La NADPH oxydase Présentation générale et exemple d étude

Transcription

1 La NADPH oxydase Présentation générale et exemple d étude Biochimie des flavoprotéines Laura Baciou, Tania Bizouarn Florence Lederer Leila Lamanuzzi (Post Doc) Biochimie sous rayonnement ionisant C. Houée Levin Magali Gelinotte (Post Doc) Photobiologie Marie Erard Fabienne Merola Luis Alvarez (Doctorant)

2 Le Stress oxydant Production de «Réactiv Oxygen Species» 1, OH, -, H 2 ou R.O.S. Capacités de défense anti-oxydante Enzymes de protection Enzymes de réparation Capteurs (vitamines, ) Stress Oxydant Désordres cellulaires graves (cibles: protéines, lipides, ADN, ) - Cancer, Maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, Inflammation - Défense contre les agents infectieux / Granulomatose septique chronique

3 La phagocytose Cellule: modèle de neutrophiles (cellules du système immunitaire) Objet phagocyté: levures marquées avec une sonde fluorescente sensible aux ROS pipette

4 La phagocytose Membrane de la cellule 1) Reconnaissance 2) Englobement

5 La phagocytose Membrane de la cellule 3) Les granules contenant les protéines nécessaires à la production des radicaux fusionnent avec le phagosome.

6 La phagocytose Membrane de la cellule ROS 4) Destruction -ROS (OH, -, H 2,, ClO ) - acidification, - enzyme de dégradation -

7 La phagocytose Membrane de la cellule ROS ROS 5) Diffusion des ROS hors du phagosome Destruction des neutrophiles eux-mêmes (kamikaze!) La NADPH oxydase est à l origine de la production des ROS : production de - - conduit à OH, H 2, ClO -

8 La NADPH oxydase : les composants Membrane de la cellule FAD p40 Membrane Cytoplasme GDI Rac GDP

9 Membrane de la cellule La NADPH oxydase : les composants p40 FAD Membrane Cytoplasme GDI Rac GDP - - Activation NADPH NADP + + H + FAD Rac GTP NADPH NADP + + H +

10 La NADPH oxydase : le bilan de la réaction Réduction à 1électron Le substrat: NADPH NADP + + H + oxydation - FAD Rac GTP P NADPH NADP + P NADPH NADP + + H + nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

11 La NADPH oxydase : le bilan de la réaction Réduction à 1électron La chaîne de transfert d électrons: NADPH NADP + + H + oxydation E - - FAD Rac GTP Flavoprotéine! (Fe 3+ ) (Fe 2+ ) FAD FADH 2 NADP + NADPH NADPH NADP + + H + Tania Bizouarn : Site de fixation de NADPH

12 La NADPH oxydase : les outils AU REPOS: In vitro En cellule FAD Membrane de neutrophiles de bœuf Granules ou membrane cellulaire p40 GDI Rac GDP Recombinantes humaines ou bovines Dans le cytoplasme des cellules

13 La NADPH oxydase : in vitro - Rac GTP + Amphiphile Mime une partie des modifications dues à la signalisation FAD Rac GTP NADPH NADP + + H +

14 La NADPH oxydase : en cellule - 1) Signalisation membranaire via les phospholipides FAD Rac P GTP P NADPH NADP + + H + p40 2) Phosphorylation de p40 GDI GDI Rac GDP 3) Echange GDP GTP / activation de Rac

15 La NADPH oxydase : en cellule Sonde fluo pour ROS ROS Outils: Videomicroscopie Imagerie de durée de vie de fluorescence pour l analyse du FRET. Coll Pr. Oliver Nüsse (U757 INSERM, Orsay) FAD Rac GTP CFP Citrine FRET? - Observation de la production des ROS dans le phagosome - Localisation de l assemblage et étude cinétique - Mesure de constantes d association entre sous unités cytosoliques

16 Outils: biologie moléculaire, biochimie, spectro UV-Vis et fluorescence stationnaire, stopped flow, radiolyse La NADPH oxydase : in vitro Rac GTP + Amphiphile - FAD Rac GTP NADPH NADP + + H + Objectifs: - Etablir les constantes d association entre les sous unités - Cinétique et séquence d association et de dissociation des sous unités Acquisition du Stopped Flow

17 La NADPH oxydase : in vitro - FAD Rac GTP NADPH NADP + + H + - Quel est l effet des radicaux libres sur le fonctionnement de l enzyme lui même? Post Doc EDF

18 La NADPH oxydase : in vitro FAD - Exprimer et purifier les sous unités membranaires recombinantes pour les études fonctionnelles et structurales in vitro. Post Doc ANR Jeunes Chercheurs