COURS BIOLOGIE CELLULAIRE M1. CANCER du FOIE. Angela SUTTON Université Paris 13 UFR SMBH
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- Lucile Morin
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1 COURS BIOLOGIE CELLULAIRE M1 PREDISPOSITIONS GENETIQUES au CANCER du FOIE Angela SUTTON g Université Paris 13 UFR SMBH
2 BIOCHIMIE DES ERO O 2 oxygène e - RNH 2 NOS Réaction d Haber-Weiss O 2.- anion superoxyde. NO monoxyde d azote OH. radical hydroxyle H 2 O 2 SOD ON. OO - peroxynitrite R. H 2 O 2 H + O 2 ROO. radical peroxyl peroxyde d hydrogène ON. OOH Fe 2+, Réaction de Fenton Cu 2+. NO 2 OH. radical hydroxyle
3 Génération des ERO par le fer Fe 2+ + O Fe O 2 (Réaction d Haber-Weiss) Fe 2+ + O H + Fe 3+ + H 2 O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH - + OH. (Réaction de Fenton)
4 SYSTEMES ANTIOXYDANTS CELLULAIRES Substances liposolubles Substances hydrosolubles Vitamine E β-carotène Ubiquinol-10 Bilirubine Flavonoïdes Vitamine C Glutathion Urates Protéines (ferritine, céruloplasmine, etc) Vitamine A CAR + LOO. LOO-CAR. LOO-CAR. + LOO. LOO-CAR-OOL
5 D après Alain Favier. Le stress oxydant. L actualité chimique (nov-dec 2003)
6 Espèces réactives de l oxygène Protéines Lipides ADN Oxydation... Péroxydation Bases modifiées : bases hydroxylées lipidique... (8-OH guanine...), Simples et doubles cassures de l ADN, Modification des sucres et des protéines de l ADN. Altérations des transports ioniques Systèmes enzymatiques... Altération Membranaire... Altération de l expression des gènes... ATTEINTE CELLULAIRE
7 Espèces réactives de l oxygène Réponse cellulaire Activation de facteurs de transcription Induction de gènes de réponse au stress oxydant Anti-oxydants Enzymes de Réparation de l ADN Enzymes de Réparation des lipides Protéases, cytokines, protéines de choc thermique... Prolifération cellulaire abérrante Apoptose Nécrose Adaptation au Stress oxydant
8 MISE EN EVIDENCE des ERO PAR FLUORIMETRIE Dihydroéthidine : réagit avec l anion superoxyde pour former de l éthidium λ excitation = 480 nm λ émission = 600 nm Dichlorofluorescéine diacétate : désestérifié par les estérases cellulaires. Réagit avec le peroxyde d hydrogène λ excitation = 488 nm λ émission = 525 nm Dosage au fluorimètre ou au cytomètre de flux
9 PAR LUMINESCENCE Réaction avec un système luminol Dosage au luminomètre
10 ATTEINTES OXYDATIVES DE L ADN Il existe des lésions oxydatives dans l'adn comme la conversion de la guanine en 8-hydroxyguanine (8-oxoguanine ou oxog) ce qui peut entraîner une incorporation d'adénine face à l'oxog. Mise en évidence : Utilisation d anticorps anti-marqueurs des dommages de l'oxydation de l'adn/arn ladn/arn (ABCYS) Cet anticorps reconnaît le deoxyguanosine 8-hydroxy-2 (OH8dG), le hydroxyguanine 8 (OH8G), et le hydroxyguanosine 8 (OH8G). Applications en Immunohistochimie et en ELISA
11 Immuno-marquage au 8-OHdG Stress oxydant intra-hépatique, marqueur du risque de CHC Tanaka et al, Br J Cancer 2008
12 MECANISME DE LA PEROXYDATION LIPIDIQUE -H R H R (diènes conjugués) Phase d initiation : arrachement d un H Réarrangement intramoléculaire Espèce radicalaire comportant des doubles liaisons conjuguées (diènes conjugués). + O 2 ROO OO + RH OOH ROOH + R Phase de propagation : Réaction entre diènes conjugués et oxygène moléculaire conduisant à la formation d un radical lipoperoxyle (ROO ) et d un nouveau radical R. ROO + R R + R ROOR RR Phase de terminaison : R réagit avec H ou avec un autre R pour former un dérivé stable RH ou RR.
13 HHE PEROXYDATION LIPIDIQU UE CON TROLES CONTROLES + FER VHC VHC + FER HNE 45% DE CHC vs 0% DANS LES AUTRES GROUPES PROLIFERATION
14 Mouse liver and kidney sections stained with rabbit anti-dnp antibody at 1:100 dilution and developed by 3,3 - diaminobenzidine (DAB). Specimens were incubated with (DNPH(+)) or without (DNPH(-)) DNPH solution. Protein carbonyls are detected only in DNPH-treated specimen and not detected at all in untreated specimen. Courtesy of Dr. Akihito Ishigami, Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology
15 Métabolisme de l alcool Voie constitutive (cytoplasmique) Oxydation spontanée ADH NAD + NADH, H + ETHANOL CH 3 CH 2 OH Voie inductible (microsomale) spontanée NADPH + O 2 + H + CH. 3 CH2 OH radical hd hydroxyéthyl éhl CYP 2E1, NADPH CYP réductase + OH. NADP + + H 2 O CH 3. CH2 OH radical hydroxyéthyl O 2 H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 Voie mineure (peroxysomale) catalase CH 3 CHO acétaldéhyde CH 3 CHO acétaldéhyde Réaction de Fenton, SOD, GPx, catalase CH 3 CHO acétaldéhyde CH 3 CHO acétaldéhyde ALDH CH 3 COO - acétate NAD + NADH, H + Chaîne respiratoire XO / AO CH 3 COO - acétate O 2
16 Mitochondrie et lésions hépatiques alcooliques ALCOOL Métabolisme ERO NADH+H + - ADH - ALDH - CYP 2E1 ERO Altérations oxydatives des molécules Lésions cellulaires Apoptose ou nécrose Lésions hépatiques
17 Système antioxydant mitochondrial H 2 O 2 CAT H2 O O 2 - H 2 O 2 GPx1 H 2 O e- MnSOD MPO ClO - Fe 2+ CR OH MnSOD: Superoxyde Dismutase à Manganèse GPx1: Glutathion Peroxydase 1 MPO: Myéloperoxydase CAT: Catalase
18 Alcool et enzymes antioxydantes mitochondriales ALCOOL O 2. - H2 O 2 H 2 O MnSOD GPx 1 OH. Fe 2+, Cu 2+ Toxicité cellulaire
19 TOXICITE HEPATIQUE DE L ALCOOL Foie normal ALCOOL Maladies alcooliques du foie BUT DES ETUDES Facteurs génétiques? -Stress oxydant -Métabolisme du fer Cirrhose Carcinome hépatocellulaire
20 Carcinome hépatocellulaire
21 Cirrhose = état pré-cancéreux TRAITEMENT CURATEUR «Petit CHC» DEPISTAGE «Gros CHC»
22 Dimorphisme génétique Ala/Val ALCOOL O 2.- H 2 O 2 H 2 O MnSOD Fe 2+, Cu 2+ OH. GPx1
23 Dimorphisme génétique Ala/Val de la MnSOD Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité MnSOD C/T Ala/Val Ala/Ala Val/Val Ala/Val Ala >>> Val ARN x Protéine Alanine Valine Structure Hélice α Feuillet β MEILLEUR IMPORT MITOCHONDRIAL ACTIVITE ENZYMATIQUE ACCRUE Sutton et al, Pharmacogenetics 2003 Sutton et al, Pharmacogenetics and Genomics, 2005
24 CONSEQUENCES FONCTIONNELLES du DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD Ala-MnSOD Val-MnSOD Ribosome attaché ARNm ARNm dégradé Protéine d ancrage Protéasome Ala-MnSOD (hélice α) Protéine d ancrage Protéasome Val-MnSOD (feuillet β) SUTTON A, KHOURY H, PRIP-BUUS C, CEPANEC C, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics, 2003, 13: SUTTON A*, IMBERT A*, IGOUDJIL A, ALBANO V, CAZANAVE S, PESSAYRE D, DEGOUL F. Pharmacogenetics and Genomics. 2005, 15:
25 ADN PCR RFLP 2 ml sang non coagulé + Ficoll (EDTA) sérum Membrane centrifugation lymphocytes Membrane Globules rouges Récupération et lavage des lymphocytes ADN ARN
26
27
28 Extraction automatisée d ADN
29 PCR
30 RFLP
31
32 PCR en temps réel Principe de la PCR Amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel. A chaque cycle d amplification, la quantité d ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l émission est directement proportionnelle à la quantité d amplicons produits. Cinétique de la réaction et donc la quantification n de l ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale.
33 Homozygotes Allèle 1 Hétérozygotes Allèle 1 / Allèle 2 Homozygotes Allèle 2
34 Différents degrés de lésions hépatiques Foie sain ALCOOL Stéatoses (SMa, SMi) Cirrhose Altération du métabolisme des acides gras Peroxydation lipidique Inflammation Fibrose Carcinome hépatocellulaire Sélection clonale Prolifération cellulaire
35 LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de MALADIES ALCOOLIQUES DU FOIE SMa = stéatose macrovacuolaire (n=10) Smi = stéatose microvésiculaire (n=28) * HA = hépatite alcoolique aiguë (n=12) 69% C = cirrhose (n=13) Contrôles (n=79) * 43% * 58% 19% 17% % Ala/Ala * : p < 0.05 Contrôles SMa SMi HA C DEGOUL F, SUTTON A, MANSOURI A, CEPANEC C, DEGOTT C, FROMENTY B, BEAUGRAND M, VALLA D, PESSAYRE D. Gastroenterology, 2001, 120 :
36 Foie sain Cirrhose Cancer = Carcinome hépatocellulaire
37 LE DIMORPHISME GENETIQUE Ala/Val de la MnSOD MODULE le RISQUE de CHC Val/Val Ala/Val Ala/Ala p Distribution n (%) 40 (25%) 83 (51%) 39 (24%) Age (ans) NS Sexe Masculin (%) NS Alcool (g/j) NS Child-Pugh (score) 7,8 8,1 8,3 NS Sevrage (%) NS 1.00 n=264 patients cirrhose alcoolique Patient ts sans CHC p = Val/Val (n=40) Ala/Val (n=83) Ala/Ala (n=39) (mois) NAHON P*, SUTTON A*, PESSAYRE D, RUFAT P, DEGOUL F, GANNE-CARRIE N, ZIOL M, CHARNAUX N, N KONTCHOU G, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Clinical Gastroenterology Hepatology, 2005 ; 3 :
38 Dimorphisme génétique Ala/Val Dimorphisme génétique Pro/Leu ALCOOL O 2.- H 2 O 2 H 2 O MnSOD OH. Fe 2+, Cu 2+ GPx1
39 Dimorphisme Pro/Leu de la GPx1 Chromosome Nucléotides AA Génotypes Activité GPx C/T Pro/Leu Pro/Pro Leu/Leu Pro/Leu Pro >>> Leu ARN x Protéine Proline Leucine ALTERATION STRUCTURE LIAISON AU SELENIUM ACTIVITE REDUITE
40 Association des dimorphismes de la MnSOD et de la GPx1 MnSOD «Ala» = Ala/Ala + Ala/Val Forte activité MnSOD GPx «Leu» = Leu/Leu + Pro/Leu Faible activité GPx H H Faible activité MnSOD Forte activité GPx1 Forte activité MnSOD Faible activité GPx1 2 Val-MnSOD 2 Pro-GPx1 2 Val-MnSOD 1 ou 2 Leu-GPx1 1 ou 2 Ala-MnSOD 2 Pro-GPx1 1 ou 2 Ala-MnSOD 1 ou 2 Leu-GPx1
41 Influence des polymorphismes génétiques MnSOD / GPx1 183 malades ayant une cirrhose alcoolique histologiquement gq prouvée, inclus au moment du diagnostic de cirrhose Détermination des génotypes MnSOD, GPx1 et HFE Recueil rétrospectif - Données cliniques et para-cliniques : sévérité de la maladie hépatique - Détermination de la teneur en fer intra-hépatique sur la première biopsie prouvant la cirrhose Recueil prospectif Recueil prospectif - Incidence du CHC - Délai de survenue du CHC
42 2Val-MnSOD/ 2Pro-GPx1 2Val-MnSOD/ 1ou2Leu-GPx1 1ou2Ala-MnSOD/ 2Pro-GPx1 1ou2Ala-MnSOD/ 1ou2Leu-GPx1 P Distribution [N (%)] 24 (14) 22 (12) 67 (36) 70 (38) Age (ans) 53,2 51,1 53,4 54,4 NS Sexe masculin (%) Child-Pugh (score) NS 8,4 7,5 8,0 7,8 NS Alcool (g/j) NS Sevrage (%) NS Caractéristiques initiales des 183 malades
43 Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC n=162 patients cirrhotiques Cirrhose sans CHC Cirrhose avec CHC % MnSOD Val/Val Val/Val «Ala» «Ala» GPx1 Pro/Pro «Leu» Pro/Pro «Leu» n
44 Dimorphismes MnSOD / GPx1 et risque de CHC 2Val-MnSOD 2Pro-GPx1 H 2 O 2 Malades sans CH HC Ala -MnSOD Leu -GPx1 2Val-MnSOD Leu -GPx1 Ala -MnSOD Pro -GPx1 Mois P = 0,0002 H 2 O 2
45 L ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 module le risque de CHC n=162 patients cirrhose alcoolique ans CHC Patients s HR = 2,000 IC = 1,311 3,052 p = 0, Ala -MnSOD Leu -GPx1 (n=64) Ala -MnSOD Pro -GPx1 (n=58) 2Val-MnSOD 2Pro-GPx1 (n=22) 2Val-MnSOD Leu -GPx1 Mois (n=14) H 2 O 2 H 2 O 2 SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:
46 Variant Ala-MnSOD Variant Leu-GPx1 ALCOOL O 2.- H 2 O 2 H 2 O MnSOD OH. Fe 2+, Cu 2+ GPx1
47 O 2.- H 2 O 2 H 2 O MnSOD Fe 2+ OH. GPx1
48 LE FER HEPATIQUE ACCROIT le RISQUE de DEVELOPPER un CHC n=162 patients cirrhose alcoolique Patients san ns CHC Sans fer hépatique (n=89) Avec fer hépatique (n=73) HR = 3,404 IC = 1,702 6,811 p = 0,0002 Mois SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:
49 L ASSOCIATION des DIMORPHISMES de la MnSOD et de la GPx1 MODULE LE TAUX DE FER HEPATIQUE 1ère biopsie hépatique Coloration de Perls Fer 60 50% 53% n=162 patients * * cirrhose alcoolique % 28% 0 2Val-MnSOD 2Pro-GPx1 2Val-MnSOD Leu -GPx1 Ala -MnSOD Pro -GPx1 Ala -MnSOD Leu -GPx1 n=22 (14%) n=18 (12%) n=58 (35%) n=64 (39%) * :p< SUTTON A*, NAHON P*, PESSAYRE D, RUFAT P, POIRE A, ZIOL M, VIDAUD D, BARGET N, GANNE-CARRIE N, CHARNAUX N, TRINCHET JC, GATTEGNO L, BEAUGRAND M. Cancer Research, 2006, 66:
50 LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l ACCUMULATION CELLULAIRE de FER Patients cirrhose alcoolique (n=162) Val/Val-MnSOD Ala/Val-MnSOD Ala/Ala-MnSOD (n=40) (n=83) (n=39) x 400 Cellules d hépatome humain (Huh7) transfectées Plasmide vide Val-MnSOD Ala-MnSOD x 400 NAHON P, CHARNAUX N, FRIAND V, PROST-SQUARCIONI C, ZIOL M, BARGET N, LIEVRE N, TRINCHET JC, BEAUGRAND M, GATTEGNO L, PESSAYRE D, SUTTON A. Free Radical Biology Medicine, en révision, 2008.
51 LE DIMORPHISME Ala/Val de la MnSOD MODULE l ACCUMULATION CELLULAIRE de FER Plasmide vide VlM Val-MnSOD 300 * Ala-MnSOD x6600 x6000 Ala-MnSOD Total iron (ng/µg of protein) 200 x Plasmide vide Val-MnSOD Ala-MnSOD x21000 Microscopie électronique x28500 Dosage colorimétrique * : p < 0.05
52 Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS l HOMEOSTASIE MARTIALE? FER ENTREE Hepcidine HEPATOCYTE TfR 1 TfR 2 STOCKAGE FER FONCTIONNEL Cytosolique Mitochondrial Frataxine Ferritine cytosolique Ferritine mt
53 Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l EXPRESSION DE GENES IMPLIQUES DANS l HOMEOSTASIE MARTIALE? RT-PCR semi-quantitative MnSOD
54 Le DIMORPHISME Ala/Val-MnSOD MODULE-T-IL l EXPRESSION DE PROTEINES IMPLIQUEES DANS l HOMEOSTASIE MARTIALE? Western-blot MnSOD Immunocytochimie X 400
55 FER ENTREE Hepcidine TRANSFECTION MnSOD TfR 1 TfR 2 HEPATOCYTE STOCKAGE FER FONCTIONNEL Cytosolique Mitochondrial i Frataxine Ferritine cytosolique Ferritine mt
56 Effets des dimorphismes sur l activité des enzymes antioxydantes mitochondriales ALCOOL O 2.- H 2 O 2 H 2 O MnSOD GPx Fe 2+, Cu 2+ Ala-MnSOD OH. Leu-GPx
57 TRAITEMENTS ANTI-OXYDANTS ET PREVENTION DU CHC
58 SYSTEMES ANTIOXYDANTS CELLULAIRES EC-SOD NADH, H+ ou GSH NAD+ ou GSSG CELLULE Bile XH X. a tocophéryl quinone Ascorbate Déhydroascorbate NADPH NADP + Vit E GSSG H + Vit E. GSH GR GSH GSSG O.- 2 CuZnSOD H 2 O 2 GPx H 2 O catalase I coenzyme Q10 O 2 O.- MnSOD 2 H 2 O 2 Fe 2+, Cu 2+ OH. GPx e - V IV H 2 O + GSSG GSH GR mélatonine II CR III MITOCHONDRIE CR : chaîne respiratoire mitochondriale, CuZnSOD et MnSOD : superoxydes dismutases à cuivre/zinc ou à manganèse, GPx : glutathion peroxydase, GR : glutathion réductase, GSH : glutathion réduit, GSSG : glutathion oxydé
59 STRATEGIES ANTIOXYDANTES ENVISAGEES N-Acétyl Cystéine : précurseur du glutathion (utilisé en routine dans le cadre des hépatites fulminantes d origine médicamenteuse) Augmenter les pools cytosolique et mitochondrial de GSH Accroître l activité enzymatique de la GPx Sélénium Accroître l activité enzymatique de la GPx Deferroxamine Chélateur du fer
60 Essais de prévention primaire Pas d effet CV Etude Linxian (1994) Population carencée Doses nutritionelles BC, Vit E, selenium CANCERS Etude ATBC (1994) Fumeurs «Hautes doses» BC, Vit E CANCERS Etude CARET (1996) Fumeurs «Hautes doses» BC, Vit A CANCERS Etude PHS (1996) Médecins «Hautes doses» BC, aspirine i PAS D EFFET Etude Women s health (1999) Population générale «Hautes doses» BC, aspirine PAS D EFFET Etude Women s health (2005) Population générale «Hautes doses» Vit E PAS D EFFET Etude SUVIMAX (2005) Population générale «Doses nutritionelles» BC, Vit E, selenium CANCERS
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