dans la recherche. Dans la recherche on a inclus 4 abris pour les chiens, localisés dans le Sud-Est de la Roumanie, comptant exemplaires, dont 2912 chiens dans l abri 1, 2028 chiens dans l abri 2, 4810 chiens dans l abri 3 et 4536 chiens dans l abri 4. Dans l abri 1, on a effectué des prélèvements d urine chez 312 chiens (302 échantillons ont été prélevés chez les chiens par des méthodes non invasives avec des disques absorbants et 10 échantillons ont été prélevés par la cathétérisation urétrale) et les prélèvements de sang ont été effectués chez 207 chiens (seulement chez les animaux ayant un résultat positif à l infection par la leptospirose au moment du test de la PCR de l urine). Dans l abri 2, on a effectué des prélèvements d urine chez 203 chiens (193 échantillons ont été prélevés chez les chiens par des méthodes non invasives et 10 échantillons ont été prélevés par la cathétérisation urétrale) et les prélèvements de sang ont été effectués chez 41 chiens (seulement chez les animaux ayant un résultat positif à l infection par la leptospirose au moment du test de la PCR de l urine). Dans l abri 3, on a effectué des prélèvements d urine chez 482 chiens (472 échantillons ont été prélevés chez les chiens par des méthodes non invasives et 10 échantillons ont été prélevés par la cathétérisation urétrale) et les prélèvements de sang ont été effectués chez 68 chiens (seulement chez les animaux ayant un résultat positif à l infection par la leptospirose au moment du test de la PCR de l urine). Dans l abri 4, on a effectué des prélèvements d urine chez 454 chiens (444 échantillons ont été prélevés chez les chiens par des méthodes non invasives et 10 échantillons ont été prélevés par la cathétérisation urétrale) et les prélèvements de sang ont été effectués chez 215 chiens (seulement chez les animaux ayant un résultat positif à l infection par la leptospirose au moment du test de la PCR de l urine). Au moment de l évaluation de certaines méthodes de diagnostic pour la borréliose de Lyme chez les chiens on a prélevé 108 échantillons de sérum sanguin et de sang entier récolté sur l EDTA chez les animaux présentés dans les Cliniques de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Bucarest et dans d autres cabinets vétérinaires de Bucarest. L optimisation de la technique de la PCR a été réalisée avec de la culture inactivée de Leptospira interrogans sérovar icterohaemorrhagiae (3 x 10 8,0 / ml). 4

5 L évaluation des matériaux absorbants «fil de coton», «lavette de coton» et «disques de coton» pour la collecte des échantillons d urine, en vue de l isolement de l ADN de la leptospirose de ceux-ci, a été réalisée avec de la culture inactivée de Leptospira interrogans sérovars: icterohaemorrhagiae, canicola et grippotyphosa (au minimum 1 x 10 7,0 / ml de chaque sérovar). Dans la recherche de la perception et des stratégies de diagnostic dans la pratique médicale vétérinaire des animaux de compagnie de Roumanie en ce qui concerne la borréliose chez les chiens, on a inclus 250 unités d assistance sanitaire vétérinaire. Les échantillons d urine des quatre abris ont été prélevés soit par la collecte de l urine éliminée d une manière spontanée par les animaux à l aide de certains matériaux absorbants, soit par cathétérisation urétrale. Pour l extraction de l ADN de la leptospirose des échantillons d urine, on s est servi du kit Link Genomic DNA (Invitrogen, EUA), en utilisant le protocole d isolement des acides nucléiques des cellules bactériennes Gram-négatives. La technique de la PCR de détection de la leptospirose sp. dans l urine des chiens a été optimisée spécialement pour effectuer ces recherches. Les échantillons de sérum sanguin prélevés des chiens ayant un résultat positif au test de la PCR pour la leptospirose dans l urine ont été examinés pour détecter les anticorps anti-leptospires à l aide du test d agglutination microscopique (MAT). Pour réaliser le sondage téléphonique concernant la perception et le diagnostic de la borréliose de Lyme chez les chiens on a utilisé un questionnaire de 10 questions, et les protocoles de diagnostic de la borréliose de Lyme chez les chiens ont été : la microscopie électronique en champ sombre en partant d échantillons de sang entier (goutte fraîche), le test immunochromatographique et le test d immunofluorescence indirecte. Dans le chapitre 7, intitulé «L optimisation d une méthode de la PCR qui permette la mise en évidence de l ADN de la leptospirose dans l urine chez le chien», on a observé que la réaction en chaîne de la polymérase est une méthode avec sensibilité et spécificité élevées, dont l optimisation suppose l harmonisation et la synchronisation de tous les paramètres biochimiques et physiques qui prennent part à la réaction. La réaction en chaîne de la polymérase pour la leptospirose, qui a eu comme but l amplification d un fragment de 331 bp, en utilisant la paire d amorces 5 GGCGGCGCGTCTTAAACATG-3, (position en génome: 38-57) et 5 TTCCCCCCATTGAGCAAGATT-3 (position en génome: ), a été optimisée aux paramètres : dénaturation initiale à 94 C pendant 3 minutes, 45 cycles de PCR 5

6 (dénaturation à 94 C pendant une minute, alignement à 63 C pendant 1,5 minute, extension à 72 C pendant 2 minutes) et extension finale à 72 C pendant 10 minutes. Dans le chapitre 8, intitulé «Études concernant l optimisation du protocole innovateur de prélèvement non invasif des échantillons d urine dans les abris pour les chiens sans maître en vue de la surveillance de la leptospirose» on a établi que les fils, les lavettes et les disques de coton sont des substrats absorbants utiles à la collecte des échantillons d urine pour la détection de l ADN de la leptospirose par la technique de la PCR, mais la qualité de ces matériaux peut influencer le résultat obtenu. Avant d utiliser certains matériaux absorbants pour le prélèvement de l urine pour des investigations de la PCR, on recommande de tester ces matériaux pour vérifier s ils contiennent de possibles résidus qui peuvent inhiber l une des composantes de la réaction de la PCR pour que les résultats ne soient pas considérés comme négatifs, d une manière erronée. Le prélèvement non invasif des échantillons d urine en utilisant des matériaux absorbants semblables aux Disques de coton Cotoneve (Ø: 57 mm) à usage cosmétique, peut être extrêmement utile pendant la surveillance active de la leptospirose dans les abris pour les chiens sans maître. Dans le chapitre 9, intitulé «Étude concernant le risque zoonotique de la leptospirose dans des abris pour les chiens sans maître sur le territoire de la Roumanie», suite à l application de la technique de la PCR de détection de l ADN de la leptospirose dans l urine, la prévalence des chiens en bonne santé qui éliminent des leptospires par l urine a été 66,35% dans l abri 1, 20,20% dans l abri 2, 14,10% dans l abri 3 et 47,36% dans l abri 4, avec une prévalence moyenne chez tous les animaux testés de 36,60% (531/1451). Tous les animaux qui ont fourni des résultats sérologiques positifs au test de la PCR pour la leptospirose des échantillons d urine ont fourni des résultats sérologiques positifs au test d agglutination microscopique. Dans le sud-est de la Roumanie circulent au moins les sérovars L. Pomona, L. Canicola, L. Ballum et L. Grippothyphosa. Dans le chapitre 10, intitulé «La perception et le diagnostic de la borréliose de Lyme chez le chien dans les cabinets vétérinaires du sud-est de la Roumanie» on a établi que les syndromes cliniques associés par les médecins vétérinaires d une manière usuelle à la maladie de Lyme chez le chien ont été les troubles neuronaux (80%), la fièvre (75%), la polyarthrite (70%) et la glomérulopathie (65%), mais seulement la moitié des cliniques vétérinaires sont capables de tester de manière sérologique les chiens pour la maladie de Lyme et 70% d entre eux ont une collaboration avec des laboratoires spécialisés. Le test sérologique a été réalisé pour les chiens ayant un historique d infestation de tiques dans 15% des cas, pour les chiens au syndrome fébrile dans 20% des cas et pour ceux boiteux dans 70% des cas. Une proportion 6

7 significative des cabinets vétérinaires (70%) sollicite la confirmation du diagnostic dans des laboratoires spécialisés. Dans le chapitre 11, intitulé «Les tests de diagnostic utilisés dans des cabinets vétérinaires de Roumanie pour le diagnostic de la borréliose de Lyme chez le chien» on a établi que par l exploitation d au moins deux méthodes de diagnostic de la borréliose de Lyme la sécurité du diagnostic augmente et il est recommandé de corroborer les résultats d au moins deux méthodes de diagnostic qui ont à la base des principes de travail différents. Dans le chapitre 12 on a synthétisé les conclusions et les recommandations générales : L identification de la méthode et du matériel support pour le prélèvement des échantillons d urine chez les populations de chiens a eu comme objectif la conservation des propriétés de l échantillon pour utiliser celui-ci dans la technique de la PCR, et la validation de celles-ci a été réalisée avec ce but. Pendant l investigation de l état d une population animale par rapport à un certain pathogène, le prélèvement collectif d échantillons d urine peut être exploité pour diverses investigations qui utilisent la PCR, en employant le support sélecté dans cette étude, ayant comme avantages le caractère non invasif pour l individu et pour la population en gardant la spécificité des résultats. Le test de la PCR des échantillons d urine prélevés à l aide de certains matériaux absorbants en coton (à usage industriel, à usage domestique ou à usage cosmétique) a fourni des résultats positifs pour tous les échantillons infectés d une manière expérimentale dans un intervalle de jusqu à 32 heures à partir du moment du prélèvement de ceux-ci sur les substrats mentionnés, maintenus à une température ambiante de C. Les échantillons d urine prélevés sur le support absorbant identifié peuvent être analysés par la PCR, sans altérer le résultat de l investigation, 32 heures après le prélèvement s ils ont été gardés à une température de C. Les variations enregistrées en utilisant les divers supports pour le prélèvement des échantillons d urine (coton à usage industriel, à usage domestique ou à usage cosmétique) recommandent de tester ces matériaux avant de les utiliser pour le prélèvement des échantillons destinés au test de la PCR pour la leptospirose pour exclure les résultats non pertinents ou faux. Le support de prélèvement représenté par les disques de coton à usage cosmétique a conservé la plus grande quantité d acide nucléique par rapport aux autres matériaux testés avec ce but de manière que les échantillons en question ont fourni des résultats positifs pour 7

8 tous les échantillons infectés d une manière expérimentale même après 4 jours de conservation à C, et les bandes électrophorétiques obtenus ont été beaucoup plus intenses. Le protocole de la PCR recommandé pour le dépistage des porteurs et des éliminateurs chroniques de leptospires par l urine utilise la paire d amorces 5 GGCGGCGCGTCTTAAACATG-3, (position en génome : 38-57) et 5 TTCCCCCCATTGAGCAAGATT-3 (position en génome : ) et les paramètres suivants : dénaturation initiale à 94 C pendant 3 minutes, 45 cycles de PCR (dénaturation à 94 C pendant 1 minute, alignement à 63 C pendant 1,5 minute, extension à 72 C pendant 2 minutes) et extension finale à 72 C pendant 10 minutes. L utilisation de 30 cycles au lieu de 45 dans l amplification de la PCR a comme effet la diminution de la sensibilité de la technique : la PCR avec 45 cycles a permis l identification de l ADN cible dans un millilitre d urine qui contenait une culture inactivée de Leptospira sp.(au minimum 3 x 10 8 copies de l ADN cible) à une dilution de 10-8, pendant que la PCR avec 30 cycles est devenue négative après la dilution Le nombre des échantillons soumis à l investigation en vue de l établissement du statut des populations des chiens errants a satisfait les critères des chercheurs dans ce domaine [71, 136], de manière que les résultats obtenus sont pertinents et peuvent être extrapolés à l entier effectif. La prévalence des chiens porteurs et éliminateurs de leptospires par l urine dans des abris pour les chiens errants ramassés dans des localités du sud-est de la Roumanie, en utilisant les protocoles validés, a été de 36,60% (531/1451) avec limites entre 20,22% et 66,35%. Parmi les populations de chiens errants des abris situés dans le sud-est de la Roumanie on a mis en évidence la circulation simultanée de plusieurs sérotypes, dont les plus fréquents sont L. Canicola identifié chez 73,82% (392/531) des chiens avec un résultat positif et L. Pomona identifié chez 25,05% (133/531) des chiens avec un résultat positif. La prévalence des sérotypes L. Grippothyphosa chez 0,94% (3/531) des chiens avec un résultat positif a été beaucoup moins importante, même insignifiante, en mettant en évidence un phénomène accidentel. Dans le sud-est de la Roumanie, parmi les populations de chiens errants, circulent au moins les sérovars L. Pomona, L. Canicola, L. Ballum et L. Grippothyphosa. La présence, parmi les populations de chiens, à l origine errants, d un panel de sérovars appartenant au genre Leptospira, qui inclut aussi, en plus des souches à spécifique pathogène pour le chien, des souches dont le spectre de pathogénicité intéresse d autres, ou 8

9 mieux, et d autres espèces animales, y compris l homme, représente un élément objectif pour l institution de certaines mesures de restriction de la libre circulation des chiens sans maître. Dans la pratique médicale vétérinaire de Roumanie, la suspicion de la maladie de Lyme se fait, le plus souvent, en corrélation avec les syndromes neuronal (80%), fébrile (75%), polyarthritique (70%) et rénal (65%). Cependant, les résultats obtenus peuvent être associés à un biais médiatique parce que pendant les recherches on a déroulé une forte campagne médiatique concernant la maladie de Lyme chez l homme. Le test sérologique pour la borréliose de Lyme a été réalisé seulement chez 15% des chiens ayant un historique d infestation de tiques, mais le test a été réalisé chez 70% des chiens boiteux: cela indique une association plus faible dans le raisonnement clinique entre l infestation de tiques et la transmission de la borréliose par rapport à l association du phénomène arthritique avec celle-ci. Le diagnostic clinique de la borréliose de Lyme est soutenu par des méthodes spécifiques - tests de dépistage sérologique, seulement dans 50% des cabinets où on a fait des recherches; cependant, 70% de ces cabinets vétérinaires collaborent avec des institutions spécialisées en diagnostic soit pour la certification de la suspicion clinique, soit pour la confirmation des résultats des tests rapides utilisés dans le laboratoire clinique. La microscopie en champ sombre, les tests immunochromatographiques et l immunofluorescence indirecte sont des méthodes de diagnostic utiles dans la pratique médicale vétérinaire pour orienter le diagnostic en cas de suspicion de borréliose de Lyme, mais l emploi exclusif d une seule méthode ne permet pas l établissement d un diagnostic sûr de maladie. Pendant que la microscopie en champ sombre ne peut pas établir l appartenance au genre et à l espèce des spirochètes présents dans le champ microscopique, les tests immunochromatographiques offrent un résultat rapide, mais les résultats positifs obtenus certifient le fait que l animal a été exposé à l agent, mais ils ne certifient pas la cause des manifestations cliniques dues à la borréliose de Lyme. Le test d immunofluorescence indirecte a été le plus sensible et le plus spécifique dans la découverte de la prévalence des anticorps spécifiques chez les animaux examinés (38,89%, 42/108), mais sans pouvoir établir une corrélation avec les manifestations cliniques. Pour l établissement d un diagnostic de confirmation sûr, utile au thérapeute, les laboratoires cliniques qui se trouvent dans les cliniques vétérinaires devraient détenir au moins deux méthodes de test de toute suspicion de la maladie de Lyme, et ces méthodes devraient avoir des principes de travail différents. 9

10 L extension et la diversification des méthodes de prélèvement de certains échantillons biologiques par des méthodes non invasives, en concordance avec le but de l investigation et avec la méthode d investigation employée. Le test de la présence des leptospires dans l urine des chiens, avant l adoption, avant la monte, mais aussi une fois par an, tenant compte du fait que la vaccination n exclut pas la recontamination et l excrétion des différentes souches. La diversité des souches de leptospires qui peut être éliminée par l urine des chiens veut que la demande zootechnique d élevage des animaux dans les conditions de séparation des espèces soutienne l élimination des chiens des exploitations d animaux à intérêt économique. L inclusion dans le Programme de formation tout au long de la vie des médecins vétérinaires, comme thème prioritaire, de la pathologie infectieuse transmise par des tiques aux chiens. La standardisation du diagnostic de la Maladie de Lyme pour la pratique vétérinaire et des schémas thérapeutiques. On a consulté 325 références bibliographiques, toutes étant citées dans le texte de la thèse de doctorat. 10