Analyse in-silico de séquences biologiques

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1 Analyse in-silico de séquences biologiques Carl Herrmann IBDML Université de la Méditerranée année

2 Génomique "traditionnelle" organisme à séquencer séquençage "contigs" assemblage du génome 2

3 Une nouvelle science: la métagénomique 2000: expédition Sorcerer II de C. Venter dans la mer des Sargasses But: 3 prélever des échantillons marins séquencer l'adn présent étudier les diversité des organismes marins expérience renouvelée dans des mines de fer et d'autres environnements

4 Procédé: 1. prélèvement 2. filtrage 3. séquençage par "shotgun" 4. assemblage des fragments génomiques pour obtenir... 4

5 ... ça (1 Giganucléotides d'adn...) >gi gb EN marine metagenome JCVI_SCAF_ genomic scaffold, whole genome shotgun sequence GAAGATGAGGCGCACAAAACGGCCTTTGAAGCGCTGGTTAAAGCGGCTAAAATAAACGGAATTAACGGTC ACCGCGATGTTGGTGGTTACCGTGCATCGATGTACAATGCACTAGGCTTAGACAGTGTTCAGGCGTTAGT GGATTGTATGCAAGAATTAGAAAACACACACGCATGAAAGTATTAGCAAACGACGGAATTTCAGCTTCGG GAATCGCAGCGATAGAGGCTTCAGGGCACGAATTAATCACCACTAAAGTCGCTCAAGAGCAACTGGAAAG CTACATCAACGAACACCAGATTGATGTGGTTTTGGTGCGTTCAGCAACTACGGTGCGCAAGGAATTGATT GATGCATGTCCTTCAATAAAAGGCATCGGTCGCGGTGGCGTAGGTATGGATAATATCGATGTGGCGTATG CGCGTGAGAAAGGCCTCAAGGTATTTAATACGCCTGCAGCGTCTTCAGATTCTGTCGCGGAATTAGTGAT GGGACACATGCGAACGTTGGTACGTTTCTTACACGACTCCAATAGAAACATGCCGCTCGACGGTGATTCA AAATTCGCGTCGTTGAAAAAAGCCTATGCCGGCGGGATGGAATTGCGCGGTAGAACTTTAGGTATTGTTG GATTCGGTCGCATCGGTCAAGCTTTGGCGAAATTGGCTATTGGTGCGGGAATGGAAGTCGTTTTCTCCGA TATGCACAATGATCACATGGATGTGGCATTGGAATTCTTTGACGGTCAATCGTTAAGCTTCACATGTAAG AATGTAGGCTTGGAAAGGCGTGTTGGCACAATCGGATTTCATTTCACTACACGTTCCAGCGGCGATTTGA TTGGCGCAGCGGAAATTGCAAAAATGAAGGACGTGTGTTTTCTTATTAAATGCTGCGCGTGGCGGAGTAA TTAATGAAGAGGCATTGCTTGATGCGCTGGAGAGCGGCAAGGTAGCTGGAGCTGGATTAGATGTCTTCAA GAATGAGCCTACGCCCGCTGTGAAAGTCTTAATGAATGGAAAAGTGAGTCTTACTCCGCACATTGGTGCA GCGACGGGAGAGGCACAAGATCGCATTGGAACTGAATTGGCGTCCCATATTGATGCGCTCGCAGCGAGTC TCTAGACTGTACTTATAACTTTTTGATGAGCCCTGCGGATTCCGCGGGGCTTTTCTTTTTTGATTGTGTA ATTTCACTTCAAGAACCACCAACAGAATAGAGCTATGCTCCGACCTTTCAAAGCGGTACGTCCGACGCGT GATAAAGCGTATTTAGTTGCCACCCGTTCCTATATTACTTACGGGGCGGAAGAGCTAGATGATAAGTTAG AAAATAACCCGTATACCTTCTTGCACGTCATCAATCCAAATGCATTGCCGGAAGCAAATTATAAAGACCG GTTCAAGGCCGTACGCAGCCGCTACGATCGGTTCGAAAAGGAAGACATCTTTATTCAAGAAGCCCAGTCG ACGTATTACCTCTATGAGCAAAAAACACCTTCGGCAACCTATACGGGCGTTATTGGTTTACTTGACGCCG AAAGTGTGGTCAACGGGACAACGCTGCCGCACGAGAAAACAATCGCAAAACGCGAGCATATTTTTGCCCG ATATCTCAGTATCACAGGGTTTCAGGCAGAACCTGTGTTGGTTTTTGGAGAAGCCGATGAGCACTACGAT CGCTTGGTGAATCGAATTAAAGAAGACCGGCCCGAATACGAGTTTTCCTCCACTGATAGGTATTGCCACA AATTATGGGTGGTGCCATCAGAATACGTA quelles questions poser? 5

6 Questions possibles codant/non-codant? 2. si codant: fonction de la protéine? domaines protéiques? histoire évolutive de la protéine (séquences orthologues chez d'autres organismes)? nous allons utiliser des outils "in-silico" pour répondre à ces questions... 6

7 QUESTION 1: la séquence d'adn est-elle codante ou non?? (i.e. contient-elle un gène codant pour une protéine?) 7

8 A quoi reconnait-on un gène? codon d'initiation de la traduction codon stop ACGTCGGATCATGCTTAGCTTAGGCTATGCTTAAATT M L S L G Y A * cadre de lecture ouvert = ORF = "open-reading frame" ATTENTION: un gène contient un ORF, mais un ORF ne correspond pas forcément à un gène!! 8

9 un petit calcul fréquence des nucléotides: A,C,G,T = 0.25 fréquence des ATG = 0.25*0.25*0.25 = on trouve un ATG en moyenne tous les 64 nucléotides codons stop: TGA, TAA, TAG 1 codon sur ~ 21 en moyenne est un codon stop beaucoup de ATG...(stop) dans les séquences d'adn 9

10 la preuve: séquence intergénique de Drosophile (garanti 100% sans gène!) >up FBgn loc= strand= sourcefile=../dmel chr4 r4.3.fasta.masked CCATCCTGAATGTGGTATGTAAATCTAACATTTTTATGCTAAGCCTCCACTTACTTGTATATTATATAGG CTACGTTTCGTAACGATCGAGGTGTATACAAAGAAGCCGAAATTCACAGGTATGTAAAGCATTTAATTTA... comment distinguer les "bons" ORF des "mauvais"? longueur(orf)» 21 codons (~ 60 et plus) 10

11 Recherche d'orf sur le brin direct et reverse complémentaire dans les 3 cadres de lecture taille minimale des ORF: > 60 AA E D E A H K T A F E A L V K A A K I N G K M R R T K R P L K R W L K R L K. T E R. G A Q N G L. S A G. S G. N K R N GAAGATGAGGCGCACAAAACGGCCTTTGAAGCGCTGGTTAAAGCGGCTAAAATAAACGGA CTTCTACTCCGCGTGTTTTGCCGGAAACTTCGCGACCAATTTCGCCGATTTTATTTGCCT F I L R V F R G K F R Q N F R S F Y V S L H P A C F P R Q L A P. L P. F L R F S S A C L V A K S A S T L A A L I F P I 11

12 QUESTION 2: cet ORF est-il codant? si oui, quelle fonction? cet ORF ressemble-t-il à une protéine connue? 12

13 au début sont les alignements... alignements = outils de base de l'analyse bioinformatique permettent de comparer des séquences biologiques 13 nucléiques (ADN,ARN) protéiques différents outils en fonction du type d'alignement (local/global) de la longueur des séquences, etc... alignement contre des banques de données de séquences (séquences nucléiques, protéiques, EST, ARNm,...)

14 pourquoi comparer les séquences? 14 une ressemblance entre séquences peut indiquer: une fonction biologique proche une structure 3D semblable une origine et/ou histoire évolutive commune la comparaison de séquence permet aussi d'assembler des fragments de séquences de mettre en évidence les différences de séquençage entre différents laboratoires

15 comparaison de 2 séquences séquence A W L T E K E G S Y P K L séquence B W L S S S M N N Q V F P Q L exemple d'alignement insertion/deletion W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L identité substitution non-conservative 15 substitution conservative

16 d'autres alignements sont possibles W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L comment décider?? 16

17 évolution des séquences protéiques mutations d'acides aminés certaines mutations plus favorables propriétés physico-chimiques semblables structure 3D conservée insertion/délétion de fragments de séquences iso-formes issues de l'epissage alternatif certains scénarios évolutifs sont plus probables que d'autres 17

18 évaluation d'un alignement score qui dépend nombre et nature des identités nombre et nature des substitutions nombre d'insertion/délétion score global = scores des positions meilleur alignement: score maximum W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L score = s(w,w) +s(l,l) + s(t,s) + s(e,s) s(gap l=2)

19 les paramètres insertion/délétion: 2 paramètres ouverture de gap extension de gap CGATGCAGCAGCAGCATCG CGATGC------AGCATCG CGATGCAGCAGCAGCATCG CG-TG-AGCA-CA--AT-G ouverture de gap extension de gap (13 x 1) (6 x 1) = (13 x 1) - (5 x 10) - (6 x 1) = -43 le caractère non linéaire est plus conforme à la réalité biologique

20 les paramètres ex.: BLOSUM62 identité/substitution: matrices de substitution score pour chaque conservation/substitution 20 obtenu empiriquement à partir des substitutions observées entre séquences

21 influence des paramètres matrice BLOSUM62 W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L matrice PAM250 W L T E K E G S Y P K L W L S S S M N N Q V F P Q L 21

22 Alignement optimal 22 comment trouver l'alignement optimal? énumération de tous les alignements possibles et recherche du score max impossible! (complexité en (2n)!/n²) méthodes "heuristiques" pas de garantie que l'alignement soit optimal (il l'est cependant presque toujours...) énorme gain de rapidité (complexité en O(n²))

23 alignement global/local A B Alignement global Alignement forcé des extrémités A B Alignement local 23 Pénalisation forte des délétions/insertions

24 alignement global A B Alignement global 24 Alignement forcé des extrémités utilisé pour aligner des séquences homologues (gènes, protéines, chromosomes) afin de déterminer les mutations évolutives à la base des alignements multiples (ClustalW,...)

25 alignement local A B Alignement local 25 Pénalisation forte des délétions/insertions utilisé pour identifier des séquences homologues, p.ex. dans les banques de données l'homologie peut être restreinte à une portion de séquence (domaine protéique) algo. le plus répandu: BLAST (blastp, blastn,...)

26 BLAST algorithmes Needelman & Wunsch : trop lents pour aligner une séquence contre des centaines d'autres... BLAST: approche heuristique 26 (Altschul, 1990) avantage : rapide inconvénient: pas forcément la solution optimale... recherche de similarité dans des banques de séquences (GenBank, SwissProt,...)

27 BLAST score 27 (Altschul, 1990) longueur de l'alignement

28 BlastP à la loupe BlastP de la protéine dffa_human de SwissProt contre la banque SwissProt

29 29

30 E-value: combien d'alignement de cette qualité peut-on s'attendre à obtenir de manière aléatoire? 30

31 BLAST (Altschul, 1990) plusieurs versions séquence banque de séquence b la s tn n u c lé iq u e n u c lé iq u e b la s tp p ro té iq u e p ro té iq u e b la s tx n u c lé iq u e p ro té iq u e p ro té iq u e tb la s tn p ro té iq u e n u c lé iq u e p ro té iq u e tb la s tx 31 n u c lé iq u e n u c lé iq u e p ro té iq u e p ro té iq u e permet de détecter des gènes potentiels dans une séquence d'adn

32 Comparer ADN ou peptide?? 73% nucl. id 93% nucl. id A C C G T T A C A T G G T A T A C G G T G A C C T G G T A C A C C G T T A C A T G G T A T A C C G T T A T A T G G T A T T T V V T T 100% AA id 32 W W Y Y T T V V T I W W 80% AA id Conclusion: les mutations dans la séquence d'adn ne sont pas équivalentes: mutations synonymes (ne changent pas l'aa) mutations non-synonymes Y Y

33 Comparer ADN ou peptide?? similarité moyenne entre 2 séquences d'adn de longueur égale: 25% similarité moyenne entre 2 séquences d'aa de longueur égale: 5% Conclusion: il est plus fréquent d'avoir une bonne similarité due au hasard entre 2 séquences d'adn que d'aa Si la séquence d'adn est potentiellement codante (présence d'orf),on compare les séquences d'acides aminés plutôt que les séquences d'adn 33

34 exemple de banques de séquences 34 SwissProt: séquences protéiques (Institut Suisse de Bioinformatique & EBI) 200,000 séquences grande qualité des fiches beaucoup d'informations fonctionnelles nr = non-redundant: compilation de plusieurs banques de données protéiques 3.4 millions de séquences SwissProt Protein Information Ressource (PIR) traduction de séquences nucléiques de GenBank PDB (structurale)

35 QUESTION 3: si la séquence est codante, quelle est la fonction de la protéine? 35

36 BlastP à la loupe... BlastP d'un ORF contre la banque SwissProt les similarités semblent se concentrer dans certaines régions 36

37 Protéines homologues gi sp O70302 CIDA_MOUSE Cell death activator CIDE-A (... gi sp P56198 CIDEC_MOUSE Cell death activator CIDE-3... gi sp O60543 CIDA_HUMAN Cell death activator CIDE-A (... gi sp Q96AQ7 CIDEC_HUMAN Cell death activator CIDE-3... gi sp P10567 MYSP_CAEEL Paramyosin gi sp Q02171 MYSP_ONCVO Paramyosin gi sp Q9NJA9 MYSP_ANISI Paramyosin (Allergen Ani s 2) gi sp Q01202 MYSP_BRUMA Paramyosin gi sp P13392 MYSP_DIRIM Paramyosin e-09 2e-08 3e-08 7e

38 Conclusion 38 Blast semble définir des familles de protéines définies par la possession d'une portion de séquence commune

39 Familles, domaines, motifs etc 39 famille protéique: ensemble de protéines évolutivement reliées; un ou plusieurs domaines protéiques communs domaine protéique: unité structurale (et fonctionnelle) indépendante, évolutivement conservée (doigt de zinc, boucle,...) motifs protéiques: plus courts site de modification post-traductionnelle site de liaison (ADN, métal,...) site actif d'enzyme un domaine contient généralement plusieurs motifs

40 Domaines protéiques 1. Comment caractériser ces régions? 2. Comment rechercher leur présence dans des séquences protéiques? 40

41 Outils d'alignement Blast : homologie «deux à deux» on veut plus!! on veut étudier l'homologie au sein d'une famille au niveau de chaque acide aminé! 41 quels sont les acides aminés conservés? y en a-t-il certains plus conservés que d'autres? quelles sont les substitutions tolérées?

42 Un nouvel outil: ClustalW ClustalW = outil d'alignement multiple alignement global «tous contre tous» alignement global 2 à 2 de toutes les paires de séquences matrices de distance; construction d'un arbre de guidage («guide tree») alignement progressif dans l'ordre phylogénétique (+ proches d'abord)

43 Exemple alignement ClustalW: alignement de séquences homologues 43 E Q = conservatif: AA polaires et chargés F V = semi-conservatif: AA hydrophobes mais V petit

44 protéines liées à l'insuline motif protéique lié à l'insuline IGF1B_HUMAN IGF1_PIG IGF1_CANFA IGF2_HORSE INS_CHIBR INS_ORNAN INS_AOTTR * :. 44 APQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAR APQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAR APQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAR -RSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSERDV -----IVDQCCTSICTLYQLENYCN IVEECCKGVCSMYQLENYCN MQKRGVVDQCCTSICSLYQLQNYCN :*::** * : *: ** conservation parfaite subsitution conservative substitution semi-conservative

45 Le guide du petit protéomiste situation 1 séquence protéique quels sont les motifs contenus dans cette protéine? 45 situation 2 situation 3 séquence protéique motif protéique quelles sont les protéines qui contiennent ce motif? quels sont les motifs contenus dans cette protéine? quelles sont les autres protéines qui contiennent ce(s) motif(s)?

46 InterPro la mère de toutes les banques 46

47 analyse d'une protéine contre InterPro recherche de fiches par mots-clé 47

48 Résultat InterProScan fiche Pfam fiche ProDom 48

49 Fiche InterPro annotation fonctionnelle liée à ce domaine 49

50 Conclusion 1. est ce que la séquence d'adn est potentiellement codante? ORFfinder 2. est ce que cet ORF correspond à une protéine? BLASTP ou BLASTX 3. quelle est la fonction potentielle de la protéine? INTERPROSCAN 50