Clonage Positionnel. Positionnement des gènes de prédisposition dans le génome humain (ou le génome de la souris, modèle d une maladie humaine)

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1 Clonage Positionnel Positionnement des gènes de prédisposition dans le génome humain (ou le génome de la souris, modèle d une maladie humaine)

2 Génétique classique vs Clonage positionnel

3 Positional Cloning Family studies Chromosome interval Segregation and Linkage Analyses Genomic sequences The Human Genome Project Fine Genetic Mapping Candidate genes Disease mutation Met A T G Val G T C Ser T C A Leu C T G Gln C A A Pro C G G Cys T G T A Met T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T * A A C G G T G T Identification of Genes Causing the Disease

4 Clonage Positionnel 1 Données du problème et principe de l approche 2 Les outils moléculaires: marqueurs génétiques 3 Localisation des gènes de prédisposition 4 Conclusions: et l identification des gènes de prédisposition et leurs variants?

5 1 Données du problème et principe de l approche Liaison génétique (Linkage): coségrégation de deux ou plusieurs allèles au cours des générations en raison de la proximité de leur locus sur le génome/sur le même chromosome.

6 1 Données du problème et principe de l approche Taux de recombinaison: proportion de gamètes recombinés sur l ensemble des gamètes transmis par le parent. Le taux de recombinaison est une mesure de distance génétique Centimorgan: unité de distance génétique équivalant à une probabilité de recombinaison de 1% par méiose. Correspond approximativement à 1million de paires de base (1 mégabase)

7 1 Données du problème et principe de l approche Liaison génétique d un marqueur génétique avec un phénotype (trait qualitatif ou quantitatif): coségrégation d allèles du marqueur génétique avec (l allèle de prédisposition à) la maladie au cours des générations (en raison de la proximité de leur locus sur le génome/sur le même chromosome).

8 1 Données du problème et principe de l approche Maladie humaine: de monogénique à multifactorielle Causée par un seul gène Causée par un gène majeur+autres gènes+facteurs environnementaux Causée par quelques gènes+autres gènes+facteurs environnementaux Causée par de nombreux gènes+facteurs environnementaux

9 1 Données du problème et principe de l approche Maladie humaine monogénique (cfpénétrance) Taux de pénétrance: nb de sujets atteints et porteurs de la mutation morbide/nb total de sujets porteurs de la mutation morbide. Pénétrance complète si taux=1

10 1 Données du problème et principe de l approche Maladie humaine monogénique (pénétrance très élevée): Calculs de génétique formelle donnent la fréquence de l allèle délétère Analyses de liaison génétique permettent de localiser le gène (méthode des Lod scores) Analyses de recombinants permettent d affiner cette localisation

11 1 Données du problème et principe de l approche Maladie multifactorielle Facteurs environnementaux X, Y, Z augmentent le risque de développer la maladie N (nb inconnu) gènes inconnus défectueux prédisposent à la maladie Pour chaque gène, plusieurs allèles de prédisposition possibles (nb inconnu), et impact de chaque gène/allèle inconnu Mode héréditaire pour chaque gène/allèle inconnu

12 1 Données du problème et principe de l approche Maladie monogénique ou à 1 gène majeur: PARAMÈTRES calculables Héritabilité et Pénétrance Fréquence de l allèle morbide Mode héréditaire dominant, codominant ou récessif =>Analyses paramétriques de liaison génétique pour localiser le gène

13 1 Données du problème et principe de l approche Maladie multifactorielle: de très nombreux paramètres sont inconnus =>Analyses NONparamétriques de liaison génétique pour localiser le gène sur le génome humain =>Exploiter un modèle animal expérimental où on réduit le nombre d inconnues (contrôle des facteurs environnementaux; réduction de la complexité génétique en utilisant 2 génome parentaux; contrôle des croisements)

14 2 Les outils moléculaires: marqueurs génétiques (homme ou souris) Les marqueurs microsatellites: allèles identifiés par leur taille répartis sur l ensemble du génome Les SNPs: -substitution/délétion-insertion d une seule bp -de nombreuses techniques pour les typer/identifier - répartis sur l ensemble du génome

15 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental De nombreuses similitudes sur les plans génomiques, physiologiques et physiopathologiques entre l homme et la souris Séquence complète des deux génomes De nombreuses lignées consanguines disponibles avec des phénotypes contrastés Des croisements entre 2 lignées ayant des phénotypes différents

16 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental Des croisements entre 2 lignées résistante au neuropaludisme (R) Sensible au neuropaludisme (S) =>obtention des souris F2 =>association entre le génotype des souris F2 et un trait QUALITATIF, le neuropaludisme: => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN SIMPLE X2

17 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental Des croisements entre 2 lignées L une contrôlant bien l infection par P.chabaudi (résistante R) L une contrôlant mal l infection par P.chabaudi (sensible S) =>obtention des souris F2 =>association entre le génotype des souris F2 et un trait QUANTITATIF, la parasitémie => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN SIMPLE t-test ou test de Mann-whitney

18 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental Des croisements entre 2 lignées R et S =>obtention des souris F11, dont le génome est une mosaïque du génome des 2 lignées parentales R et S =>cartographie génétique à haute résolution dans une région d intérêt (repérée sur la base d une analyse de liaison génétique/souris F2)

19 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental Des croisements entre 2 lignées R et S Établissement de lignées congéniques: le génome d une lignée congénique ne diffère du génome parental S qu au niveau d UN SEUL LOCUS (taille de la région jusquà 0,5 cm) =>montre clairement le rôle de gène(s) situé(s) dans la région étudiée.mais l identité du ou des gènes n est pas encore élucidée

20 3 Localisation des gènes de prédisposition La souris, modèle expérimental Démonstration directe du rôle d un gène par ciblage génique (KO) ou transgénèse: Ex: le gène X est-il impliqué dans la résistance à une maladie? KO d un gène chez une souris R Transgénèse du gène (provenant d une souris R) chez une souris S

21 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Une affaire nettement plus complexe. =>est-on convaincu qu il existe une composante génétique? =>si oui, peut-on modéliser cette composante suivant un modèle mendélien (1 gène voire 2 gènes max)? =>si oui (ou si non), quelles sont les méthodes d analyses adéquates de liaison génétique?

22 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladie monogénique ou à un gène majeur Pour chaque famille, calcul de la probabilité d observer les données en supposant un taux de recombinaison theta<0,5 sachant La fréquence de l allèle morbide La pénétrance La fréquence des allèles des marqueurs =>probabilité sous l hypothèse de liaison génétique (theta<0,5 ) en faisant varier theta

23 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladie monogénique ou à un gène majeur Pour chaque famille, calcul de la probabilité d observer les données en supposant un taux de recombinaison theta=0,5 sachant les paramètres suivants: La fréquence de l allèle morbide La pénétrance La fréquence des allèles des marqueurs =>probabilité sous l hypothèse de NON liaison génétique (theta=0,5 ) =>LOD score=log10 P(liaison)/P(non liaison) =>somme des LOD scores de toutes les familles

24 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladie monogénique ou à un gène majeur Calcul du Lod score pour l ensemble des familles en faisant varier theta θ

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26 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladie monogénique ou à gène majeur: de nombreux succès Cystic fibrosis CFTR gene Huntington disease HD gene Alzheimer disease APP Hereditary breast cancer BRCA1 BRCA2

27 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladie monogénique ou à un gène majeur ANALYSES DE LIAISON GÉNÉTIQUES PARAMETRIQUES Puissantes Mais sensibles aux erreurs d estimation des paramètres Biais important sur l estimation du taux theta de recombinaison (ie de la localisation du gène de prédisposition)

28 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladies multifactorielles: de nombreuses inconnues/paramètres =>analyses NONparamétriques de liaison génétique, tq méthodes des paires de germains atteints L idée: si le gène X de prédisposition est proche du marqueur M alors les deux germains partageront plus d allèles que ne le voudrait le hasard /OU/ Deux germains atteints ont des génotypes similaires au locus marqueur M proche du gène de prédisposition

29 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme méthodes des paires de germains atteints (trait qualitatif) Comparaison du nombre d allèles partagés sous l hypothèse de liaison génétique VS l hypothèse de NON liaison génétique (random distribution) =>SI différence significative ALORS il y a liaison génétique entre le marqueur et la maladie (si la différence est significative, il y a association entre un trait=maladie et un excès d allèles partagés)

30 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme méthodes des paires de germains (trait quantitatif) Idée similaire: si le gène X de prédisposition est proche du marqueur M alors deux germains AYANT DES TRAITS SIMILAIRES partageront plus d allèles que ne le voudrait le hasard /OU/ Deux germains AYANT DES TRAITS SIMILAIRES ont des génotypes au locus marqueur M proche du gène de prédisposition X

31 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Une méthode des paires de germains (trait quantitatif):haseman-elston Corrélation du nombre d allèles partagés par les germains avec la différence du trait quantitatif des germains IE Corrélation de la ressemblance génotypique des germains avec leur ressemblance phénotypique

32 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Approche plus résolutive de la localisation: les tests d association allélique en présence de liaison génétique IE Les tests TDT (Transmission Disequilibrium Tests) IE Family-based association tests

33 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Le test historique de Spielman et al Un trio avec au moins un parent hétérozygote pour le marqueur et un enfant atteint Idée:on recherche un allèle donné du marqueur préférentiellement transmis par les parents hétérozygotes aux enfants atteints

34 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Le test historique de Spielman et al Comparaison des allèles transmis aux enfants atteints vs les allèles non transmis aux enfants atteints : McNemar's test avec b nb d allèles M2 transmis et c nb d allèles non transmis (test X2 avec 1df) (b - c) 2 b + c

35 3 Localisation des gènes de prédisposition chez l homme Maladies multifactorielles: quelques ex de succès (linkage+tdt) - diabète - maladie de Crohn - lèpre

36 3 Localisation des gènes de prédisposition: Approche combinée homme-souris Conservation de la synténie entre les génomes de l homme et de la souris: gènes colocalisés chez l homme=>orthologues colocalisés chez la souris Approche combinée/paludisme ch 5q31-q33 homme/ch 11 souris ch 6p21-p23 homme/ch 17 souris (MHC)

37 Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme Human chromosome 5 10 cm Mouse syntenic chromosomal region 5q31-q33 region linked to parasitemia Linked to P. chabaudi resistance Hernandez et al, 2003

38 Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme Human chromosome 5 10 cm Mouse syntenic chromosomal region 5q31-q33 region linked to parasitemia Linked to P. chabaudi resistance Hernandez et al, 2003

39 Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme 6p21-p23 region linked to mild malaria Human chromosome 6 Linked to P.chabaudi resistance Burt et al, 1999 Hernandez et al, 2003 Chromosomes Mouse syntenic chromosomal region

40 La susceptibilité au paludisme est liée à la région MHC chez l homme Flori et al (2003), Hum Mol Genet,12(4): 375 4,5 4 3,5 3 TNF LOD score = 3.86 P= ,5 2 Lod score 1,5 1 0,5 0 MHC class I A C B MHC Class II DR DQ DP 1cM 1 D6S276 TNFb TNF-308, -244, -238 TNFd D6S291

41 La susceptibilité au paludisme est liée à la région MHC chez l homme.et chez la souris Flori et al (2003), Hum Mol Genet,12(4): 375 4,5 4 3,5 3 TNF LOD score = 3.86 P= ,5 2 Lod score 1,5 1 0,5 0 MHC class I A C B MHC Class II DR DQ DP 1cM 1 D6S276 TNFb TNF-308, -244, -238 TNFd D6S291 Bloc synténique lié au paludisme de la souris

42 La susceptibilité au paludisme est liée à la région MHC chez l homme.et chez la souris Hypothèse: TNF impliqué c/l homme et la souris Analyses TDT du gène TNF chez l homme: association de plusieurs polymorphismes avec le paludisme Souris KO pour le TNF montre le rôle du TNF dans le modèle expérimental du paludisme

43 A la recherche des Gènes de Prédisposition Des souris et des hommes Localisation des gènes/souris Analyse du transcriptome homme et souris Ciblage génique souris Localisation de gènes de prédisposition sur le génome (10-20cM) Localisation fine de gènes de prédisposition sur le génome (1-5cM) Identification de gènes et variants associés Identification de gènes et variants impliqués Analyse de liaison Déséquilibre de liaison/tdt Étude de gènes candidats Étude fonctionnelle in vitro

44 4 Conclusions: Maladies monogéniques: approche génétique très efficace Maladies multifactorielles: approche génétique efficace pour la localisation plus délicate pour l identification des gènes de prédisposition Critères pour le choix des gènes candidats? Par ex, surexpression d un gène chez les sujets susceptibles