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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE : Santé, Sciences, Technologies INSERM U618 : Protéases et Vectorisation Pulmonaires Equipe 3 : Aérosols et Cancer Bronchopulmonaire THÈSE présentée par : Guillaume GAUD Soutenue le : 11 Février 2009 Pour obtenir le grade de : Docteur de l Université François - Rabelais Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé Impact de l expression d un inhibiteur de protéases à sérine, le TFPI-2, sur le microenvironnement tumoral pulmonaire THÈSE dirigée par : Mme Pascale Reverdiau Co-encadrement par : Mlle Sophie Iochmann RAPPORTEURS : Mme Valérie Trichet Mr Vincent Lagente Professeur, Université François Rabelais de Tours Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours Maître de conférences, Université de Nantes Professeur, Université de Rennes JURY : Mr Philipe Birembaut Mr Francis Gauthier Mlle Sophie Iochmann Mr Vincent Lagente Mme Pascale Reverdiau Mme Valérie Trichet Professeur, Université de Reims Professeur, Université François Rabelais de Tours Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours Professeur, Université de Rennes Professeur, Université François Rabelais de Tours Maître de conférences, Université de Nantes

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3 REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé au sein de l unité INSERM U618 dirigée par le Professeur Francis GAUTHIER et ce doctorat a pu être effectué grâce au soutien financier de la Région Centre. J exprime mes sincères remerciements au Professeur Yves Gruel pour m avoir accueilli au sein de son équipe Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Professeur Pascale REVERDIAU et au Docteur Sophie IOCHMANN pour avoir encadré mes premiers pas dans la recherche. Votre rigueur, votre curiosité scientifique et votre esprit critique m ont beaucoup appris. Je tiens à vous remercier tout particulièrement pour votre disponibilité lors de ces longs mois de rédaction où vous avez été présentes à chaque étape pour me diriger dans cet exercice. J adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury : - le Professeur Francis GAUTHIER qui m a accueilli dans l unité U618 et a accepté de faire partie de mon jury, - le Professeur Vincent LAGENTE et le Docteur Valérie TRICHET qui me font l honneur d être les rapporteurs de ma thèse, - le Professeur Philippe BIREMBAUT qui a accepté de juger cette thèse. Merci à l équipe d enseignants en Biochimie qui m a guidé lors de mes trois années de monitorat : Les Professeurs Francis Gauthier et Fréderic ESNARD, Les Docteurs Fabien LECAILLE, Michelle FERRER, Sylvie ATTUCCI et Lydie NADAL-DESEBARATS les Docteurs Emanuel GODAT et Marina SHKRELI. Merci aux étudiants de la promotion : Kevin «Keuvin» BARANGER, l homme à qui il ne faut pas laisser une raquette entre les mains ; Alexandre «gromoute» GAUTHIER, l homme qui a inventé le poker ; et à Agnès «bouclettes» MAILLET, la femme qui murmurait à l oreille des souris nude. Merci également à Florian «flo» VEILLARD, le seul homme au monde capable de manger son poids en saucisson. Merci également à Nathalie HEUZE-VOURC H pour ses conseils scientifiques et sa bonne humeur perpétuelle. Par contre, je ne te remercie pas pour tes revers dévastateurs au squash... Un grand merci au Docteur Benjamin BRILLET, à Stéphanie PETIOT et à Pierre LAPAQUETTE pour leur participation à ce travail. 3

4 Merci aux «nouveaux» arrivants : Gwen, Clément, Annabelle, Noémie ; et à tous les membres de l unité 618. Un immense merci à tous mes amis tourangeaux : Anne-Marie, Redot, Marina, Yo, Caro, Flo, Julien, Greg, Amandine, Valérie ; et aux autres amis éparpillés dans le pays et de part le monde : Aurelien, Romain, Clem, Aurelie, Zabou, Matthieu, Tonio, Martin, Yann, Mad, oingh, Mat et les autres. Merci pour votre présence, votre humour et les vacances et week-end passés ensemble. Merci à Julien Fauvel, complice pendant toutes mes années universitaires et sans qui je n en serais peut être pas arrivé là. Un grand merci à toute ma famille et particulièrement à mes parents, mon frère, Matthieu, et ma belle sœur, Cécile. Votre patience et votre soutien inconditionnel ont été primordial dans l accomplissement de ce travail. Un grand merci à Catherine et Jonathan TOWNER pour les bons moments passés ensemble et ceux à venir. Un remerciement particulier à Anne ETIENNE et Luis RODRIGUEZ, pour leur soutien et leur chaleur. Enfin mes derniers mots vont vers ma complice depuis tant d années, Marianne. Tu es certainement la plus méritante pour avoir réussi à me supporter quotidiennement pendant ces trois années et particulièrement pendant ces derniers mois de rédaction. Une page se tourne et nous en écrirons de nouvelles, ensemble, à l étranger 4

5 RESUME La progression tumorale est un processus multi-étapes dépendant notamment des interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma environnant. Le développement du cancer broncho-pulmonaire, première cause de mortalité par cancer chez l'homme, implique ainsi le dialogue entre les cellules tumorales et les cellules fibroblastiques, composant cellulaire prépondérant du microenvironnement pulmonaire. Pour former ces métastases à distance de la tumeur primitive, les cellules tumorales pulmonaires vont franchir de nombreuses barrières cellulaires et matricielles, notamment grâce à la plasmine et à des métalloprotéases (MMP). Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2), maintenant considéré comme un gène suppresseur de tumeur, est un inhibiteur de la plasmine qui peut limiter la génération de MMP et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales. Le laboratoire avait préalablement montré qu une diminution de l expression de cet inhibiteur de protéases, associée à une hyperméthylation de son promoteur, était fréquemment observée dans les stades les plus avancés de cancer broncho-pulmonaire. Cependant les conséquences de cette répression transcriptionnelle du TFPI-2 dans le microenvironnement tumoral pulmonaire restent encore mal connues. Dans le but d étudier ces mécanismes, une stratégie d ARN interférence basée sur des micro RNA (mirna) a été développée afin d inactiver stablement et de façon spécifique le TFPI-2. Deux clones cellulaires pour lesquels l inactivation du transcrit du TFPI-2 était supérieure à 90% ont été sélectionnés (mirna-1b et 2b). Avec les clones cellulaires mirna-1b et -2b, un pourcentage de migration et d invasion 2 à 3 fois supérieur a été observé par rapport au clone mirna-nég. Ces résultats sont associés à une plus grande adhérence des cellules aux différentes protéines de la matrice extracellulaire et notamment à la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l expression des MMP-1 et 3. Deux modèles de coculture, mettant en jeu des fibroblastes pulmonaires sains (CCD- 19-Lu) et les clones de cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2 ont été développés. Ainsi en cocultures directes qui impliquent des contacts entre les deux types cellulaires et permettent l étude de signaux membranaires, une augmentation des MMP-3, -7 et 13 a été observée avec les cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2. En présence de milieux conditionnés, sources de formes protéiques solubles produites par les cellules tumorales, une potentialisation de l expression transcriptionnelle et protéique des MMP-1, -3, -7 a également été montrée lorsque l expression du TFPI-2 par les cellules tumorales a été inhibée. Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes impliqués dans le remodelage de la MEC et pourrait jouer un rôle inhibiteur de la protéolyse péricellulaire notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales. Mots clés : cancer, microenvironnement, TFPI-2, MMP, ARN interférence, mirna 5

6 RÉSUMÉ EN ANGLAIS Tumour progression is a complex multistep process that depends on an evolving crosstalk between cancer cells and the surrounding stromal tissue. The invasion process involves extracellular matrix (ECM)-degrading proteases, including matrix metalloproteinases (MMPs) that have been shown to be highly expressed and activated in the tumour microenvironment. TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor-2), an inhibitor of serine proteinases, particularly plasmin, can indirectly regulate the activation of MMPs, thus regulating ECM degradation and tumour cell invasion. In agreement with these studies, we have demonstrated that decreased TFPI-2 gene expression and hypermethylation are frequently associated with advanced stages of non-small cell lung cancer (NSCLC), particularly with lymph node invasion. The consequences of TFPI-2 downregulation on MMP expression by both tumoral and stromal cells remain unclear and could play a key role in controlling tumour invasion by modifying the balance between ECM degrading proteases and their inhibitors in the microenvironment. Here, we showed that TFPI-2 transcripts can be significantly decreased in the NCI- H460 human non-small cell lung cancer cell line using the artificial microrna technology. Consistent with the mrna degradation, we observed a strong decrease of TFPI-2 protein by both Western blotting and immunofluorescence assay, in two of the produced clones, named NCI-H460 mirna-1b and NCI-H460 mirna-2b. Our results demonstrated that TFPI-2 silencing was associated with a 2 and 3-fold increase in invasive ability through basement membrane components, for clones NCI-H460 mirna-1b and -2 respectively. Our experiments showed that down-regulation of TFPI-2 significantly increased the relative attachment of mirna clone cells towards extracellular matrix proteins, particularly for laminin and collagen IV. Moreover, the invasive behaviour of NCI-H460 cells silenced for TFPI-2 was associated with increased MMP-1 and MMP 3 expression. In direct coculture, allowing cell-cell contact, an increase in MMP-3, -7 and -13 transcriptional expression was observed when CCD19-Lu cells were cocultured with NCI- H460 clones inhibited for TFPI-2. In indirect coculture, allowing contact between fibroblasts and NCI-H460 clones conditioned media, an increase in MMP-1, -3 and -7 expression was measured, for both transcript and protein, when CCD19-Lu were cocultured with NCI-H460 mirna-1b and -2b conditioned medium. This study has demonstrated that TFPI-2 can influence ECM remodelling-associated genes and then act as a pericellular proteolysis inhibitor, particularly at the tumour-stroma interface. Key words : cancer, microenvironment, TFPI-2, MMPs, ARN interference, mirna. 6

7 SOMMAIRE Remerciements 3 Résumé 5 Résumé en anglais 6 Sommaire 7 Liste des tableaux 15 Liste des figures 16 Liste des annexes 19 Abbréviations 20 Introduction générale 23 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 24 CHAPITRE 1 : LES DIFFERENTS CONSTITUANTS DU MICROENVIRONNEMENT TUMORAL A- LES CELLULES DU MICROENVIRONNEMENT TUMORAL 25 I- Les cellules tumorales 25 I-1. Caractéristiques générales de la cellule tumorale 25 I-2. Les théories de «l expansion clonale» et des «cellules souches tumorales» 26 I-3. Les cellules tumorales pulmonaires 28 I-3.1. Origine des cellules tumorales pulmonaires 28 I-3.2. Tabac et cancer broncho-pulmonaire 29 I-3.3. Les cancers broncho-pulmonaires 30 I Classification des cancers broncho-pulmonaires 30 I Les différents types histologiques de cancers broncho-pulmonaires 31 II Les cellules fibroblastiques 33 II-1. Origine et caractéristiques des cellules fibroblastiques 33 II-2. Les cellules fibroblastiques associées à la tumeur 33 III Les cellules vasculaires 34 III-1. La vascularisation de la tumeur 34 III-2. Les cellules endothéliales 35 III-2.1. Les cellules endothéliales des vaisseaux pulmonaires sains 35 III-2.2. Les cellules endothéliales des néo-vaisseaux 36 III-3. Les péricytes 37 IV Les cellules de l inflammation et de l immunité 37 IV-1. Les macrophages 38 IV-2. Les cellules dendritiques 40 IV-3. Les polynucléaires neutrophiles 41 7

8 IV-4. Les lymphocytes 41 IV-5. Les autres cellules 42 B- LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ET LA MEMBRANE BASALE 42 I Les principales protéines de MEC pulmonaire 42 I-1. Le collagène 43 I-2. La fibronectine 43 I-3. L élastine 44 I-4. Les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes 44 I-5. La vitronectine 44 II- La membrane basale 45 II-1. Les laminines 46 II-2. Le collagène de type IV 46 II-3. Entactine et perlecan 46 III Les modifications de la MB et la MEC dans la tumeur 47 III-1. Remodelage de la MB dans les tissus tumoraux 47 III-2. Remodelage de la MEC dans les tissus tumoraux 47 C- LES PRINCIPALES PROTEASES DU STROMA TUMORAL 48 I - Les protéases à sérine 49 I-1. Le système de la plasmine 50 I-1.1. Activation du plasminogène en plasmine 50 I-1.2. Fonctions de la plasmine 51 I-1.3. Régulation de la plasmine 51 I Par les serpines 51 I Par le TFPI-2 52 I-2. Les kallicréines tissulaires 60 I-2.1. Localisation génomique 60 I-2.2. Expression tissulaire et cellulaire des kallicréines 60 I-2.3. Kallicréines tissulaires et cellules cancéreuses 60 I-2.4. Structure des kallicréines tissulaires 61 I-2.5. Rôle physiologique des kallicréines tissulaires 62 I-2.6. Régulation de l activité des kallicréines 63 I-3. L élastase leucocytaire, la protéase 3 et la cathepsine G 63 I-3.1. Origine cellulaire 63 I-3.2. Fonctions biologiques 63 I-3.3. Protéases des polynucléaires neutrophiles et des cellules cancéreuses 64 I-3.4. Régulation des protéases des polynucléaires neutrophiles 64 II Les cathepsines à cystéine 65 II-1. Caractéristiques générales et localisation cellulaire des cathepsines à cystéine 65 II-2. Cathepsines à cystéine et cellules cancéreuses 66 II-3. Structure et activation des cathepsines à cystéine 68 8

9 II-4. Fonctions des cathepsines à cystéine 68 II-5. Inhibition de l activité des cathepsines à cystéine 69 III Les protéases acides 69 III-1. Localisation génomique et expression cellulaire de la cathepsine D 69 III-2. Cathepsines D et cellules cancéreuses 69 III-3. Structure de la cathepsine D 70 III-4. Rôle physiologique de la cathepsine D 70 III-5. Régulation de l activité de la cathepsine D 70 IV - Les métalloprotéases matricielles 70 IV-1. Structure et classification des MMP 70 IV-1.1. Les collagénases 72 IV-1.2. Les gélatinases 74 IV-1.3. Les stromélysines 74 IV-1.4. Les matrilysines 75 IV-1.5. Les MMP membranaires 75 IV-1.6. MMP hétérogènes 76 IV-1.7. Substrats des MMP 76 IV-2. Origine cellulaire des MMP 77 IV-3. Régulation des MMP 78 IV-3.1. Régulation transcriptionnelle des MMP 78 IV-3.2. Stabilité des ARNm 80 IV-3.3. Activation des zymogènes en forme active 80 IV-3.4. Activation des MMP au sein du microenvironnement 82 IV-3.5. Inactivation des MMP 83 IV Les TIMP 84 IV RECK 85 IV Inhibiteurs majorant la clairance des MMP 85 CHAPITRE 2 : REGULATION DU TFPI-2 ET DES METALLOPROTEASES DU MICROENVIRONNEMENT : IMPACT SUR LES DIFFERENTES ETAPES DU DEVELOPPEMENT TUMORAL A- INITIATION ET PROLIFERATION CLONALE 88 I Altérations génétiques et épigénétiques 88 I-1. Altérations de l information génétique dans le cancer 88 I-1.1. Altérations génétiques dans les cellules tumorales 88 I-1.2. Microenvironnement et altérations génétiques 89 I-2. Modifications épigénétiques dans le cancer 91 I-2.1. Méthylation de l ADN et déacetylation des histones 91 I-2.2. Un variant d épissage du TFPI-2 93 I-2.3. Régulation par microrna endogènes 93 9

10 II Modifications du cycle cellulaire et immortalité des cellules tumorales 93 II-1. Les deux voies d activation de l apoptose 94 II-2. Le TFPI-2, un facteur pro-apoptotique 95 III-3. Les métalloprotéases, des facteurs anti-apoptotiques 96 B-ANGIOGENESE TUMORALE 97 I Les mécanismes de l angiogenèse 98 II- Les protéases activatrice de l angiogenèse 99 II-1. MMP et angiogenèse 99 II-2. Cathepsines, kallicréines et angiogenèse 100 III- Les inhibiteurs de l angiogenèse 101 III-1. Les métalloprotéases peuvent exercer une action anti-angiogénique 101 III-2. Les protéases peuvent générer des peptides à activité anti-angiogéniques 101 III-3. Activité anti-angiogénique du TFPI C- INVASION TUMORALE 102 I- Les différents modes de migration cellulaire 102 II La transition épithélio-mésenchymateuse 104 II-1. Les facteurs stimulant la TEM 104 II-2. Caractéristiques générales de la TEM 106 III- Les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement stimulent l invasion tumorale 107 III-1. Les modifications structurelles de la MEC influencent l invasion cellulaire 107 III-2. Les matricryptines stimulent l invasion tumorale via l induction de l expression de MMP par le stroma tumoral 108 III-3. Les interactions entre les cellules du stroma tumoral stimulent l expression de MMP et le potentiel invasif des cellules tumorales 110 III-3.1 Surexpression des MMP par les fibroblastes du stroma 110 III-3.2. Surexpression des MMP par les cellules de l inflammation 110 III-3.3. Implication de l EMMPRIN dans les interactions entre les cellules du stroma et l invasion tumorale 111 IV- Le TFPI-2 inhibe l invasion tumorale 111 D- DISSEMINATION METASTATIQUE 112 I Passage des cellules tumorales dans le système vasculaire : l intravasation 114 II Mécanismes de résistance des cellules tumorales dans le sang 115 III Adhérence à la paroi luminale et extravasion 116 IV Ciblage des foyers secondaires 118 V La colonisation et l adaptation au nouveau microenvironnement 119 V-1. La dormance tumorale 120 V-2. La formation de niches pré-métastatiques 121 VI-TFPI-2, MMP et foyers métastatiques

11 MATERIELS ET METHODES 124 A-PRODUCTION D UNE LIGNEE CELLULAIRE TUMORALE PULMONAIRE STABLEMENT INHIBEE POUR LE TFPI-2 PAR ARN INTERFERENCE 124 I- Génération d un oligonucléotide double brins codant les pré-mirna 124 I-1. Séquences des oligonucléotides simple brins codant les pré-mirna 124 I-2. Hybridation des oligonucléotides 125 II- Construction des plasmides pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miRNA recombinants 126 II-1. Ligature dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR 126 II-2. Transformation des bactéries compétentes 127 II-3. Préparation d ADN plasmidique 128 II-4. Digestion enzymatique d ADN 128 II-5. Electrophorèse de l ADN 129 II-6. Séquençage d ADN 129 III- Obtention des clones cellulaires exprimant les mirna 130 III-1-Lignée cellulaire tumorale pulmonaire utilisée 130 III-2. Transfection des cellules 131 III-3. Contrôle de l inactivation du TFPI III-3.1 Retro-transcription et PCR quantitative 132 III Extraction des ARN messagers (ARNm) et transcription inverse 132 III Etude de l expression génique par PCR quantitative 133 III-3.2 Immuno-empreinte 134 III Extraction des protéines de la matrice extracellulaire 134 III Dosage des protéines 135 III Immuno-empreinte 135 III-3.3 Immunofluorescence 136 B- CARACTERISATION DES CELLULES TUMORALES PULMONAIRES INACTIVEES POUR LE TFPI I - Migration et invasion cellulaire in vitro 137 II- Prolifération cellulaire 139 III- Mesure de l adhérence des cellules aux protéines de la matrice extracellulaire 139 IV- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN 141 IV-1. Mise au point de la PCR en temps réel spécifique à la MMP IV-1.1. Mise au point de la gamme d étalonnage 142 IV PCR quantitative spécifique de la MMP IV-2. Quantification des transcrits des MMP et de l EMMPRIN 142 IV-3. Quantification de l expression protéique des MMP-1, -3 et IV-3.1. Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte 143 IV Extraction et dosage des protéines cytoplasmiques 143 IV Obtention des protéines secrétées 144 IV Immuno-empreinte

12 IV-3.2 Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence 145 IV-4. Activité gélatinolytique des MMP-2 et C- Interactions entre les cellules tumorales, exprimant ou non le TFPI-2, et les fibroblastes 147 I- Fibroblastes pulmonaires 147 II- Cocultures entre les cellules tumorales et les fibroblastes 147 II-1. Cocultures directes 148 II-2. Cocultures indirectes 148 II-2.1. Obtention des milieux conditionnés de cellules tumorales 148 II-2.2. Contact du milieu conditionné de cellules tumorales NCI-H460 avec des cellules 149 CCD19-Lu III- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN 149 III-1. Quantification des transcrits 149 III-2. Expression protéique des MMP-1, -3 et -7 en coculture indirecte 149 III-2.1. Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte 149 III-2.2. Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence 149 RESULTATS ET DISCUSSION CHAPITRE I : OBTENTION DES CLONES CELLULAIRES STABLEMENT INACTIVES POUR LE TFPI I- L ARN interférence 151 I-1. Les différentes techniques d ARN interférence 151 I-2. Mode d action des mirna 153 I-3. Séquences du TFPI-2 ciblées par les mirna 154 II- Clonage des séquences codant les pré-mirna dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR 155 II-1. Plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR 155 II-2. Hybridation des oligonucléotides 155 II-3. Ligature des séquences codant les mirna dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miR et clonage dans les bactéries stbl3 156 II-4. Séquençage des plasmides recombinants 157 III- Obtention des cellules NCI-H460 exprimant les mirna 157 III-1. Efficacité de la transfection 158 III-2. Sélection et amplification des clones NCI-H460 exprimant les mirna 158 III-3. Evaluation de l inactivation du TFPI III-3.1 Transcrit du TFPI III-3.2. Protéine TFPI III Détection du TFPI-2 par immuno-empreinte 161 III Détection du TFPI-2 par immunofluorescence 162 IV- Conclusions

13 CHAPITRE II : IMPACT DE L INACTIVATION DU TFPI-2 SUR LES CELLULES TUMORALES PULMONAIRES NCI-H460 I-Impact de l inactivation du TFPI-2 sur les potentiels invasif et migratoire 164 des cellules tumorales H460 II-Impact de l inactivation du TFPI-2 sur la prolifération des cellules tumorales NCI-H III-Impact de l inactivation du TFPI-2 sur l adhérence des cellules NCI-H460 aux protéines 169 de la MEC IV- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN par les cellules tumorales 172 NCI-H460 inactivées pour le TFPI-2 IV-1. Quantification de l expression transcriptionnelle des MMP par PCR en temps réel 172 IV-1.1 Mise au point de la PCR en temps réel spécifique de la MMP IV-1.2. Expression transcriptionnelle des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN 176 dans les clones cellulaires NCI-H460 IV-2. Expression protéique des MMP-1, -2,-3, -7 et -9 par les clones cellulaires NCI-H IV-2.1. Activité gélatinolytique des MMP-2 et -9 des clones cellulaires NCI-H IV-2.2. Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence 179 IV-3.3. Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte 181 V- Conclusions 183 CHAPITRE III : IMPACT DE L INACTIVATION DU TFPI-2 AU SEIN DU MICROENVIRONNEMENT TUMORAL 185 I-Interactions directes entre les cellules tumorales NCI-H460 et des fibroblastes sains du stroma, 185 les cellules CCD19-Lu I-1. Mise au point du modèle de coculture directe 185 I-1.1 Influence des ratios NCI-H460 : CCD19-Lu sur l expression des MMP-1 et MMP I-1.2 Influence du temps de contact entre les cellules NCI-H460 et CCD19-Lu en coculture sur l expression des transcrits MMP-1 et MMP I-2. Influence de l inactivation du TFPI-2 sur l expression des transcrits MMP et EMMPRIN lors de cocultures directes 189 I-2.1. Gènes dont l expression n a pas été significativement modifiée par les interactions directescellules tumorales/fibroblastes 190 I-2.2. Gènes dont l expression a été significativement modifiée par les interactions directes cellules tumorales/fibroblastes 193 II- Interactions indirectes entre les surnageants de cellules tumorales NCI-H460 et des fibroblastes sains du stroma 196 II-1. Mise au point du modèle de coculture indirecte 196 II-1.1 Effet de la concentration du milieu conditionné de cellules tumorales sur les fibroblastes 197 II-1.2. Effet du temps de conditionnement du milieu des cellules tumorales sur les fibroblastes 198 II-1.3. Effet de la congélation du milieu conditionné de cellules tumorales sur les fibroblastes

14 II-2. Impact du milieu conditionné de cellules NCI-H460 exprimant ou non du TFPI-2 sur l expression de MMP par les fibroblastes 201 II-2.1. Expression des transcrits non significativement modifiée lors des cocultures indirectes. 201 II-2.2. Expression des transcrits significativement modifiés lors des cocultures indirecte 203 II-2.3. Expression protéique des gènes significativement modifiés lors de cocultures indirectes. 204 II Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence 204 II Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte 206 V-Conclusion 207 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 209 BIBLIOGRAPHIE 219 ANNEXES 14

15 LISTE DES TABLEAUX Tableau I : Expression tissulaire et fonctions des cathepsines à cystéine humaines 67 Tableau II : Caractéristiques et principaux substrats des MMP 73 Tableau III : Modifications cellulaires associées à la transition épithélio-mésenchymateuse 106 Tableau IV : Effet de la surexpression ou de l inhibition de différentes MMP dans la cellule tumorale sur la formation de métastases 123 Tableau V : Séquences sens et anti-sens des oligonucléotides codant les pré-mirna-1 et -2 ciblant le TFPI Tableau VI : Séquences des amorces utilisées pour la PCR quantitative en temps réel spécifiques du TFPI-2 et de la β-actine 134 Tableau VII : Séquences des amorces utilisées pour la PCR quantitative en temps réel spécifiques des MMP et de l EMMPRIN 143 Tableau VIII : Anticorps primaires et secondaires utilisés pour détecter les MMP-1 et -3 par immuno-empreinte 144 Tableau IX : Anticorps primaires et secondaires utilisés pour la détéction des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence

16 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Les différents types cellulaires composant le microenvironnement tumoral 24 Figure 2 : Théorie de l expansion clonale et des cellules souches 28 Figure 3 : Changements dynamiques des fibroblastes lors de la progression tumorale 33 Figure 4 : Principaux récepteurs de la famille des intégrines 35 Figure 5 : Interactions entre les TAM et la tumeur 39 Figure 6 : La membrane basale 46 Figure 7 : Mode d action des protéases de mammifères 49 Figure 8 : Le système de la plasmine 51 Figure 9 : Région promotrice du gène du TFPI-2 55 Figure 10 : Structure protéique du TFPI-2 56 Figure 11 : Interactions entre le domaine K1 du TFPI-2 et la plasmine 58 Figure 12 : Structure tridimensionnelle de la proklk6 62 Figure 13 : Classification structurale des MMP sécrétées et membranaires 71 Figure 14 : Origine cellulaire des MMP dans le cancer du sein 77 Figure 15 : Mécanismes d activation de la pro-mmp-2 par le complexe MT-1-MMP/ TIMP-2 à la surface cellulaire 81 Figure 16 : Structure de l EMMPRIN 83 Figure 17 : Les inhibiteurs directs des MMP 84 Figure 18 : Principales étapes de la progression tumorale 87 Figure 19 : Les différents types d altérations épigénétiques 92 Figure 20 : Les deux voies d activation de l apoptose 95 Figure 21 : Différents modèles d invasion des cellules tumorales 103 Figure 22 : Régulation de la TEM par le microenvironnement 105 Figure 23 : Organisation du réseau d actine associé aux intégrines 107 Figure 24 : Formation des métastases 114 Figure 25 : RhoC coopère avec le VEGF pour favoriser l intravasation cellulaire 115 Figure 26 : L étape d extravasation 117 Figure 27 : Séquence de l ADNC du TFPI Figure 28 : Carte du plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen) 127 Figure 29 : Système d invasion/migration basé sur le modèle de la chambre de Boyden 138 Figure 30 : Principe d activation des MMP pendant la zymographie. 141 Figure 31 : Mode d action des mirna 154 Figure 32 : Hybridation des oligonucléotides double brins codant pour les mirna ciblant le TFPI Figure 33 : Digestion par l enzyme Bgl II de deux plasmides codant chacun un des deux mirna 157 Figure 34 : Expression de la GFP par les cellules NCI-H460 exprimant le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miRNA-1 48 h après la transfection 158 Figure 35 : Expression de la GFP par le clone NCI-H460 mirna-1b

17 Figure 36 : Pourcentages d inhibition du TFPI-2 dans les clones cellulaires inhibés pour le TFPI-2 et le clone contrôle 160 Figure 37 : Immunodétection du TFPI-2 exprimé dans la MEC extraites des clones cellulaires exprimant les différents mirna 161 Figure 38 : Détection par immunofluorescence de l expression du TFPI-2 dans les clones NCI-H460 exprimant les différents mirna 162 Figure 39 : Migration et invasion des cellules HT Figure 40 : Effet de l inactivation du TFPI-2 sur les potentiels invasif et migratoire des cellules NCI-H Figure 41 : Mise au point du test MTS 168 Figure 42 : Impact de l inactivation du TFPI-2 sur la prolifération des cellules NCI-H Figure 43 : Effet de l inactivation du TFPI-2 sur l adhérence des cellules NCI-H Figure 44 : Détection de l expression de la MMP-7 dans différentes lignées cellulaires par PCR 173 Figure 45 : Courbes de fluorescence en fonction du nombre de cycles 174 Figure 46 : Gamme d étalonnage pour la quantification des transcrits de la MMP Figure 47 : Courbes de fusion des produits de PCR obtenus à partir de la gamme d étalonnage de MMP Figure 48 : Impact de l inactivation du TFPI-2 sur l expression des MMP et de l EMMPRIN par les cellules NCI-H Figure 49 : Activité gélatinolytique des MMP-2 et MMP-9 par zymographie des surnageants de culture des clones cellulaires exprimant les différents mirna 178 Figure 50 : Visualisation par immunofluorescence de l expression des MMP-1, -3 et -7 dans les cellules NCI-H460 exprimant les mirna-1b, mirna-2b ou mirna-nég. 180 Figure 51 : Détection des MMP-1 et MMP-3 par immuno-empreinte sur des extraits cytoplasmiques des clones cellulaires exprimant les différents mirna 181 Figure 52 : Modèle de coculture directe 186 Figure 53 : Effet des différents ratios de cellules NCI-H460/CCD19-Lu en coculture sur l expression transcriptionnelle des MMP-1 et MMP Figure 54 : Effet des différents temps de contact entre les cellules NCI-H460/CCD19-Lu en coculture sur l expression transcriptionnelle des MMP-1 et MMP Figure 55 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales sur leurs interactions directes avec des fibroblastes pulmonaires sains 191 Figure 56 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales sur leurs interactions directes avec des fibroblastes pulmonaires sains 193 Figure 57 : Effet de la concentration du milieu conditionné de cellules tumorales sur l expression transcriptionnelle des MMP-1 et MMP-3 par les fibroblastes pulmonaires 197 Figure 58 : Effet du temps de concentration du milieu conditionné des cellules tumorales sur l expression transcriptionnelle des MMP-1 et MMP-3 par les fibroblastes pulmonaires 199 Figure 59 : Effet de la congélation du milieu conditionné de cellules tumorales sur l expression transcriptionnelle des MMP-1 et MMP-3 par les fibroblastes pulmonaires

18 Figure 60 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales lors de cocultures indirectes sur l expression transcriptionnelle des MMP-2, -9, -13, 14 et de l EMMPRIN par des fibroblastes pulmonaires 202 Figure 61 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales lors de cocultures indirectes sur l expression transcriptionnelle des MMP-1, -3 et -7 par des fibroblastes pulmonaires 203 Figure 62 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales lors de cocultures indirectes sur l expression des MMP-1, -3 et -7 par des fibroblastes pulmonaires sains, détectée par immunofluorescence 205 Figure 63 : Impact de l inhibition du TFPI-2 dans les cellules tumorales lors de cocultures indirectes sur l expression cytoplasmique des MMP-1, -3 et -7 par des fibroblastes pulmonaires sains, détectée par immuno-empreinte

19 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 : Modulation of cellular response to stable RNA silencing of tissue factor pathway inhibitor-2 in lung cancer cells. G. Gaud, S. Iochmann, B. Brillet, S. Petiot, C. Blechet, N. Heuze-Vourc h, Y. Gruel, P. Reverdiau. (Soumis dans BMC Biology) Annexe 2 : Transient RNA silencing of Tissue Factor Pathway Inhibitor-2 modulates lung cancer cell invasion. Iochmann S, Bléchet C, Chabot V, Saulnier A, Amini A, Gaud G, Gruel Y, Reverdiau P. (En révision dans Clinical Experimental Metastasis) Annexe 3 : Inhibition of cervical cancer cells growth by packaging HPV oncoprotein shrnas into HPV virus-like particles. Bousarghin L, Touzé A, Gaud G, Iochmann S, Alvarez A, Reverdiau P, Gaitan J, P.Sizaret, Coursaget P. (Accepté dans Molecular Cancer Therapeutics) 19

20 ABBREVIATIONS α2m : α2 macroglobuline α2-ap : α 2-AntiPlasmine α1-pi : α1-proteinase Inhibitor-Carboxyterminal αsma : α-smooth Muscle Actin 3 UTR : 3 UnTranslated Region ADAM : A Disintegrin And Metalloprotease domain ADAM-TS : A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type I motif Ang-1, -2 : angiopoetin-1, -2 AP-1 : Activator Protein-1 APK/JNK : Stress-Activated Protein Kinase/Jun N-terminal Kinase astfpi-2 : aberrantly-spliced TFPI-2 BCA : bicinchoninic Acide BET : Bromure d EThidium bfgf : basic Fibroblast Growth Factor BK : bradykinine BPTI: Bovine pancreatic trypsin inhibitor BSA : Bovin Serum Albumin CAF : Cancer Associated Fibroblast CBD : Collagen Binding Domain CBPNPC : Cancer Broncho-Pulmonaire Non à Petites Cellules CBPPC : Cancer Broncho-Pulmonaire à Petites Cellules CD : Cellules Dendritiques CG : cathepsine G CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité CMV : CytoMegaloVirus CpG : Dinucléotide CG Ct : Threshold Cycle CTGF : Connective Tissue Growth Factor CTL : Cytotoxic T Lymphocyte DAPI : 4',6' DiAmidino-2-Phényl Indole ddntp : didesoxynucleotidetriphosphate dntp : desoxynucleotidetriphosphate DR : Death Receptor EDP : Elastine Derived Peptides EDTA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid EGF : Epithelial Growth Factor EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor EmGFP : Emerald Green Fluorescent Protein EMMPRIN : Extracellular Matrix MetalloProteinase Inducer EPC : Endothelial Precursor Cell ERK : Extracellular signal-regulated protein Kinase FGF : Fibroblast Growth Factor FN : Fibronectine GAG : GlycosAminoGlycannes GATA : GATA binding protein GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor GPI : GlycosylPhosphatidylInositol GST : Gene Suprresseur de Tumeur 20

21 HER : Human Epidermal growth factor Receptor HB-EGF : Heparin Binding-Epidermal Growth Factor HGF : Hepatocyte Growth Factor HIF-1α: Hypoxia-Inducible Factor-1α HLA-DR : Human Leucocyte Antigen-D Related HNE : Human Leucocyte Elastase HPV : Human PapillomaVirus H-ras : Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog IFN : InterFéroN ICAM : InterCellular Adhesion Molecule IGF : Insulin Growth Factor IGFBP : Insulin Growth Factor Binding Protein 3 IL : Interleukines IRF 1 : Interferon Regulatory Factor 1 JAM : unctional Adhesion Molecules K1, K2, K3 : Domaine Kunitz 1, 2, 3 KDR : Kinase Domain containing Receptor Ki : constante d inhibition KLK : kallicréine K-ras : Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog LAM : leucémie aigue myéloblastique LDL : Low Density Lipoprotein LDLR: Low-Density Lipoprotein Receptor LRP : Low density lipoprotein Receptor-related Protein LYF1 : LYmphoid transcription Factor 1 MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MB : Membrane Basale MEC : Matrice ExtraCellulaire MeCP : MEthyl CpG binding Protein mirna : microrna MMP : Matrix MetalloProteinase MNEI : Monocyte / Neutrophil Elastase Inhibitor MSPI : Matrix-associated Serine Protease Inhibitor MT-MMP : Membrane-Type Matrix Metalloproteinase MyoD : Myogenic Differentiation NCAM : Neural Cell Adhesion Molecule NF-1 : Nuclear Factor-1 NF-Y : Nuclear transcription Factor-Y NF-κB : Nuclear Factor κb NK : Natural Killer N-myc : Neuroblastoma-dervived MYeloCytomatsis oncogene NOD-SCID : Nonobese diabetic-severe combined immune deficiency N-ras : Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog OMS : Organisation Mondiale de la Santé PAI : Plasminogen Activator Inhibitor PAR : Protease Activated Receptor PDGF : Platelet Derived Growth Factor PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PEA-3 : Polyomavirus Enhancer A binding protein-3 PKC : Protein Kinase C 21

22 PMA : Phorbol 12-Myristate 13-Acetate PNN : polynucléaires neutrophiles PP5 : Placental Protein 5 PR3 : PRoteinase 3 pro-hb-egf : pro-heparin Binding-Epidermal Growth Factor RANKL : Receptor Activator of Nuclear factor Kappa beta Ligand RASSF1A : RAS association Family 1A RB : RetinoBlastoma RECK : REversion inducing Cysteine Rich protein with Kazal motif RNAi : RNA interference ROS : Reactive Oxygen Species rtfpi-2 : recombinant TFPI-2 SCC : Squamous Cell Carcinoma SCF : Stem Cell Factor SCID : Severe Combined ImmunoDeficiency SDF-1 : Stromal cell-derived Factor-1 SDS : Sodium Dodecyl Sulfate shrna : short hairpin RNA sirna : small interfering RNA SLPI : Secretory Leukocyte Protease Inhibitor SMC : Smooth Muscle Cell SPARC : Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein TADC: Tumor-Associated Dendritic Cells TAE : Tris-Acetate-EDTA TAM : Tumour-Associated Macrophages TEM : Transition Epithelio-Mesenchymateuse TEMED : NNN N tetramethylethylene diamine TFPI-2 : Tissue Factor Pathway Inhibitor-2 TGF-β : Transforming Growth Factor-β THSP : ThromboSPondines TIMP : Tissue Inhibitor of MetalloProteinase TKR : Tyrosine Kinase Receptor TNF-α : Tumour Necrosis Factor-α TNM : Tumor Node Metastasis t-pa : tissue Plasminogen Activator TRAIL : Tumor necrosis factor-related Apoptosis-Inducing Ligand upa : urokinase-type Plasminogen Activator upar : urokinase-type Plasminogen Activator Receptor VEGFR : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor VE-Caderin : Vascular Endothelial Cadherin VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor UDG : Uracile DNA Glycolase 22

23 Introduction générale Le cancer broncho-pulmonaire, première cause de mortalité par cancer chez l'homme et en constante progression chez la femme, est un problème majeur de santé publique. En France chaque année, environ nouveaux cas sont diagnostiqués et décès sont recensés (Institut de Veille Sanitaire, 02/08). Ce grand nombre de décès est lié au diagnostic souvent tardif de ce cancer lorsque l exérèse chirurgicale des tumeurs est impossible en raison des métastases déjà présentes. Bien que le traitement chirurgical reste encore à l heure actuelle le plus efficace, le taux de rechute est cependant très élevé, proche de 50%, et la survie à 5 ans tous stades confondus, reste inférieure à 10%. Afin d améliorer l espérance de vie des patients, l enjeu est donc de développer des thérapies innovantes du cancer bronchopulmonaire de par leurs cibles, leurs mécanismes d action et leurs voies d administration. Dans le cadre de cette recherche de nouvelles thérapies ciblées, les inhibiteurs de protéases et notamment le TFPI-2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor 2) pourraient, en association d autres traitements anticancéreux, limiter efficacement la progression de la tumeur primitive et le développement des métastases. Le TFPI-2, maintenant considéré comme un gène suppresseur de tumeur, peut en effet inhiber la plasmine et réguler la génération de métalloprotéases actives, réduisant ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales pulmonaires. L équipe 3 de l U618 a récemment démontré qu une diminution de l expression du TFPI-2, associée à une hyperméthylation du promoteur, était fréquemment observée dans les stades les plus avancés de cancers broncho-pulmonaires et que l inactivation transitoire du TFPI-2 par ARN interférence favorisait l invasion tumorale. L objectif de mon travail de thèse s est focalisé sur l étude de l impact de l inactivation stable du TFPI-2 dans une lignée de cellules tumorales pulmonaires au sein du microenvironnement tumoral. Il est en effet maintenant clair qu un dialogue s établit entre les cellules cancéreuses et les fibroblastes du microenvironnement. Ces interactions peuvent avoir un effet «bénéfique» sur le développement de la tumeur, et il est donc indispensable de comprendre les mécanismes impliqués afin de cibler le microenvironnement tumoral. Cette étude s est déroulée en trois étapes avec 1. L obtention d une lignée de cellules tumorales pulmonaires stablement et spécifiquement inactivée pour le TFPI-2 à l aide d une stratégie d ARN interférence (mirna). 2. L étude de l impact de cette inactivation du TFPI-2 sur les fonctions des cellules tumorales et notamment la prolifération, l adhérence, la migration et l invasion cellulaires ainsi que sur le profil d expression des principales métalloprotéases. 3. L étude in vitro des interactions entre les cellules tumorales et les fibroblastes du microenvironnement à l aide de modèles de cocultures et évaluer l impact de l inactivation du TFPI-2 sur l expression des métalloprotéases par les fibroblastes. 23

24 Introduction bilbiographique-chapitre 1 - CHAPITRE 1 - LES DIFFERENTS CONSTITUANTS DU MICROENVIRONNEMENT TUMORAL Une tumeur maligne est un ensemble complexe composé d une population hétérogène de cellules qui dialoguent entre elles et qui interagissent également avec les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) et différentes molécules solubles de leur environnement. Les différents types cellulaires du microenvironnement tumoral peuvent être classés en quatre grands groupes, les cellules cancéreuses porteuses d anomalies génétiques, les cellules constitutives du tissu de soutien, les cellules de l inflammation et de l immunité et les cellules vasculaires (figure 1). Les interactions entre ces différents types cellulaires et le microenvironnement vont contribuer à accélérer la transformation néoplasique et soutenir l invasion tumorale puis la dissémination métastatique, responsable de 90% des décès liés à des cancers issus d une tumeur solide, dont le cancer broncho-pulmonaire (Gupta et al., 2006). Cellule endothéliale Membrane basale Matrice extracellulaire Cellule tumorale Péricyte Lymphocyte Neutrophile Macrophage Mastocyte Fibroblaste Figure 1 : Les différents types cellulaires composant le microenvironnement tumoral (D après Weinberg, 2007). 24

25 Introduction bilbiographique-chapitre 1 A- LES CELLULES DU MICROENVIRONNMENT TUMORAL I Les cellules tumorales I-1. Caractéristiques générales de la cellule tumorale Le développement d une tumeur maligne, à partir d une cellule normale, s étend généralement sur une période considérable de la vie, pouvant aller jusqu à plusieurs décennies. Une période d au moins vingt ans est en général observée entre le début de la consommation de tabac et l âge auquel le cancer du poumon est le plus souvent diagnostiqué. En effet, de multiples étapes et de nombreux facteurs sont nécessaires pour faire évoluer une cellule normale en cellule cancéreuse (Hanahan & Weinberg, 2000). Cette dernière va alors acquérir les principales caractéristiques suivantes : - L autosuffisance vis-à-vis de la production de signaux induisant la croissance cellulaire avec, par exemple, l activation de l oncogène K-ras. La tumeur peut alors croître en absence de stimulus extérieur. - L insensibilité aux signaux anti-prolifératifs avec la perte d expression des gènes suppresseurs de tumeur (GST) et notamment le gène du Rétinoblastome (RB) et p16. Les cellules tumorales sont alors capables de se multiplier indéfiniment. - L aptitude à échapper aux mécanismes induisant l apoptose avec la répression, par exemple, du GST p53. - L immortalité cellulaire avec un échappement à la sénescence liée à une activité télomérase. - La capacité à induire l angiogenèse. - L aptitude à l invasion des tissus adjacents et à la formation de métastases. - L échappement à la surveillance immunitaire. Ce phénotype cancéreux est progressivement acquis par les cellules au fil de nombreuses altérations génétiques accumulées aléatoirement tout au long de la progression tumorale. Toutes ces mutations acquises par les cellules cancéreuses finissent par donner naissance à une tumeur hétérogène constituée de cellules ne possédant pas toutes le même phénotype et donc les mêmes capacités à soutenir la progression tumorale et la dissémination métastatique. Il a en effet été montré que les cellules possédant un haut pouvoir métastatique présentaient significativement plus de mutations que celles ne pouvant pas former de métastases bien qu elles soient pourtant toutes issues de la même tumeur (Fidler, 2003). Il est donc indispensable de comprendre les mécanismes entraînant ces mutations, aussi bien au 25

26 Introduction bilbiographique-chapitre 1 cœur de la tumeur que dans son microenvironnement. Cependant là où réside le débat actuel est sur la nature même de la cellule cancéreuse primitive. I-2. Les théories de «l expansion clonale» et des «cellules souches tumorales» Deux concepts ont été proposés pour expliquer l hétérogénéité des tumeurs et décrire les cellules à l origine de la tumeur primitive (figure 2). Le plus ancien de ces concepts, celui de «l expansion clonale», soutient que la tumeur est issue d une cellule somatique différenciée qui a accumulé de multiples mutations génétiques ou épigénétiques lui conférant un potentiel prolifératif illimité. Les cellules filles issues de cette cellule mère pourraient à leur tour subir de nombreux remaniements génétiques au fil des générations. Par analogie avec le darwinisme pour l évolution des espèces, la sélection naturelle favoriserait les cellules les plus adaptées et les plus agressives (Merlo et al., 2006). Parmi elles, certaines seraient plus invasives et d autres, par exemple, plus résistantes à l apoptose (Campbell & Polyak, 2007). La composante environnementale serait également essentielle, les cellules interagissant entre elles ou avec d autres facteurs du microenvironnement. Une grande partie des cellules tumorales serait donc capable de soutenir la progression tumorale et la guérison du patient dépendrait de la destruction totale de la tumeur. La deuxième théorie est celle des «cellules souches tumorales» et suggère que la tumeur primitive ait pour origine un petit nombre de cellules souches transformées favorisant la progression tumorale. Les cellules souches saines ont en effet la capacité soit de s autorenouveler, permettant ainsi de maintenir une réserve de cellules indifférenciées au sein d un tissu tout au long de l existence de l hôte, soit de se différencier pour maintenir des clones cellulaires fonctionnels au sein d un tissu. Ces mécanismes doivent être strictement régulés pour assurer un équilibre entre les cellules souches indifférenciées et les cellules différenciées (Al-Hajj et al., 2004). Certains scientifiques supposent que certaines cellules souches peuvent subir des modifications génétiques ou épigénétiques altérant leur capacité à s auto-réguler mais gardant leur capacité à s auto-renouveler ou à se différencier. A chaque division, une nouvelle cellule souche cancéreuse pourrait naître et ainsi servir de «racine» à la tumeur. Des cellules qui proliféreront et se différencieront pour donner des cellules cancéreuses au phénotype variable formeront l essentiel de la tumeur. Selon cette théorie, seules ces cellules seront détruites lors du traitement anticancéreux, laissant les cellules souches cancéreuses intactes et éventuellement capables de reconstituer une tumeur (Al-Hajj et al., 2004 ; Wicha et al., 2006). Les premières preuves scientifiques étayant cette théorie ont été amenées par une 26

27 Introduction bilbiographique-chapitre 1 série d études montrant qu à partir d un échantillon de moelle osseuse issue d un sujet atteint de leucémie aigue myéloblastique (LAM), seule une cellule tumorale sur 10 4 à 10 7, implantées chez des souris NOD-SCID (Nonobese diabetic-severe combined immune deficiency) irradiées, pouvait initier de nouveau une LAM (Campbell & Polyak, 2007). Récemment, des expériences similaires ont permis d identifier de potentielles cellules souches cancéreuses dans différents modèles de tumeurs solides et notamment du sein (Al-Hajj et al., 2003), du colon (Ricci-Vitiani et al., 2007), ou du cerveau (Singh et al., 2003). Ces cellules seraient identifiables en raison de leur profil particulier, par exemple CD34+ CD38- dans le cas de LAM, et seraient capables d initier une tumeur. La majorité des cellules issues du même échantillon mais ne possédant pas ce profil en serait en revanche incapable. Cependant l étude ne montre pas si ce phénotype malin est lié à une capacité innée des cellules à s autorenouveler ou uniquement dû à la capacité de ces cellules à communiquer et survivre dans un microenvironnement étranger (Adams et al., 2008). Plutôt que de s opposer, ces deux mécanismes de sélection clonale et de cellules souches tumorales pourraient en réalité être complémentaires, tous deux impliqués dans la progression tumorale, et expliquer l hétérogénéité des tumeurs (figure 2). Il est de plus maintenant clairement évoqué un rôle important du microenvironnement dans la pression de sélection en lien avec la coopération entre les cellules stromales et les cellules tumorales, ou entre les cellules tumorales elles-mêmes. Des sous-populations différentes de cellules continueraient à proliférer et évolueraient indépendamment les unes des autres, certaines pouvant même acquérir la capacité d auto-renouvellement comme les cellules souches. Ceci pourrait expliquer la raison pour laquelle les mutations et les propriétés des cellules tumorales diffèrent d un organe à l autre et même d une cellule à l autre au sein d une même tumeur (Axelrod et al., 2006). 27

28 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Figure 2 : Théorie de l expansion clonale et des cellules souches proposées pour expliquer le développement cancéreux. Certaines cellules souches (en violet) peuvent acquérir des mutations (étoile) et se transformer en cellules néoplasiques. Elles peuvent alors s auto-renouveler ou se différencier. De nouvelles mutations peuvent apparaitre dans chacune de ces cellules menant à une différenciation, une dédifférenciation ou à l acquisition de nouvelles caractéristiques. Ici, la cellule cancéreuse peut subir d autres mutations et être plus différenciée (en bleu) puis muter pour acquérir de nouveau la capacité à s auto-renouveler, comme les cellules souches. Parallèlement, une autre cellule souche cancéreuse peut acquérir d autres mutations, se différencier et croître d avantage (bleu, rouge, vert). Les cellules ayant une prolifération accrue deviendront le type cellulaire dominant dans la tumeur (D après Campbell et al., 2007). I-3. Les cellules tumorales pulmonaires I-3.1. Origine des cellules tumorales pulmonaires Les tumeurs broncho-pulmonaires sont des carcinomes constitués de cellules tumorales qui dérivent des cellules épithéliales bronchiques. Ces dernières tapissent normalement les parois des bronchioles, protégeant l organisme de l environnement extérieur grâce à leurs cils vibratiles et à la sécrétion de mucus. En raison de leur situation, les cellules épithéliales sont au contact direct des agents pathogènes ou des composés irritants provenant de l extérieur, parmi lesquels les agents cancérigènes contenus dans le tabac. Le remodelage très précoce de l épithélium précède l accumulation par les cellules épithéliales de nombreuses mutations pouvant mener au développement d un carcinome (Pankiewicz et al., 2007). Cependant, à l instar d autres cancers, toutes les cellules épithéliales ne peuvent être à l origine d un cancer broncho-pulmonaire. L hypothèse serait donc qu il faudrait que ce soit une cellule souche pulmonaire qui accumule ces mutations pour entraîner la formation d une lésion néoplasique. Dans le cancer du poumon, l existence de cellules souches cancéreuses est suspectée depuis plus de 25 ans. Il a en effet été montré que 1,5% des cellules issues de prélèvements tumoraux de patients atteints d un adénocarcinome ou d un carcinome à petites cellules étaient capables de former in vitro des colonies. Ces mêmes colonies cellulaires, après avoir été injectées par voie intracrânienne à des souris nude, étaient capables de reproduire une 28

29 Introduction bilbiographique-chapitre 1 tumeur aux caractéristiques identiques à celles de la tumeur initiale, supportant l idée de l existence de cellules souches tumorales pulmonaires (Carney et al., 1982). Cependant chez l homme, toutes les études visant à caractériser ces cellules ont pour l instant échoué faute de marqueurs suffisamment spécifiques pour les différencier et les isoler. Seulement un petit nombre de cellules, se comportant comme des cellules souches, ont été identifiées dans des lignées cellulaires ou des prélèvements issus de tumeurs broncho-pulmonaires non à petites cellules (CBPNPC) et montrent bien des caractéristiques typiques des cellules souches. Cependant il a été impossible de différencier ces cellules des autres cellules tumorales en utilisant les marqueurs des cellules souches, CD24, CD34, CD44 et la nestine, les plus fréquemment utilisés dans d autres cancers. Chez la souris, deux populations de cellules souches cancéreuses pulmonaires ont été décrites, mais les deux marqueurs utilisés pour les caractériser ne peuvent être employés pour identifier les cellules souches humaines. En effet, Sca-1 n a pas d homologue chez l homme et le CD34 est insuffisamment discriminant pour identifier les potentielles cellules souches décrites dans le CBPNPC (Ho et al., 2007). I-3.2. Tabac et cancer broncho-pulmonaire Le cancer broncho-pulmonaire est l un des rares cancers pour lequel l agent causal principal, le tabac, est depuis longtemps parfaitement identifié. En effet, les premières observations cliniques et épidémiologiques montrant l association entre le tabagisme et le cancer du poumon datent des années 1950 (Wynder et al, 1950). En 1962 et 1964, le Collège Royal des médecins de Londres et l U.S. Department of Health Education and Welfare concluaient que le tabagisme était un facteur étiologique important dans le développement du cancer pulmonaire. La prévalence du tabagisme est en effet parallèle à l incidence du cancer du poumon. Toutefois, il existe un décalage d environ 20 à 25 ans entre la prévalence et l incidence et ceci à la fois chez l'homme et chez la femme. Cet intervalle de temps correspond en général à la période de latence nécessaire au développement du cancer et peut varier d un individu à l autre. Le tabagisme actif est responsable de 90% des cancers pulmonaires (Collins & Graham, 2007) mais le rôle du tabagisme passif n est cependant pas négligeable. Les 10% de cas restant sont attribués aux maladies professionnelles. Lors de sa combustion, le tabac dégage plus de 4000 substances dont 43 sont carcinogènes. Parmi ces dernières, les hydrocarbures aromatiques polycycliques seraient en grande partie responsables de l apparition des cancers bronchiques. La nicotine, un des nitrosamines majeurs du tabac, est parmi les plus toxiques. Présente à la fois dans la fumée 29

30 Introduction bilbiographique-chapitre 1 inhalée et dans la fumée de combustion, la nicotine est rapidement absorbée par les epithelia bronchiques et les alvéoles (Wynder & Muscat, 1995). I-3.3. Les cancers broncho-pulmonaires Dans les pays industrialisés, le cancer broncho-pulmonaire est la cause majeure de décès par cancer chez l homme et est en constante augmentation chez la femme. Malheureusement, plus des 2/3 des patients ne sont pas opérables en raison d un diagnostic tardif et d une évolution rapide de ce cancer. Des métastases sont en effet souvent déjà présentes au moment du diagnostic. Cependant, lorsque la tumeur est localisée lors du diagnostic initial, le taux de survie à 5 ans est d environ 40%. La survie est en revanche réduite à 8% lorsque le cancer broncho-pulmonaire est diagnostiqué avec un envahissement ganglionnaire ou des métastases (Etzioni et al., 2003). Afin d améliorer la survie des patients atteints de cancer broncho-pulmonaire, la connaissance des modifications génétiques et moléculaires liées à cette pathologie, de même qu une meilleure compréhension du rôle du microenvironnement dans la progression tumorale, sont des enjeux primordiaux pouvant permettre l identification de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, la découverte de nouveaux marqueurs pourrait faciliter une détection précoce et une meilleure prise en charge des patients atteints par ce type de cancer. I Classification des cancers broncho-pulmonaires La classification de 2004 de l Organisation Mondiale de la Santé (OMS) distingue différents types histologiques de cancers broncho-pulmonaires : les carcinomes épidermoïdes, les adénocarcinomes, les carcinomes à grandes cellules et les carcinomes à petites cellules. Les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules et les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules (CBPPC) diffèrent par leur rapidité d évolution et les modalités thérapeutiques utilisées. Les CBPNPC représentent environ 85% des cas alors que les CBPPC, les plus agressifs, touchent environ 15% des patients (Travis et al., 2004). Le système international de classification TNM (Tumor Node Metastasis) des cancers pulmonaires permet de décrire l extension anatomique de la tumeur en loco-régional et à distance (Sobin & Wittekind, 2002). La catégorie T (Tumor) représente l extension tumorale locale au niveau du site primitif. La catégorie N (Node) décrit l extension ganglionnaire régionale. Enfin, la catégorie M (Metastasis) traduit l absence ou la présence de métastases à distance. Différentes combinaisons de T, N et M sont ainsi possibles et certaines d entre elles 30

31 Introduction bilbiographique-chapitre 1 définissent des stades pouvant correspondre à des pronostics comparables. Des stratégies thérapeutiques identiques sont alors utilisables (Spira et al., 2004). I Les différents types histologiques de cancers broncho-pulmonaires Les carcinomes épidermoïdes Plus de 90% des carcinomes épidermoïdes atteignent des fumeurs. Chez ces patients, des lésions pré-néoplasiques précèdent généralement l installation d un carcinome épidermoïde in situ puis d un carcinome infiltrant. Plusieurs étapes se succèdent sous l effet des carcinogènes du tabac. La transformation d une cellule épithéliale bronchique conduit à une hyperplasie, une métaplasie malpighienne puis une dysplasie. L épithélium cilié et pseudostratifié devient ainsi pavimenteux et pluristratifié. Histologiquement, les carcinomes épidermoïdes infiltrants se caractérisent par l existence de jonctions intercellulaires et d une kératinisation (Collins et al., 2007). Demeurant le plus fréquent en France, avec 40% des cas de cancers broncho-pulmonaires, le carcinome épidermoïde se localise préférentiellement dans une bronche lobaire ou segmentaire. Il se présente souvent sous la forme d une tumeur végétante, proximale dans les 2/3 des cas, et est fréquemment associé à une pneumonie obstructive. Lorsque la tumeur est périphérique, une nécrose centrale est habituelle. Elle présente souvent une extension locale agressive. Il semblerait que l association de ce type de cancer avec la consommation de tabac brun et celle de cigarettes sans filtre soit plus marquée. En immunohistochimie, le marquage des cytokératines de haut poids moléculaire et de l EGF-R (Epidermal Growth Factor Receptor) est fréquemment positif (Travis et al., 2004). Les adénocarcinomes Les adénocarcinomes représentent 30% des cas de cancers broncho-pulmonaires en Europe et leur incidence en France augmente régulièrement pour atteindre 50% des cas. Ces adénocarcinomes sont hétérogènes et sont ainsi divisés en plusieurs sous-types histologiques, acineux, papillaire, bronchiolo-alvéolaire solide avec production de mucines, le plus fréquent étant la forme mixte qui associe ces différents sous-types (Travis et al., 2004). L adénocarcinome est le plus souvent une tumeur périphérique qui se localise dans les régions sous-pleurales, entraînant des lésions non visibles à l endoscopie. L augmentation de sa fréquence serait expliquée par l usage de tabac blond et surtout par l utilisation de filtres. En microscopie électronique, les cellules des adénocarcinomes, larges avec un noyau très irrégulier, possèdent à leur surface des microvillosités. Elles se caractérisent également 31

32 Introduction bilbiographique-chapitre 1 par un réticulum endoplasmique et un appareil de Golgi relativement abondant et des granules sécrétoires. En immunohistochimie, le marquage de l antigène carcino-embryonnaire est le plus souvent positif de même que celui des cytokératines de faible poids moléculaire (Travis et al., 2004). Une partie des adénocarcinomes pulmonaires présente une mutation du gène K- ras. Les carcinomes à grandes cellules Le carcinome à grandes cellules ou carcinome indifférencié à grandes cellules, de pronostic sombre, est une prolifération maligne indifférenciée de cellules à cytoplasme large, à noyau très atypique, ne présentant pas de différenciation squameuse ou glandulaire. Ce groupe représente environ 10% des cancers bronchiques, et comprend les carcinomes à grandes cellules avec des cellules géantes, les carcinomes à cellules fusiformes et les carcinomes endocrines à grandes cellules (Travis et al., 2004). Les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules Le cancer broncho-pulmonaire à petites cellules (15% des cas) est une tumeur endocrine indifférenciée qui se localise généralement dans les voies aériennes proximales. La plupart des patients atteints d un CBPPC sont des fumeurs. L accumulation des mutations conduit à une perte d activité des gènes suppresseurs de tumeur, notamment p53 et RB, une très forte résistance à l apoptose et une importante activité télomérase. Dans la majorité des cas, la tumeur est mal limitée et envahit très précocement les relais ganglionnaires hilaires et médiastinaux de même que les vaisseaux sanguins et lymphatiques. L activité mitotique est très élevée et les tumeurs sont souvent très nécrotiques. Les CBPPC sont constitués de cellules de petite taille, inférieure à 3 fois celle d un lymphocyte, avec un rapport nucléo-cytoplasmique élevé, des limites cytoplasmiques mal définies et une chromatine finement granulaire sans nucléole visible. Les critères ultrastructuraux comme la présence de grains neurosécrétoires, sont très évocateurs. Les marqueurs immunohistochimiques les plus utilisés pour le diagnostic de CBPPC sont la chromogranine, spécifique du caractère endocrine, la synaptophysine et la protéine NCAM ou CD56 (Travis et al., 2004). 32

33 Introduction bilbiographique-chapitre 1 II Les cellules fibroblastiques II-1. Origine et caractéristiques des cellules fibroblastiques Les cellules fibroblastiques sont des cellules à l aspect fusiforme issues de la spécialisation des cellules souches mésenchymateuses présentes le long des capillaires sanguins. Les fibroblastes sont les cellules prédominantes du stroma et sont responsables de la synthèse de la plupart des composants de la MEC, comme le collagène et les protéoglycanes structurels, de différents facteurs de croissance mais aussi de diverses classes d enzymes protéolytiques et de leurs inhibiteurs (Sappino et al., 1990). Chaque organe possède une composition tissulaire et cellulaire particulière et les fibroblastes présents sont spécifiques de l organe avec une expression variable de molécules actives. De plus, en réponse à différents signaux physiologiques, les fibroblastes changent de phénotype et de fonction (Chang et al., 2004). Ils sont ainsi impliqués dans le catabolisme du cholestérol ou encore dans les défenses anti-infectieuse et anti-virale par la sécrétion de facteurs chimiotactiques et d'interféron-β (IFN-β). II-2. Les cellules fibroblastiques associées à la tumeur Les fibroblastes représentent la majorité des cellules du stroma tumoral. Les pathologistes ont été les premiers à observer que les fibroblastes associés aux tumeurs étaient particuliers et subissaient des changements dynamiques tout au long de la progression tumorale (Bhomwick et al., 2004 ; 2005). Les termes de myofibroblastes, fibroblastes péritumoraux, cellules stromales réactives, fibroblastes activés et fibroblastes associés aux carcinomes (CAF) ont alors été utilisés pour nommer les fibroblastes associés aux tumeurs et présentant un phénotype particulier (figure 3). A-Fibroblaste du stroma sain B-Fibroblaste associé aux carcinomes Collagène I Noyau α- actine de muscle lisse Fibres d actine Tenascine C Vimentine SPARC MEC Fibronectine α1β1 intégrine Facteurs de croissances Protéases de la MEC Chimiokines Fibronectine Figure 3 : Changements dynamiques des fibroblastes lors de la progression tumorale. A-Les fibroblastes normaux sont entourés de la MEC du tissu conjonctif, principalement composée de collagène I et de fibronectine. Ils interagissent avec leur environnement grâce aux intégrines, telle que l intégrine α1β1. B- Les fibroblastes associés aux tumeurs peuvent acquérir un phénotype particulier et sont caractérisés par une prolifération accrue, une augmentation de l expression de protéines de la MEC, comme le collagène I, la tenascine C ou la fibronectine, ou encore l expression de l α-actine des cellules musculaires lisses (D après Kalluri & Zeisberg, 2006). 33

34 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Les fibroblastes associés aux tumeurs ont tendance à proliférer plus vite que les fibroblastes sains, expriment l α-actine des cellules musculaires lisses (αsma) et sont généralement entourés de collagène fibrillaire (Willis, 1967 ; Sappino et al., 1990). En effet, les fibroblastes isolés de différents tissus cancéreux issus du sein, du colon, de la prostate ou du poumon, montrent un phénotype altéré et produisent des quantités importantes de collagènes, de hyaluronates, de deux protéines de la MEC : la tenascine C et SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein), et de facteurs de croissance épithéliaux (Bauer et al ; Knudson et al., 1984, Kalluri & Zeisberg, 2006). Ce phénotype est également associé à des dépôts de MEC, au recrutement de cellules inflammatoires et à l activation de l angiogenèse (Muller et al., 2004). Ces cellules présentent aussi une motilité accrue responsable d une croissance désorganisée (Rasmussen & Cullen, 1998). Un phénotype similaire a même été observé pour des fibroblastes non tumorigénes présents dans des sites distants de la tumeur. Un profil invasif altéré a aussi été retrouvé pour des fibroblastes du derme de patients cancéreux où ayant des prédispositions héréditaires de cancer (Schor et al, 1986, 1988). Ces fibroblastes modifiés pourraient affecter les interactions entre l épithélium et le stroma, favorisant ainsi la formation de lésions néoplasiques. III Les cellules vasculaires III-1. La vascularisation de la tumeur La croissance d une tumeur d un volume supérieur au mm 3 et la formation de métastases sont étroitement liées à l angiogenèse qui assure à la fois l apport en oxygène et en nutriments mais aussi l élimination des catabolites produits par les cellules cancéreuses (Naumov et al., 2006). La progression de la tumeur est donc dépendante de la néovascularisation qui doit passer d une phase de latence à une phase agressive «Switch» comme l a parfaitement décrit Judha Folkman, à l origine de la découverte de l angiogenèse dans les années 70 (Folkman et al. 1971). En effet, la densité vasculaire est directement corrélée au degré de malignité de la tumeur et à la dissémination métastatique (Weidner et al, 1993). Contrairement aux vaisseaux irrigant normalement le tissu pulmonaire et organisés de manière hiérarchique, les vaisseaux sanguins tumoraux ont un diamètre supérieur et moins régulier. En raison de leur organisation en réseau chaotique, ces néo-vaisseaux ne peuvent fournir un apport uniforme aux cellules cancéreuses, causant souvent un environnement hypoxique puis une nécrose cellulaire. De plus, la densité vasculaire est très hétérogène avec 34

35 Introduction bilbiographique-chapitre 1 une quantité de vaisseaux quatre à dix fois plus importante au niveau du front invasif de la tumeur par rapport au centre de cette dernière (Balkwill & Mantovani, 2001). III-2. Les cellules endothéliales III-2.1. Les cellules endothéliales des vaisseaux pulmonaires sains Les cellules endothéliales représentent le principal composant cellulaire des vaisseaux sanguins et lymphatiques, qu elles tapissent. D origine mésenchymateuse, ces cellules spécialisées se différencient à partir de précurseurs des cellules endothéliales, ou EPC (Endothelial Progenitor Cells), localisés dans la moelle osseuse, puis sont mobilisées dans la circulation. Elles sont recrutées sur les sites hypoxiques par différents facteurs tel que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) pour former de nouveaux vaisseaux ou encore réparer un vaisseau lésé (Rafii et al., 2003). La cohésion des cellules endothéliales entre elles est assurée par les jonctions adhérentes et serrées auxquelles participent différents types de protéines comme l occludine, les cadhérines, les claudines et les protéines JAM (Junctional Adhesion Molecules). Deux d entre elles sont spécifiques des cellules endothéliales, la claudine-5 et la VE-cadhérine (Vascular Endothelial cadherin) et cette dernière jouerait également un rôle important dans l angiogenèse (Wallez & Huber, 2008). Les cellules endothéliales sont également stabilisées par les liaisons qu elles forment avec les protéines de la matrice extracellulaire, interactions médiées par une autre famille de protéines, les intégrines. Les intégrines sont une famille de récepteurs membranaires composés de deux sous-unités transmembranaires de type 1, α et β (figure 4). Récepteurs du collagène Récepteurs spécifiques des leucocytes Récepteurs RGD Récepteurs de la laminine Figure 4 : Principaux récepteurs de la famille des intégrines. 35

36 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Chez les mammifères, 18 sous-unités α et 8 sous-unités β peuvent s associer pour former 24 intégrines permettant les interactions cellule-cellule ou cellule-matrice (figure 4). Les cellules endothéliales expriment certaines intégrines spécifiques dont les récepteurs de la fibronectine α4β1 et α5β1, les récepteurs du collagène α1β1 et α2β1, les récepteurs de la laminine α3β1, α6β1 et α6β4, les récepteurs de l ostéospontine α9β1 et les récepteurs de la vitronectine αvβ3 et αvβ5 (Silva et al., 2008) III-2.2. Les cellules endothéliales des néo-vaisseaux Lors de la progression de la tumeur, les cellules contribuent à la mise en place puis à la stabilisation des néo-vaisseaux grâce à la production continue de VEGF, de PDGF (Platelet Derived Growth Factor) et de bfgf (basic Fibroblast Growth Factor) responsables de la prolifération endothéliale. Cette production de facteurs de croissance est sous le contrôle de l hypoxie tissulaire via l expression d HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor-1α) qui est régulée par la pression partielle en oxygène. Le VEGF est aussi responsable de la perméabilité altérée des nouveaux vaisseaux (Ribatti, 2007). Ainsi, l endothélium tumoral est souvent discontinu ce qui augmente la perméabilité vasculaire et permet aux protéines plasmatiques comme la fibrine de fuir le système vasculaire (Kalluri & Zeisberg, 2006). Le dépôt de fibrine en péricapillaire et en intratumoral est en effet fréquemment observé. La présence de cellules tumorales dans ces espaces inter-cellulaires, fréquents dans la paroi des pseudo-capillaires, est aisni nommée vasculomimicrie. Les néovaisseaux formés sont donc tapissés de cellules endothéliales anormales qui se multiplient cinquante à deux cents fois plus rapidement que les cellules endothéliales saines (Vermeulen et al., 1995). Ces cellules produisent aussi des protéines de la MEC avec préférentiellement de la fibronectine et du collagène I qui participent à l initiation de l angiogenèse (Kalluri & Zeisberg, 2006). Les cellules endothéliales des néo-vaisseaux diffèrent également des cellules endothéliales normales par leur profil d expression des molécules d adhérence. Elles surexpriment généralement les intégrines de surface αvβ3 et αvβ5 (Magnussen et al., 2005), la E-sélectine, l endogline, l endosialine et les récepteurs du VEGF, les KDR à activité tyrosine kinase (Kinase Domain containing Receptor). Les voies de signalisation déclenchées par l activation de ces récepteurs stimulent la migration endothéliale. A l opposé, la VE-cadhérine est peu exprimée par les vaisseaux tumoraux, causant leur déstabilisation et un remodelage anormal (Ribatti, 2007). 36

37 Introduction bilbiographique-chapitre 1 III-3. Les péricytes Les péricytes, d origine mésenchymateuse, sont des cellules péri-vasculaires qui entourent et stabilisent les nouveaux vaisseaux. Ils forment une fine couche le long des capillaires sanguins ou lymphatiques au contact direct des cellules endothéliales. Les péricytes sont des cellules peu différenciées qui peuvent donner naissance à des fibroblastes, des cellules musculaires lisses ou des macrophages. La formation de néovaisseaux implique la migration et la différenciation des péricytes. Dans la tumeur, les zones de contact sont lâches et les péricytes ont une forme anormale avec des excroissances cytoplasmiques éloignées de la paroi vasculaire. De plus, ils sont entourés de couches supplémentaires de membrane basale à laquelle ils sont faiblement liés. Ces aberrations sont associées à une altération de la voie de signalisation du PDGF. En effet, des souris génétiquement déficientes en PDGF ou en son récepteur présentent des vaisseaux sanguins avec des péricytes de diamètre variable et faiblement associés aux cellules endothéliales. Des anomalies similaires sont observées dans de nombreux vaisseaux tumoraux (Ribatti, 2007). Comme les cellules endothéliales, les péricytes expriment des intégrines incluant les récepteurs de la fibronectine, des collagènes, de la laminine et de l ostéopontine (Silva et al., 2008). IV Les cellules de l inflammation et de l immunité Pour la première fois en 1863, Rudolf Virchow nota la présence de leucocytes dans le tissu néoplasique et suggéra l existence d un lien entre inflammation et cancer. En effet, au sein de la plupart des tumeurs ainsi que dans le stroma tumoral, des cellules du système immunitaire et des cellules inflammatoires sont retrouvées (Balkwill & Mantovani, 2001). La régulation de la réponse immunitaire se fait via l expression de nombreuses chimiokines qui vont attirer et stimuler l infiltration des cellules du système immunitaire dans le microenvironnement tumoral. Ce recrutement de cellules immunitaires peut, lors des premiers stades de la carcinogenèse, promouvoir un effet anti-tumoral via l élimination de cellules néoplasiques par les macrophages. Cependant, au cours de la progression tumorale, les cellules cancéreuses détournent à leur profit la stratégie des cellules immunitaires, créant ainsi un climat favorable au développement de la tumeur. De nombreuses études ont montré que les chimiokines sécrétées par la tumeur amènent en effet les leucocytes à favoriser la croissance tumorale, à fournir des signaux de survie ainsi que des facteurs stimulant l angiogenèse tumorale. Dans de nombreux cas, le récepteur d une chimiokine particulière 37

38 Introduction bilbiographique-chapitre 1 peut être surexprimé par les cellules tumorales pour favoriser la fixation et donc l action de celle-ci lorsqu elle est sécrétée dans le microenvironnement (Raman et al., 2007). Les cellules du système immunitaire peuvent également promouvoir la croissance tumorale en sélectionnant des variants tumoraux ayant une immunogénicité réduite et pouvant ainsi leur échapper. Ce système, appelé «immunoédition», comprend trois phases. Au cours de la première phase, appelé phase d élimination, les cellules effectrices du système immunitaire inné (macrophages, cellules tueuses et dendritiques) et adaptatif (lymphocytes T) vont reconnaître et détruire les cellules tumorales, protégeant ainsi l organisme hôte du cancer. La seconde phase est celle de l équilibre où la croissance tumorale et la surveillance immunitaire sont en balance, les tumeurs étant hautement immunogènes. La troisième phase est celle d échappement où les variants tumoraux moins immunogènes sont capables d échapper au système immunitaire et des lésions néoplasiques détectables se développent alors (Dunn et al., 2004). IV-1. Les macrophages Les macrophages, après maturation et différenciation à partir de monocytes circulants, sont des phagocytes mononucléés présents dans un grand nombre de tissus. Leurs principales fonctions dans le système immunitaire sont de réguler la réaction inflammatoire locale par production de cytokines pro- ou anti-inflammatoires, de fournir un premier mécanisme de défense non spécifique par phagocytose et d initier le déclenchement d une réponse immunitaire spécifique par présentation d antigènes aux cellules effectrices (Pouniotis et al. 2006). Dans de nombreux cancers et notamment dans celui du poumon, il a été montré que les cellules tumorales produisaient des facteurs chimioattractants, tels que le VEGF ou diverses chimiokines, capables de recruter des monocytes circulants qui sont rapidement éduqués au sein du microenvironnement tumoral (figure 5). La migration des macrophages est également favorisée lorsque des régions hypoxiques apparaissent dans la tumeur. Cette hypoxie induit en effet l expression de HIF-1, de VEGF, de la chimiokine CXCL12 (SDF-1, Stromal cell-derived Factor-1) et de son récepteur CXCR4. Les macrophages associés aux tumeurs, ou TAM (Tumour-Associated Macrophages), reçoivent aussi de nombreux signaux de diverses cellules du microenvironnement dont les fibroblastes (Chen et al., 2005 ; Sica et al., 2006 ; Redente et al., 2007) et les cellules endothéliales (Mantovani et al, 2004). La présence des TAM dans le microenvironnement tumoral est l une des marques «hallmarks» de l inflammation associée au cancer. 38

39 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Au sein de la tumeur deux types de macrophages, M1 et M2, sont présents et jouent un rôle central dans de nombreuses interactions tumeur-stroma. A l image du Yin et du Yang, les macrophages M1 activés, avec un phénotype IL12 High et une capacité importante à présenter l antigène, exerceraient une action cytotoxique envers les cellules tumorales (figure 5). De plus, ces macrophages produisent de l angiostatine, un fragment généré lors de la protéolyse du plasminogène, qui exerce une activité anti-angiogénique. En revanche, les macrophages M2, de phénotype IL12 Low et IL10 High et présentant une faible capacité à présenter l antigène, auraient une action suppressive vis-à-vis de la réponse Th1. Les TAM M2 favoriseraient ainsi l angiogenèse, mais aussi le remodelage de la matrice extracellulaire, car ils produisent également des métalloprotéases matricielles -2 et -9 (MMP-2 et 9), des activateurs du plasminogène (tpa et upa), du TGF-β (Transforming Growth Factor-β) et de l IL-6. Monocytes circulants Chimiokines M-CSF VEGF Cellule tumorale FACTEURS DE CROISANCE ET DE SURVIE CELLULAIRE FACTEURS CHIMIOATTRACTANTS ET DE SURVIE CELLULAIRE TAM Tumeur solide REMODELAGE DE LA MATRICE NEO- ANGIOGENESE FIBROBLASTES VAISSEAUX Figure 5 : Interactions entre les TAM et la tumeur. Différents facteurs chimioattractants, comme le M-CSF, Macrophage-Colony Stimulating Factor, le VEGF ou diverses chimiokines, peuvent attirer les monocytes circulants vers la tumeur. Une fois dans le microenvironnement tumoral, les monocytes se différencient en macrophages tumoraux (TAM) qui établissent une relation symbiotique avec la tumeur. Les TAM sécrètent des facteurs de croissance, favorisant la croissance cellulaire tumorale, régulent la synthèse et le remodelage de la MEC et influencent la néoangiogenèse (D après Sica et al., 2006). Durant le processus inflammatoire, les TAM produisent aussi des dérivés réactifs de l oxygène (ROS), des cytokines, des chimiokines et des facteurs angiogéniques qui contribuent à l initiation de la tumorigenèse. Il a de plus été montré que des macrophages issus de lavages broncho-alvéolaires obtenus de patients atteints de cancers primitifs pulmonaires présentaient une diminution d expression membranaire de HLA-DR (Human 39

40 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Leucocyte Antigen-D Related), ICAM-1, CD83 et du récepteur au mannose. Une production diminuée de TNF-α, d IL-1 et d IL-6, suggère également que ces patients auraient une capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale, via les lymphocytes T, très compromise (Pouiniotis et al. 2006). IV-2. Les cellules dendritiques Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d antigènes professionnelles actuellement considérées comme les chefs d orchestre de la réponse immunitaire. Leur tache est de surveiller continuellement les sites d exposition aux antigènes, d apprêter puis de présenter un antigène de façon à activer une réponse adaptative spécifique de cet antigène via l activation de lymphocytes T naïfs, CD4 + auxiliaires ou CD8 + cytotoxiques (Mantovani et al., 2008). De ce fait, les CD devraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire anti-tumorale et l infiltration de cellules dendritiques dans le microenvironnement et être associées à une réponse immune dirigée contre la tumeur. Or la sécrétion, par les cellules tumorales et/ou par les cellules du stroma, de facteurs immunosuppressifs tels l IL-10 constitue l un des mécanismes impliqués dans la modulation de la fonction des cellules présentatrices de l antigène et dans l échappement immunologique des tumeurs. Bien que de nombreuses études histologiques montrent une corrélation positive entre le nombre de CD présentes à l intérieur de la tumeur solide et l absence de progression de cette dernière, il apparaît cependant que les CD associées aux tumeurs, ou TADC (Tumor-Associated Dendritic Cells), présentent des caractéristiques particulières (Mantovani et al., 2008). En effet, les TADC présentes dans des métastases de mélanome en progression ont un phénotype de CD immatures. Elles expriment des quantités réduites de CD83 et de CD86 et sont ainsi de faibles stimulateurs de la réponse T. Ce phénotype est aussi celui des CD circulantes présentes chez des patientes atteintes de cancers du sein de stade III et IV (Gabrilovich et al., 1997). En fait et comme cela a été montré dans le cancer du poumon, les cellules tumorales sécrètent du VEGF, qui est un inhibiteur du développement et de la maturation des CD (Oyama et al., 1998), ou de l IL10 qui altère leur fonction immuno-stimulatrice. Dans des analyses histologiques de spécimens de CBPNPC, l expression de VEGF et le degré d infiltration des CD sont en effet inversement corrélés et un meilleur pronostic est observé dans le cas de faible expression de VEGF et de forte infiltration de CD (Inoshima et al., 2002). A l inverse, l expression de GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor) dans les 40

41 Introduction bilbiographique-chapitre 1 adénocarcinomes est corrélée a une augmentation du nombre de CD infiltrantes mais la signification pronostique de ces observations n a pas encore été établie (Tazi et al., 1993). IV-3. Les polynucléaires neutrophiles Les polynucléaires neutrophiles (PNN) font partie des cellules du système immunitaire inné et sont les leucocytes les plus abondants du système vasculaire. Les PNN sont des phagocytes essentiels en phase précoce d une infection bactérienne et sont de puissants effecteurs de l inflammation. Ils libèrent en effet une multitude de substances antimicrobiennes et de médiateurs de l inflammation. De plus, la sécrétion de facteurs chimiotactiques solubles permet le recrutement des cellules effectrices de l immunité non spécifique et spécifique. Puisque les PNN produisent également des cytokines et des chimiokines, ils modulent l équilibre entre immunité humorale et cellulaire en contribuant à la stimulation des réponses Th1 ou Th2. De cette manière, les PNN sont engagés dans une relation complexe avec les cellules endothéliales et les cellules de l immunité, faisant le lien entre immunité innée et adaptative (Di Carlo et al., 2001). Les PNN sont aussi capables de produire toute une gamme de protéases dont l élastase, la protéase 3, la cathepsine G et la MMP-9, susceptibles d influencer l initiation puis la progression tumorale. IV-4. Les lymphocytes L immunité anti-tumorale repose sur la capacité des lymphocytes T cytotoxiques CD8 + (CTL) à reconnaître, sur la cellule maligne, des peptides tumoraux associés aux molécules de classe I du CMH (Complexe Majeur d Histocompatibilité). Ces peptides leur auront été préalablement présentés, dans les ganglions lymphatiques par les CD matures ayant été au contact de la tumeur. Les CTL vont ensuite éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses cibles. Les cellules du système immunitaire spécifique peuvent également favoriser le développement tumoral. Comme il a été démontré dans plusieurs types de cancer, les lymphocytes T infiltrant la tumeur voient leurs fonctions affectées par de nombreux facteurs produits au sein du microenvironnement tumoral. A titre d exemple, les lymphocytes Th2, sous classe de lymphocytes T CD4 + auxiliaires qui induisent la production d anticorps par les lymphocytes B, sont capables d activer les macrophages M2. Ces derniers vont promouvoir la croissance tumorale et sa progression en synthétisant de l IL-10 (Balkwill & Mantovani, 2001). De plus, Le TGF-β peut induire la conversion des lymphocytes T CD4 + /CD25 - en lymphocytes T CD4 + /CD25 +, appelés également lymphocytes T régulateurs (T Reg ). Ces 41

42 Introduction bilbiographique-chapitre 1 cellules T Reg, normalement impliquées dans la tolérance du soi peuvent, dans le cas de cancer, participer à l échappement immunitaire des cellules tumorales (Liu et al., 2007). IV-5. Les autres cellules Les cellules NK (Natural Killer) sont une variété de lymphocytes circulants appartenant au système immunitaire inné contrairement aux lymphocytes B et T. Les cellules NK ont la capacité de tuer les cellules tumorales en induisant leur apoptose, par les systèmes perforine/granzyme ou Fas/Fas ligand, et de secréter de l interféron gamma (IFN-γ). Cette cytokine est importante pour la réponse anti-tumorale puisqu elle permet localement d induire la production de chimiokines qui attirent à leur tour un nombre encore plus grand de cellules effectrices. L IFN-γ est capable notamment de diriger la réponse immunitaire spécifique Th1 et de stimuler les cellules présentatrices d antigènes et les macrophages (Caligiuri, 2008). Le mastocyte a pour origine un progéniteur hématopoïétique médullaire lequel passe dans le sang puis colonise les tissus où il termine sa maturation sous l influence de cytokines, essentiellement le SCF (Stem Cell Factor). Ces cellules ont un rôle essentiel dans la réaction d hypersensibilité immédiate médiée par les IgE. Les mastocytes peuvent également être stimulés par de nombreuses substances biologiques et produire des protéases, des cytokines, des chimiokines ou encore des facteurs de croissance, pouvant interférer avec de nombreux processus physiologiques y compris l angiogenèse, la croissance cellulaire ou encore la réponse inflammatoire. Les mastocytes et les substances qu'ils produisent peuvent participer activement aux processus de défense anti-tumorale et la dérégulation de leur sécrétion peut avoir un effet sur le développement tumoral (Metcalfe, 2008). B- LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ET LA MEMBRANE BASALE I Les principales protéines de MEC pulmonaire La composition de la MEC varie beaucoup d un tissu à l autre selon les propriétés physico-chimiques de chacun. La structure de la MEC pulmonaire influence fortement les propriétés mécaniques du tissu conjonctif pulmonaire, très élastique, le rendant apte à la fonction respiratoire. Les protéines de la MEC sont principalement synthétisées par les fibroblastes du stroma, sain ou tumoral. La MEC des tissus pulmonaires sains est un réseau tridimensionnel constituant la charpente du tissu, un support pour l adhérence des cellules et génère des signaux indispensables pour réguler les fonctions cellulaires. La MEC est en effet 42

43 Introduction bilbiographique-chapitre 1 un réservoir de facteurs de croissance, chimiokines et protéases qui sont libérés lors de sa dégradation. Ces facteurs solubles vont interagir avec les cellules du microenvironnement et les cellules néoplasiques, et influencer leur comportement en faisant varier, entre autre, le niveau d expression de différentes protéases comme les MMP, les cathepsines ou encore les kallicréines. Les variations mécaniques de la structure de la MEC vont également être perçues par les cellules du microenvironnement via des protéines transmembranaires telles que les intégrines, et moduler le comportement cellulaire (Larsen et al., 2006). Le réseau de la MEC est principalement composé d eau et de macromolécules, parmi lesquelles le collagène, la laminine, la fibronectine, l élastine et les protéoglycanes jouent un rôle particulièrement important. I-1. Le collagène Il existe plus de 20 types de collagènes. La plupart des collagènes interstitiels (I, II, III, V et XI) sont des structures hélicoïdales enroulées les unes autour des autres, formées de trois chaînes-α, chacune d une taille d environ 1000 acides aminés (Brown & Timpl, 1995) et d environ 100 kda. Cette structure rend les collagènes insensibles à des protéases comme la pepsine. Seules des protéases spécifiques, les collagénases, sont capables de cliver la triple hélice. Ces chaînes sont capables de s assembler spontanément pour former des structures fibrillaires. Ces fibrilles de collagène peuvent encore s assembler en fibres plus épaisses en se liant entre elles via leurs résidus lysyl et hydroxylysyl (Silver et al., 2003). Cette conversion, réalisée par la lysyl oxydase, se fait dans l espace extracellulaire et permet la formation de liaisons covalentes entre les chaînes α des différentes triples hélices. Dans le tissu interstitiel pulmonaire, le parenchyme est principalement composé des collagènes I et III qui forment la structure des parois alvéolaires (Sobin et al., 1988). Il existe également des collagènes globulaires, comme le collagène de type IV, particulièrement abondant dans la membrane basale des cellules épithéliales. I-2. La fibronectine La fibronectine est une glycoprotéine dimérique de grande taille, en forme de V et d environ 100 kda. Les deux monomères sont reliés par deux ponts disulfures situés dans leur extrémité C-terminale. La fibronectine est composée de trois domaines différents FNI, FNII et FNIII. Un processus spécifique contrôle la transformation de la fibronectine plasmatique en fibronectine fibrillaire dans la MEC. Les molécules de fibronectine s assemblent pour former 43

44 Introduction bilbiographique-chapitre 1 des fibrilles à la surface de nombreuses cellules et participent activement à la formation de la structure de la MEC. Les domaines rigides présentent les sites d interaction avec les autres composants de la matrice (collagène, protéoglycane ). La fibronectine peut également lier les intégrines par deux séquences RGD (arginine-glycine-aspartate). Elle peut donc simultanément se lier à la cellule et à d autres molécules de la matrice extracellulaire, y compris à une autre molécule de fibronectine (Vakonaki & Campbell, 2007). I-3. L élastine Les fibres élastiques retrouvées dans les tissus pulmonaires qui lui conférent ses propriétés élastiques sont des structures complexes principalement composées d élastine. L élastine est synthétisée sous forme monomérique soluble de kda, la tropoélastine, qui devra s assembler en polymère fonctionnel insoluble. Ces polymères s assemblent par la suite avec d autres structures, telles que les microfibrilles, elles mêmes composées de plus de trente protéines différentes, pour former les fibres élastiques (Shifren & Mecham., 2006). Celles-ci peuvent être très hétérogènes et sont capables de se lier au collagène via les protéoglycanes (Kietly et al., 2002). I-4. Les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes Dans le poumon, les composants de la MEC sont entourés d un gel hydraté, principalement composé de glycoaminoglycanes (GAG). Les GAG sont des polysaccharides sulfatés composés d un motif disaccharidique répété 40 à 100 fois en moyenne (Ruoslahti, 1988 ; Kjellen & Lindahl, 1991). Il existe cinq types de GAG : l acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d héparane, le sulfate de dermatane et le sulfate de kératane. Dans le poumon, les plus abondants sont les sulfates d héparane et de chondroïtine. La plupart des GAG sont liés de manière covalente à des protéines pour former des protéoglycanes, tels que l aggrecan ou le perlecan. Tout comme le collagène, les GAG peuvent former des structures secondaires et tertiaires, régions hélicoïdales organisées de manière aléatoire en fonction du ph et de l environnement ionique de la matrice (Scott et al., 1992). I-5. La vitronectine La vitronectine est l une des principales protéines de la MEC circulant dans le sang. Elle a également été retrouvée dans de nombreux tissus et dans la MEC de différentes tumeurs malignes (Tomasini & Mosher, 1988 ; Akalu et al, 2005). 44

45 Introduction bilbiographique-chapitre 1 La vitronectine a une masse de 75 kda sous sa forme monomérique. La vitronectine plasmatique circulante est le plus souvent sous forme native, tandis que les protéines retrouvées dans la MEC sont en général sous forme multimérique et active, avec un domaine cryptique RGD exposé. Le site RGD est situé sur l extrémité N-terminale de la protéine et peut être reconnu par de nombreuses intégrines, lui permettant d influencer le comportement cellulaire (Cretu & Brooks, 2007). II- La membrane basale La membrane basale (MB) est un type de MEC spécialisée doublant un épithélium, le séparant ainsi des tissus conjonctifs sous-jacents. Son épaisseur varie de 50 à 800 nanomètres. Elle est retrouvée associée à tous les épithéliums (peau, tube digestif, vessie, utérus...). En général, la MB sépare l épithélium du stroma environnant dans tous les tissus et est également retrouvée accolée à la face baso-latérale des cellules endothéliales, des adipocytes ou encore des cellules musculaires lisses. La MB est formée de la lame basale, mince feuillet de glycoprotéines sécrétées par les cellules épithéliales ou endothéliales et de la lame réticulaire, feuillet plus épais composé de matériel extracellulaire sécrété par les cellules du tissu conjonctif sous-jacent. La lame basale est composée essentiellement de protéoglycanes, de collagène de type IV, de fibronectine, de laminine et d entactine. Le collagène de type IV et la laminine interagissent avec l entactine, une protéine adaptatrice reliant la membrane basale à la cellule, et au perlecan pour former un réseau capable de se lier à différentes intégrines (figure 6). La lame réticulaire contient surtout des fibres de collagène de type III (réticuline). La MB est également composée d autres constituants moins représentés tels les collagènes de type VII, XV et XVIII (Kalluri et al., 2003). La membrane basale sert d ancrage à l'épithélium et est indispensable à la cicatrisation. Elle protège les tissus sous-jacents et assure une certaine perméabilité à différentes molécules, notamment les nutriments. 45

46 Introduction bilbiographique-chapitre 1 nidogène perlecan laminine collagène de type IV Membrane plasmique intégrine Figure 6 : La membrane basale. Les protéines de la membrane basale qui forment des polymères sont la laminine et le collagène de type IV. Ces polymères interagissent avec les protéoglycanes, le perlecan et le nidogène. A la surface des cellules, les intégrines interagissent avec les différents constituants de la MB et stabilisent le complexe (d après Weinberg, 2007). II-1. Les laminines Les laminines sont une famille de glycoprotéines constituées de complexes trimériques composés de trois chaînes, α, β et γ, formant 15 associations possibles. Les chaînes de laminine, de 400 kda, sont sécrétées par les cellules épithéliales (1 chaîne) et par les cellules conjonctives (2 chaînes) du stroma sous-jacent. Elles s'assemblent en un réseau de mailles fines dans la MB et forment un réseau extracellulaire avec le collagène de type IV (Lebleu et al., 2007). II-2. Le collagène de type IV Le collagène de type IV est une forme de collagène non fibrillaire qui représente jusqu à 50% de la membrane basale. Sa structure diffère de celle du collagène fibrillaire interstitiel par la présence d un domaine non collagénique globulaire (domaine NC). Chez les mammifères, il existe six formes différentes de chaînes-α formant six hétérotrimères de collagène de type IV, synthétisées par les cellules épithéliales (Lebleu et al., 2007). II-3. Entactine et perlecan Les entactines, représentant 2 à 3% de la membrane basale, existent sous deux formes, chacune composée de trois domaines globulaires (G1, G2 et G3). Les entactines peuvent se fixer au collagène de type IV, à la laminine, au perlecan et à la fibronectine. 46

47 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Le perlecan est un sulfate d héparane de kda, formé de cinq domaines différents (Domaines I-V). La protéine formant le corps de la molécule peut se lier à l entactine, au collagène de type IV, aux intégrines, aux sulfates d héparanes et aux GAG. (Lebleu et al., 2007). III Les modifications de la MB et la MEC dans la tumeur III-1. Remodelage de la MB dans les tissus tumoraux La composition de la membrane basale est modifiée tout au long de la progression tumorale. Certaines protéines constitutives de la MB ne sont ainsi plus exprimées. Par exemple, le collagène de type VII n est plus sécrété dans les carcinomes mammaires (Wetzels et al., 1991), les mélanomes (Kirkham et al., 1989 ), les cancers de la prostate (Nagle et al., 1995) et dans les carcinomes broncho-pulmonaires (Catusse et al., 2000). A l inverse, des études immunohistochimiques ont montré la présence de chaînes α3 du collagène de type IV, α3(iv), autour de groupes de cellules néoplasiques dans le cancer broncho-pulmonaire, alors qu elles ne sont pas retrouvées dans les tissus bronchiques sains (Polette et al., 1997, Catusse et al., 2000). Enfin, la localisation de certains composants peut également être modifiée comparativement à leur répartition dans les tissus sains. Ainsi, la distribution de la chaîne α1 du collagène de type IV est régulière dans le tissu sain, mais devient anarchique autour d amas de cellules tumorales (Polette et al., 1997). Dans les cancers gastriques, pancréatiques et hépatiques, les laminines sont exprimées au pôle invasif de la tumeur. Ainsi, la laminine 5 est considérée comme un marqueur de l invasion tumorale (Tani et al., 1996, 1997). Dans le cancer broncho-pulmonaire, la laminine 5 n est plus co-localisée avec le collagène VII. Or, l association de ces deux protéines participe à la formation des desmosomes en liant les cellules épithéliales à la lame basale dans les tissus sains. La dislocation de ces complexes pourrait donc favoriser l invasion cellulaire (Catusse et al., 2000). III-2. Remodelage de la MEC dans les tissus tumoraux La MEC peut être remodelée par différents processus, incluant la synthèse de novo des protéines qui la composent, son épaississement ou sa dégradation. A ce jour, les composants les plus étudiés dans ces phénomènes sont le collagène I et la fibonectine, deux des principaux composants de la MEC. Les fibroblastes sont les cellules du microenvironnement les plus impliquées dans la synthèse accrue des protéines de la MEC. En effet, les CAF surexpriment notamment la 47

48 Introduction bilbiographique-chapitre 1 fibronectine et le collagène de type I. Ce dernier joue de plus un rôle primordial dans la motilité des fibroblastes et des cellules tumorales (Wolf et al., 2007). Cette augmentation de l expression du collagène I et de la fibronectine entraîne également un épaississement de la MEC, un phénomène appelé stromatogenèse et souvent associé à la progression tumorale (Sivridis et al., 2004). Cet épaississement se traduit par une plus grande rigidité de la MEC dans la tumeur et le stroma environnant (Paszek et al., 2005). Les cellules tumorales ressentent ces modifications par l intermédiaire des intégrines et y répondent en modifiant de nombreuses voies de signalisation intracellulaires, menant à une expression accrue d intégrines (Yeung et al., 2005) et à une modification du comportement cellulaire (Wang et al., 1998 ; Paszek et al., 2005). Enfin, la MEC est également fortement modifié lors de l invasion tumorale, phénomène accompagné de la protéolyse de plusieurs de ces composants. La MT1-MMP (Membrane-Type Matrix Metalloproteinase 1) est une des principales protéases supportant la dégradation de la MEC en clivant notamment le collagène fibrillaire de type I (Wolf et al., 2007). C- LES PRINCIPALES PROTEASES DU STROMA TUMORAL La croissance d une tumeur primaire et sa dissémination sont dirigées par un grand nombre de facteurs incluant les protéases. Ces dernières sont impliquées lors des interactions entre la tumeur et le stroma, et notamment dans l activation ou l inactivation de cytokines ou de facteurs de croissance. Selon leur capacité à hydrolyser de manière irréversible de nombreux substrats présents dans le microenvironnement tumoral, les protéases interviennent dans différentes étapes de la cancérogenèse telles l angiogenèse, la prolifération et l adhérence cellulaire, le remodelage de la matrice extracellulaire, l inflammation ou l invasion (De Clerck et al., 2004 ; Wilson & Singh, 2008). Les quatre classes majeures de protéases, c est-à-dire les protéases à sérine, les protéases à cystéine, les protéases à aspartate et les métalloprotéases, sont impliquées dans la progression tumorale. Chaque protéase appartient à une famille, en fonction d une identité de séquence, et à un clan regroupant les familles qui possèdent une origine commune dans l évolution. Les protéases sont répertoriées dans la base de données MEROPS (the peptidase database : ; Rawlings et al., 2006). L hydrolyse d une liaison peptidique dépend d un mécanisme d acylation et de déacylation impliquant les résidus de la triade catalytique (Figure 7). 48

49 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Catalyse covalente (protéases à Ser, Cys, Thr) Catalyse acide-base (Asp, MMP) LIAISONS COVALENTES LIAISONS HYDROGENES CHAINE DU SUBSTRAT N-terminale Substrat C-terminale Protéase Figure 7 : Mode d action des protéases de mammifères. (a) Mécanismes catalytiques des protéases. (b) Type de clivage du substrat par les peptidases. (c) Représentation de l interaction enzyme/substrat selon la nomenclature de Schechter et Berger (Nature publishing group. Signalling scissors : new perspectives on proteases (online : En amont et en aval du site de clivage du substrat, entre les résidus P1 P 1, se situent des résidus impliqués dans la fixation à la protéase, P2, P3, Pn en N-terminal et P 2, P 3, P n en C-terminal (figure 7). Ces résidus du substrat se logent dans les sous-sites correspondants de la protéase (S2, S3, Sn et S 2, S 3, S n) selon la nomenclature de Schleter et Bergers, I - Les protéases à sérine Les protéases à sérine (EC n) clivent la liaison peptidique P1-P 1 grâce à la triade catalytique composée d une sérine, d une histidine et d un acide aspartique. Selon leur spécificité, trois groupes de protéases à sérine ont été définis dont celui de la trypsine avec une arginine ou une lysine en P1, celui de la chymotrypsine avec un résidu aromatique en P1 et celui de l élastase avec des petits résidus en P1. 49

50 Introduction bilbiographique-chapitre 1 I-1. Le système de la plasmine I-1.1. Activation du plasminogène en plasmine La plasmine (EC ) est une protéase à sérine de 90 kda et possédant une spécificité enzymatique de type trypsine. Son zymogène, le plasminogène, est synthétisé par les hépatocytes. La conversion du plasminogène en plasmine intervient après clivage de la liaison Arg Val 561, permettant la génération d une protéase à serine avec la triade catalytique His 602, Asp 645 et Ser 740 (Holvoet et al., 1985). Le clivage du plasminogène est catalysé par des enzymes spécifiques, l upa (urokinase Plasminogen Activator) et le tpa (tissue Plasminogen Activator) qui sont également des protéases à sérine. Le tpa (EC ), préférentiellement synthétisé par les cellules endothéliales, est principalement impliqué dans la génération de la plasmine dans le système vasculaire. En revanche, l upa (EC ) joue un rôle central dans l activation du plasminogène en plasmine au sein de la MEC et participe ainsi à son remodelage. L upa, synthétisé par les cellules épithéliales et les cellules endothéliales mais également par un grand nombre de cellules tumorales, participe aux processus inflammatoires et de réparation tissulaire. Cathepsines B, L KLK-2, -4 TFPI-2 PRO-MMP-1 PRO-MMP-2 PRO-MMP-3 PRO-MMP-9 RECEPTEUR DE LA PLASMINE OU DU PLAMSINOGENE RECEPTEUR DE LA PLASMINE OU DU PLAMSINOGENE MMP-1 MMP-2 MMP-3 MMP-9 DEGRADATION DE LA MEC TFPI-2 LIBERATION DE FACTEURS DE CROISSANCE FAMILLE DES RECEPTEURS LDLR ENDOCYTOSE ET RECYCLAGE DU RECEPTEUR RECEPTEURS PROTEASES INHIBITEURS Figure 8 : Le système de la plasmine. Une fois fixé à son récepteur (upar), le pro-upa est activé en upa par différentes protéases. L upa active alors le plasminogène en plasmine qui va à son tour activer les pro- MMP-1, -2, -3 et -9. Les MMP actives sont alors capables de dégrader les protéines de la MEC, libérant ainsi différents facteurs de croissance qui y sont séquestrés. L upar est ensuite internalisé pour être recyclé via des recepteurs de la famille des LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor). Ce système peut être inhibé à différents niveaux : l upa par les PAI, empêchant ainsi l activation du plasminogène, et la plasmine par l alpha 2 antiplasmine (α 2 -AP) ou le TFPI-2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor-2), empêchant l activation des MMP-1, -2, -3 et -9. (D après Croucher et al., 2008) 50

51 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Comme toutes les protéases à sérine, l upa est synthétisé sous forme d un zymogène ou pro-upa qui est activé par les cathepsines B et L ou les kallicréines KLK2 et KLK4 (Andreasen et al., 1997 ; Beaufort et al., 2006) après clivage de la liaison entre la Lys 158 et l Ile 159. L upa est également activé par la plasmine qui exerce ainsi un rétrocontrôle positif vis-à-vis de sa propre génération (figure 8). Pour être activé efficacement, le pro-upa doit tout d abord être lié à son récepteur, l upar (Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor) puis le complexe upa - upar active le plasminogène, lui-même fixé sur son récepteur membranaire (Blasi & Carmeliet., 2002). L upar est produit par de nombreuses cellules du microenvironnement dont les polynucléaires neutrophiles, les monocytes, les cellules épithéliales et les cellules endothéliales. Ce récepteur ne possède pas de domaine transmembranaire mais est ancré à la membrane par son extrémité C-terminale via un glycosyl-phosphatidylinositol ou GPI. L upar est également présent à la surface de la plupart des cellules tumorales issues de gliomes, d ostéosarcomes mais aussi de cancers du sein, de la prostate, du colon et du poumon (Andreasen et al., 1997). Une corrélation directe entre l activation du système upa/upar/plasmine et l agressivité du cancer, notamment la présence de métastases, est très fréquemment retrouvée (Dass et al., 2008). I-1.2. Fonctions de la plasmine Dans le secteur vasculaire, la fonction principale de la plasmine est d intervenir dans le processus de la fibrinolyse en hydrolysant la fibrine du caillot formé lors de la coagulation (Collen & Lijnen, 1986). En extravasculaire, la plasmine peut hydrolyser des protéines des membranes basales ou de la MEC comme la fibronectine, la vitronectine, la laminine, la thrombospondine, l élastine, la ténascine C, l aggrécane et la fibrine mais le collagène natif n est pas clivé par la plasmine. De plus, la plasmine peut favoriser la libération de facteurs de croissance à partir de la MEC et permettre l activation directe ou indirecte de nombreuses métalloprotéases, les MMP-1, -3, -7, -9, -10, -12 et 13, par clivage de leur pro-domaine (Visse & Nagase, 2003 ; Mook et al., 2004). I-1.3. Régulation de la plasmine I Par les serpines La génération de plasmine est régulée spécifiquement par des serpines (serine protease inhibitors), le PAI-1 et le PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor), qui inhibent à la fois le tpa et l upa, aussi bien sous sa forme libre que lorsqu il est complexé à l upar. Le 51

52 Introduction bilbiographique-chapitre 1 PAI-1 est produit par les plaquettes, les cellules endothéliales, les polynucléaires et les cellules tumorales. Ces dernières synthétisent également du PAI-2 de même que les cellules trophoblastiques, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les monocytes/macrophages. A la surface des cellules, le complexe upa/upar/pai interagit avec un récepteur de la famille des LDLR (Low-Density Lipoprotein Receptor) puis est internalisé (Croucher et al., 2008). L upa et le PAI sont dégradés alors que le récepteur upar est recyclé (Cubellis et al., 1990). L expression des deux inhibiteurs aurait des effets opposés puisque le PAI-1 serait plutôt associé à la progression de la tumeur et au mauvais pronostic du cancer alors que le PAI-2 réduirait la survenue de métastases et augmenterait la survie des patientes atteintes d un cancer du sein (Foekens et al., 2000). Les MMP et la plasmine peuvent aussi cliver l upar, ce qui diminue la quantité d upa à la surface cellulaire et réduit donc la génération de plasmine et de MMP actives (Blasi et al., 2002). L alpha 2-antiplasmine (α2-ap) est également un inhibiteur spécifique de la plasmine lorsque cette dernière n est pas fixée à son récepteur mais l α2-ap agit préférentiellement dans le plasma. I Par le TFPI-2 Le TFPI-2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor-2), appelé aussi MSPI (Matrix-associated Serine Protease Inhibitor) ou PP5 (Placental Protein 5), est un inhibiteur de protéases à sérine de type Kunitz physiologiquement présent dans de nombreux tissus et cellules. Son expression au sein des tumeurs étant souvent inversement corrélée au degré de malignité de ces dernières, l implication du TFPI-2 dans l inhibition de la progression tumorale est dorénavant reconnue cependant ses mécanismes d action sont encore incomplètement élucidés. Depuis plusieurs années, le laboratoire s est particulièrement focalisé sur l étude de cet inhibiteur de protéases qui fait également l objet de ce travail de thèse. Origine tissulaire et cellulaire du TFPI-2 Le TFPI-2 a initialement été isolé à partir du placenta humain à terme, tissu dans lequel il est retrouvé en abondance (Butzow et al., 1988 ; Chinni et al., 2008). L ARN messager et la protéine sont retrouvés dans les cellules syncytiotrophoblastiques bordant les villosités placentaires au contact du sang maternel (Butzow et al., 1988 ; Udagawa et al., 2002). En revanche, seuls les transcrits sont détectés dans la couche cytotrophoblastique sous-jacente à partir de laquelle se différencie le syncytiotrophoblaste (Hubé et al., 2003a). De nombreux autres organes et tissus comme le foie, les muscles squelettiques, le cœur, l estomac, le sein, l endomètre, le colon, le rein, le larynx, le pancréas et le cerveau 52

53 Introduction bilbiographique-chapitre 1 synthétisent également du TFPI-2 (Miyagi et al., 1994 ; Wojtukiewicz et al., 2003). Les cellules endothéliales vasculaires et surtout celles des petits vaisseaux produisent du TFPI-2, majoritairement sécrété (60 à 80%) vers le microenvironnement cellulaire et notamment la matrice extracellulaire (Rao et al., 1995b, Iino et al., 1998). Il s associe alors aux GAG et notamment à l acide hyaluronique, au sulfate de chondroïtine, au sulfate d héparane, au sulfate de dermatane, au sulfate de kératane, au collagène de type I, à la vitronectine, au fibrinogène et à la laminine-5. En revanche, il n établit aucune interaction avec le collagène de type IV, la fibronectine ou la laminine-1 (Rao et al., 1996 ; Liu et al., 1999 ; Rao et al., 1999 ; Rao et al., 2000). Le TFPI-2 non sécrété vers la MEC, soit 5 à 25%, reste associé à la membrane avec seulement 2% de la protéine libérée dans le milieu des cellules en culture. D autres cellules telles les cellules souches mésenchymateuses et les fibroblastes (Rao et al., 1995a, Izumi et al., 2000 ; Ishii et al., 2005), les cellules épithéliales (Deng et al., 2001 ; Ortego et al., 2002 ; Tanaka et al., 2004), les cellules musculaires lisses artérielles (Blindt et al., 2002) ou encore les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (Reverdiau et al., 1999) synthétisent également du TFPI-2. TFPI-2 et cellules cancéreuses Le niveau d expression du TFPI-2 dans les cellules tumorales est souvent inversement corrélé à l agressivité de la tumeur. Ceci a été observé dans les hépatocarcinomes (Neaud et al., 2000 ; Wong et al., 2007), les mélanomes (Konduri et al., 2000 ; Nobeyama et al., 2007), les choriocarcinomes (Jin et al., 2001 ; Iochmann et al., 2002), les carcinomes ovariens (Miyagi et al., 1994) mais aussi les cancers du sein (Guo et al., 2007), de l œsophage (Schrump & Nguyen, 2005), du poumon (Lakka et al., 2000 ; Rollin et al., 2005), du pancréas (Sato et al., 2004), de la prostate (Konduri et al., 2001a ; Rao et al., 2003), de l endomètre, de l estomac, du colon, du rein ou du larynx (Wojutukiewiccz et al., 2003). Ainsi, à titre d exemple, le TFPI-2 est présent dans le tissu cérébral sain alors que dans les gliomes de bas grade et les astrocytomes anaplasiques, son niveau d expression est plus faible (Rao et al., 2001). Dans les glioblastomes, tumeurs cérébrales les plus agressives, il n est plus détecté (Konduri et al., 2003a). De même, dans plus d un tiers des cas de cancers bronchopulmonaires non à petites cellules, et surtout dans les stades les plus avancés, une diminution de l expression du TFPI-2 de 4 à 120 fois est observée dans le tissu tumoral en comparaison du tissu pulmonaire sain adjacent (Rollin et al., 2005 ). 53

54 Introduction bilbiographique-chapitre 1 A l opposé, le TFPI-2 est retrouvé dans les cellules du stroma tumoral en particulier dans les macrophages infiltrant les tumeurs gastriques, rénales et broncho-pulmonaires non à petites cellules (Wojtukiewicz et al., 2003 ; Rollin et al., 2005). Gène du TFPI-2 Situé sur le chromosome 7 (7q22), le gène du TFPI-2 humain (7kb) comprend 5 exons séparés de 4 introns et est constitué d un promoteur, d une région 5 non codante de 75 pb, de la région codante de 705 nucléotides et d une région 3 non codante de 235 nucléotides (Sprecher et al., 1994). L exon 1 du gène code le peptide signal N terminal de 22 acides aminés, les exons 2 à 4 les trois domaines de Kunitz et l exon 5 la partie C-terminale de la molécule. Le promoteur du gène ne comporte ni boîte TATA ni boîte CAAT mais plusieurs sites d initiation de la transcription (figure 9). Un site majeur (MIS) ainsi que deux sites mineurs (mis) ont été localisés respectivement en -75, -49 et -38 en amont du site d initiation de la traduction (ATG) (Kamei et al., 2001 ; Hubé et al., 2003b). Comme de nombreux gènes ne possédant pas de boîte TATA, le gène du TFPI-2 peut être régulé grâce à la présence de plusieurs sites Sp1 situés en amont des sites d initiation de la transcription, soit en 284, 179 et 126 (Hubé et al., 2003b). La région promotrice proximale contient également d autres sites potentiels de fixation pour des facteurs de transcription, tels MyoD, LYF-1, NFY, GATA, oct-1, AP-1, NF1, NF-κB et egr-1/sp1. Une région suffisante pour l expression basale et inductible du gène TFPI-2, située entre 350 et 80 en amont de l ATG, a été caractérisée (Kamei et al., 2001 ; Konduri et al., 2002 ; Hubé et al., 2003b). Plusieurs sites AP-1 situés dans cette zone seraient importants pour l induction de l'expression du gène TFPI-2 par le PMA (Phorbol Myristate Acetate). En effet, cet ester de phorbol initie la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK laquelle induit la transcription des gènes fos et c jun. L hétérodimère Jun/Fos se fixe aux sites AP-1 et induit la transcription du gène TFPI-2 (Konduri et al., 2002, Kast et al., 2003). L activation de la voie de signalisation dépendante de JNK induit également une augmentation de l expression du TFPI-2 (Wolter et al., 2002) et pourrait impliquer les sites egr-1/sp1. Bien que l induction de l expression du TFPI-2 par le TNF-α soit variable d un type cellulaire à l autre, il est problable qu elle soit dépendante de NF-κB (Hinz et al., 2002). Dans les myofibroblastes hépatiques, l expression du TFPI-2 peut également être induite par la thrombine et cette induction bloquée en inhibant la cyclooxygénase-2 (Neaud et al., 2004). 54

55 Introduction bilbiographique-chapitre 1 % GC 75% 50% 25% NF1 Sp1-266 NF-kB egr-1 Promoteur inductible AP-1 Sp1 MIS mis mis ATG -166 egr Promoteur minimum +48 CpG Exon 1 Figure 9: Région promotrice du gène du TFPI-2. Le promoteur du TFPI-2 contient de nombreuses séquences de fixation pour différents facteurs de transcription tels que AP-1, Sp1 ou NF-κB. La région promotrice du TFPI-2 est également très riche en résidus GC avec un ilots CpG allant de la région promotrice minimum jusqu à l exon 1 (D après Hubé et al., 2003b). Le promoteur du gène du TFPI-2 humain a également la particularité d être très riche en résidus CG avec un ilot CpG, s'étalant de la région promotrice jusqu'à l'exon 1 (figure 9). ARN messager Un transcrit majeur d environ 1,4 kb et un transcrit mineur d environ 2 kb ont été détectés dans les cellules endothéliales humaines et les cellules placentaires (Miyagi et al., 1994 ; Sprecher et al., 1994), deux sites de polyadénylation étant présents. Dans le placenta où le gène du TFPI-2 est surexprimé, des transcrits de 2,2 et 2,8 kb sont retrouvés et leur présence peut être due à un épissage incomplet (Miyagi et al., 1994). Structure protéique du TFPI-2 Le TFPI-2 humain mature, après clivage du peptide signal de 22 acides aminés, est une glycoprotéine de 32 kda composée de 213 acides aminés dont 18 cystéines et qui possède 2 sites potentiels de N-glycosylation (séquences Asn-X-Thr/Ser) situés sur les Asn 94 et Asn 148 (Sprecher et al., 1994). En fonction du degré de glycosylation, des molécules de taille variable ont été détectées dans la matrice extracellulaire. La forme native de 27 kda est non glycosylée alors que les molécules de 29 et 32 kda sont partiellement glycosylées. Il est 55

56 Introduction bilbiographique-chapitre 1 probable que la glycosylation soit nécessaire pour permettre la sécrétion rapide des inhibiteurs de 32, 30 et 27 kda appelés «triplet TFPI-2» mais ne serait pas indispensable à leur fixation aux composants de la matrice ni à leur activité inhibitrice (Rao et al., 1996). Cet inhibiteur de protéases à sérine est constitué de trois domaines de type Kunitz (K) comportant chacun 3 ponts disulfures, d'une courte région amino terminale chargée négativement avec 3 résidus glutamyl et d une région carboxy terminale de 27 acides aminés, riche en acides aminés basiques dont 5 résidus lysyl consécutifs (figure 10). Figure 10: Structure protéique du TFPI-2. Les trois domaines de Kunitz, K1, K2 et K3 contiennent chacun 3 ponts disulfures. * représente les deux sites de N-glycosylation. (D après Sprecher et al., 1994). Le TFPI-2 présente des analogies avec le TFPI-1 (32% sur l ensemble de la molécule), et plus particulièrement dans la région C-terminale. Cette dernière est plus longue pour le TFPI-1 qui est ainsi plus sensible à la protéolyse. L'alignement des séquences des 2 inhibiteurs montre également des régions entre les domaines de Kunitz plus courtes pour le TFPI-2. En dépit de ces analogies, il est cependant à noter que les anticorps monoclonaux commercialisés et spécifiques du TFPI-1 ne réagissent pas avec le TFPI-2. Le TFPI-1 quant à lui agit essentiellement dans le secteur intravasculaire où il inhibe le complexe facteur tissulaire (FT) / facteur VIIa. La modélisation 3D du domaine K1 du TFPI-2 a permis de montrer que sa structure tridimensionnelle était extrêmement voisine de celle des domaines de Kunitz d autres inhibiteurs possédant cette structure, tel que le BPTI (Bovin Pancreatic Trypsin Inhibitor). L étude du domaine K1 du TFPI-2 par spectroscopies infrarouge et Raman et dichroïsme circulaire a montré une grande stabilité thermique de ce domaine (Zhang et al., 2007). La 56

57 Introduction bilbiographique-chapitre 1 structure secondaire du domaine K1 est composée de 24% de feuillets β constitués de brins antiparallèles, de l arginine 20 à la phénylalanine 33, de 13% de coudes β et de 17% d hélices α constituées de 2 tours, du tryptophane 48 à l alanine 54. Cette structure est stabilisée par trois ponts disulfures en positions 5-55, et 30-51, lesquels sont retrouvés dans tous les domaines de Kunitz. Activités inhibitrices du TFPI-2 vis-à-vis des protéases Bien que sa structure soit proche de celle du TFPI-1, le TFPI-2 exerce une activité inhibitrice vis-à-vis d une gamme de protéases à sérine plus variée, certaines étant impliquées dans les processus de la coagulation et de la fibrinolyse. Le TFPI-2 inhibe en effet fortement les activités amidolytiques de la trypsine, de la plasmine, du facteur XIa, de la chymotrypsine et de la kallicréine plasmatique, vis-à-vis de substrats synthétiques spécifiques avec des Ki respectivement de 2, 3, 15, 18 et 25 nm (Petersen et al., 1996a). Le TFPI-2 est plus faiblement inhibiteur de l activation du facteur X par le complexe IXa/polylysine (Ki = 410 nm), de la cathepsine G (Ki = 200 nm) et de l'activité amidolytique du complexe facteur tissulaire/viia. En revanche, le TFPI 2 n inhibe pas significativement la kallicréine glandulaire, l upa, le tpa, la protéine C activée, le facteur Xa, la thrombine et l élastase leucocytaire (Petersen et al., 1996b ; Kamei et al., 1999). L héparine augmente légèrement l inhibition de la plasmine et celle du complexe facteur tissulaire/viia (Sprecher et al., 1994 ; Liu et al., 1999). L inhibition des protéases à sérine par le TFPI-2 implique le domaine K1 (figure 11) et notamment le résidu P1 (Arg 24), qui interagit avec le site actif de l enzyme, pour la plasmine avec l Asp 189 (Hubé et al., 2003c ; Chand et al., 2004a). Par mutagénèse dirigée, Kamei et al. ont ainsi montré que le mutant R24Q TFPI-2, qui résulte d une substitution de l arginine 24 par une glutamine, perd son activité inhibitrice vis-à-vis de la trypsine et de la plasmine (Kamei et al., 1999). En revanche, la substitution par une lysine restaure non seulement l activité inhibitrice du K1 mais potentialise même cette dernière vis-à-vis de la trypsine et de la plasmine (Chand et al., 2004). Le domaine K1 du TFPI-2 permet d ailleurs à lui seul d inhiber la plasmine et la trypsine avec des constantes d inhibition inférieures à celles obtenues avec la molécule de TFPI-2 entière, soit pour la plasmine 3 nm pour le K1 contre 9 nm pour le TFPI-2 et pour la trypsine 13 nm contre 21 nm (Chand et al., 2004a). 57

58 Introduction bilbiographique-chapitre 1 A B Figure 11 : Interactions entre le domaine K1 du TFPI-2 et la plasmine. (A) Modélisation 3D du complexe plasmine / domaine K1 du TFPI-2. La représentation du domaine K1 du TFPI-2 en ruban (vert) montre l importance de l arginine 24 (jaune) dans l interaction avec le site actif de la plasmine, colorée en fonction de son potentiel électrostatique, avec les zones chargées négativement en rouge et les zones chargées positivement en bleu (D après Hube et al., 2003d). (B) Structure du KD1. En gris sont indiqués les acides aminés impliqués dans la stabilisation des interactions avec la plasmine, en noir les principaux acides aminés impliquées dans l activité inhibitrice du TFPI-2 envers la plasmine (D après Chand et al., 2004). La modélisation 3D de l interaction du K1 du TFPI-2 avec la plasmine (Hubé et al., 2003c) confirme que les charges positives de l Arg 24 du TFPI-2 réagissent avec les charges négatives de l Asp 189 située dans la crevasse de la plasmine (Figure 11A). Cette interaction est stabilisée par des liaisons hydrophobes impliquant les résidus Leu 26 (P 2), Leu 27 (P 3) et Leu 28 (P 4) du KD1 (Chand et al. 2004a). L absence de ces liaisons hydophobes lors des interactions entre le TFPI-2 et le facteur VIIa expliquent le plus faible potentiel inhibiteur du TFPI-2 vis-à-vis de cette protéase à sérine (Schmidt et al., 2005). Les expériences de mutagénèse du P6 (Asp 19) et du P 5 (Arg 29) ont montré une diminution considérable des activités inhibitrices du TFPI-2, surtout vis-à-vis de la plasmine (Chand et al., 2004a), témoignant de l importance de ces résidus proches du P1 dans la spécificité de l inhibition (Figure 11B). Le second domaine de Kunitz est quant à lui impliqué dans l interaction du TFPI-2 avec la protéine gc1qr, régulatrice des cascades du complément, de la coagulation et de la production des kinines. Cette interaction permettrait d expliquer la fixation du TFPI-2 à la matrice extracellulaire et à la surface cellulaire indépendamment des protéoglycanes (Peerschke et al., 2004). L association entre le TFPI-2 et l héparine ou les GAG de la MEC, qui sont chargés négativement, impliquerait plusieurs résidus arginine du K1 et du K3 du TFPI-2. Le TFPI-2 58

59 Introduction bilbiographique-chapitre 1 contient en effet trois résidus arginyl dans son premier domaine de Kunitz (K1) et quatre résidus arginine dans le troisième (K3), un ou plusieurs de ces résidus pouvant participer aux interactions TFPI-2/MEC. Un analogue de la lysine, l acide 6 aminohexanoïque, ne modifie pas l association du TFPI-2 avec la matrice, excluant un rôle des résidus lysyl de la partie C- terminale de la molécule dans son interaction avec les GAG. La conformation du TFPI-2, et plus particulièrement l intégrité de ses ponts disulfures, est essentielle à sa fixation à l héparine et à la MEC alors que la glycosylation ne paraît pas intervenir (Liu et al., 1999). Plusieurs études ont montré que le TFPI-2, en inhibant directement la plasmine, pouvait par conséquent réduire l activation de plusieurs MMP (figure 8). L équipe de Rao a ainsi été la première à montrer que le TFPI-2 recombinant (rtfpi-2) pouvait inhiber la plasmine en milieu liquide mais également la plasmine générée dans la matrice extracellulaire ou à la surface des cellules fibrosarcomateuses HT1080 (Rao et al., 1998). Ces mêmes auteurs ont ensuite démontré que l expression du récepteur de l activateur du plasminogène de type urokinase (upar) à la surface des cellules HT1080 et HeLa leur permettait d activer le plasminogène en plasmine et de générer ainsi des MMP-1 et -3 actives (Rao et al., 1999). Le TFPI-2, en inhibant la génération de MMP actives, limiterait alors la protéolyse de la matrice extracellulaire par ces protéases (figure 8). L inhibition de la plasmine peut également réduire la libération de facteurs de croissance et l activation du TGF-β. L action inhibitrice directe du TFPI-2 vis-à-vis des MMP actives reste encore controversée. En effet, certains auteurs ont montré une réduction de l activité gélatinolytique des MMP-2 et -9 que ce soit avec la protéine entière ou seulement avec le K1 (Kong et al., 2004). De même, le TFPI-2 inhiberait directement l activité des MMP-1 et MMP-3 et, dans une moindre mesure, celle des MMP-2 et -9 (Herman et al., 2001). En revanche, d autres travaux démontrent que le TFPI-2 n inhibe pas l activité protéolytique de la MMP-1 et qu il ne forme pas de complexe avec les MMP-1, -2 ou -9 (Du et al., 2003). Récemment, il a également été montré une interaction entre le TFPI-2 et ADAMTS1 (A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), métalloprotéase extracellulaire impliquée dans une variété de processus physiologiques. Le clivage par ADAMTS1 de la région C-terminale du TFPI-2 limiterait l association de ce dernier à la MEC et aux protéoglycanes sans altérer son activité inhibitrice vis-à-vis des protéases à sérine (Torres-Collado et al., 2006). 59

60 Introduction bilbiographique-chapitre 1 I-2. Les kallicréines tissulaires I-2.1. Localisation génomique Les kallicréines tissulaires humaines sont des protéases à sérine codées par 15 gènes (KLK1 à KLK15) situés sur le chromosome 19 dans une zone de 300 kb du locus q13.3-q13.4 (Borgono & Diamandis, 2004). La transcription des gènes des kallicréines aboutit à la synthèse d au moins 82 transcrits majoritaires et alternatifs (Kurlender et al., 2005). Pour chaque gène, au moins un transcrit coderait des pré-proenzymes avec un peptide signal N- terminal de 16 à 30 acides aminés, un propeptide qui les maintient sous la forme de zymogène et un domaine représentant la forme mature de la protéine (Yousef et al., 2001). L expression de la plupart des gènes des kallicréines est soumise à une régulation transcriptionnelle, notamment par les hormones stéroïdiennes. Ainsi, une surexpression de KLK2 et KLK3 est observée dans des lignés cellulaires de cancer du sein et de la prostate en réponse aux androgènes et à la progestérone (Young & Diamandis, 1995 ; Cleutjens 1997). En revanche, les gènes KLK1, 6 et 10 sont plus sensibles aux œstrogènes. Des facteurs épigénétiques comme la méthylation de l ADN sont également impliqués dans la régulation de l expression des gènes des kallicréines et notamment dans le cancer du sein pour KLK10 et KLK6 (Li et al., 2001 ; Sidiropoulos et al., 2005 ; Pampalakis et al., 2006). I-2.2. Expression tissulaire et cellulaire des kallicréines De nombreux tissus et organes co-expriment fortement les gènes de plusieurs kallicréines dont le système nerveux central (KLK6, 7, 8, 9 et 14), la peau (KLK5, 7, 8 et 11), le sein (KLK5, 6, 7, 10, 12 et 13), la moelle osseuse (KLK14), la prostate (KLK2, 3, 4, 11 et 15). L expression des gènes KLK5, 6, 7, 10, 11, 12 et 13 est également retrouvée dans le poumon même s il n est pas leur site exclusif de synthèse (Thèse de C. Planque, 2005). Les kallicréines synthétisées sont localisées dans le cytoplasme des cellules glandulaires épithéliales puis sécrétées dans de nombreux fluides biologiques dont le plasma, le lait et le liquide séminal (Borgono et al., 2004 ; Petraki et al., 2006). I-2.3. Kallicréines tissulaires et cellules cancéreuses Les 15 kallicréines tissulaires humaines sont différemment exprimées dans le cancer et le sont particulièrement dans les cancers hormonaux dépendants. Selon l origine tissulaire, les kallicréines peuvent être sur- ou sous-exprimées. Ainsi, les kallicréines KLK11, 14 et 15 sont sur-exprimées dans le cancer de la prostate, alors que les KLK2, 3, 5, 6 et 10 sont sous- 60

61 Introduction bilbiographique-chapitre 1 exprimées. Cependant, au sein d une même tumeur, l expression des KLK peut être variable (Borgono et al., 2004), avec des niveaux d expression différents au cœur de la tumeur où à l interface tumeur-stroma. Les kallicréines sont également retrouvées dans plusieurs autres cancers non hormonaux dépendants. Par exemple, l expression des KLK5, 6, 7, 8, 10, 11, 13 et 14 a été décrite dans le cancer du poumon (Planque et al., 2005, 2006, 2008) et il est a noter l augmentation des taux de KLK5, 7, 8, 10 et 12 dans le sérum de patients atteints de cancer du poumon, comparativement à ceux de sujets sains. L expression de KLK5 est plus élevée dans les carcinomes épidermoïdes, mais non correlée à la survie des patients, alors que celle de KLK7 est diminuée dans les adénocarcinomes (Planque et al., 2005). A l inverse, les taux de KLK11, 13 et 14 sont diminuées dans le cancer pulmonaire. Les kallicréines seraient ainsi de nouveaux marqueurs tumoraux (Diamandis & Yousef, 2002, Paliouras et al., 2007) et l analyse combinée du taux de sécrétion de plusieurs kallicréines comme KLK4, 8, 10, 11, 12, 13 et 14 pourraient ainsi servir de facteur pronostique (Planque et al., 2008b). La KLK3 ou PSA (Prostate Specific Antigen) est d ailleurs un marqueur tumoral du cancer de la prostate déjà bien connu (Diamandis 1998), rôle que peut tout aussi efficacement remplir la KLK2 et la KLK11 (Magklara et al., 1999). I-2.4. Structure des kallicréines tissulaires Les kallicréines tissulaires sont synthétisées sous la forme de pré-proenzymes inactives de 244 à 293 acides aminés avec une forme mature constituée d une chaîne polypeptidique d environ 30 kda composée de 227 à 252 acides aminés (Clements et al., 2004). Cette forme mature possède la triade catalytique caractéristique des protéases à sérine, His-Asp-Ser, ainsi que 10 à 12 cystéines à l origine de 5 à 6 ponts di-sulfures (Figure 12). Douze des kallicréines tissulaires humaines font partie de la famille S1 de la trypsine et possèdent des résidus glutamyl ou aspartyl en position S1, capables de former une liaison électrostatique avec une lysine ou une arginine chargées positivement. Les trois kallicréines tissulaires restantes, KLK3, 7 et 9 possèdent respectivement une sérine, une asparagine ou une glycine, leur conférant une spécificité de type chymotrypsine (Yousef et al., 2001). La plupart des kallicréines tissulaires sont glycosylées avec une O-glycosylation pour KLK1 et seulement des sites de N-glycosylation pour les autres kallicréines. Elles sont organisées en 2 domaines formés d un feuillet β à 6 brins anti-parallèles et d une hélice α avec le site actif situé entre ces deux domaines. De plus, des boucles flexibles situées au voisinage du site actif des KLK1, 2 et 3, pourraient participer au contrôle de l activation, de la spécificité de substrat et d inhibiteurs de ces protéases. 61

62 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Figure 12 : Structure tridimensionnelle de la proklk6. Les structures secondaires sont représentées par des flêches (feuillet-β) et des rubans (hélices-α). Les chaines latérales des résidus de la triade catalytique (gris clair) et les six ponts dissulfures (gris foncé SS1-SS6) sont représentés. Les extrémités N et C- terminales et la position des structures en boucles sont également indiquées (D après Gomis-Rüth et al., 2002). I-2.5. Rôle physiologique des kallicréines tissulaires Le rôle physiologique des kallicréines 1, 2 et 3 a été largement décrit mais à ce jour, celui des autres kallicréines, de KLK4 à KLK15, n est pas encore bien compris. En effet, les fonctions des KLK libérées dans le milieu extracellulaire dépendent de la présence de substrats spécifiques dans le milieu environnant et restent encore mal connues. Ainsi, les KLK3, 5, 6, 13 et 14 ont été décrites comme capables de dégrader différentes protéines de la matrice extracellulaire prenant part au remodelage matriciel à l instar des métalloprotéases (Stamenkovic, 2003). De plus, les KLK2 et 4 sont capables de contribuer indirectement au remodelage de la MEC en clivant le pro-upa et générant ainsi de l upa (Borgono et al., 2004). KLK2 potentialise même les effets de l upa en inactivant son inhibiteur, le PAI-1 (Mikolajczyk et al., 1999). Ces kallicréines activent aussi différentes pro- MMP (Sternlicht & Werb, 2001) et clivent le plasminogène, libérant alors l angiostatine connue pour inhiber l angiogenèse (Fortier et al., 2003). Les KLK5, 6 et 14 peuvent également activer ou inactiver les PAR (Protease-Activated Receptor), récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, et ainsi participer à la régulation des processus biologiques auxquels sont associés ces récepteurs (Oikonomopoulou et al., 2006). Les PAR sont en effet impliqués dans l activation plaquettaire, l inflammation, la régulation du tonus vasculaire et de la douleur. 62

63 Introduction bilbiographique-chapitre 1 I-2.6. Régulation de l activité des kallicréines L activation des kallicréines tissulaires se fait via le clivage de leur propeptide et nécessite l action de protéases de type trypsine comme la trypsine elle-même, l entérokinase ou encore d autres kallicréines douées de cette activité enzymatique. Certaines kallicréines telles KLK2, 4, 5, 12 et 13 pourraient également s auto-activer (Borgono et al., 2004). Les kallicréines peuvent être inactivées par protéolyse interne, soit par une autoinactivation, soit par une inactivation médiée par d autres protéases encore mal connues (Borgono et al., 2004). Cependant, la régulation de l activité des kallicréines est principalement assurée par des inhibiteurs capables d interagir avec leur site actif comme les serpines et notamment l α1-antitrypsine, l α1-antichymotrypsine, le PAI-1, l antitrombine et l α2-antiplasmine (Borgono et al., 2004). Dans le plasma, l α2-macroglobuline est l inhibiteur majoritaire des KLK avec lesquelles elle forme des complexes. I-3. L élastase leucocytaire, la protéase 3 et la cathepsine G I-3.1. Origine cellulaire Les protéases des polynucléaires sont exprimées tout au long de la différenciation cellulaire depuis le stade promyélocyte et sont stockées dans les granulations primaires ou azurophiles, sous forme active. Lors de leur activation et de leur dégranulation, les polynucléaires neutrophiles (PNN) libèrent des protéases à sérine de la famille de la chymotrypsine, comme l élastase leucocytaire (HNE, Human Neutrophil Elastase, EC ), la protéase 3 (PR3, Proteinase 3, EC ) et la cathepsine G (CG, EC ). Ces trois protéases participent notamment au remodelage de la MEC lors des réactions inflammatoires (Pham, 2008 ; Korkmaz et al., 2008). Les monocytes et les mastocytes synthétisent également la cathepsine G et l HNE dans lesquels de faibles taux d ARNm sont retrouvés (Shapiro et al., 1991). I-3.2. Fonctions biologiques Les protéases des polynucléaires sont capables de cliver l élastine, dont le tissu pulmonaire est très riche, mais aussi d autres protéines de la MEC tels les collagènes (Mainardi et al., 1980a ; 1980b ; 1980c ), la fibronectine (Mc Donald & Kelley, 1980), la laminine et des protéoglycanes (Heck et al., 1990). Elles participent activement à la défense de l organisme par la destruction des microorganismes et peuvent également être libérées sous forme active dans l environnement extracellulaire lorsque le PNN est exposé à des stimuli inflammatoires. (Belaaouaj et al., 2000). La cathepsine G (CG) et l élastase pourraient aussi 63

64 Introduction bilbiographique-chapitre 1 rester associées à la membrane des PNN via une fixation aux sulfates d héparane et de chondroïtine de la MEC ce qui les protègeraient de l inactivation par leurs inhibiteurs (Campbell & Owen, 2007). L élastase leucocytaire est capable de cliver le TFPI-1 entre les thréonines 87 et 88 situées dans le polypeptide reliant les domaines de Kunitz K1 et le K2 alors qu elle n a aucune action sur le TFPI-2 (Petersen et al., 1992). Les protéases des polynucléaires interviennent aussi dans la régulation de chimiokines ou de cytokines en clivant notamment RANTES (CCL5), l IL-8, SDF-1α et MIP-1α, ainsi que le récepteur du TNF-α (TNFR75). L HNE peut également hydrolyser le pro-tgf β à la surface des cellules épithéliales pulmonaires puis le TGF-β alors libéré active la voie de signalisation dépendante de l EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) permettant la sécrétion de mucus (Kohri et al., 2002). Les récepteurs PAR impliqués dans l inflammation sont aussi la cible des protéases des PNN avec des effets pro ou anti-inflammatoires. Il a également été démontré que l HNE, en dégradant le plasminogène, potentialiserait l activation de ce dernier par l upa (Machovich et al., 1989). La génération de plasmine serait ainsi favorisée d autant que l HNE clive également le PAI-1 le rendant inactif. De plus, l HNE activerait les pro-mmp -1, -2, -3 et 9 et permettrait la génération de formes actives de ces métalloprotéases (Zhu et al., 2001). I-3.3. Protéases des polynucléaires neutrophiles et des cellules cancéreuses L élastase leucocytaire est synthétisée par différentes lignées de cellules tumorales pulmonaires et le taux de l HNE au sein des tumeurs broncho-pulmonaires est plus élevé dans les stades les plus avancés de cancer (Yamashita et al., 1996). Ces taux élevés d élastase leucocytaire pourraient être associés à la présence d un polymorphisme situé dans la région promotrice du gène suggérant un rôle de cette protéase dans le développement du cancer du poumon (Taniguchi et al., 2002). Les concentrations élevées d élastase leucocytaire dans les PNN de patientes atteintes de cancer du sein ont également été corrélées à la présence de métastases et à un faible taux de survie (Yamashita et al., 1995 ; Foekens et al., 2003 ; Akizuki et al., 2007). Le taux de l HNE est également augmenté dans les leucémies aigues promyélocytaires (Lane & Ley, 2005). I-3.4. Régulation des protéases des polynucléaires neutrophiles Deux grandes familles d inhibiteurs, les chelonianines et les serpines, régulent les protéases des PNN. 64

65 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Le SLPI (Secretory Leukocyte Protease Inhibitor), exprimé par les cellules épithéliales, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles ainsi que l élafine, retrouvée dans les sécrétions bronchiques, sont les inhibiteurs naturels de l HNE, de la PR3 et de la CG appartenant à la famille des chélonianines (Moreau et al., 2008). De nombreuses études ont montré que la synthèse de SLPI, inhibiteur de protéase à sérine de 11,7 kda, était modulée dans de nombreux cancers mais de façon variable d un cancer à un autre. Ainsi, le SLPI est sous exprimé dans le carcinome pharyngé (Sriuranpong et al., 2004), le cancer de la vessie (Liang et al., 2002) et dans certains cancers du sein (Kluger et al., 2004 ). A l inverse, il est surexprimé dans les cancers du pancréas (Iacobuzio-Donahue et al., 2003), du col de l utérus (Rein et al., 2004) et de l ovaire (Israeli et al., 2005). Dans les CBPNPC, la concentration sérique de SLPI a directement été corrélée avec le stade du cancer, son taux étant plus élevé dans les stades III et IV que dans les stades I et II. Il a même été observé une diminution de la concentration plasmatique de SLPI après l exérèse chirurgicale ou la chimiothérapie chez des patients atteints de CBPNPC (Ameshima et al., 2000). Des serpines comme l α1-pi (α1 Protease Inhibitor) ou le MNEI (Monocyte / Neutrophil Elastase Inhibitor) inhibent également l HNE, la PR3 et la CG dont l inhibiteur physiologique principal est l α1-antichymotrypsine. II Les cathepsines à cystéine II-1. Caractéristiques générales et localisation cellulaire des cathepsines à cystéine Les cathepsines à cystéine humaines forment un groupe de 11 protéases (B, H, L, S, C, K, O, F, V, X, et W) douées d une activité enzymatique de type papaïne (famille C1, clan CA). Ce sont principalement des endopeptidases intracellulaires localisées dans les vésicules endolysosomales où leur activité est optimale en raison de l acidité du milieu (Brix et al., 2008 ; Lecaille et al. 2008). Les cathepsines à cystéine exercent également une activité dans l environnement péricellulaire vers lequel elles sont sécrétées. Elles agissent alors sous forme soluble ou liée à des récepteurs membranaires. Les cathepsines B, H et L sont très largement exprimées dans l organisme alors que les cathepsines F, S et V sont plus spécifiques de certains tissus ou cellules. La cathepsine K, détectée à l origine dans les ostéoclastes et les cellules ovariennes, est maintenant retrouvée dans la plupart des cellules épithéliales, notamment thyroïdiennes et pulmonaires (Buhling et al., 1999). Cette cathepsine est un marqueur de l inflammation et notamment de l activation macrophagique. 65

66 Introduction bilbiographique-chapitre 1 II-2. Cathepsines à cystéine et cellules cancéreuses De manière générale, l expression et l activité des cathepsines sont augmentées dans des conditions néoplasiques et ces protéases peuvent alors jouer un rôle dans différents processus favorisant la progression tumorale. Dans les carcinomes in situ, il a été montré que les cathepsines étaient sécrétées vers le pôle basal des cellules contribuant ainsi à la dégradation de la MEC (Rozhin et al., 1994). Une diffusion régulière des protéases est également possible en raison de leur localisation dans des cavéoles (Mohamed & Sloane, 2006). Les cathepsines B et L ont été parmi les plus étudiées et leur augmentation, observée dans différents cancers, est généralement associée à un mauvais pronostic (Palermo & Joyce, 2008). Ainsi, dans le cancer du poumon, la cathepsine B a été décrite comme étant plus abondante dans le tissu cancéreux comparativement au tissu sain, au même titre que les cathepsines L et S (Mohamed & Sloane, 2006) et cette surexpression est corrélée à un mauvais pronostic (Inoue et al., 1994). Même si la cathepsine H est moins exprimée dans les tissus tumoraux, son expression est cependant associée à une diminution de la survie chez les patients fumeurs (Schweiger et al., 2000). A l opposé, un taux élevé de cathepsine S dans les tissus tumoraux est directement associé à un meilleur pronostic et à une survie des patients allongée (Kos et al., 2001). 66

67 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Tableau I : Expression tissulaire et fonctions des cathepsines à cystéine humaines (D après Brix et al., 2008). Cathepsines à cystéine Expression tissulaire Localisation et fonction biologique B Ubiquitaire Lysosomale et extracellulaire Rôle dans l invasion et la dissémination métastatique C Ubiquitaire Lysosomale, active les protéases à sérine des granulocytes, Factor XIII neuraminidases F Cœur, muscles striés, cerveau, testicules, ovaires Lysosomale Rôle dans l invasion dissémination métastatique H Cerveau, rein, foie, amygdales enflammé Lysosomale Dégradation de la chaîne légère invariable K Principalement dans les os; dans la plupart des epithelia Lysosomale et extracellulaire Résorption osseuse, dégradation du fibrinogène et ECM L Ubiquitaire Lysosomale, extracellulaire, nucléaire (tronquée); présentation antigène (PA), régulation du cycle cellulaire O Largement exprimée Lysosomale; turnover protéine S Macrophages alvéolaires, rate, testicules, cellules épithéliales, LT CD4+ Lysosomale, extracellulaire, athérogenèse, PA, angiogenèse, activité élastinolytique V Principalement dans le thymus, testicules, présent dans cerveau, epithelium de la cornée, peau Lysosomale (putative), PA W Rate, NK et LT cytotoxiques (LTC) Réponse immunitaire, régulation de l activité cytotoxique des LTC X Largement exprimée; ubiquitaire dans les tumeurs primaires et les lignées cellulaires cancéreuses Lysosomale, adhérence cellulaire En plus de leur surexpression et/ou de leur activité accrue, certaines cathepsines peuvent également être redistribuée différemment dans la cellule lors de la progression tumorale. En effet, dans la cellule normale, les cathepsines à cystéine sont localisées principalement dans le lysosome alors que, dans la cellule cancéreuse, elles peuvent être exprimées à la surface cellulaire et secrétées dans le milieu extracellulaire. La présence de pompes à protons ATP dépendantes, générant un ph péricellulaire acide, a permis de démontrer que ces protéases restaient actives et stables même après leur sécrétion (Punturieri 67

68 Introduction bilbiographique-chapitre 1 et al., 2000). Cette localisation extracellulaire leur permet notamment d interagir avec la matrice extracellulaire et d influencer la progression néoplasique (tableau I). II-3. Structure et activation des cathepsines à cystéine Les cathepsines B, L et H sont des enzymes monomériques d environ 30 kda, possédant une structure à deux domaines avec à leur interface un site catalytique en forme de V. L un des domaines est composé d hélices α et l autre contient un motif en feuillet β (McGrath, 1999). Les acides aminés du site actif sont une cystéine, située en position 25 (numérotation papaïne) et localisée à l extrémité N-terminale de l hélice α, une histidine et une asparagine. La cystéine forme une liaison ionique avec l histidine 159 positionnée sur le feuillet β à l opposé du site actif. Les spécificités enzymatiques sont principalement dues aux sites de liaison au substrat de S3 à S1 (Turk et al., 2002 ; Choe et al., 2006). La plupart des cathepsines sont des endopeptidases, hormis les cathepsines B et H qui exercent respectivement des activités carboxy-dipeptidasique et aminopeptidasique. La majorité des cathepsines sont synthétisées sous la forme d une pré-procathepsine. L activation du zymogène se fait via le clivage du propeptide en position N-terminale, action accomplie in vitro par des endopeptidases comme la pepsine, la cathepsine D ou d autres cathepsines à cystéine, ou encore selon un processus autocatalytique en milieu acide (Turk et al., 2000 ; Mohamed et al., 2006). Une fois maturées, les cathepsines ont un énorme potentiel d activité car leur concentration à l intérieur des lysosomes peut facilement excéder 1 mm (Xing et al., 1998). II-4. Fonctions des cathepsines à cystéine Les cathepsines interviennent dans un grand nombre de fonctions physiologiques générales (tableau I), comme la dégradation des protéines intracellulaires ou encore le recyclage des protéines au sein des compartiments endosomaux et lysosomaux (cathepsines B, L, K et H). D autres fonctions plus spécialisées sont exercées par certaines cathepsines comme la présentation de l antigène au molécules de classe II du CMH (cathepsines B, L et S), le remodelage des tissus osseux (cathepsine K), la différenciation des kératinocytes et le cycle folliculaire capillaire (cathepsine L), la reproduction (cathepsine L) et l apoptose (cathepsines C et B) (Mohamed et al., 2006). Elles présentent une activité protéolytique visà-vis des constituants majeurs de la matrice extracellulaire, dont le collagène et l élastine, et de la membrane basale. Les cathepsines participent ainsi à divers processus pathologiques 68

69 Introduction bilbiographique-chapitre 1 incluant la progression tumorale, avec notamment l angiogenèse et l invasion, l ostéoporose ou encore la polyarthrite rhumatoïde. II-5. Inhibition de l activité des cathepsines à cystéine Les cathepsines peuvent être régulées par des inhibiteurs spécifiques endogènes, les cystatines, divisées en trois groupes, les stéfines, les cystatines et les kininogènes. Les stéfines sont intracellulaires alors que les cystatines et les kininogènes sont extracellulaires (Turk & Bode, 1991). En plus de ce groupe, d autres inhibiteurs spécifiques ont été décrits, comme les thyropines ou les serpines (Schick, 1998 ; Mohamed et al., 2006) ou le fragment de la chaîne invariable p41 associé au CMH de classe II, qui est un inhibiteur spécifique de la cathepsine L (Guncar et al., 1999). III Les protéases acides III-1. Localisation génomique et expression cellulaire de la cathepsine D Le gène de la cathepsine D est situé dans la région p15.5 du chromosome 11 où se trouve également localisé l oncogène H-Ras (Minarowska et al., 2008). La cathepsine D, lysosomale, est exprimée dans la plupart des cellules humaines, des tissus et des organes hormis les érythrocytes matures, dépourvus de lysosomes (Fusek & Vetvicka, 2005). La majeure partie de la cathepsine D se situe dans la fraction soluble, mais 20% des molécules seraient liées à la membrane (McIntyre & Erickson, 1991). L expression transcriptionnelle de la cathepsine D est régulée par les hormones stéroïdiennes et notamment les oestrogènes, par les facteurs de croissance IGF-1, TNF-α et EGF, et par l acide rétinoïque (Minarowska et al., 2008). III-2. Cathepsines D et cellules cancéreuses La cathepsine D est surexprimée dans les tumeurs mammaires et cette surexpression serait corrélée à la présence de métastases et donc à un mauvais pronostic (Rochefort, 1992). Cependant l utilisation de la pro-cathepsine D comme facteur pronostique est difficile en raison du manque de procédure standardisée pour la doser et des difficultés à diférencier les formes intra ou extracellulaires. Dans le cancer du sein, l augmentation du taux de cathepsine D, dont la production est stimulée par les oestrogènes, serait cependant associée à un moins bon pronostic même en l'absence d'une atteinte ganglionnaire. De plus, une étude récente a montré que la cathepsine D serait exprimée de manière plus importante dans les tissus issus 69

70 Introduction bilbiographique-chapitre 1 d un carcinome pulmonaire en comparaison de tissus sains, suggérant un rôle potentiel de cette peptidase comme biomarqueur dans le cancer du poumon (Lou et al., 2007). III-3. Structure de la cathepsine D La cathepsine D (EC ), synthétisée sous la forme d une pré-pro cathepsine, est une endopeptidase de 44 kda, faisant partie de la famille A1 des peptidases à aspartatyl comme la pepsine. La structure secondaire de ces protéases est principalement constituée de feuillets β avec de courts segments d hélice α. Le repliement de la structure tertiaire permet la formation d une structure en deux lobes au fond de laquelle se situent deux résidus aspartyl et la triade catalytique Asp-Thr-Gly, permettant la fixation du substrat aussi bien que celle d un inhibiteur (Fusek et al., 2005). III-4. Rôle physiologique de la cathepsine D La cathepsine D assure sa fonction principale de protéolyse dans les compartiments lysosomaux de la cellule. Elle pourrait également être impliquée dans la dégradation d antigènes (Mohamadzadeh et al., 2004), d hormones et de neuropeptides (Fusek et al., 2005). La cathepsine D est également impliquée dans le remodelage tissulaire (Saftig et al, 1995) en raison de sa capacité à dégrader les protéines de la MEC à ph acide. La procathepsine D aurait également un rôle dans l apoptose (Bidere et al., 2003). III-5. Régulation de l activité de la cathepsine D Le seul inhibiteur endogène connu de la cathepsine D est l α2-macroglobuline plasmatique, mais son activité peut également être neutralisée par des anticorps, quelques glycoaminoglycanes et des fragments d ADN. Une famille d inhibiteurs spécifiques produits par les bactéries du genre Streptomyces, les pepstatines, peuvent également inhiber l activité de cette protéase (Minarowska et al., 2008). IV - Les métalloprotéases matricielles IV-1. Structure et classification des MMP Les métalloprotéases, ou MMP (Matrix MetalloProteinase) sont des endopeptidases qui contiennent un atome de zinc dans leur site actif. Les MMP font partie de la super-famille des metzincines qui inclut d autres enzymes possédant un site métalloprotéase tels que les astacines, les adamlysines ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease domain) et ADAM-TS 70

71 Introduction bilbiographique-chapitre 1 (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type I motif), les serralysines, les snapalysines et les leishmaniolysines. A ce jour, 24 MMP différentes ont été isolées chez l homme, de la MMP-1, décrite pour la première fois en 1963, à la MMP-28, découverte en 2001 (Greenlee et al., 2007). Les MMP-4, -5, et -6 ont été retirées de la liste quand il a été prouvé qu elles étaient identiques à des membres précédemment identifiés. Les MMP-18 et 22 correspondent à des métalloprotéases non humaines. Les gènes codant les MMP-1, -3, -7, -8, -10, -13, -20, -27 sont tous regroupés sur le chromosome 11 à proximité de la région 11q22 (Visse & Nagase., 2003). Les autres MMP sont codées par des gènes répartis sur les chromosomes 1, 8, 12, 14, 16, 20, et 22. Les critères pour qu une protéine appartienne de la famille des métalloprotéases matricielles sont la présence de 3 domaines conservés : un prédomaine permettant l acheminement de la protéine à la surface cellulaire, un prodomaine et le groupement catalytique (figure 13). Le prodomaine, d environ 80 acides aminés, contient la séquence consensus Pro-Arg-Cys-Gly-(Val/Asn)-Pro-Asp dont le résidu thiol de la cystéine (motif «cystein switch» ) établit une liaison avec l atome de zinc du site actif permettant de maintenir la MMP sous forme zymogène (prommp). Le domaine catalytique possède la séquence consensus His-Glu-X-His-XX-Gly-X-X-His dont les trois résidus histidinyl lient l atome de zinc du site actif. A l exception des MMP-7, -23 et -26, les MMP possèdent également une région charnière (Hinge region) riche en résidus prolyl et un domaine hémopexine dans l extrémité C-terminale de la protéine qui intervient dans la spécificité de substrat. MMP-sécrétées Structure minimale des MMP-(MMP-7, -26) SH MMP-membranaires MMP-trans-membranaires (MMP-14, -15, -16, -24) SH S S MMP-avec un domaine hémopexine simple (MMP-1, -3, -8, -10, -12, -13, -18, -19, -20, -22, -27) MMP-membranaires avec un domaine GPI (MMP-17, -25) SH S S SH S S MMP-trans-membranaire avec un domaine Ig-like (MMP-23) SH Gélatinase avec des domaines de type fibronectine (MMP-2, -9) SH S S Légende MMP-sécrétées avec un site de clivage de type furine (MMP-11, -28) SH S S MMP-avec un domaine de type vitronectine (MMP-21) SH S S Pré-domaine Pro-domaine Domaine catalytique Zn 2+ Domaine hémopexine Domaine fibronectine de type II Région charnière (Hinge) Séquence de clivage de la furine Domaine vitronectine Domaine transmembranaire Domaine d ancrage GPI (glycophosphatidylinositol) Domaine transmembranaire de type II Domaine riche en cystéine Domaine Ig-like Figure 13 : Classification structurale des MMP sécrétées et membranaires. (D après Egeblad & Werb, 2002). 71

72 Introduction bilbiographique-chapitre 1 En se basant sur leur spécificité de substrat, leur homologie de séquence et leur organisation structurelle, les MMP ont été classées en différents groupes : les collagénases, les gélatinases, les stromélysines et matrilysines (figure 13). De plus, les MMP peuvent être classées selon qu elles sont secrétées ou associées à la membrane. IV-1.1 Les collagénases Les collagénases-1 (MMP-1), -2 (MMP-8) et -3 (MMP-13) sont les principales protéases sécrétées capables d initier la dégradation de la MEC en protéolysant le collagène fibrillaire natif de type I-III et VII (Tableau II). Ces collagénases clivent la chaîne α du collagène générant ainsi des fragments N-terminal 3/4 et C-terminal 1/4 qui sont rapidement dénaturés en gélatine, laquelle sera à son tour dégradée par d autres MMP. La MMP-1 clive préférentiellement le collagène de type III, tandis que la MMP-8 dégrade le collagène de type I (Egeblad & Werb et al., 2002). La MMP-1 est produite par de nombreuses cellules telles que les fibroblastes, les kératinocytes, les cellules endothéliales, les macrophages et les cellules tumorales. La MMP-8 est synthétisée par les polynucléaires lors de leur maturation dans la moelle osseuse et est sécrétée en réponse à des stimuli externes. 72

73 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Tableau II: Caractéristiques et principaux substrats des MMP (D après Visse & Nagase., 2003; Lagente et al., 2005 ; Nagase et al., 2006 ; Wilson & Singh et al., 2008 ). MMP Localisation chromosomique ARN (pb) Masse moléculaire (kda) Principaux substrats MMP-1 (Collagènase 1) MMP-2 (Gélatinase A) MMP-3 (Stromélysine 1) MMP-7 (Matrilysine 1) MMP-8 (Collagènase 2) MMP-9 (Gélatinase B) MMP-10 (Stromélysine 2) MMP-11 (Stromélysine 3) MMP-12 (Métallo-élastase) MMP-13 (Collagènase 3) MMP-14 (MT1-MMP) MMP-15 (MT2-MMP) MMP-16 (MT3-MMP) MMP-17 (MT4-MMP) 11q p ,9 11q q ,7 11q ,4 20q ,4 11q ,2 22q ,6 11q q ,8 14q ,9 16q ,8 8q Collagènes (types I, II, III, VII, VIII, X, XI), gélatine, fibronectine, IGFBP, laminine, vitronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, caséine, CXCL12, fibrine, fibrinogène, IL-1β, L-sélectine, pro-tnf-α, Perlecan, MMP-1, -2, -9 Collagènes (types I, II, III, II, IV, V, VII, X, X, XI), gélatine, élastine, fibronectine, IGFBP3, laminine, vitronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, CCL7, CXCL12, FGFR1, fibrine, fibrinogéne, fibrinogène, IL-1β, plasminogène, IL-1β, plasminogène, TGF-β latent, TGF-β pro-tnf-α, latent, pro-tnf-α MMP1, -2, -9, -13 Collagènes (types III, IV, V, VII, IX, X, XI, XVIII), gélatine, élastine, fibrine, fibrinogène, fibronectine, IGFBP, laminine, perlecan, vitronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, caséine, CXCL12, E-cadhérine, IL-1β, L-sélectine, PAI-1, plasminogène, pro-tnf-α, upa, MMP-1, -2,-3, -7, -8, Collagènes Collagènes (types (types I, IV), I, gélatine, IV), gélatine, élastine, élastine, fibronectine, fibronectine, laminine, laminine, vitronectine, vitronectine, α1-pi, caséine, α1-pi, E-cadhérine, caséine, E-cadhérine, FasL, fibrinogéne, FasL, intégrine fibrinogène, β4, plasminogène, intégrineβ 4, plasminogène pro-tnf-α, MMP1,, pro-tnf-α -2, -9 Collagènes (types I, II, III), α2-macroglobuline, α1-pi, fibrinogène, MMP-8 Collagènes (types IV, V, XI, XIV, XVIII), gélatine, élastine, IGFBP3, laminine, vitronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, caséine, CXCL1, CXCL4, précurseur du CXCL7, CXCL12, fibrine, fibrinogène, IL-1β, CXCL8, IL-2Rα, plasminogène, TGF-β, pro-tnf-α Collagènes (types III, IV, V), gélatine, élastine, laminine, fibronectine, caséine, fibrinogène, MMP-1, -8, -10 Collagène type IV, gélatine, fibronectine, laminine, IGFBP, α2-macroglobuline, α1-pi, PAI-2, caséine Collagènes (types I, IV, V, XVIII), gélatine, élastine, fibronectine, laminine, vitronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, caséine, fibrinogène, plasminogène, pro-tnf-α Collagènes (types I, II, III, IV, VI, IX, X, XIV, XVIII), gélatine, fibronectine, α-macroglobuline, caséine, CXCL12, fibrinogène, MMP-9, -13 Collagènes Collagènes (types I, (types II, III), I, II, gélatine, III), gélatine, fibronectine, fibronectine, perlecan, perlecan, laminine, laminine, vitronectine, vitronectine, α1-pi, α2- Macroglobuline, α-macroglobuline, CD44, α1-pi, CXCL12, CD44, fibrine, CXCL12, fibrinogéne, fibrine, intégrine fibrinogène, αv, pro-tnf-α, αv-intégrine, MMP-2, pro-tnf-α -13, fibronectine, laminine, perlecan, pro-tnf-α Collagène III, gélatine, vitronectine, laminine, caséine, fibronectine, α2-macroglobuline, α1-pi, MMP -2 12q ,1 Gélatine, fibrine, fibrinogène, pro-tnf-α, MMP -2 MMP-19 12q ,4 Collagène (types I, IV), gélatine, fibronectine, laminine, caséine, fibrine, fibrinogène MMP-20 (Enamelysine) MMP-21 (XMMP) MMP-23 (CA-MMP) 11q ,4 Collagène XVIII 10q p ,9 MMP-24 (MT5-MMP) 20q ,2 MMP-25 (MT6-MMP) MMP-26 (Matrilysine 2) MMP-27 (CMMP) MMP-28 (Epilysine) Gélatine, caséine, MMP -2 Gélatine Gélatine, fibronectine 16q Collagène type IV, gélatine, fibronectine, fibrinogène, fibrine 11p ,7 Collagène type IV, gélatine, fibrinogène, fibronectine, vitronectine, caséine, α2-macroglobuline,α1-pi, E-cadhérine, FasL 11q Gélatine, caséine 17q ,9 Caséine La MMP-13 clive préférentiellement le collagène de type II et possède une meilleure activité gélatinolytique que les MMP-1 et -8. Elle dégrade également les collagènes de type IV, IX, X, XV, la fibronectine, la laminine, le fibrilline-1 et les inhibiteurs de 73

74 Introduction bilbiographique-chapitre 1 protéases à serine. En raison de son affinité pour de nombreux substrats, la MMP-13 est essentiellement exprimée dans les zones nécessitant un remodelage rapide de la MEC tel que le tissu osseux fœtal en développement ou dans des conditions pathologiques lors d inflammation chronique ou d invasion tumorale. IV-1.2. Les gélatinases Les gélatinases (MMP-2 et -9) ont la particularité de posséder un domaine CBD (Collagen Binding Domain) situé au sein du domaine catalytique et comprenant trois domaines répétés analogues aux motifs de la fibronectine de type II. Ces motifs permettent la fixation de l enzyme au collagène de type IV, à la gélatine et à la laminine (Allan et al., 1995), composants majeurs de la MEC. Les substrats de la MMP-2 et de la MMP-9 sont proches mais toutefois non identiques (tableau II) (Bjorklund & Koivunen, 2005). En effet, la MMP-2 dégrade le collagène de type I, action non exercée par la MMP-9. Cette spécificité de substrat est attribuée au résidu S2 du site catalytique qui est un aspartyl pour la MMP-9 et un glutamyl pour la MMP-2. L activité collagénolytique de la MMP-2 est ainsi bien plus faible que celle de la MMP-1. Cependant, la prommp-2 étant recrutée à la surface cellulaire pour y être activée, elle possède une bonne activité gélatinolytique sur ou à proximité de la surface cellulaire (Nagase et al., 2006). Les gélatinases sont exprimées par de nombreuses cellules dont les fibroblastes, les cellules endothéliales et les monocytes pour la MMP-2 et les polynucléaires et les macrophages alvéolaires pour la MMP-9 (Johansson et al., 2000). Elles sont également exprimées par de nombreuses cellules tumorales. IV-1.3. Les stromélysines Les stromélysines, MMP-3, -10 et -11, ont une organisation structurelle de leur domaine similaire aux collagénases mais elles ne clivent pas le collagène interstitiel. Les stromélysines -1 et -2 (MMP-3 et -10) ont un spectre protéolytique étendu qui inclut de nombreuses glycoprotéines et des protéoglycanes. La MMP-3 a une activité protéolytique plus importante que la MMP-10 envers les composants de la MEC et elle est de plus capable d activer d autres pro-mmp, comme la MMP-1 dont la génération nécessite également l activité de la MMP-3 (Bini et al., 1996). Les MMP-3 et MMP-10 sont exprimées par les fibroblastes et les cellules épithéliales normales ou transformées. La MMP-11 n a qu une très faible activité envers les protéines de la MEC (Murphy et al., 1993) mais intervient dans le clivage des inhibiteurs de protéases à serine, comme l α-1 74

75 Introduction bilbiographique-chapitre 1 antitrypsine (Pei et al., 1994). La MMP-11 est principalement exprimée dans les tissus tumoraux et faiblement pour les cellules du microenvironnement IV-1.4 Les matrilysines Les matrilysines, MMP-7 (matrilysine-1) et MMP-26 (matrilysine-2) sont les MMP structurellement les plus simples et se caractérisent par l absence du domaine hémopexine. La MMP-7 clive de nombreux composants de la MEC mais également des molécules de surface comme la pro-α-défensine, le Fas-ligand, le pro-tnfα, la E-cadhérine et RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa beta Ligand) à la surface des ostéoblastes (Nagase et al., 2006 ; Lynch et al., 2005) Elle est synthétisée par les cellules épithéliales de l endomètre, de la peau, des voies respiratoires et également par les cellules tumorales d origine épithéliale. La MMP-26 a également une large activité envers les protéines de la MEC et contrairement à de nombreuses MMP, elle est majoritairement stockée en intra-cellulaire (Marchenko et al., 2004). La MMP-26 est principalement exprimée par les cellules normales et les carcinomes d origine épithéliale. IV-1.5. Les MMP membranaires Il existe également des MMP membranaires (MT-MMP). Les MMP-14, -15, -16, et - 24 (respectivement MT1-, MT2-, MT3- et MT5-MMP), possèdent un domaine transmembranaire de type I suivi d un petit domaine C-terminal cytoplasmique. Deux MMP membranaires, les MMP-17 et -25 (respectivement MT4- et MT6-MMP), présentent une région hydrophobe de type GPI (glycosylphosphatidylinositol) qui permet leur ancrage à la membrane. La MT1-MMP est exprimée par les fibroblastes du derme, les cellules épithéliales malignes. De nombreux tissus expriment les MMP membranaires. Ainsi, la MT3-MMP et la MT5-MMP sont présentes dans le tissu pulmonaire et rénal. Il a été montré que ces 2 protéases membranaires existent également sous la forme de MMP soluble. L expression des MT2- et MT3-MMP a été observée dans le placenta et le cœur. Dans le cerveau, les MT2-, MT4- et MT5-MMP ont également été décrites (Visse & Nagase., 2003). La MMP-23 est une MMP transmembranaire qui ne possède pas de peptide signal et qui est ancrée dans la membrane par sa séquence N-terminale du pro-domaine (Fillmore et al., 2001 ; Visse & Nagase., 2003). Ce pro-domaine est très court et ne présente pas de motif «cysteine switch». Le clivage, entre le pro-domaine et le domaine catalytique, par les furines permet donc à la fois l activation et la sécrétion de la MMP-23. De plus, la région charnière et le domaine hémopexine sont remplacés par un domaine riche en résidus cystéinyl et prolyl et 75

76 Introduction bilbiographique-chapitre 1 par un domaine IgG-like. La MMP-23 est principalement exprimée dans les tissus des organes reproducteurs et aurait un rôle fonctionnel dans le poumon et le cœur (Fillmore et al., 2001). IV-1.6. MMP hétérogènes Parmi les autres MMP, la MMP-12, ou métalloélastase, est principalement exprimée par les macrophages et digère l élastine et de nombreuses autres protéines (Nénan et al., 2005). La MMP-19 (Stracke et al., 2000) est synthétisée principalement par les kératinocytes et des cellules de nombreux organes dont le poumon (Sadowski et al., 2003). L expression de la MMP-20 est restreinte au tissu dentaire tandis que la MMP-21 est exprimée dans de nombreux tissus fœtaux et adulte (Ahokas et al., 2003). Enfin, la MMP-28 ou épilysine est fortement exprimée dans les testicules et plus faiblement dans le poumon et de nombreux autres organes. Elle est également synthétisée par les kératinocytes et jouerait un rôle dans la cicatrisation (Saarialho-Kere et al., 2002). IV-1.7. Substrats des MMP De nombreux substrats ont été décrits pour les MMP, notamment les composants de la MEC dont le clivage facilite la migration cellulaire (tableau II). Bien qu elles aient un substrat préférentiel, le spectre protéolytique des différentes MMP est assez large ce qui permet la dégradation de l ensemble des protéines de la MEC. Cependant, le clivage des composants de la MEC tels que la laminine 5, le collagène de type IV, XV et XVIII peut générer des fragments avec de nouvelles fonctions favorisant ou au contraire inhibant l invasion tumorale ou l angiogenèse (Polette et al., 2004). Le plasminogène est également dégradé par les MMP- 3, -7, -9 et 12 ce qui génère un fragment capable d inhiber la prolifération des cellules endothéliales (Cornelius et al., 1998). Les molécules d adhérence font également partie des substrats des MMP. Ainsi, la MMP-3 et la MMP-7 clivent la E-cadhérine (Noë et al., 2001) tandis que le CD44 est clivé par la MT1-MMP (Kajita et al., 2001) ce qui va faciliter la dissémination et la migration des cellules tumorales. De plus, de nombreuses molécules capables de réguler l expression des MMP peuvent à leur tour être un substrat des MMP. Ainsi, les MMP participent également au relargage de précurseurs membranaires des facteurs de croissance comme le TGF-β qui peut être libéré après clivage par les MMP-2 et 9 (Yu & Stamenkovic, 2000). Le bfgf peut être relargué après dégradation du perlecan des cellules endothéliales par les MMP-1 et 3 (Whitelock et al., 1996). Les récepteurs des facteurs de croissance tels que HER2/neu (Human Epidermal 76

77 Introduction bilbiographique-chapitre 1 growth factor Receptor/neu) et HER4, qui font partie de la famille des EGFR, sont également des substrats des MMP (Codony-Servat et al., 1999, Vecchi et al., 1998). Le récepteur du FGF-1 (Fibroblast Growth Factor), FGFR-1, est clivé par la MMP-2 (Levi et al., 1996). La MMP-7 est capable de générer la forme soluble de Fas Ligand et de potentialiser l apoptose de cellules épithéliales (Powell et al., 1999). Les MMP peuvent également cliver des inhibiteurs de protéases. Ainsi, les MMP-2, - 7, -9 et 12 clivent l inhibiteur de protéase-1 (α 1 -PI) (Liu et al., 2000). IV-2. Origine cellulaire des MMP Les MMP sont synthétisées à la fois par les cellules tumorales et les cellules du stroma (figure 14). De plus, dans le cadre d une coopération cellulaire, les cellules tumorales peuvent stimuler les cellules stromales afin qu elles produisent des MMP via l action de cytokines, de facteurs de croissance ou encore par l expression d EMMPRIN (Extracellular Matrix MetalloPRoteinase INducer) (Sternlicht & Werb, 2001). Les MMP vont alors agir dans le milieu extracellulaire. Cependant, les MMP exprimées peuvent être recrutées par la membrane des cellules du microenvironnement. Par exemple, l ARNm codant la MMP-2 est exprimé par les cellules stromales de tumeur du sein et la protéine est présente aussi bien à la surface des cellules stromales que tumorales (Polette et al., 1994). Macrophage MMP- 9,- 12 Lymphocyte MMP- 9 P é ricyte MMP- 9 Neutrophile MMP- 9 Fibroblaste MMP- 1,- 2,- 3,- 11,- 14 Myofibroblaste Fibroblaste MMP- 13 intra- tumoral MMP-2, -7, -9, -14 Cellule endothé liale MMP- 2,- 3,- 9 Cellule tumorale MMP- 1,- 3,- 7,- 9,- 13 Figure 14: Origine cellulaire des MMP dans le cancer du sein (D après Egeblad & Werb, 2002). Différentes MMP sécrétées peuvent ainsi avoir une localisation membranaire en s associant à des molécules d adhérence ou à des protéoglycanes de surface. Ainsi, la MMP-2 77

78 Introduction bilbiographique-chapitre 1 interagit avec l intégrine αvβ3 par son domaine hémopéxine (Brooks et al., 1998). La MMP-7 et la MMP-13 se fixent aux sulfates d héparane (Yu et al., 2002 ; Stamenkovic., 2003) ou au CD151, une glycoprotéine transmembranaire (Shiomi et al., 2005). La MMP-9 se fixe sur plusieurs récepteurs de surface tels que le CD44, ICAM-I et des intégrines (Bourguignon et al., 1998 ; Fiore et al., 2002 ; Yu et al., 2002 ; Stamenkovic, 2003). IV-3. Régulation des MMP Les MMP sont exprimées physiologiquement dans les tissus lors du développement et lors de processus physiologiques ou pathologiques nécessitant une migration cellulaire et un remodelage tissulaire. Leur activité peut être régulée à différents niveaux, lors de la transcription du gène, par activation protéolytique du zymogène et par l inhibition de l activité de l enzyme. L activité des MMP va donc dépendre de l équilibre entre leur activation et leur inhibition. IV-3.1. Régulation transcriptionnelle des MMP L expression des MMP peut être induite par des signaux extracellulaires tels que les cytokines, les facteurs de croissance ou lors de contacts cellule-cellule ou cellule-mec. Les gènes de MMP inductibles par ces signaux, tels que ceux des MMP-1, -3, -7, -9, - 10, -12 et 13, possèdent un site de fixation AP-1 (Activator Protein-1) dans leur promoteur proximal (Westermarck & Kahari, 1999 ; Samuel et al., 2007 ; Yoshinaga et al., 2008 ; Shih et al., 2008 ; Kim et al., 2008). En revanche, le promoteur des gènes codant les MMP-2, -11 et 14 ne contiennent pas de site AP-1. Ainsi, les signaux extracellulaires activent le complexe dimérique AP-1, composé des protéines Jun et Fos, qui se fixe au promoteur des MMP et active leur transcription. L activation du complexe AP-1 est médiée les MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) et font intervenir les voies ERK (Extracellular signal- Regulated protein Kinase), SAPK/JNK (Stress-Activated Protein Kinase/Jun N-terminal Kinase), et p38 (Westermarck & Kahari, 1999). Il a ainsi été montré que le blocage de la voie p38-mapk inhibait l expression des MMP-13, -1 et 9 par des kératinocytes transformés et des cellules SCC (Squamous Cell Carcinoma) ainsi que leur invasion in vitro (Simon et al., 1998 ; Johansson et al., 2000). Des résultats similaires ont été obtenus sur l expression des MMP-1 et -9 et sur l invasion des cellules SCC lorsque la voie ERK1/2 a été bloquée (Johansson et al., 2000). De même l inhibition des voies MEK/ERK1/2 et p38 MAPK/JNK inhibe l expression de la MMP-9 (Tai et al., 2008, Lee et al., 2008). 78

79 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Le facteur de transcription NF-κB joue également un rôle important dans la régulation des MMP et notamment de celle de la MMP-9 exprimée par les fibroblastes, les SMC (Smooth Muscle Cell) vasculaires (Bond et al., 1998), et les cellules tumorales issues d un sarcome de Hewing s (Sanceau et al., 2002) ou d un gliome (Nozell et al., 2008). Les facteurs de croissance ont également un rôle régulateur des MMP. Ainsi, l activation de l EGFR entraîne une surexpression de la MMP-14 dans les fibroblastes pulmonaires (Kheradmand et al., 2002). De plus, l augmentation des MMP-9 et 14 observée dans les cellules tumorales ovariennes après activation de l EGFR est médiée par la fixation de l élément PEA-3 (Polyomavirus Enhancer A binding protein-3) sur le promoteur des gènes codant les MMP (Cowden Dahl et al., 2007). Le facteur PEA-3, qui fait partie des facteurs de transcription de la famille Ets, est en effet présent sur le promoteur de plusieurs gènes des MMP, tels que les gènes MMP-1, -2, -3, -7, 9, -12, -13 et -14 et peut coopérer avec le site AP-1 pour augmenter la transcription de ces gènes (Ala-aho & Kahari, 2005 ; Overall & Lopez-Otin, 2002). De même, l activation de HER2 induit l expression de la MMP-7 via l action du facteur de transcription STAT3 (Yuan et al., 2008). L HGF (Hepatocyte Growth Factor) induit la surexpression des MMP-2 et -9 chez la souris (Mizuno et al., 2005) et de la MMP-1 dans des cellules issues d un cancer du pancréas (Singh et al., 2008). Le TGF-β, peut entraîner une diminution de l expression du gène de la MMP-1 (Yuan & Varga, 2001) ou a l inverse une augmentation de l expression des MMP-1, -3 et -9 dans des fibroblastes (McKeown et al., 2007 ; Sadick et al., 2008). Les chimiokines et cytokines sont également capables d induire des MMP, à l image de CCL2 qui augmente l expression de MMP-1 et -2 dans les fibroblastes, mécanisme médié par l IL-1α (Yamamoto et al., 2000). L IL-1, -6 et le TNFα entraînent la surexpression de différentes MMP dans les cellules en culture (Kusano et al., 1998 ; Kossakowska et al., 1999 ; Yao et al., 1997). L IL-13, via STAT6, peut également induire l expression de MMP-2 et -9 dans le poumon (Corry & Kheradmand., 2002 ; Venkayya et al., 2002). De même, L IL-1-β peut induire l expression des MMP-1 et -3 via l action du NF-κB (Tsutsumi et al., 2008). Enfin l IL-17 augmente également l expression de la MMP-1 via l activation de la voie des MAP-kinases et l action des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB (Cortez et al., 2007). 79

80 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Les intermédiaires de la réaction inflammatoire peuvent également réguler l expression de différentes MMP. Ainsi, les espèces réactives de l oxygène (ROS) présentes en abondance dans la fumée de cigarette stimulent par exemple l expression du gène MMP-1 via l activation des facteurs de transcription AP-1 et Ets-1 (Nelson et al., 2006). De plus, les ROS favorisent indirectement l activation d autres gènes de MMP via la voie des JNK et ERK (Nelson & Melendez., 2004, Nelson et al., 2006). Les espèces activées de l azote, telles que le monoxyde d azote endogène, a été décrit comme pouvant augmenter l activité du promoteur de la MMP-1 dans des cellules de mélanome en culture (Ishii et al., 2003). Le monoxyde d azote est également capable d induire l expression de la MMP-9 dans des cellules épithéliales pulmonaires (Marcet- Palacios et al., 2007). IV-3.2. Stabilité des ARNm La régulation de la stabilité des ARNm est importante notamment dans la régulation des gènes codant les collagénases (Ala-Aho & Kahari., 2005). En effet, la région non traduite 3 (3 UTR) de l ARNm de la MMP-1 et de la MMP-13 contient des séquences riches en bases AU qui jouent un rôle dans la stabilisation des ARNm. De plus, la voie p38 MAPK, impliquée dans la régulation de la stabilité de nombreux gènes, est capable de stabiliser l ARNm des MMP-1 et -3 dans les fibroblastes (Reunanen et al., 2002). IV-3.3. Activation des zymogènes en forme active Les MMP sont sécrétées sous formes inactives (pro-mmp) et le clivage du prodomaine est une étape indispensable à la génération des formes actives (Van Wart & Birkedal-Handsen, 1990). Ce processus nécessite la rupture de la liaison entre l atome de zinc et le résidu thiol de la cystéine du pro-domaine par des protéases telles que la plasmine, la trypsine, la chymase ou la tryptase. De nombreuses MMP sont également capables d activer des pro-mmp et peuvent aussi s activer elles-mêmes. Toutes les MT-MMP possèdent un site de clivage par les protéases de type furine situé entre le propeptide et le domaine catalytique qui permet l activation des formes latentes des MT-MMP. Ainsi, les MT-MMP, sont activées au niveau intracellulaire par une furine convertase alors que l activation des MMP solubles intervient soit à la surface cellulaire, soit au niveau de la MEC. Les MT-MMP interviennent également dans l activation protéolytique des autres MMP. Par exemple, la pro-mmp-2 est activée par toutes les MT-MMP, exceptée par la MT4-MMP (English et al., 2000). La protéolyse du pro-domaine est également observée après modification du thiol par des 80

81 Introduction bilbiographique-chapitre 1 composés physiologiques comme les oxydants, les bisulfites, les électrophiles ou des composés non physiologiques tels que des agents alkylants ou des métaux lourds. Les mécanismes conduisant à la formation des MMP actives sont donc complexes avec de nombreuses voies d activation croisées. Ainsi, l activation de la MMP-9 met en jeu les MMP-1, -2, -3, -7, -10, -13 et -26, mais également d autres protéases comme la trypsine-2 ou l élastase leucocytaire. Plusieurs études in vitro ont montré une activation de la MMP-9 par la MMP-3, elle-même étant activée par la plasmine (Ogata et al., 1992 ; Ramos- DeSimone et al., 1999). La MMP-2 est quant à elle activée par un processus particulier mis en jeu au niveau de la membrane cellulaire (figure 15). La pro-mmp-2 se lie ainsi à la MT1-MMP par l intermédiaire de TIMP-2 (Tissue Inhibitor of MetalloProteinases-2) formant un complexe trimoléculaire (Kinoshita et al., 1998 ; Strongin et al., 1995). Le domaine N-terminal de TIMP-2 se fixe à la MT1-MMP alors que son domaine C-terminal interagit avec le domaine hémopexine de la MMP-2. La formation de ce complexe à la surface de la cellule permet à une seconde molécule de MT1-MMP de cliver le pro-domaine N-terminal de la pro-mmp-2 au niveau de la liaison peptidique Asn 37 -Leu 38. La protéine formée est une forme intermédiaire de MMP-2 de 64 kda, partiellement activée, et qui est hydrolysée au niveau des résidus Asn 80 -Tyr 81 par une molécule de MMP-2 déjà active et liée à l intégrine α v β 3, permettant de générer la forme mature de MMP-2 (Deryugina et al., 2001). TIMP-2 participe donc à l activation de la MMP-2 mais lorsqu il est présent en excès, l activation est bloquée (Strongin et al., 1995). TIMP-3 et TIMP-4 peuvent également se fixer à la pro-mmp-2 et à la MT1-MMP. Toutefois le complexe incorporant TIMP-4 ne génère pas de MMP-2 active vraisemblablement en raison d un assemblage moléculaire inadapté par rapport à celui formé avec TIMP-2 ou TIMP-3 (Hernandez-Barrantes et al., 2001 ; Zhao et al., 2004). Extracellulaire pro-mmp-2 MMP-2 active TIMP-2 α β 3 v Intracellulaire Dimérisation de la MT1-MMP Fixation de TIMP-2 Fixation de la pro-mmp2 et 1 er clivage protéolytique intégrine 2 nd clivage protéolytique par la MMP-2 active fixée à l intégrine α v β 3 MMP-2 active Figure 15 : Mécanismes d activation de la pro-mmp-2 par le complexe MT-1-MMP/ TIMP-2 à la surface cellulaire (Thèse de J. Rollin, 2006) 81

82 Introduction bilbiographique-chapitre 1 Certaines MMP sont également activées sans clivage du prodomaine après un changement conformationnel observé lors de la fixation de la MMP au substrat et favorisant le clivage de la liaison entre le groupement thiol du prodomaine et l atome de zinc. Ainsi, dans des kératinocytes en migration, de la pro-mmp-1 active a été observée après fixation au collagène via l intégrine α2β1 (Dumin et al., 2001). De même, il a été montré que la pro- MMP-9 pouvait être active après fixation à la gélatine (Bannikov et al., 2002). IV-3.4. Activation des MMP au sein du microenvironnement Parmi les facteurs impliqués dans la coopération entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement tumoral, l EMMPRIN ou CD147 est impliqué dans l augmentation de l expression des MMP-1, -2, -3, -9, -14 et 15 et dans l induction de l angiogenèse en stimulant l expression du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (Foda et al., 2001 ; Haseneen et al., 2003 ; Nabeshima et al., 2006a). D autres fonctions d EMMPRIN ont été décrites comme l activation de cellules T, rôle de molécule chaperonne pour le transport de monocarboxylate, récepteur de la cyclophilline A ou encore comme protéine intervenant dans le développement du système nerveux et dans la maturation des cellules impliquées dans la reproduction (Nabeshima et al., 2006b). L EMMPRIN est une glycoprotéine membranaire, de 44 à 66 kda, (Biswas et al. 1995), appartenant à la superfamille des immunoglobulines et codée par un gène présent sur le chromosome 9. Il est composé de deux domaines immunoglobulines extracellulaires, d un domaine transmembranaire et d un court domaine cytoplasmique (Biswas et al ; Muramatsu & Miyauchi, 2003) (figure 16). La région extracellulaire contient trois sites de N- glycosylation et la partie glycanique diffère selon l origine de la protéine, lui conférant sa variabilité de masse moléculaire. La glycosylation du premier domaine immunoglobuline a été décrite comme indispensable à l activité stimulatrice des MMP (Guo et al., 1997 ; Sun & Hemler, 2001, Yan et al., 2005). Ainsi, l EMMPRIN purifié et déglycosylé ne peut non seulement pas induire l expression de MMP mais est en plus un antagoniste de la molécule glycosylée et interfère sur son activité stimulatrice de MMP (Sun & Hemler, 2001). Le second domaine immunoglobuline permet l association avec la cavéoline-1 et régule l activité de l EMMPRIN en diminuant la formation des formes hautement glycosylées d EMMPRIN ainsi que l ancrage de la molécule à la surface des cellules. En effet, l EMMPRIN existe à la fois sous une forme membranaire et une forme secrétée. Cette dernière est observée après relargage de vésicules à partir de la membrane de la cellule tumorale et peut donc stimuler l expression de MMP à distance de la tumeur. 82

83 Introduction bilbiographique-chapitre 1 L interaction entre les cellules peut être médiée par l oligomérisation de molécules d EMMPRIN via le premier domaine immunoglobuline extracellulaire (Fadool & Linser, 1996 ; Yoshida et al., 2000 ; Belton et al., 2008). De plus, il a été montré que des anticorps dirigés contre ce domaine de la protéine bloquaient son activité inductrice des MMP, possiblement en empêchant l oligomérisation d EMMPRIN (Biswas et al ; Sun & Hemler, 2001). L interaction d EMMPRIN avec un récepteur non encore identifié est également possible. 27 kda + glycosylation INDUCTION DE MMP INTER-LIAISONS EN TRANS OLIGOMERISATION EN CIS ASSOCIATION AUX INTEGRINES ASSOCIATION A LA CAVEOLINE-1 Forme mature kda DOMAINE DE LIAISON A LA MEMBRANE DOMAINE CYTOPLASMIQUE Figure 16 : Structure de l EMMPRIN (D après Nabeshima et al., 2006). L EMMPRIN est souvent surexprimé dans de nombreuses tumeurs malignes telles que les cancers de la vessie (Muraoka et al., 1993), de la peau (Van den Oord et al., 1997) du sein et du poumon (Polette et al., 1997 ; Caudroy et al., 1999 ; Dalberg et al., 2000). De plus, l EMMPRIN est la protéine la plus exprimée dans les tumeurs primaires et les micrométastases, suggérant un rôle central dans la progression tumorale et la formation de métastases (Klein et al., 2002). Les mécanismes par lesquels l EMMPRIN agit sont encore peu connus. Il a cependant été montré que l EMMPRIN membranaire stimulait la production de la MMP-1 par des fibroblastes via la voie de signalisation de la p38 MAPK (Lim et al., 1998) et celle de la MMP-2 par l activation de la voie phospholipase A2 et 5-lipoxygénase (Taylor et al., 2002). Dans des cellules issues d un carcinome mammaire, EMMPRIN est capable de stimuler de manière autocrine l expressiondes MMP-2 et -9 via une voie de signalisation utilisant ERK1/2 (Li et al., 2007) IV-3.5. Inactivation des MMP Les inhibiteurs régulant l activité des MMP exercent un rôle critique dans l homéostasie de la MEC. De nombreux inhibiteurs directs des MMP sont décrits tels que la 83

84 Introduction bilbiographique-chapitre 1 famille des TIMP, RECK (REversion inducing Cystein rich protein with Kazal motif), l αmacroglobuline ainsi que des fragments de digestion du collagène comme l endostatine par exemple (Greenlee et al., 2007 ; Fu et al., 2008) (figure 17). Collagène XVIII Endostatine MMP active pro-mmp MMP-9 active MMP-2 active TIMP-1 TIMP-2 TIMP-4 TIMP-3 pro-mmp-2 MT1-MMP RECK pro-mmp-9 ADAM-10 ADAMTS-4 MT-MMP Héparane sulfate ADAM-10,-12,-17,-19 ADAMTS-4, -5 Figure 17: Les inhibiteurs directs des MMP. Les TIMP inhibent l ensemble des MMP, bien que TIMP-1 n inhibe pas les MMP membranaires (MT-MMP). TIMP-1 et TIMP-3 inhibent également certaines ADAM et ADAMTS. RECK inhibe la MMP-2, la MMP-9 et la MT1-MMP. D autre part, RECK régule également la sécrétion de la pro-mmp-9. L endostatine est un produit de dégradation du collagène XVIII par les MMP, qui inhibe l activité de nombreuses MMP, notamment les MMP-2 et -9 (Thèse de J. Rollin, 2006). IV Les TIMP Les TIMP sont les inhibiteurs directs majeurs des MMP, d une masse moléculaire d environ 21 kda. Quatre ont à ce jour été caractérisés: TIMP-1, -2, -3 et -4. Ce sont des protéines sécrétées qui ont une affinité élevée pour les MMP avec lesquelles elles forment des complexes réversibles de rapport stœchiométrique 1:1. Le domaine C-terminal des TIMP peut établir une liaison avec le domaine hémopexine de la pro- MMP-9 ou de la pro-mmp-2, mais c est la région N-terminale des TIMP qui interagit avec le domaine catalytique et inhibe les MMP avec l implication de la séquence VIRAK, séquence conservée dans tous les TIMP de toutes les espèces (Lambert et al., 2004). Les TIMP sont capables d inhiber un grand nombre de MMP mais avec une efficacité variable. Par exemple, TIMP-1 inhibe la MMP-9 avec une constante d inhibition (Ki) de 8,5 nm alors que le Ki du complexe TIMP-2/MMP-9 est de 43,4 nm (Olson et al., 1997). TIMP-2 84

85 Introduction bilbiographique-chapitre 1 inhibe l activité de MMP, mais il participe également à l activation de la pro-mmp-2 (figure 17). TIMP-3 inhibe également les membres de la famille de protéases ADAM (Handsley & Edwards, 2005 ; Wisniewska et al., 2008). Les ADAM sont impliquées dans la dégradation de la MEC et participent, pour certaines d entre elles, au développement tumoral (Huovila et al., 2005). De plus, TIMP-3 est le seul inhibiteur de cette classe capable de se fixer aux molécules de sulfate d héparane de la MEC, ce qui lui permet d être localisé à proximité des membranes basales (Yu et al., 2000). IV RECK RECK est une glycoprotéine membranaire de 110 kda qui possède 3 domaines de type SPI (Serine Protease Inhibitor) dont l un contient une séquence consensus avec un motif de type Kazal. Il possède également un domaine GPI qui permet son ancrage à la membrane (Takahashi et al., 1998). Il a été montré in vitro que RECK inhibe directement l activité de la MMP-2 et celle de la MT1-MMP, limitant ainsi l activation de la pro-mmp-2 en MMP-2 active (Oh et al., 2001) (figure 17). RECK pourrait également interagir avec la MT1-MMP et CD13 pour accélérer l internalisation de la MT1-MMP (Miki et al., 2007). L activité gélatinolytique des MMP-9 et MMP-2 est aussi directement inhibée par la protéine recombinante RECK avec un Ki de 78 nm. RECK régule également la sécrétion de la pro- MMP-9 puisqu une diminution de la sécrétion de ce zymogène a été associé à une forte expression de RECK dans les cellules étudiées (Takahashi et al., 1998). De plus, après traitement par la phospholipase C, libérant RECK dans le milieu de culture par clivage de son domaine GPI, la quantité de pro-mmp-9 sécrétée est augmentée. La localisation de RECK à la membrane semble donc nécessaire à son action régulatrice sur la libération de MMP-9 dans la MEC (Takahashi et al., 1998). Les capacités inhibitrices de RECK vis-à-vis des MMP-2, -9 et MT1-MMP suggèrent donc son implication dans l inhibition de l invasion tumorale. IV Inhibiteurs majorant la clairance des MMP Le dernier mécanisme permettant la régulation de l activité des MMP met en jeu trois types de protéines : le recepteur LRP (Low density lipoprotein Receptor-related Protein), l α2-macroglobuline et les thrombospondines 1 et 2 (THSB-1, -2). Ces protéines vont agir sur la clairance des MMP permettant l internalisation des protéases dans la cellule et leur dégradation. Les récepteurs LRP-1 et -2 font partie de la famille des récepteurs au LDL (Low Density Lipoprotein) mais contrairement à ces derniers, qui interviennent uniquement dans le 85

86 Introduction bilbiographique-chapitre 1 métabolisme des lipoprotéines, les LRP lient de multiples ligands. Ils s associent notamment des protéines de la MEC (fibronectine), des protéases à sérine (tpa et upa), des métalloprotéases (MMP-2, -9, -13) et des inhibiteurs de protéases (PAI-1, THSB-1 et THSB- 2) (Strickland & Ranganathan, 2003). Les LRP pourraient donc être des régulateurs important de la balance MMP/inhibiteurs au sein de la MEC. Ils agiraient en se liant directement aux MMP, comme la pro-mmp-9 via son domaine hémopexine (Hahn-Dantona et al., 2001 ; Van den Steen et al., 2006), ou en se fixant à des complexes inhibiteur-protéase tels que THSB-2/pro-MMP-2, TIMP-2/pro-MMP- 2 ou TIMP-1/MMP-9 (Emonard et al., 2005 ; Van den Steen et al., 2006 ). Ces complexes sont ensuite internalisés et dégradés dans la cellule. L α2-macroglobuline (α2m) est une glycoprotéine plasmatique homotétramérique de 720 kda, formée par l assemblage de deux paires de sous-unités identiques de 180 kda reliées entre elles par des ponts disulfures. Cet inhibiteur agit en piégeant la protéase à l intérieur de ce tétramère et possède un spectre d inhibition très large recouvrant l ensemble des quatre grandes classes de protéases. Parmi ces protéases, l α2m inhibe la plasmine, (Sottrup-Jensen, 1989), lui permettant ainsi de réguler indirectement l activation des MMP. De plus, l α2m est capable de former avec les formes actives de MMP des complexes qui sont internalisés dans la cellule via la protéine LRP puis dégradés (figure 17) (Borth, 1992). Les thrombospondines 1 et 2 (THSB-1 et -2) sont des glycoprotéines impliquées dans l adhérence cellulaire (cellule-cellule et cellule-mec) mais elles participent également à l inhibition et la clairance des MMP. Plusieurs études ont démontré que THSB-1 et THSB-2 sont synthétisées et secrétées par de nombreuses lignées cellulaires issues notamment de mélanome ou de gliome (Sid et al., 2004) mais également par des cellules du stroma telles que les fibroblastes et les cellules endothéliales (Adams & Lawler, 2004). Dans les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules, du colon, ou du col de l utérus, une faible expression de THSB-1 ou de THSB-2 est associée à un mauvais pronostic. De plus, l expression de ces deux molécules est inversement corrélée à la microdensité vasculaire des tumeurs (Oshika et al., 1998 ; Yamaguchi et al., 2002). Par ailleurs, une diminution d expression du gène de la THSB-1 en relation avec une hyperméthylation de son promoteur a été mise en évidence dans les cellules tumorales neuroblastiques, colorectales ou gastriques (Ahuja et al., 1997; Oue et al., 2003; Yang et al., 2003). 86

87 Introduction bilbiographique-chapitre 2 - CHAPITRE 2 - REGULATION DU TFPI-2 ET DES METALLOPROTEASES DU MICROENVIRONNEMENT : IMPACT SUR LES DIFFERENTES ETAPES DU DEVELOPEMENT TUMORAL La connaissance des mécanismes de la cancérogenèse a été largement approfondie ces dernières décennies, suffisamment pour que l on puisse maintenant affirmer que le cancer est une maladie causée par des altérations génétiques, accumulées par les cellules épithéliales dans le cas des carcinomes. Cependant, un nombre croissant d observations démontrent que la progression tumorale dépend également des interactions entre les cellules épithéliales, les cellules stromales et la MEC. De nombreuses études dans différents modèles de cancer, incluant le cancer du poumon, ont ainsi identifié un stroma «activé» ou «réactif» influant sur de nombreux mécanismes tumoraux et ce de l initiation à la dissémination métastatique. L association de ces deux phénomènes permet l apparition et la croissance de cellules tumorales de plus en plus agressives, capables d échapper au système immunitaire et d éventuellement coloniser différents sites de l organisme après une succession d étapes qui permettra la sélection des cellules néoplasiques les plus adaptées à la survie et au développement de la tumeur (figure 18) (Axelrod et al., 2006). Ce processus multi-étapes est notamment régulé par différents facteurs, parmi lesquels de nombreuses protéases et leur inhibiteurs. Le TFPI-2 et les MMP jouent ainsi un rôle important dans plusieurs étapes du développement de la tumeur. TRANSFORMATION ANGIOGENESE MIGRATION & INVASION ARRET DANS LE CAPILLAIRE capillaires, veinules, vaisseaux lymphatiques adhérence Aggrégats multicellulaires (plaquettes) EXTRAVASATION INTERACTIONS AVEC LE MICROENVIRONNEMENT PROLIFERATION TUMORALE ET ANGIOGENESE METASTASES SECONDE VAGUE DE METASTASES Figure 18 : Principales étapes de la progression tumorale (D après Langley & Fidler, 2008). 87

88 Introduction bilbiographique-chapitre 2 A-INITIATION ET PROLIFERATION CLONALE L initiation tumorale est un processus irréversible par lequel les cellules précancéreuses vont accumuler suffisamment de modifications génétiques pour être transformées et initier la prolifération tumorale, laquelle augmente à son tour le risque de mutations additionnelles. Ces mutations peuvent notamment entraîner l activation d oncogènes tels que ras ou myc ou à l inverse inhiber des gènes suppresseurs de tumeur tels que p53, Rb ou encore TFPI-2, de plus en plus décrit comme faisant partie de cette famille de gènes. L instabilité génétique est responsable de l apparition de sous-clones possédant de nouvelles propriétés comme la résistance à l apoptose, la différenciation, l échappement au système immunitaire, le remodelage de la MEC et l augmentation des pouvoirs invasif et métastasant. I Altérations génétiques et épigénétiques Les modifications de l expression génique peuvent être associées à deux phénomènes ; les altérations de l information génétique et les modifications épigénétiques. Elles peuvent être héréditaires, favorisant l apparition de cancers «familiaux», ou acquises, notamment lors d exposition à des agents cancérigènes tel que le tabac (Sawan et al., 2008). I-1. Altérations de l information génétique dans le cancer I-1.1. Altérations génétiques dans les cellules tumorales L information génétique peut être modifiée par plusieurs mutations dans un gène ou son promoteur. C est par exemple le cas des mutations touchant les oncogènes K-ras ou EGFR impliqués dans 10 à 30% des adénocarcinomes (Cho et al., 1997 ; Scagliotti et al., 2004 ; Herbst et al., 2008). L altération des gènes suppresseurs de tumeur tels que p53 est retrouvée dans 50 à 70% des CBPNPC, et celle de p16 dans 10 à 40% des cas (Mao et al., 1997 ; Brambilla et al., 1999 ; Herbst et al., 2008). L expression de ces oncogènes peut ensuite influencer celle d autres gènes. Ainsi, la répression de l expression du TFPI-2 dans certaines cellules tumorales pourrait résulter de l activation d oncogènes. En effet, la synthèse des ARNm du TFPI-2 est diminuée dans les cellules fibroblastiques MRC-5, exprimant une forte activitée de l oncogène H-ras (Izumi et al., 2000) et dans les cellules de neuroblastome dans lesquelles l oncogène MYCN, ou N-myc (Neuroblastoma-dervived MYeloCytomatsis oncogene), est surexprimé (Becker et al., 2008). Les altérations génétiques peuvent également intervenir à l échelle chromosomique avec la délétion ou le gain d une partie ou de la totalité d un ou plusieurs chromosomes, 88

89 Introduction bilbiographique-chapitre 2 phénomène appelé aneuploïdie, entraînant l acquisition d une ou plusieurs copies supplémentaires d oncogènes ou la perte de gènes suppresseurs de tumeur comme cela l a été observé pour les gènes p53 et RB (Weinberg, 2007). Pour le TFPI-2 également, des délétions du chromosome 7, où se situe son gène, sont fréquemment observées dans de nombreux cancers, et notamment ceux de l estomac (Jianchuan et al., 1999), du colon ou de la prostate (Atkin & Baker, 1993). De plus, dans des cancers hautement agressifs, la région chromosomique 7q est fréquemment délétée, entraînant une absence totale de TFPI-2 dans les cellules tumorales pancréatiques (Sato et al., 2004), prostatiques (Dong, 2001) ou utérines (Saito et al., 2005 ; Sell et al., 2005). Des variations de séquence ont également été détectées dans le promoteur du TFPI-2 et ces polymorphismes pourraient influencer la régulation du gène (Siegling et al., 2004 ; Rollin et al., 2007). I-1.2. Microenvironnement et altérations génétiques Ces altérations génétiques pourraient être induites par le stroma environnant, et notamment par les fibroblastes. Ainsi, une étude menée par Kuperwasser et al. en 2004 a consisté à injecter des cellules épithéliales humaines à des souris dont les tissus fibreux mammaires avaient été enrichis d un mélange de fibroblastes humains normaux et irradiés, afin d humaniser les tissus murins. Des cellules épithéliales saines se sont révélées capables de coloniser ces tissus fibreux murins humanisés puis de former un cancer in situ, puis un carcinome invasif (Kuperwasser et al., 2004). Le lien entre le vieillissement cellulaire et l incidence des cancers a également été établi. Ainsi, les fibroblastes issus de patients de ans et ans ont été comparés. Les fibroblastes de ce dernier groupe ce sont révélés plus permissifs à la croissance des cellules pré-néoplasiques prostatiques N15C6 que les fibroblastes des sujets plus jeunes (Kayali et al., 2003 ; Engl et al., 2006). Ces études semblent donc montrer qu un stroma altéré peut induire une instabilité génétique favorisant la formation de lésions néoplasiques. Les fibroblastes pourraient également jouer un rôle dans cette étape par l intermédiaire des MMP qu ils produisent et notamment des MMP-1, -2, -3, -9, -11, -13 et de la MT1-MMP (Basset et al., 1990 ; Sternlicht et al., 1999 ; Bisson et al., 2003 ; Ala-Aho & Kahari, 2005 ). Il a ainsi déjà été observé que la surexpression de MMP était un des phénomènes accompagnant la sénescence des fibroblastes, ceci pouvant favoriser la génération d un microenvironnement pro-oncogénique et expliquer en partie l augmentation de l incidence du cancer avec l âge (Liu & Hornsby, 2007). De plus, des études in vivo ont permis de lier l expression de MMP synthétisées par les fibroblastes lors d interactions avec des cellules 89

90 Introduction bilbiographique-chapitre 2 tumorales à l initiation tumorale. Ainsi, des fibroblastes n exprimant pas la MMP-11 ou la MT1-MMP ne soutiennent pas la croissance tumorale in vitro alors que les fibroblastes sauvages correspondants y contribuent (Masson et al, 1998 ; Zhang et al., 2006). De même, la MMP-3 stromale peut induire la transformation maligne de cellules en culture et la formation de carcinomes mammaires génétiquement instables chez la souris transgénique (Sternlicht et al., 1999). Ce phénomène serait expliqué par la capacité de la MMP-3 a induire un variant d épissage de Rac1 provoquant une augmentation de la production de ROS, connues pour induire des modifications génétiques (Radisky et al., 2005). De plus, les MMP ont une activité promotrice de la croissance tumorale diminuée lorsque leur capacité à s activer est réduite par adjonction de TIMP-2 ou d inhibiteurs synthétiques (Noel et al., 1998). Les cellules de l inflammation, recrutées sur le site tumoral, pourraient également causer des altérations génétiques à l origine de la transformation néoplasique des cellules épithéliales. En effet, lorsqu un tissu est lésé ou exposé à un irritant chimique, les cellules endommagées entrent en apoptose tandis que la croissance des cellules saines est accélérée pour faciliter la régénération, maintenant ainsi l homéostasie tissulaire. Cet état prolifératif et inflammatoire persiste même après la clairance de l agent irritant ou la cicatrisation du tissu. Il apparaît alors un environnement «activé», riche en cellules inflammatoires et produisant des agents favorisants les lésions de l ADN (Clevers, 2004). Parmi ces agents, les espèces réactives de l oxygène et de l azote sont particulièrement connues pour créer une instabilité génétique, de même que plusieurs MMP et notamment les MMP-1, -9 et -12. Ces métalloprotéases sont en effet particulièrement surexprimées par les macrophages et les neutrophiles des patients ayant développé des pathologies pulmonaires liées à la consommation de tabac (Lagente et al., 2005), et pourrait participer à la création d un microenvironnement propice au développement cancéreux. Ainsi, un modèle murin de souris K14-HPV-16 n exprimant plus la MMP-9 montra que l absence cette métalloprotéase réduisait la carcinogenèse (Giraudo et al., 2004), mais que le développement néoplasique était restitué lorsque l on transférait dans ces souris des cellules sauvages de moelle osseuse, exprimant la MMP-9, démontrant que les cellules de l inflammation contribuaient au moins en partie à la carcinogenèse de novo via l expression de MMP-9 dans le microenvironnement tumoral (Coussens et al., 2000). Cette expression de MMP-9 a également été associée à la croissance tumorale dans un modèle murin de carcinome ovarien (Huang et al., 2002). 90

91 Introduction bilbiographique-chapitre 2 I-2. Modifications épigénétiques dans le cancer I-2.1. Méthylation de l ADN et déacetylation des histones Le terme épigénétique correspond à des changements de l expression génétique et de l organisation de la chromatine qui ne sont pas codés par l ADN génomique lui-même. Cette information épigénétique peut être contrôlée par trois phénomènes distincts (figure 19). Le premier est la méthylation de l ADN, qui correspond à la méthylation d une base cytosine localisée en 5 d une guanine dans un dinucléotide CpG, catalysée par une ADN méthyltransférase. Cette méthylation peut avoir une incidence sur la régulation de l expression génique lorsque cette méthylation a lieu dans le promoteur d un gène (Bird, 2002). La méthylation aberrante de l ADN est retrouvée dans tous les cancers humains et est associée à une modification de l expression de certains gènes, le plus souvent suppresseurs de tumeur, comme p16, DAPK et RASSF1A (Ras ASSociation domain Family 1 isoform A) dans le cancer du poumon (Yanagawa et al., 2007). La méthylation anormale de l ilôt CpG de la région promotrice est également le mécanisme de répression transcriptionnelle du gène du TFPI-2 le plus fréquemment observé dans les cellules cancéreuses. Ainsi, dans de nombreuses cellules tumorales issues de cancers du sein (Guo et al., 2007), de la prostate (Rao et al., 2003), de mélanomes (Nobeyama et al., 2007), d hépatocarcinomes (Wong et al., 2007), de gliomes (Konduri et al., 2003a), de choriocarcinomes (Hubé et al., 2003c), d adénocarcinomes pancréatiques (Sato et al., 2004 ; Jiang et al., 2006 ; Ohtsubo et al., 2008) ou pulmonaires (Rollin et al., 2005 ; Steiner et al., 2005), la faible expression du TFPI-2 est corrélée à la méthylation de son promoteur. De plus, cette expression est restaurée après traitement des cellules par la 5-aza 2 -deoxycitidine. Très récemment, il a été montré que l hyperméthylation du promoteur du TFPI-2 pouvait également être un marqueur permettant de différencier les pancréatites alcooliques ou autoimmunes des cancers du pancréas et ceci très précocement puisque cette altération épigénétique est détectée dans le liquide pancréatique avant même les mutations de K-ras ou de p53 (Jiang et al., 2006 ; Ohtsubo et al., 2008). De plus, l hyperméthylation du promoteur associée à la répression transcriptionnelle du TFPI-2 pourrait témoigner de la présence de métastases. Cette association est en effet retrouvée chez 100% des patients atteints de cancers pancréatiques avec des métastases hépatiques (Jiang et al., 2006) et dans 80% des cas de cancers broncho-pulmonaires avec envahissement ganglionnaire (Rollin et al., 2005). 91

92 Introduction bilbiographique-chapitre 2 Chromosome Modifications des histones Nucléosome ARNi ARNm ARN Interférence ARNm Protéine Méthylation de l ADN Figure 19 : Les différents types d altérations épigénétiques (d aprés Sawan et al., 2008). Un autre mécanisme contrôlant l information épigénétique est la modification des protéines d histones qui contrôlent la structure de la chromatine et ainsi l accessibilité des gènes, la réplication et la réparation de l ADN. L expression du TFPI-2 peut également être régulée par ce phénomène (Wong et al., 2007). En effet, le traitement des cellules tumorales pulmonaires Calu-6 ou pancréatiques AsTC1 par des inhibiteurs de désacétylases des histones, la trichostatine A ou le depsipeptide FK228, induit une expression de TFPI-2 dans ces cellules ne l exprimant pas à l état basal (Sato et al., 2004 ; Steiner et al., 2005). La méthylation de l ADN et la désacétylation des histones pourraient même réprimer la transcription du gène du TFPI-2 d une manière coordonnée. En effet, les protéines MeCP1 et 2 (Methyl CpG binding protein) reconnaissent et s associent à des zones méthylées, empêchant alors la fixation des facteurs de transcription spécifiques. Ces protéines MeCP recrutent également des désacétylases des histones et la désacétylation favorise alors la compaction de l ADN, réprimant fortement la transcription dans cette zone d ADN (Ng et al., 1999). Certains auteurs ont ainsi montré que l action séquentielle d un agent déméthylant, la 5-aza 2 -deoxycitidine, et du depsipeptide FK228 ou de la trichostatine A, restaure, dans les 92

93 Introduction bilbiographique-chapitre 2 cellules tumorales pulmonaires Calu-6 ou de gliobastome SNB19, une expression de TFPI-2 supérieure à celle obtenue après traitement par seulement l une ou l autre de ces molécules (Konduri et al., 2003a ; Steiner et al., 2005). I-2.2. Un variant d épissage du TFPI-2 En analysant l ARN total, un variant d épissage aberrant du transcrit du TFPI-2 (astfpi-2), issu du pré-arnm natif, a été récemment mis en évidence dans de nombreuses cellules tumorales et tissus néoplasiques (Kempahia et al., 2007). Ce transcrit, très faiblement exprimé dans les tissus sains, n est pas traduit. Ce mécanisme additionnel de régulation de l expression du TFPI-2 favoriserait le développement de la tumeur et la quantification de ce variant d épissage pourrait donc se révéler un marqueur intéressant pour en évaluer la progression (Sierko et al., 2007). I-2.3. Régulation par microrna endogènes Le mécanisme épigénétique le plus récemment découvert est l ARN interférence (RNAi) mediée par des petits ARN non codants, les microrna (mirna), qui peuvent réguler l expression d un gène en interférant avec son transcrit. Plusieurs études récentes ont associé des modifications de ces mirna avec différents étapes de la progression tumorale (Calin & Croce ; Ma et al., 2007). Par exemple, le mirna-21 régule l invasion tumorale en inhibant l expression de RECK et de TIMP-3, favorisant ainsi l activation de différentes MMP et la progression tumorale (Gabriely et al., 2008) Ces différentes altérations épigénétiques peuvent être cumulées et potentialiser les effets des modifications génétiques. Il est de plus suggéré depuis peu que les modifications épigénétiques pourraient même créer un terrain favorable à l accumulation de mutations génétiques (Sawan et al., 2008). II Modifications du cycle cellulaire et immortalité des cellules tumorales Un des mécanismes cellulaires modifié dans tous les cancers par ces altérations génétiques et épigénétiques est la régulation du cycle cellulaire. Ainsi, une dérégulation de dernier est constamment observée avec la perte de la mort cellulaire programmée grâce à une activité télomèrase accrue. En effet, le mécanisme expliquant que le nombre de divisions cellulaires soit limité dépend de la présence de télomères à l extrémité des chromosomes, dont la taille est diminuée à chaque division cellulaire. Lorsque le télomère a été délété de toutes ses séquences télomériques, l apoptose de la cellule est initiée (LeBel & Wellinger, 2004). 93

94 Introduction bilbiographique-chapitre 2 Dans les cellules tumorales, cette mort programmée est évitée par une activité télomèrase accrue empêchant la perte de ces séquences télomériques. L apoptose est également régulée par d autres facteurs exprimés par le microenvironnement ou par la cellule tumorale elle-même. II-1. Les deux voies d activation de l apoptose L apoptose est un mécanisme complexe pouvant être mené par deux voies de signalisation distinctes ; l une dite intrinsèque, ou voie de stress, et l autre dite extrinsèque. La première voie d activation de l apoptose est déclenchée à l intérieur des cellules par différents facteurs de stress, comme les lésions causées à l ADN ou encore le stress oxydatif. Elle est ensuite relayée par des voies de signalisation orchestrées par p53, le principal gène de régulation de cette voie apoptotique. La protéine p53 va alors agir comme un facteur de transcription en activant différents gènes pro-apoptotiques tel que Bax, qui va favoriser l ouverture de canaux mitochondriaux et le relargage de cytochrome C dans le cytoplasme (Chipuk et al, 2004). Le cytochrome C en se liant aux protéines Apaf-1 et caspase-9 va former l apoptosome, capable d activer la pro-caspase-3 qui va activer à son tour différentes pro-caspases capables d induire l apoptose (Oberst et al., 2008) (figure 20). Certaines protéines peuvent cependant jouer un rôle inhibiteur de ce processus, les plus connues étant celles de la famille Bcl-2 qui agissent en inhibant l ouverture des canaux mitochondriaux (Chipuk et al, 2004) (figures 20). 94

95 Introduction bilbiographique-chapitre 2 FasL Fas IGFBP IGF-1/2 IGF-1R PI3 Akt/PKB Signaux de survie cellulaire Caspase Apoptosome Caspases 10 Caspases effectrices Caspase-9 Apaf-1 Bax Bcl-2 Mitochondrie Figure 20 : Les deux voies d activation de l apoptose : la voie intrinsèque dirigée par p53 et utilisant le cytochrome C mitochondrial et la voie extrinsèque, activée lors de la liaison de facteurs extracellulaires à leur récepteur membranaire (D après Weinberg, 2007). La voie d activation de l apoptose extrinsèque est déclenchée par différents facteurs extérieurs produits par le microenvironnement, agissant alors de manière paracrine, ou par la cellule elle-même, agissant ainsi de manière autocrine. Les principaux activateurs de cette voie sont le TNF-α, Fas ligand ou encore la cytokine TRAIL (Tumor necrosis factor-related Apoptosis-Inducing Ligand). Ces différents ligands peuvent se lier à cinq familles distinctes de récepteurs de mort cellulaire (DR ou Death Receptor). Fas ligand se fixera ainsi à son récepteur Fas et TRAIL à DR4 ou DR5, entrainant une cascade de signalisation qui active les caspases, indépendamment de l apoptosome (Wallach et al., 2008). Cette voie d activation est de plus indirectement contrôlée par p53 qui induit la surexpression de différents DR et de Fas à la surface cellulaire. p53 peut également induire l expression d IGFBP (Insuline Growth Factor Binding Protein) qui empêche l IGF de se lier à son récepteur et de transmettre des signaux de survie cellulaire (Butt & Williams, 2001) (figure 20). II-2. Le TFPI-2, un facteur pro-apoptotique Le TFPI-2 peut déclencher l apoptose en activant à la fois les deux voies de signalisation, intrinsèque et extrinsèque. En effet, la restauration de l expression du TFPI-2 dans une lignée humaine issue d un glioblastome entraine une augmentation de la mortalité cellulaire. Cet accroissement de l activité apoptotique a notamment été associé à la surexpression de Bax, de Fas ligand, du TNF-α et de son récepteur (George et al., 2007). Une 95

96 Introduction bilbiographique-chapitre 2 augmentation de l'activité des caspases-3 et -9 a également été associée à cette réexpression du TFPI-2. Une étude dans un modèle murin a démontré que cette activité était liée aux propriétés inhibitrices du domaine K1 du TFPI-2, médié par l arginine 24 (Chand et al., 2004a). Deux mutants TFPI-2 ont été utilisés en plus de la protéine sauvage. Dans le premier mutant, un résidu glutamine a été substitué à l arginine 24 du domaine K1 (mutant R24Q), ce qui a eu pour effet de diminuer de 90% son activité inhibitrice envers la plasmine et la trypsine (Chand et al., 2004a). Dans le deuxième mutant, l arginine 24 a été remplacée par une lysine (R24K), ce qui augmente son activité inhibitrice. Les cellules fibrosarcomateuses cultivées ensuite en présence du mutant R24Q, du TFPI-2 sauvage et du mutant R24K, présentaient un niveau d apoptose de 18%, 39% et 70%, respectivement. Ces résultats relient directement l activité inhibitrice du TFPI-2 à son activité pro-apoptotique. Cette même étude confirma l action proapoptotique du TFPI-2 via l activité accrue des caspases-3 et -9, mais également par l inhibition de certaines protéines anti-apoptotique, dont Bcl-2, et la surexpression de protéines pro-apoptotiques, comme bax (Kempaiah & Kiesiel, 2008). III-3. Les métalloprotéases, des facteurs anti-apoptotiques Des mutations sur les gènes clefs des voies de signalisation de l apoptose comme p53 ou la surexpression de Bcl-2 retrouvée dans 10 à 35% des CBPNPC ou encore l expression diminuée de bax, souvent présente dans les CBPNPC, peuvent permettre aux cellules tumorales de résister à l apoptose. Dans différents types de cancer, l expression des MMP a été associée à la survie des cellules tumorales et leur inhibition favoriserait au contraire l apoptose. Ainsi, l inhibition de l expression transcriptionnelle de la MMP-2 induit l apoptose de cellules tumorales issues d un glioblastome (Kargiotis et al., 2008). Cette inhibition entraîne également l apoptose des cellules tumorales A549, issues d un CBPNPC, via la surexpression de Bax, l inhibition de l expression de Bcl-2 et l activation des pro-caspases-3, -8 et -9 (Chetty et al., 2007). De plus, la MMP-1 intracellulaire conférerait aux cellules tumorales une résistance à l apoptose (Limb et al., 2005). Plus récemment, une étude a démontré que l inhibition de l expression de upar et de la MMP-9 dans une lignée cellulaire issue d un glioblastome humain entrainait une augmentation de l apoptose, témoignant du rôle antiapoptotique de ces protéines (Gondi et al., 2008). La MMP-11 synthétisée par les fibroblastes du stroma protégerait également les cellules tumorales de l apoptose, comme l a démontré 96

97 Introduction bilbiographique-chapitre 2 une expérience chez la souris dans laquelle un nombre accru de cellules cancéreuses apoptotiques ont été retrouvées chez les souris déficientes en MMP-11 (Boulay et al., 2001). Cependant, la stratégie la plus utilisée par les cellules tumorales pour échapper a la mort cellulaire implique le plus souvent des facteurs de survie extérieurs comme les facteurs de croissance, constitutivement synthétisés dans les tissus sains et dont l activité peut être modulée par différentes protéases. Ainsi, dans certains cancers, les MMP-1, -2 et -3 secrétées vont dégrader les IGFBP, les protéines de liaison aux IGF, dans l espace extracellulaire et permettre aux IGF-1 et -2 de transmettre un signal de survie cellulaire en se liant à leur récepteur. De plus, de nombreuses cellules tumorales synthétisent les IGF-1 et -2 à des taux anormalement élevés (Fowlkes et al., 1995). La MMP-7, quand à elle, a été associée à la survie cellulaire en protégeant les cellules tumorales de l apoptose via le clivage de FasL produisant une forme soluble de ce ligand membranaire. L apoptose dépendante de la voie de Fas est ainsi réduite (Sheu et al., 2001). Cependant une autre étude a démontré que la MMP-7 pouvait au contraire mobiliser FasL qui se fixe à son récepteur et induit l apoptose de cellules cancéreuses prostatiques (Fingleton et al., 2001). La MMP-7 peut également protéger les cellules tumorales de l apoptose en clivant le pro-hb-egf (pro-heparin Binding-Epidermal Growth Factor) membranaire, en HB-EGF mature soluble qui confère une protection à l apoptose en se fixant à son récepteur EGFR (Yu et al., 2002). Ce mécanisme est d autant plus important dans les CBPNPC que ce récepteur est surexprimé dans cette pathologie (Nakamura et al., 2003). Une étude récente a également démontré que l élastase leucocytaire humaine pouvait dégrader la MMP-7 et diminuer ainsi la résistance à l apoptose induite par cette MMP dans les cellules tumorales (Alla et al., 2008). B- ANGIOGENESE TUMORALE Après l initiation et la prolifération clonale, suit une forme de tumeur avasculaire approvisionnée en nutriments par diffusion et ne pouvant excéder une taille de un à deux mm 3 (Eichhorn et al., 2007). L acquisition d un phénotype angiogénique est donc considérée comme une étape clé de la croissance tumorale, nommée «switch» angiogénique, et qui consiste en une dérégulation de la balance molécules angiogéniques/anti-angiogéniques dans le microenvironnement tumoral (Bergers & Benjamin, 2003). 97

98 Introduction bilbiographique-chapitre 2 I Les mécanismes de l angiogenèse De nombreux facteurs angiogéniques participent au processus de néoangiogenése, les plus importants étant la famille du VEGF ( -A, -B, -C, -D, -E), Ang-1 et -2 (angiopoetins-1 et -2), le bfgf, l EGF, l IL8, le PDGF et le TGF-β (Eichhorn et al., 2007). Chacun d entre eux peut être synthétisé par différents type de cellules : cellules tumorales, cellules endothéliales tumorales, fibroblastes, cellules inflammatoires ou cellules circulantes (EPC ou plaquettes) (Ferrara & Kerbel, 2005), témoignant de l incroyable complexité de ce phénomène, parfait exemple de la communication intercellulaire tumeur-hôte. Les facteurs angiogéniques produits par les cellules tumorales et celles du microenvironnement vont stimuler la migration, la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales pour former des capillaires, qui se développent ensuite en vaisseaux matures. Les cellules péri-vasculaires sont alors recrutées afin de former un support stabilisant les néo-vaisseaux, permettant la formation d un lumen fonctionnel et d un afflux sanguins minimum (Tlsty & Coussens., 2006). La première étape est donc d attirer les cellules endothéliales sur le site hypoxique afin de commencer la néoangiogenèse. L origine de ces cellules n est pas encore complètement élucidée, mais il est sûr qu elle est au moins double. Des cellules endothéliales matures environnantes peuvent tout d abord être recrutées par une libération de VEGF qui posséde une activité mitogénique, chimiotactique et anti-apoptotique (Ferrara & Kerbel, 2005). Les molécules de la famille VEGF activent les cellules endothéliales via leurs récepteurs spécifiques (VEGFR-1, -2, -3) (Ferrara et al., 2003). Les VEGFR-1 et -2 sont localisés sur l endothélium vasculaire et sont surexprimés durant l angiogenèse. De plus la production de VEGF est stimulée par de nombreux facteurs de croissance (EGF, TGF-α et β,fgf et PDGF) et différentes hormones, cytokines et chimiokines présentes dans le microenvironnement. Parallèlement, les EPC provenant de la moelle osseuse pourraient être recrutées par chimiotactisme via la sécrétion de SDF-1 (CXCL12) par les fibroblastes du stroma tumoral, aidés en cela par la production de VEGF qui va également permettre de rendre ces cellules fonctionnelles et de participer à la formation du lumen. (Ribatti, 2007). Une fois les capillaires assemblés, la stabilisation et la maturation des vaisseaux est assurée par le recrutement de péricytes. Ce mécanisme est régulé par l action de Ang-1 et -2, qui ont été impliquées dans la néoangiogenèse de différents types de tumeurs et notamment dans le CBPNPC (Shijubo et al., 2003). 98

99 Introduction bilbiographique-chapitre 2 L angiopoiêtine-1 soutient la survie des cellules endothéliales et le recrutement des péricytes vers les segments immatures de la structure vasculaire. A l inverse, Ang-2 est exprimée sur les sites de remodelage des vaisseaux et entraine la perte des péricytes, exposant ainsi les cellules endothéliales aux facteurs angiogéniques, dont le VEGF. L expression de Ang-1 est limitée aux cellules tumorales et n est pas altérée au cours de la progression tumorale tandis que Ang-2 est surtout secrétée par les vaisseaux sanguins et sa production est accrue dans les tumeurs hautement vascularisées. Cette perturbation de l expression des deux antagonistes Ang-1 et -2 associée à la forte expression de VEGF est suspectée d être à l origine de la structure anarchique des neo-vaisseaux tumoraux (Eichhorn et al., 2007). II- Les protéases activatrice de l angiogenèse II-1. MMP et angiogenèse Les MMP impliquées dans l angiogenèse sont synthétisées par les cellules tumorales, les cellules fibroblastiques, les cellules inflammatoires ou les cellules endothéliales ellesmêmes. Les MMP sont mises en jeu à plusieurs niveaux, mais facilitent surtout l invasion du stroma tumoral par les cellules endothéliales en dégradant la MEC. L hydrolyse du collagène de type I est par exemple indispensable à la formation de néo-vaisseaux (Seandel et al., 2001). Ainsi la migration des cellules endothéliales issues de section aortique et la formation de néovaisseaux associée est compromise en absence de MT1-MMP mais pas en absence de MMP-2 ou MMP-9 (Chun et al., 2004). Cependant, des souris doublement invalidées pour la MMP-2 et pour la MMP-9 montrent une angiogenèse tumorale limitée après injection de kératinocytes malins, démontrant la pluralité des cellules hôtes impliquées pendant ce processus, la MMP-2 étant produite dans ce modèle par les cellules mésenchymateuses et la MMP-9 par les neutrophiles (Masson et al, 2005). De plus, l inhibition de la MMP-2 par sirna dans une lignée cellulaire issue d un glioblastome, diminue fortement l angiogenèse induite par ces cellules tumorales lorsqu elles sont cultivées avec des cellules endothéliales (Kargiotis et al., 2008). Certaines MMP augmentent également la libération de facteurs angiogéniques comme le VEGF, le bfgf ou le TGF-β et favorisent ainsi le «switch» angiogénique (Hanahan & Folkman., 1996 ; Kalluri, 2003). En effet, la protéine CTGF (Connective Tissue Growth Factor) forme un complexe inactif avec le VEGF 165 et les MMP-1, -3, -7, ou -13 peuvent cliver ce complexe et libérer le VEGF 165, induisant l angiogenèse (Hashimoto et al., 2002). 99

100 Introduction bilbiographique-chapitre 2 De même, les MMP-1, -3 et -7 peuvent cliver et libérer le TNF-α associé à la membrane cytoplasmique (Rundhaug, 2005). Les MMP-1 et -3 libèrent également du bfgf en dégradant les molécules de perlecan localisées au niveau de la membrane basale des cellules endothéliales (Whitelock et al., 1996). Ces facteurs angiogéniques peuvent en retour induire la libération des MMP-2, -9 et -14 par les cellules endothéliales (Rundhaug 2005). La MMP-9 pourrait également servir à recruter les péricytes, comme l a montré un modèle de tumeur formée à partir de cellules neuroblastiques humaines implantées chez des souris invalidées pour le gène MMP-9. Dans ce cas, le nombre de péricytes était très faible en périphérie des vaisseaux sanguins, suggérant que cette MMP est nécessaire à leur recrutement dans les néo-vaisseaux (Chantrain et al., 2004; 2006). De manière générale les MT-MMP sont impliquées dans le contrôle de la morphogénèse des vaisseaux par les endocytes (Chun et al., 2004 ; Plaisier et al., 2004), alors que les MMP-1 et -10 semblent contrôler le processus de régression (Davis & Saunders 2006). II-2. Cathepsines, kallicréines et angiogenèse Les cathepsines à cystéine étant principalement actives à ph acide, leur action est majoritairement intracellulaire, et leur rôle dans l angiogenèse est assez limité. Cependant, l association de la cathepsines K à une pompe à proton membranaire pourrait contribuer à l acidification localisée du ph extracellulaire et favoriser l activité des cathepsines. Ainsi les cathepsines à cystéine B, K et L, parfois rencontrées à l extérieur ou à la surface de la cellule, pourraient contribuer à l angiogenèse en recrutant les EPC (Victor, 2007). La cathepsine S pourrait également contribuer à l angiogenèse tumorale en générant un fragment proangiogénique à partir de la laminine-5 (Wang et al., 2006). La cathepsine D a également été directement associée à l angiogenèse dans un modèle in vivo de tumeur mammaire. L équipe de S. Karpatkin a montré en effet que l angiogenèse pouvait être spécifiquement inhibée par l administration d anticorps dirigés contre la cathepsine D. Ce phénomène pourrait être dû aux propriétés chimioattractantes et mitogènes de cette protéase sur les cellules endothéliales (Hu et al., 2008) Les kallicréines ont également été indirectement liées à l angiogenèse via la dégradation du kininogène, générant de la bradykinine (BK). La BK favoriserait l angiogenèse en stimulant la production de bfgf et de VEGF par les cellules endothéliales (Colman, 2006). 100

101 Introduction bilbiographique-chapitre 2 III- Les inhibiteurs de l angiogenèse Différentes molécules endogènes peuvent contrebalancer, de manière directe ou indirecte, l action pro-angiogénique des mécanismes précédemment décrits. Le TFPI-2 et différentes protéases, font partie de ces facteurs anti-angiogéniques. III-1. Les métalloprotéases peuvent exercer une action anti-angiogénique La MMP-2 peut cliver le FGFR1 (Fibroblast Growth Factor Receptor 1) qui lie encore le FGF mais est incapable de transmettre les signaux angiogéniques du FGF (Levi et al., 1996). De même, la MMP-12 peut cliver l upar et l empêcher d interagir avec son ligand, l upa, capable de stimuler l activation de voies de signalisation pro-angiogénique (Koolwijk et al., 2001). Enfin, la dégradation de la MMP-2 peut générer un fragment entrant en compétition avec la MMP-2 pour la fixation à l intégrine αvβ3 et bloquer ainsi la stimulation de facteurs pro-angiogéniques (Brooks et al., 1998). III-2. Les protéases peuvent générer des peptides à activité anti-angiogénique Les MMP peuvent indirectement inhiber l angiogenèse via le clivage de différents substrats, générant ainsi des fragments anti-angiogéniques tels que l angiostatine, l endostatine, et la tumstatine. L angiostatine est un produit de dégradation du plasminogène par les MMP-2, -3, -7, - 9 ou -12 (Pozzi et al., 2000) capable d inhiber l angiogenèse in vivo (O Reilly et al., 1994) via l inhibition de la prolifération et la stimulation de l apoptose des cellules endothéliales (Holmgren et al., 1995). La tumstatine est une matricryptine issue du clivage de la chaine α3 du collagène IV par la MMP-9 qui posséde une action anti-angiogénique via l inhibition de la prolifération des cellules endothéliales (Maeshima et al., 2001). La colocalisation de la tumstatine et de l intégrine αvβ3 dans les cellules endothéliales des capillaires suggère une interaction entre ces deux molécules en faveur d une action anti-angiogénique (Caudroy et al., 2004) L endostatine est une matricryptine issue d un fragment du collagène XVIII, clivé par l élastase ou la cathepsine L, qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales en se fixant au récepteur VEGFR-2 (Kim et al., 2002). L endostatine empêche ainsi l activité du VEGF et diminue la migration des cellules endothéliales en inhibant l activité de la MMP-2 et de la MT1-MMP (Kim et al., 2000). 101

102 Introduction bilbiographique-chapitre 2 III-3. Activité anti-angiogénique du TFPI-2 Le TFPI-2 jouerait également un rôle important dans le contrôle de la néoangiogenèse. Il a ainsi été démontré que la surexpression du TFPI-2 dans les cellules endothéliales entrainait une diminution de la néovascularisation et favorisait la synthèse de la MEC in vivo. Différentes études ont démontré que le TFPI-2 inhibait la migration des cellules endothéliales et la formation de capillaires in vitro, processus réversible par l adjonction d anticorps anti- TFPI-2 dans le milieu (Ivanciu et al., 2007, Yanamandra et al., 2005). Une étude enzymatique a également démontré que l inhibition de l activation du plasminogène en plasmine semblait être le mécanisme par lequel le TFPI-2 inhibait la migration des cellules endothéliales. Ivanciu et al. ont de plus observé que les cellules endothéliales surexprimant le TFPI-2 avaient une sensibilité accrue à l apoptose. De plus, le VEGF augmente l expression endothéliale du TFPI-2, lequel inhibe en retour la prolifération de ces cellules, normalement favorisée par le VEGF et le FGF (Xu et al., 2006). Cependant, pour ces auteurs, ce mécanisme serait indépendant de l activité inhibitrice du TFPI-2 vis-à-vis de la plasmine, puisque le domaine K1 seul est incapable d excercer ce rôle sur la prolifération. Le TFPI-2 régule également l expression du VEGF par les cellules du microenvironnement, ce qui limiterait l angiogenèse (Chand et al., 2004a) C- INVASION TUMORALE L épithélium est normalement délimité par la membrane basale qui le sépare du stroma sous-jacent et des compartiments mésenchymateux. La rupture de cette barrière est la première étape de la transition d un carcinome in situ vers un carcinome invasif et potentiellement métastatique. L invasion tumorale est un processus complexe nécessitant des cellules tumorales une activité protéolytique et une motilité accrue pour leur permettre de migrer à travers la MEC. Pour y parvenir, les cellules tumorales vont utiliser différentes stratégies. I- Les différents modes de migration cellulaire Selon le type de cellules cancéreuses et les contraintes imposées par le microenvironnement, l invasion des tissus peut se faire de manière individuelle ou collective (figure 21A), comme c est majoritairement le cas dans les tumeurs solides et notamment dans 102

103 Introduction bilbiographique-chapitre 2 les cancers broncho-pulmonaires à grandes cellules (Byers et al., 1995). Deux méthodes distinctes d invasion collectives peuvent être discernées. Dans la première, dite de migration «en chaîne», les cellules tumorales disposées en «file indienne» forment de longues chaînes alignées entre les fibres du stroma. Cette structure a été retrouvée dans différents carcinomes épithéliaux comme les carcinomes mammaires et ovariens (Pitts et al., 1991 ; Sood et al., 2001) et semble être une stratégie conférant un haut pouvoir invasif (Seftor et al., 2002). La deuxième stratégie est nommée migration en «groupe». Elle est formée d amas de cellules tumorales détachées de la tumeur d origine. Dans cette structure, des cellules tumorales particulièrement mobiles, grâce à la formation de pseudopodes, se trouvent à l avant de l amas et forcent un passage à travers la matrice extracellulaire par protéolyse, tractant aisni la masse cellulaire centrale (Figure 21B). Les pseudopodes se lient à la MEC via l expression de β1 intégrines et le passage des cellules est ensuite facilité par la focalisation de l activité protéolytique de la MMP-14 au front de migration, ce qui permet une protéolyse polarisée de la MEC (Wolf et al., 2007). Bien que d autres protéases, telles que les MMP-1, - 2, 13 et les cathepsines B et K, peuvent également dégrader différentes formes de collagène, il semble que la MMP-14 soit la plus importante dans ce processus (Friedl & Wolf, 2008). A B Protéases MT1-MMP Collagène dégradé Filaments d actine β1 intégrines Figure 21 : Différents modèles d invasion des cellules tumorales. (A) Différents modèles d invasion des cellules issues d un mélanome, observés in vivo. Invasion de cellules individuelles (flêches), invasion collective en groupe (str) et invasion en chaine (IF). (B) Stratégie de migration en groupe. (D après Friedl & Wolf, 2008). La migration collective a l avantage de permettre à la masse de cellules tumorales de produire de grandes concentrations de MMP et de facteurs facilit ant la migration. De plus, cette formation, basée sur la collaboration entre des cellules de phénotypes différents, protège les cellules situées au centre de la masse des attaques du système immunitaire. Les cellules à forte mobilité peuvent ainsi favoriser la migration de cellules moins mobiles mais, par exemple, plus résistantes à l apoptose, augmentant ainsi l efficacité de l invasion cellulaire 103

104 Introduction bilbiographique-chapitre 2 (Friedl & Wolf ; 2003). Cependant, il est fréquent de voir les cellules tumorales invasives passer d une stratégie collective vers une invasion individuelle, ce phénomène marquant une étape significative vers une agressivité accrue des cellules tumorales. La transition épithéliomésenchymateuse (TEM) est un exemple de ces modifications cellulaires fréquemment retrouvées dans les carcinomes. Lors de cette transformation, les cellules vont passer d un phénotype de cellule épithéliale à celui de cellule mésenchymateuse dont le potentiel invasif est très important. II La transition épithélio-mésenchymateuse Au cours de la progression néoplasique, les cellules tumorales voient généralement leur forme changer avec l apparition d un phénotype mésenchymateux s accompagnant de la modification des interactions cellule-cellule et cellule-matrice. En effet les cellules épithéliales vont tout d abord se dissocier de leurs voisines puis progresser au travers de la MEC. Ceci nécessite le remodelage de la MEC via une activité protéolytique augmentée qui favorise alors la progression des cellules tumorales dont la motilité est accrue (Wolf et al., 2007). Ces modifications phénotypiques sont la résultante de la TEM, souvent retrouvée dans différents contextes physiologiques nécessitant un remodelage tissulaire, tels que le développement embryonnaire ou la cicatrisation. Tous ces processus peuvent être dirigés ou potentialisés par le microenvironnement. II-1. Les facteurs stimulant la TEM Plusieurs facteurs du stroma peuvent induire la TEM des cellules tumorales, comme l EGF, le bfgf et le TGF-β. Ainsi, l exposition au TGF-β de cellules épithéliales mammaires murines transformées par l oncogène ras a pour conséquence la perte progressive de la morphologie et des marqueurs épithéliaux, notamment la cytokératine et la E-cadhérine. Parallèlement, les cellules transformées acquièrent des marqueurs mésenchymateux, tels que la vimentine, et un profil de type fibroblastique (Janda et al., 2002). Dans la cellule, ces signaux peuvent passer par les voies de signalisation RhoA/p38MAPK (Derynck et al., 2001 ; Kalluri & Neilson., 2003), mais la voie des Smads, et particulièrement celle impliquant Smad 3, sembles être la principale (Siegel & Massague, 2003). Elle agit en collaboration avec la voie de signalisation PI3K/Akt déclenchée par différents facteurs de croissance tels que le bfgf et le HGF produit par les fibroblastes (Kalluri & Zeisberg, 2006) ou l EGF par les macrophages (Goswami et al., 2005). Les voies 104

105 Introduction bilbiographique-chapitre 2 de signalisation vont déclencher l activation de signaux de survie intracellulaires qui vont protéger la cellule des effet cytostatiques et pro-apoptotiques du TGF-β ( Kalluri & Zeisberg, 2006) (Figure 22). La MMP-3 va également stimuler la TEM en clivant la E-cadherine, entraînant la perte de contact cellules-cellules et la relocalisation nucléaire de la β-caténine (Lochter et al., 1997), ceci ayant pour effet l activation de nombreux gènes impliqués dans la progression tumorale (figure 22). Collagène de type 1 Intégrines Cadhérine-E β-caténine Déclenche la TEM Figure 22 : Régulation de la TEM par le microenvironnement. De nombreux stimuli microenvironnementaux peuvent déclencher la TEM. Ceci inclut différents facteurs de croissance qui se lient à des récepteurs tyrosine kinase (TKR), tels que le FGF, l EGF l HGF ou encore le TGF-β qui se lie à son récepteur (TGF-βR), des composants de la matrice extracellulaire stimulant la voie des intégrines ou encore des protéases (MMP-3) clivant le complexe E-cadhérine-β-caténine. (D après Kalluri & Zeisberg, 2006). Ce déclenchement de la TEM par l EGF, le bfgf, le TGF-β et la MMP-3 peut également être dû à la stimulation du facteur de transcription Snail. Snail est en effet de plus en plus décrit comme étant l un des facteurs le plus importants régulant la TEM. De fait, la modification du profil d expression de la plupart des gènes impliqués dans la TEM est la conséquence directe de la régulation par Snail, et de nombreux autres processus associés en sont la conséquence indirecte (Przybylo et al., 2007). La stimulation de la voie Snail peut ainsi entrainer la diminution de la sécrétion de la E-cadhérine, l inhibition de l expression de gènes épithéliaux et l induction de gènes mésenchymateux tels que la fibronectine, la vimentine et différentes MMP (Nieto, 2002, Olmeda et al., 2007), autant de facteurs caractéristiques de la TEM. 105

106 Introduction bilbiographique-chapitre 2 II-2. Caractéristiques générales de la TEM La TEM confère une capacité invasive accrue aux cellules tumorales en raison des modifications génétiques et phénotypiques qu elle implique. Ainsi, les cellules tumorales vont exprimer différentes protéases et acquérir d autres propriétés caractéristiques permettant de les identifier (résumé dans le tableau III). Tableau III : Modifications cellulaires associées à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) (D après Weinberg, 2007). Perte de Expression de cytokératine (filaments intermédiaires) Protéine de jonction adhérente épithéliale (E-cadhérine) Polarité cellulaire épithéliale Localisation cytoplasmique de la β-caténine Acquisition de Structure de type fibroblastique Motilité Invasivité Expression de gènes mésenchymateux Protéine de jonction adhérente mésenchymateuse (Ncadhérine) Sécrétion de protéases (MMP) Expression de vimentine (filament intermédiaire) Sécrétion de fibronectine Expression des récepteurs au PDGF Expression d intégrines αvβ6 L une des particularités des cellules tumorales ayant subi une TEM est l augmentation de l expression de différentes MMP. Ainsi l expression de la MMP-13 et l upar est augmentée dans les cellules cancéreuses ayant subi une TEM après stimulation par le FGF (Billottet et al., 2008). De même la MMP-2 est surexprimée via l induction du facteur de transcription Ets-1 (Taki et al., 2006, Yokoyama et al., 2003). Des cellules issues d un carcinome mammaire présentant les caractéristiques de cellules mésenchymateuses présentent également une expression accrue de la MMP-14 associée à une plus forte activation de la MMP-2 (Pulyaeva et al., 1997). A l inverse, l expression de la MMP-2 et de l EMMPRIN est diminuée dans des cellules issues d un mélanome dans lesquelles l expression de Snail a été inhibée (Kuphal et al., 2005). III- Les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement stimulent l invasion tumorale La TEM, étape primordiale précédant l invasion tumorale, est par la suite favorisé par les interactions entre les cellules néoplasiques, la MEC et le microenvironnement cellulaire tumoral. 106

107 Introduction bilbiographique-chapitre 2 III-1. Les modifications structurelles de la MEC influencent l invasion cellulaire Les interactions cellules-matrice sont mediées par les intégrines. Ces intégrines sont reliées au cytosquelette d actine par des protéines adaptatrices (α-actinine, vinculine, taline ) et sont ainsi capables de transmettre des signaux à la cellule pour contrôler différents processus tels que la polarisation, la prolifération, l adhérence ou encore la migration cellulaire (figure 23). Intégrines Chaîne α MEC Chaîne β α-actinine Vinculine Taline Tensine Paxilline Actine Fibre de stress d actine Cytosquelette d actine Figure 23 : Organisation du réseau d actine associé aux intégrines. Les intégrines sont associées à la MEC (vert) par leur domaine extracellulaire et au cytosquelette d actine (rose) par le domaine cytoplasmique des chaîne α et β de chaque hétérodimère. Différentes protéines adaptatrices, telles que l actinine, la vinculine ou la taline permettent cet ancrage. (D après Weinberg, 2007). Bien que les cellules transformées soient moins dépendantes des contacts avec la MEC pour leur survie ou leur prolifération, elles continuent de bénéficier des signaux transmis par les intégrines. En effet, un nombre croissant d études montrent que les cellules néoplasiques augmentent leur expression d intégrines favorisant la survie, la prolifération et la migration cellulaire pendant qu elles diminuent l expression des intégrines ayant un effet contraire. La MEC peut ainsi soutenir la progression tumorale via ces protéines. Ainsi, les intégrines α5β1, se liant à la fibronectine, les α6β1 ou les α6β4, s associant à la laminine, les αvβ3, se liant à la vitronectine ou à la fibronectine et l α2β1, se fixant au collagène fibrillaire, favorisent la migration des cellules tumorales (Leavesley et al., 1992 ; Rabinovitz & Mercurio, 1997 ; Maaser et al., 1999 ; Cukierman et al., 2001). 107

108 Introduction bilbiographique-chapitre 2 Des modifications dans la structure de la MEC peuvent ainsi influencer le comportement de la cellule. Ainsi, la rigidification du stroma qui accompagne la progression tumorale modifie la réponse cellulaire à son support via l action des intégrines. Ce phénomène stimule en effet l expression localisée d intégrines qui vont tout d abord former un petit complexe focal qui, en associant de nouvelles intégrines, va finir par former une zone de contact focale capable de générer la traction de la cellule par l activation de la voie Rho/ROCK (Larsen et al., 2006). L adhérence à la matrice extracellulaire via les intégrines pourrait également avoir un effet sur la stabilité des liaisons intercellulaires. En effet l activation de Rac (une GTPase issue de la famille des protéines Rho) favorise ou au contraire dégrade les jonctions adhérentes en fonction de la matrice sur laquelle se situe la cellule (Braga et al., 2000). Or la dégradation des liaisons intercellulaires, souvent médiée par les protéines de la famille des cadhérines, est une des étapes favorisant la migration de cellules isolées (Sanders et al., 1999). III-2. Les matricryptines stimulent l invasion tumorale via l induction de l expression de MMP par le stroma tumoral La matrice extracellulaire peut également influencer l invasion tumorale via la génération de facteurs stimulant l activité protéolytique et la motilité des cellules tumorales. Le terme matricryptine, ou matrykine cryptique, désigne des peptides libérés par la lyse partielle des macromolécules de la matrice extracellulaire. Ces matricryptines peuvent influencer la prolifération, la migration ou l apoptose cellulaire mais aussi la production et l activation de MMP ainsi que l activation du système plasminogène/plasmine (Maquart et al., 2004), favorisant ainsi la protéolyse de la MEC, puis l invasion. Les peptides dérivés de l élastine, ou EDP (Elastine Derived Peptides), ont été démontrés comme favorisant l invasion tumorale. Cette action se traduit par la surexpression de plusieurs MMP dans les cellules tumorales exprimant le récepteur membranaire de l élastine de 67 kda (ou EBP). Dans les cellules HT-1080, les EDP stimulent l expression de la pro-mmp-2 et accroissent son activation à la surface cellulaire en surexprimant également la MT1-MMP et TIMP-2, toutes deux impliquées dans l activation de cette protéase (Brassart et al., 1998). Les EDP sont également capables d induire la surexpression de pro-mmp-1 et d upa dans ces mêmes cellules, contribuant à la potentialisation de leur capacité migratoire dans une matrice composée de collagène de type 1 (Maquart et al., 2005). Un autre fragment de l élastine, la Kappa élastine, est également capable de stimuler la cascade d activation 108

109 Introduction bilbiographique-chapitre 2 protéolytique plasmine dépendante des MMP dans des cellules tumorales pulmonaires BZR (Maquart et al., 2005). Les matricryptines issues du domaine N-terminal de la fibronectine (N-terminal fibrine 1) peuvent également induire la surexpression de MMP-1 par les fibroblastes du stroma (Xie et al., 1994). De même, les matricryptines issues du de l extrémité C-terminale (C-terminale fibrine 2) favorise la migration RGD-dépendante. La laminine est aussi une grande source de matricryptines favorisant l invasion tumorale. Ainsi, un site cryptique de la laminine-1 (domaine C-terminale), généré par une activité élastase, est capable de stimuler la production d upa et de MMP-9 par les macrophages (Khan & Falcone, 2000). A l inverse, les fragments issus de la digestion du même composé par les MMP-2, -7 ou par la plasmine sont incapables de stimuler les macrophages, témoignant de la grande spécificité de ces mécanismes. Une autre matricryptine, un hexapeptide issu de la chaine β de la laminine-1, est capable d induire la surexpression de MMP-1 par les fibroblastes (Brassart et al., 2001). La migration des cellules tumorales est également favorisée par le clivage de la sousunité γ2 de la laminine-5 sous l action de nombreuses MMP comme les MMP-2, -3, -12, -13, -19, -20 et la MT1-MMP. Cette dernière démasque un fragment se liant au récepteur de l EGF et induit, via la voie des MAPK, l expression de nombreux gènes incluant celui de la MMP-2 (Schenk et al., 2003). De la même manière, les matricryptines du collagène IV, ont étés décrites comme pouvant stimuler la migration cellulaire. Un exemple en est le peptide α1(iv) qui, en interagissant avec l intégrine α3β1, induit l expression de MMP-9 par les cellules tumorales (Miles et al., 1995). III-3. Les interactions entre les cellules du stroma tumoral stimulent l expression de MMP et le potentiel invasif des cellules tumorales III-3.1 Surexpression des MMP par les fibroblastes du stroma De nombreuses études in vitro ont démontré que les interactions entre les cellules cancéreuses pulmonaires et les fibroblastes du stroma pouvaient induire la surexpression de différents facteurs favorisant l invasion tumorale. Ainsi, des modifications transcriptionnelles ont lieu dans les fibroblastes pulmonaires après 24h de coculture avec des cellules cancéreuses issues d un CBPNPC (Fromigue et al., 2003). Cette étude a porté sur plus de 1000 gènes et démontré que ces interactions entrainaient la surexpression de différentes 109

110 Introduction bilbiographique-chapitre 2 familles de gènes codant notamment pour des protéases et leurs inhibiteurs. Une augmentation de l expression des MMP-9 et -11, de l upa et du tpa mais également du TFPI-2, a ainsi été observée, démontrant la complexité de ces interactions et soulevant la question de l action pro-ou anti-tumorale qui en résulte. Il a ensuite été montré que l activation de la MMP-2 était augmentée dans le surnageant de fibroblastes en coculture avec des cellules NCI-H460 issues d un CBPNPC, stimulant ainsi le remodelage de la MEC (Maneva-Radicheva et al., 2008). La même observation a été faite lors de cocultures entre des fibroblastes et des cellules d un carcinome pancréatique. Dans cette étude, l activation de la MMP-2 dans les cocultures a été associée à la surexpression de l upar, impliquant le système upa-plasminogène dans cette activation (He et al., 2007). L expression de la MMP-9 par les fibroblastes est également augmentée lorsqu ils sont cultivés en présence de cellules issues d un cancer colorectal, favorisant ainsi la protéolyse matricielle. Cette induction impliquerait la β1 intégrine et serait médiée par la PKC (Protein Kinase C) et le facteur de transcription AP-1 (Segain et al., 1996). Le contact entre des cellules issues d un carcinome utérin et des fibroblastes augmente aussi l expression transcriptionnelle des MMP-1 et -3 et favorise l invasion tumorale in vitro (Sato et al., 2004). L expression des MMP-1, -7 et -14 est également augmentée dans des fibroblastes en coculture avec des cellules tumorales issues de sarcome épithélioïde, d un cancer du sein ou d un cancer de l endomètre (Tanaka et al., 2003 ; Nguyen et al., 2006 ; Koga et al., 2007 ), témoignant d un déséquilibre de la balance protéases/anti-protéases en faveur de l invasion tumorale. III-3.2. Surexpression des MMP par les cellules de l inflammation De la même manière, les interactions entre les cellules de l inflammation et les autres cellules du stroma peuvent stimuler l expression de différentes MMP. Ainsi, des cocultures entre des macrophages tumoraux et quatre lignées cellulaires tumorales pulmonaires issues d un CBPNPC ont démontré que ces interactions stimulaient l expression transcriptionnelle des MMP-1 et -9. L activité gélatinolytique de la MMP-9 exprimée par les cellules tumorales en coculture était également augmentée et associée avec un pouvoir invasif accru de ces cellules tumorales (Chen et al., 2005). La sécrétion de MMP-9 par les neutrophiles peut de plus être stimulée par les cellules endothéliales du stroma (Saalbach et al., 2008 ; Dorweiler et al., 2008). 110

111 Introduction bilbiographique-chapitre 2 III-3.3. Implication de l EMMPRIN dans les interactions entre les cellules du stroma et l invasion tumorale L augmentation de l expression des MMP par le stroma tumoral est souvent associée à l action de l EMMPRIN. En effet, l EMMPRIN stimule la production des MMP exprimées par les fibroblastes et les cellules endothéliales ainsi que par les cellules tumorales ellesmêmes (Caudroy et al., 1999 ; Nabeshima et al., 2006a). Il est également capable d induire sa propre expression (Tang et al., 2004). Ainsi, la transfection des cellules de cancer du sein MDA-MB436 par l ADNc d EMMPRIN induit une augmentation des formes zymogène et active des MMP-2 et MMP-3 (Caudroy et al., 2002). L implantation de ces cellules transfectées dans le tissu mammaire de souris nude provoque également une augmentation de l invasion tumorale associée à celle de l expression des MMP-2 et 9 (Zucker et al., 2001). L EMMPRIN est également capable de stimuler in vitro l expression des MMP-1, -2 et -3 par les fibroblastes (Kataoka et al., 1993 ; Guo et al., 1997) et par les HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) (Caudroy et al., 2002). De même, la coculture de cellules de glioblastome exprimant EMMPRIN avec des fibroblastes issus du cerveau entraîne une augmentation de la pro-mmp-2 et de son activation ainsi qu une augmentation des MT1- MMP et MT2-MMP (Sameshima et al., 2000). Cette production de MMP est dépendante d EMMPRIN puisqu elle est inhibée en présence d anticorps monoclonaux anti-emmprin. En plus de son activité inductrice de l expression de différentes MMP, l EMMPRIN peut également lier la MMP-1 et localiser son action protéolytique afin d orienter l invasion cellulaire (Guo et al., 2000). De plus, EMMPRIN augmente l expression de l upa, de son recepteur et du PAI-1 dans les lignées de cellules cancéreuses mammaires seules ou cocultivées avec des cellules endothéliales. Ceci suggère l existence d une boucle paracrine en lien avec les interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales et pouvant promouvoir l invasion tumorale via l activation des MMP (Quemener et al, 2007). IV- Le TFPI-2 inhibe l invasion tumorale De nombreuses études ont démontré que le TFPI-2 pouvait inhiber l invasion tumorale par son activité anti-plasmine. Cette inhibition, en plus d empêcher l action protéolytique de la plasmine sur la MEC, empêche l activation directe ou indirecte de nombreuses MMP, 111

112 Introduction bilbiographique-chapitre 2 limitant ainsi l invasion tumorale. Rao et al. ont été les premiers à démontrer l action antiinvasive du TFPI-2 in vitro sur des cellules HT-1080 (Rao et al., 1998). Ces cellules, extrêmement invasives, voyaient leur capacité à dégrader du Matrigel, un substitut de MEC, fortement diminué en présence de TFPI-2. Depuis, plusieurs équipes ont établi un lien entre le niveau d expression du TFPI-2 et le pouvoir invasif de différentes lignées cellulaires tumorales, in vitro. Ainsi, les cellules A549, issues d un cancer du poumon, produisent un taux élevé de TFPI-2 et sont peu invasives in vitro. Lorsque ces cellules sont transfectées par un vecteur exprimant un transcrit antisens, elles expriment moins d'arnm et de protéine TFPI-2 et leur capacité à migrer à travers la MEC est alors majorée (Lakka et al., 2000). Parallèlement, des cellules particulièrement invasives comme les cellules issues d un cancer de la prostate humain (LNCaP) (Konduri et al., 2001), d un mélanome (C-32) (Konduri et al., 2000), d un choriocarcinome (JAR) (Jin et al., 2001), ou d un cancer du pancréas (Sato et al., 2005) produisent peu de TFPI-2 à l état basal. La transfection de ces cellules par un vecteur codant le TFPI-2 restaure l expression de cet inhibiteur et diminue leur potentiel invasif. De la même manière, d autre études plus récentes ont démontré ces effets sur des lignées cellulaires très invasives tels que des cellules issues d un glioblastome (Yamanandra et al., 2005), d un méningiome (Kondraganti et al., 2006), ou d un cancer de l œsophage (Yang et al., 2008) dont le potentiel invasif est fortement réduit après réexpression du TFPI-2. De plus, il a été clairement démontré l importance de l activité anti-plasmine dans ces phénomènes. Ainsi la seule expression du domaine K1, responsable de l inhibition de la plasmine, permet d inhiber le potentiel invasif des cellules HT1080. Cependant, la concentration de protéine tronquée TFPI-2/K1 doit être 5 fois supérieure à celle du TFPI-2 natif pour obtenir le même effet anti-invasif, suggérant un rôle des domaines K2 et K3 dans l invasion (Kong et al., 2004). D- DISSEMINATION METASTATIQUE La formation de métastases est un processus multi-étapes complexe mettant en jeu des cellules tumorales ayant subi de nouvelles mutations et acquis de nouvelles propriétés ; et le microenvironnement tumoral (Bacac & Stamenkovic, 2008). La capacité à métastaser est une des «hallmarks» d une tumeur et les métastases sont la principale cause de décès des patients atteints de cancer. Pour produire des métastases, les cellules tumorales doivent s échapper de la tumeur primaire puis traverser la paroi des néovaisseaux afin de gagner la circulation 112

113 Introduction bilbiographique-chapitre 2 sanguine ou lymphatique. Elle vont ensuite devoir survivre au transport dans la circulation systémique, adhérer puis pénétrer la paroi vasculaire des tissus distants et reformer un foyer tumoral pour enfin croître dans le parenchyme tissulaire de l organe cible (Figure 24 B). La survie des cellules lors de chacune de ces étapes est indispensable à l établissement de foyer métastatique distant, ce qui explique l extrême inefficacité de ce processus pathologique. En effet, Fidler a démontré que moins de 0,01% des cellules cancéreuses injectées par voie systémique étaient capables d établir un foyer métastatique dans le poumon, premier organe généralement atteint par les métastases (Fidler, 1970). A Métastases cérébrales B INTRAVASATION Transport par la voie systémique Arrêt dans les capillaires de différents organes EXTRAVASATION Métastases osseuses Cancer Broncho-pulmonaire Interactions avec des plaquettes, lymphocytes et autres composants sanguins Formation d une micrométastse Métastases hépatiques Colonisation- Formation d une macrométastase Figure 24 : Formation des métastases. (A) Localisations des foyers secondaires les plus fréquemment observés dans le cancer broncho-pulmonaire. B- Différentes étapes sont nécessaires à une cellule néoplasique pour former une macrométastase. Une fois passées dans la circulation sanguine, les cellules néoplasiques doivent survivre à différentes agressions, puis s arrêter dans un capillaire, effectuer une extravasation pour enfin coloniser le nouveau microenvironnement de l organe cible et former une macrométastase. (D après Weinberg, 2007). Le cancer broncho-pulmonaire fait partie des cancers à fort pouvoir métastasant, avec une prédilection pour la formation de métastases cérébrales, osseuses ou hépatiques (Figure 24 A). 113

114 Introduction bilbiographique-chapitre 2 I Passage des cellules tumorales dans le système vasculaire : l intravasation Après détachement des cellules tumorales de la tumeur initiale et invasion du compartiment stromal, les cellules cancéreuses pénètrent dans les vaisseaux des systèmes vasculaires sanguin et lymphatique, un phénomène appelé intravasation. Cependant, si l entrée des cellules néoplasiques dans le système sanguin a clairement été corrélée à l établissement de foyers secondaires dans des sites distants, la dissémination métastatique à travers le système vasculaire lymphatique n a pas encore clairement été établie. Comme dans toutes les phases précédentes de la progression tumorale, le microenvironnement joue un rôle important dans l intravasation à travers le système sanguin. Ainsi, il est à ce jour fortement supposé que l intravasation s effectue à travers les vaisseaux néoangiogéniques dont la formation a été stimulée lors de la croissance de la tumeur primaire, plutôt qu à travers le système sanguin préexistant. Un argument majeur en faveur de cette théorie est la réduction de la formation de métastases dans des modèles où la néoangiogenèse a été inhibée (Rundhaug, 2005). Comme précédemment décrit, les cellules du stroma vont intervenir dans un premier temps en participant à la génération d un gradient de chimiokines, ou d autres molécules comme la MMP-1, dirigeant les cellules vers les vaisseaux sanguins néoformés. Les cellules tumorales vont ensuite pénétrer dans la lumière des vaisseaux en utilisant des mécanismes complexes dont les principaux acteurs n ont pas encore été découverts, tant il est compliqué de mettre au point des modèles animaux permettant la visualisation de ce phénomène. Cependant, une étude a permis de mettre au point un nouveau modèle permettant de visualiser cette intravasation, en utilisant des poissons zèbres. Ces animaux possèdent le double avantage d être transparents et de posséder un génome très proche du génome humain (Zon & Peterson, 2005). En utilisant ce modèle, cette équipe a pu démontrer que des cellules carcinomateuses mammaires humaines, modifiées pour co-exprimer du VEGF et RhoC, protéine de la famille des GTPases contrôlant le cytosquelette et la motilité cellulaire, étaient capables de former des protrusions d au moins 5 µm s introduisant dans la lumière des vaisseaux sanguins. En revanche, les mêmes cellules exprimant le VEGF ou RhoC seuls en étaient incapables (figure 25). Dans un autre modèle, ces mêmes cellules montrèrent une capacité 8 fois supérieure à mener une intravasation, comparé aux cellules contrôles. Ces résultats suggèrent donc que RhoC, exprimé dans les cellules cancéreuses, et le VEGF, produit par le microenvironnement et les cellules néoplasiques, coopèrent pour effectuer une 114

115 Introduction bilbiographique-chapitre 2 intravasation efficace en régulant respectivement la dynamique du cytosquelette d actine/myosine et le remodelage vasculaire (Stoletov et al., 2007). Figure 25 : RhoC coopère avec le VEGF pour favoriser l intravasation cellulaire. Sections optiques montrant les cellules tumorales, exprimant RhoC (A), le VEGF (B) ou RhoC et le VEGF (C), interagissant avec la surface des vaisseaux sanguins. Des reconstructions en trois dimensions de l intérieur des vaisseaux permettent de visualiser les interfaces cellules tumorales-surface des vaisseaux (carrés en pointillé sur les images de gauche). Les flèches montrent les protrusions dans la lumière des vaisseaux. (D) section optique montrant une protrusion membranaire d une cellule tumorale exprimant RhoC et le VEGF à l intérieur du vaisseau (fléche).(carré) : La même cellule 5 minutes après. (E) Diagramme représentant le pourcentage de cellules ayant accompli une intravasation selon qu elles expriment RhoC, le VEGF, RhoC et le VEGF ou que ce soit des cellules parentales témoins. Les cellules exprimant RhoC et le VEGF ont un pourcentage d intravasation significativement plus important (p<0,05, test t) que les autres types cellulaires (D après Stoletov et al., 2007). Quelques rares études ont permis d associer les MMP à la capacité d intravasation. Ainsi les MMP-9 et -2 ont été reliées à la présence de cellules tumorales colorectales dans les vaisseaux sanguins (Tien et al., 2003). De même, l expression de MMP-9 et d upar par des cellules humaines cancéreuses a été associée à leur capacité à réaliser l intravasation (Kim et al., 1998). Plus récemment, une étude dans un modèle embryonnaire de poulet a montré au contraire un rôle inhibiteur des MMP-1, -2 et -9 dans ces mécanismes. Dans cette expérimentation, l inhibition des ces trois MMP par ARN interférence dans des cellules fibrosarcomateuses HT-1080 entrainait une augmentation de leur capacité à pénétrer dans les vaisseaux sanguins. De plus, l addition de MMP-9 recombinante restaurait le niveau d intravasation initialement observé dans les cellules inhibées pour cette gélatinase (Partridge et al., 2007). II Mécanismes de résistance des cellules tumorales dans le sang Une fois parvenues dans la circulation sanguine, les cellules tumorales vont être menacées par la perte de signaux trophiques, par la réponse toxique sérologique, le stress 115

116 Introduction bilbiographique-chapitre 2 physique occasionné par les forces de cisaillement et les déformations mécaniques imposées par l étroitesse de certains microvaisseaux, et par les attaques du système immunitaire. Les cellules néoplasiques vont tout d abord être menacées par l absence de signaux de survie produits par le stroma ou les autres cellules tumorales. De plus, aprés la perte de contact avec la MEC, également productrice de signaux de survie, les cellules peuvent déclencher une anoïkis. L acquisition d une résistance à l apoptose est donc indispensable à la survie de cellules néoplasique métastatiques (Weinberg, 2007). Les cellules tumorales vont également être confrontées aux forces de cisaillement présentes dans les microvaisseaux et vont alors tenter d y échapper en développant deux stratégies possibles. La première est de se déplacer par agrégats. Il a en effet été démontré que des cellules en amas avaient beaucoup plus de chance de survivre que des cellules isolées et des expériences in vitro ont notamment associé l élastase leucocytaire et la cathepsine G à la formation de ces groupes de cellules (Yui et al., 2005). Un autre phénomène observé est la formation d agrégats de cellules tumorales et de plaquettes ou de leucocytes dans la circulation. Les interactions régissant ces mécanismes sont complexes et encore très peu étudiées, mais quelques études ont suspecté l implication de MMP, et notamment l activation de la MMP-2 via la MT1-MMP. Des interactions complexes entre les MMP et les récepteurs des intégrines et des glycoprotéines pourraient être impliquées dans la formation de ces agrégats (Gassmann et al., 2004). Par exemple, l intégrine αvβ3, exprimée par les cellules néoplasiques et les plaquettes, serait impliquée en raison de sa capacité à lier le fibrinogène, permettant l agrégation de ces deux types cellulaires (Felding-Habermann, 2001). En plus de les isoler des forces mécaniques, la formation de ces structures protège les cellules tumorales des attaques du système immunitaire (Nieswandt et al., 1999), échappement également favorisé par la production de différentes molécules telles que la MMP-9, inhibant la prolifération de lymphocytes T ou la MMP-11 capable de diminuer la sensibilité de cellules tumorales aux cellules Natural Killer (Folgueras et al., 2004). III Adhérence à la paroi luminale et extravasion Dans les vaisseaux sanguins, l ancrage des cellules tumorales à la paroi endothéliale est principalement médié par les sélectines, alors que les interactions entre les cellules tumorales et la MEC dépendent des intégrines. Ce processus actif implique l expression d intégrines et d autres ligands spécifiques, déterminante dans le ciblage des organes secondaires qui serviront de foyer à l établissement des tumeurs secondaires. Ce processus 116

117 Introduction bilbiographique-chapitre 2 peut également être passif lorsque les cellules sont bloquées dans un capillaire de faible diamètre. Une fois arrêtées, les cellules vont pouvoir proliférer à l intérieur du vaisseau, processus menant généralement à la rupture de la paroi endothéliale et à l invasion des cellules tumorales dans le stroma de l organe hôte, c est le processus d extravasation. La cellule tumorale va alors recruter en quelques minutes des plaquettes, via des interactions avec l intégrine αvβ3 et les sélectines (Felding-Habermann, 2001), qui vont former un micro-thrombus. Une ou plusieurs cellules endothéliales seront repoussées pour favoriser un contact direct entre les cellules tumorales et la membrane basale. En un jour, le thrombus plaquettaire sera dissout par les protéases sanguines et la cellule tumorale va proliférer dans la lumière du vaisseau, sous l action de la stimulation des plaquettes (Boucharaba et al., 2004). Ce dernier mécanisme a cependant été récemment remis en cause par des expériences de cocultures démontrant que les plaquettes auraient au contraire un effet inhibiteur sur la croissance tumorale (Wang et al., 2008). Finalement, les cellules tumorales vont dégrader la membrane basale, grâce à l action des protéases qu elles expriment, puis pénétrer le parenchyme environnant, accomplissant l extravasation proprement dite (Crissman et al., 1988) (figure 26). L implication des MMP dans ce processus, nécessitant pourtant la dégradation de la membrane basale, est encore discutée. En effet, différentes études utilisant des inhibiteurs de MMP à large spectre, tel que le Batimastat, ont montré que cette inhibition n avait aucun effet sur l extravasation (Luzzi et al., 1998). Cependant, une expérience récente utilisant un autre inhibiteur de MMP, le MMI270, semble démontrer au contraire que le rôle des MMP serait justement critique pendant l étape d extravasation (Kasaoka et al., 2008). Cellule cancereuse Parenchyme Plaquettes Cellules endothéliales Membrane basale du capillaire Figure 26: L étape d extravasation. (A) La cellule cancéreuse se fixe à la paroi endothéliale du capillaire. (B) Elle recrute des plaquettes en quelques minutes qui forment un micro-trombus. (C) Elles repoussent une ou plusieurs cellules endothéliales pour atteindre la membrane basale. (D) le caillot est dissout par les protéases (E) et les cellules tumorales peuvent proliférer à l intérieur du vaisseau puis (F) traverser la membrane basale pour arriver dans le parenchyme de l organe hôte. (D après Weinberg, 2007) 117

118 Introduction bilbiographique-chapitre 2 Les cellules de l inflammation, effectuant fréquemment une migration transendothéliale, pourraient également aider à l accomplissement de ce processus. Ainsi, des cellules tumorales circulantes ont déjà été observées accompagnées de macrophages (Pollard et al., 2004), et les polynucléaires neutrophiles pourraient également participer (Liang et al., 2008). Cependant, il reste à savoir si ces cellules inflammatoires interviennent dans le processus d extravasation in vivo. IV Ciblage des foyers secondaires Le premier scientifique à s être demandé si la localisation de foyer secondaire pouvaient être déterminé par les cellules tumorales fut le pathologiste britannique Stephen Paget, en Après l étude de 735 cas de cancer du sein, Paget conclut que la distribution des métastases, préférentiellement localisées dans les viscères et les os, ne pouvait être seulement dûe au hasard et énonça pour la première fois sa théorie de «la graine et du sol» (seed and soil). Selon lui, la cellule tumorale à l origine de la métastase, la «graine», ne trouve un environnement favorable que dans certains organes compatibles, le «sol», la métastase ne pouvant se développer qu avec l adaptation de l une à l autre (Fidler, 2003). En 1924, Ewing proposa une théorie contredisant celle de Paget, en avançant que la dissémination métastatique n était régie que par les contraintes mécaniques du système vasculaire (Ewing, 1924). Ainsi, la forte tendance des carcinomes colorectaux à métastaser dans le foie pourrait simplement refléter le fait que les cellules cancéreuses quittent le colon via la veine porte, échouant ainsi inévitablement dans les microcapillaires hépatiques. Le plus probable est que ces deux théories soient deux facettes du même phénomène. Une étude détaillée démontra en effet que 66% des métastases pouvaient être expliquées par les simples contraintes mécaniques vasculaires exercées entre le site de la tumeur primaire et le foyer secondaire. Vingt pour cent seraient dû au microenvironnement favorable fourni par l organe cible et dans 14% des cas des interactions négatives entre les cellules tumorales et le microenvironnement diminueraient le nombre de métastases observées par rapport à ce que les contraintes mécaniques pouvaient laisser présager (Weinberg, 2007). Plus récemment, d autres mécanismes moléculaires ont été proposés pour expliquer le tropisme des cellules métastatiques. Ainsi certains organes cibles pourraient produire des signaux chimiques dans la circulation systémique attirant spécifiquement les cellules 118

119 Introduction bilbiographique-chapitre 2 néoplasiques circulantes. Un exemple en est la production de CXCL-12, ou SDF-1, par les fibroblastes des organes ciblés (os, foie, poumons et ganglions lymphatiques) par les cellules carcinomateuses mammaires, qui expriment quand à elles son récepteur, le CXCR4 (Müller et al., 2001). L activation de la voie CXCR4 dans ces cellules tumorales stimule de nombreuses réponses cellulaires favorisant l établissement de métastases, parmi lesquels la polymérisation d actine, la formation de pseudopodes et l invasion, via la production de MMP-2 et -9 (Luker et al., 2006). De plus, l activation de CXCR4 stimule l activation d intégrines augmentant l affinité de la cellule néoplasique pour l endothélium vasculaire. Les intégrines joueraient également un rôle important dans la sélection des organes cibles. Ainsi, les capillaires formant le réseau vasculaire de ces organes expriment à leur surface des molécules spécifiques du tissu, comme les sélectines. Ces molécules pourraient servir de point d ancrage spécifique aux cellules tumorales exprimant les récepteurs adéquats, comme des intégrines tels que α4β1 (Taichman et al, 1991). Ce modèle est même parfois appelé le «code postal vasculaire» puisque l endothélium de ces vaisseaux portent un véritable code d adressage sous forme chimique pour les cellules tumorales. Ces mécanismes sont similaires à ceux utilisés par les leucocytes lors du «roulement» permettant leur arrêt dans le système vasculaire. Ainsi la E-selectine, marqueur endothélial exprimé par les polynucléaires neutrophiles, est également utilisée par les cellules carcinomateuses colorectales pour se fixer à l endothélium hépatique (Brodt et al., 1997) ou par les cellules tumorales prostatiques pour métastaser au niveau des os (Dimitroff et al., 2005). Le ciblage des organes pour l établissement de foyers métastatiques est donc un processus pouvant dépendre d un ou plusieurs mécanismes différents, englobant chacune de ces théories. Cependant, le pourcentage de cellules néoplasiques parvenant à accomplir ces étapes est bien supérieur à la fréquence d apparition de métastases détectables (Weinberg, 2007). En effet, une fois que la cellule tumorale a envahi le parenchyme de l organe hôte, il lui faut parvenir à croître pour former une macrométastase, phénomène presque entièrement contrôlé par le nouveau microenvironnement. V La colonisation et l adaptation au nouveau microenvironnement Des études utilisant la vidéomicroscopie in vivo ont démontré que la grande majorité des cellules cancéreuses circulantes ne pouvaient former de métastases. Ceci est dû aux difficultés rencontrées lors du passage dans le système circulatoire et à la diversité des mécanismes mis en jeu pour envahir un nouveau tissu. Cependant, même une fois établis dans 119

120 Introduction bilbiographique-chapitre 2 le parenchyme tissulaire, seuls quelques uns de ces micro-foyers métastatiques, composés d une ou quelques cellules tumorales, son capables de proliférer et encore plus rares sont celles capables de former une macrométastase détectable et vascularisée (Chambers et al., 2001). V-1. La dormance tumorale Cette étape de la colonisation semble en effet être une des plus critiques pour la cellule tumorale, qui se retrouve isolée dans un environnement théoriquement dépourvu de tous les signaux qui lui ont permis de croître sur le site primaire. Il est ainsi fréquent que les cellules néoplasiques finissent par périr, dépourvues des facteurs de croissance et de survie fournis par le stroma tumoral, ou restent en l état, sans se diviser, formant plusieurs colonies de cellules isolées ou de micrométastases. Ce dernier phénomène, nommé dormance tumorale, est suspecté d être responsable, au moins en partie, des périodes de latence et de la récurrence du cancer (Naumov et al., 2002). Les cellules tumorales isolées et les micrométastases peuvent être toutes deux maintenues à l état de dormance tumorale selon deux processus différents. Les micrométastases dormantes sont capables de proliférer, mais leur croissance est contrebalancée par une forte mortalité cellulaire, probablement due à leur incapacité à former de nouveaux vaisseaux sanguins pour supporter la croissance tumorale (Naumov et al., 2008), résultant en un équilibre entre prolifération et apoptose. A l inverse, les cellules isolées quiescentes sont incapables de proliférer ou d entrer en apoptose (Naumov et al., 2002). Les processus impliqués sont très mal connus tant la mise au point de modèle in vivo pour étudier des cellules dormantes isolées est complexe. Il a cependant été observé que des cellules issues d une même population métastatique et implantées dans le même tissu se comportaient différemment, certaines entrant en apoptose, d autres restant quiescentes et d autres encore commençant à proliférer. De plus, le comportement adopté n est pas uniquement déterminé lors de l arrêt de la cellule dans l organe cible, mais est maintenu pendant toute la durée du processus puisque certaines cellules dormantes peuvent finir par proliférer (Naumov et al., 2002). Il n est cependant pas encore compris si ces cellules dormantes faisaient partie d une sous-population spécialisée, ou si elles appartenaient à une sous population inadaptée pour croître dans le microenvironnement rencontré. Cependant, dans les deux cas, le microenvironnement joue un rôle prépondérant dans la croissance métastatique. Un phénomène accidentel a permis de le démontrer en 1993, quand des chercheurs décrivirent 55 cas de patients cancéreux auxquels 120

121 Introduction bilbiographique-chapitre 2 on avait arraché une dent et qui avaient développé en quelques semaines une métastase sur le site inflammé (Hirshberg et al., 1993). Cette observation démontre clairement qu un microenvironnement «activé» permet la croissance rapide de macrométastases. V-2. La formation de niches pré-métastatiques Il a récemment été décrit que les cellules tumorales circulantes, ou la tumeur primaire elle-même, seraient capables de produire à distance des signaux induisant l activation du microenvironnement dans les tissus où une métastase va préferentiellement se développer, recréant ainsi les conditions rencontrées dans le foyer primaire (Kaplan et al., 2005 ; Hiratsuka et al., 2006). Ce microenvironnement «pré-activé» est appeler niche prémétastatique. Une étude a ainsi démontré qu il suffit d injecter du milieu conditionné par des cellules tumorales dans un organe cible pour établir de telles niches pré-métastatiques dans lesquelles les cellules tumorales peuvent ensuite se développer (Kaplan et al., 2005 ). Les mécanismes impliqués sont encore peu étudiés, mais il semblerait que le recrutement par les cellules tumorales de cellules progénitrices VEGFR1+, issues de la moelle osseuse, et des cellules myéloïdes sur le site dans lequel les métastases se formeront, soient indispensables à la formation de ces niches pré-métastatiques (Kaplan et al., 2005). Les cellules progénitrices contribueraient à induire le vascularisation et le remodelage de la MEC de la niche, tandis que les cellules myéloïdes produiraient une protéine de liaison permettant l arrêt des cellules tumorales circulantes dans la zone ciblée (Hiratsuka et al., 2006). Dans le cas de métastases pulmonaires, les cellules endothéliales et les macrophages pulmonaires produiraient de la MMP-9, via la stimulation de VEGFR1, necessaire à la formation de ces métastases (Hiratsuka et al., 2002). Les fibroblastes du microenvironnement seraient également stimulés pour produire de la fibronectine, contribuant à l établissement de ces niches (Kaplan et al., 2005). Le VEGF-A, le TNF-α et le TGF-β pourraient être impliqués dans la prédétermination de ces niches pré-métastatiques dans le poumon (Hiratsuka et al., 2006). Les cellules endothéliales sont également suspectées de jouer un rôle majeur, et l étude des ganglions lymphatiques drainant la tumeur ont permis d observer des changements de leur vascularisation avant leur envahissement par les cellules tumorales. Ces modifications sont certainement induites par le VEGF-A et le VEGF-C produit par les cellules néoplasiques (Qian et al., 2006, Hirakawa et al., 2006). Ces modifications s accompagnent non seulement d une augmentation de l incidence métastatique dans ces ganglions mais également dans d autres organes, et il reste maintenant à définir si ce 121

122 Introduction bilbiographique-chapitre 2 phénomène et dû à l augmentation du nombre de cellules échappées des ganglions envahis ou à un véritable changement de la vascularisation de ces organes, induit à distance par les cellules cancéreuses (Eccles et al., 2007). VI-TFPI-2, MMP et foyers métastatiques De nombreuses études expérimentales in vivo ont prouvé l action pro-métastatique des MMP (Deryugina & Quigley, 2006). Cependant, selon le modèle utilisé et la localisation de la modification génétique, dans la cellule tumorale ou le stroma, il a été rapporté quelques cas paradoxaux où les MMP exerçaient une action protectrice anti-tumorale, témoignant de la complexité des interactions régissant l établissement de foyers métastatiques (Tableau IV). Le TFPI-2 a quant à lui été décrit dans quelques études comme ayant une activité antimétastatique. De plus, son inactivation dans les cellules tumorales a été corrélée à une activité métastatique accrue. Ainsi, l inhibition du TFPI-2 par hyperméthylation de son promoteur a été associée à des stades avancés de différents cancers, comme dans le CBPNPC, où le promoteur du TFPI-2 était plus fréquemment hyperméthylé dans les stades III et IV de la maladie, et chez les patients présentant des métastases ganglionnaires (Rollin et al., 2005). Une autre étude de Chand et al., a démontré que 75% des souris développant des tumeurs sans TFPI-2 fonctionnel (incapable d inhiber la plasmine) avaient des métastases pulmonaires quand les animaux développant une tumeur exprimant du TFPI-2 fonctionnel n en avaient que dans 42% des cas (Chand et al., 2004b). Ces derniers travaux soutiennent que le rôle du TFPI- 2 dans la dissémination métastatique serait dépendant de sa capacité à inhiber la plasmine, et donc à inhiber l activation de différentes MMP. Ces observations vont dans le sens d une activité pro-métastatique des métalloprotéases matricielles. Plus récemment, une étude a démontré que la réexpression du TFPI-2 dans des cellules issues d un carcinome œsophagien extrêmement invasif diminuait fortement la formation de métastases pulmonaires (Yang & Pan, 2008). Enfin, une étude observant les effets anti-métastatiques d une isoflavone, la génistéine, sur des cellules issues d un carcinome mammaire, a démontré que l adjonction de cette molécule est associée à la surexpression de différents gènes suppresseurs de tumeur, parmi lesquels le TFPI-2, et à la diminution de l expression de plusieurs gènes pro-métastatiques comme ceux de la MMP-7 et de la MMP-2 (Lee et al., 2007). 122

123 Introduction bilbiographique-chapitre 2 Tableau IV : Effet de la surexpression ou de l inhibition de différentes MMP dans la cellule tumorale sur la formation de métastases. L influence des MMP exprimées par l hôte a été étudiée en utilisant des souris KO ou null. Dans la plupart des cas, les MMP ont une activité pro-métastatique (rouge). Dans certains cas, les MMP peuvent avoir une action protectrice anti-métastatique (vert) (D après Deryugina & Quigley, 2006 ; Pulukuri & Rao, 2008 ; Blackburn et al., 2008). MMP MMP-1 MMP-2 Cellules tumorales Hôtes surexpression inhibition déficience -Dans des cellules cancéreuses mammaires : restitue un phénotype métastatique. -Dans des cellules murines carcinomateuses de vessie : accroît leur phénotype métastatique. -Dans une lignée cellulaire prostatique : Diminue la formation de métastases pulmonaires. -Dans une lignée cellulaire issue d un mélanome : inhibe la formation de métastases. - MMP-2 KO : Réduit les métastases pulmonaires de cellules issues de carcinome ou mélanome. - MMP-7 Dans des cellules issues d un cancer colorectal : production de nombreuses métastases hépatiques. Dans des cellules issues d un cancer colorectal : inhibition des métastases hépatiques. MMP-7 null : augmentation de la formation de métastases pulmonaires par des cellules issues d un carcinome pulmonaire de Lewis. MMP-8 Dans des cellules métastatiques issues d un cancer mammaire : réduction de la formation de métastases. MMP-9 - Dans des cellules non métastatiques issues d un cancer mammaire : acquisition du pouvoir métastasant -Réduit la formation de métastases dans de nombreux modèles. -Augmente la formation de métastases dans une lignée cellulaire hautement métastatique. MMP MMP-14 -Dans des cellules issues d un carcinome pulmonaire, multiplie par 3 le nombre de métastases pulmonaires -Pas d effet sur une lignée cellulaire hautement métastatique. - Réduit la formation de métastases dans de nombreux modèles. -MMP-11 KO : augmente le nombre de métastases

124 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones A- PRODUCTION D UNE LIGNEE CELLULAIRE TUMORALE PULMONAIRE STABLEMENT INHIBEE POUR LE TFPI-2 PAR ARN INTERFERENCE La technique d ARN interférence a été utilisée pour inhiber stablement et de façon spécifique le TFPI-2. Pour cela, des plasmides codant les mirna ciblant le transcrit du TFPI- 2 ont été produits et transfectés dans des cellules tumorales pulmonaires. Ces plasmides recombinants s intègrent dans le génome de la cellule hôte et permettent l expression constitutive des mirna choisis, afin d obtenir une répression transcriptionnelle durable du gène d intérêt. I- Génération d un oligonucléotide double brins codant les pré-mirna I-1. Séquences des oligonucléotides simple brin codant les pré-mirna La première étape a été de configurer la séquence de 2 mirna ciblant l ARNm du TFPI-2, de manière à ce que l inhibition soit la plus efficace possible. Les séquences codant les mirna ont été définies à partir des séquences cibles choisies dans le transcrit TFPI-2, dont la séquence a été décrite par Sprecher et al. en 1994 (figure 27). La structure des pré-mirna est basée sur celle du mirna endogène murin mir-155 (Largos-Quintana et al., 2002) et a été optimisée par le fournisseur au niveau de la séquence des boucles présentes sur le mirna. Les séquences codant les pré-mirna TFPI-2 sont donc constituées d une séquence ciblant le transcrit du TFPI-2 et de séquences dérivant du mir Le fragment d ADN double brin codant ces pré-mirna TFPI-2 a été obtenu après hybridation d un brin sens et d un brin anti-sens. La première séquence, codant le pré-mirna-1, a été choisie à partir de la séquence d un sirna (small interfering RNA) utilisé lors d une étude antérieure menée au sein du laboratoire afin d inhiber transitoirement le TFPI-2 par sirna (Iochmann et al., accepté sous reserve de modifications). La séquence sirna a été convertie en mirna à l aide du logiciel RNAi designer (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et a été nommée mirna-1. Ce mirna cible les nucléotides compris entre 858 et 878 pb de l exon 5 du TFPI-2 (figure 26) correspondant à une séquence 3 non traduite du transcrit. La séquence codant le deuxième mirna, mirna-2, a été entièrement choisie à l aide du logiciel RNAi designer et cible une séquence comprise entre les nucléotides 581 et 601 de 124

125 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones l exon 4 du transcrit TFPI-2 (figure 27) qui correspond à la séquence codant le troisième domaine de type Kunitz. Une séquence contrôle codant pour un mirna ne ciblant aucun gène connu de mammifère a été utilisée (mirna-neg). agaaagccgcgcacctcctcccgccaggcgctttctcggacgccttgcccagcgggccgcccgaccccctgcaccatggac cccgctcgccccctggggctgtcgattctgctgcttttcctgacggaggctgcactgggcgatgctgctcaggagccaacag gaaataacgcggagatctgtctcctgcccctagactacggaccctgccgggccctacttctccgttactactacgacaggta cacgcagagctgccgccagttcctgtacgggggctgcgagggcaacgccaacaatttctacacctgggaggcttgcgacg atgcttgctggaggatagaaaaagttcccaaagtttgccggctgcaagtgagtgtggacgaccagtgtgaggggtccaca gaaaagtatttctttaatctaagttccatgacatgtgaaaaattcttttccggtgggtgtcaccggaaccggattgagaacag gtttccagatgaagctacttgtatgggcttctgcgcaccaaagaaaattccatcattttgctacagtccaaaagatgaggga ctgtgctctgccaatgtgactcgctattattttaatccaagatacagaacctgtgatgctttcacctatactggctgtggaggg aatgacaataactttgttagcagggaggattgcaaacgtgcatgtgcaaaagtttgaaaaagaaaaagaagatgccaaa gcttcgctttgccagtagaatccggaaaattcggaagaagcaattttaaacattcttaatatgtcatcttgtttgtctttatggc ttatttgcctttatggttgtatctgaagaataatatgacagcatgaggaaacaaatcattggtgatttattcaccagtttttatta atacaagtcactttttcaaaaatttggatttttttatatataactagctgctattcaaatgtgagtctaccatttttaatttatggtt caactgtttgtgagactgaattcttgcaatgcataagatataaaagcaaatatgactcactcatttcttggggtcgtattcctg atttcagaagaggatcataactgaaacaacataagacaatataatcatgtgcttttaacatatttgagaataaaaaggacta gcaaataaaacacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Figure 27 : Séquence de l ADNC du TFPI-2 selon Sprecher et al (1994). Les exons son représentés, ainsi que les codons start et stop (encadrés) et l extrémité polyadenylée (rouge). Les séquences ciblées par les mirna-1 (bleu clair) et mirna-2 (jaune) son également indiquées. I-2. Hybridation des oligonucléotides La séquence des oligonucléotides codant les pré-mirna doit suivre certaines règles pour que l inhibition soit optimale. En effet, les séquences cibles choisies doivent être composées de 21 nucléotides de long, avoir un pourcentage de bases G+C compris entre 30-50% et ne pas avoir d homologie de séquence significative avec d autres gènes (tableau V). Les oligonucléotides sens et anti-sens sont configurés en fonction de ces séquences cibles et doivent avoir une structure bien spécifique : -Pour le brin sens (5 3 ) : - une extrémité 5 cohésive TGCT nécessaire à la ligature orientée dans le plasmide, - 5 G suivie de la séquence complémentaire de 21 nucléotides ciblant le transcrit TFPI-2 125

126 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones - la séquence de 19 nucléotides 5 -GTTTTGGCCACTGACTGAC-3 qui formera la boucle terminale du mirna. - une séquence identique à la séquence cible mais délétée des nucléotides en 9 et 10 ème position permettant de créer une boucle interne dans le mirna. -Pour le brin antisens (5 3 ) : - une extrémité 5 cohésive CCTG, nécessaire à la ligation dans le plasmide vecteur, - la séquence complémentaire du brin sens. Tableau V : Séquences sens et anti-sens des oligonucléotides codant les pré-mirna-1 et -2 ciblant le TFPI-2. Les séquences ciblant le transcrit sont représentées en gras. Les nucléotides délétés en 9 et 10 ème position sur la séquence complémentaire correspondante sont soulignés Brin sens séquence 5 -TGCTGATGATTTGTTTCCTCATGCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGCATGAAAACAAATCAT-3 Brin antisens 5 -CCTGATGATTTGTTTTCATGCTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAGCATGAGGAAACAAATCATC-3 Brin sens 5 -TGCTGAATAATAGCGAGTCACATTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAATGTGTCGCTATTATT-3 Brin antisens 5 -CCTGAATAATAGCGACACATTGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCAATGTGACTCGCTATTATTC-3 Brin sens 5 -TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 II-1. Ligature dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR Les séquences codant les pré-mirna sont ligaturées dans le plasmide pcdna TM 6.2- GW/EmGFP-miR (Invitrogen) sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus humain (CMV) (figure 28 ). Ce vecteur contient également le gène codant pour une protéine PrémiRNA-1 PrémiRNA-2 PrémiRNA-nég Brin anti-sens 5 -AAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTCAGCA-3 Afin d obtenir des séquences double brins codant les pré-mirna, l hybridation a été réalisée avec 50 µm de chaque oligonucléotide (sens et antisens). Les réactions sont effectuées dans un volume final de 20 µl en présence du tampon d hybridation (Tris-HCl 100 mm, ph 8 ; EDTA 1 mm, ph 8) pendant 4 minutes à 95 C, puis 5 à 10 min à température ambiante. Les oligonucléotides double brins obtenus ont ensuite été dilués afin d obtenir la solution finale à 5 nm utilisée pour la ligature. Cette opération a été réalisée pour les oligonucléotides codant les mirna-1, -2 et -nég. II- Construction des plasmides pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miRNA recombinants 126

127 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones fluorescente, l EmGFP (Emerald Green Fluorescent Protein). L EmGFP a une longueur d onde d excitation à 487 nm et d émission à 509 nm. Ce vecteur contient également des séquences codant pour les gènes de résistance à la blasticidine et à la spectinomycine. Figure 28 : Carte du plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen). Les ADN double brins codant les pré-mirna ont été insérés dans le vecteur d expression pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR. Pour cela, les ligatures ont été effectuées selon un rapport molaire vecteur/insert de 1:15 en utilisant 10 ng de vecteur. Les réactions ont été effectuées dans un volume final de 20 µl contenant 2 mm de tampon de ligature (50 mm Tris HCl, ph 7.6 ; 10 mm MgCl 2 ; 1 mm ATP ; 1 mm DTT ; 5% Polyethylene-glycol 8000), 1 unité d ADN ligase T4 (Invitrogen) et incubées 5 minutes à 20 C, puis mises dans la glace. II-2. Transformation des bactéries compétentes Deux microlitres de chacune des solutions de ligature ont été mis en présence de 50 µl bactéries Escherichia coli TOP 10, compétentes chimiquement (One Shot Top 10, Invitrogen). La suspension a été incubée 10 minutes dans la glace, puis le choc thermique de 30 secondes à 42 C suivi de 2 à 5 minutes dans la glace a permis aux plasmides de pénétrer dans les bactéries. Enfin, 250 µl de milieu SOC (0.5% extrait de levure ; 2.0% tryptone ; 10 mm NaCl ; 2.5 mm KCl ; 10 mm MgCl 2 ; 10 mm MgSO 4 ; 20 mm glucose) ont été ajoutés. La suspension a alors été agitée 1 heure à 37 C, puis 100 µl de chaque préparation ont été étalés sur du milieu Luria-Bertani (1% tryptone ; 0,5% extrait de protéine ; 1% NaCl) contenant 1,5% d agar (LB/agar) et 100 µg/ml de blasticidine pour sélectionner les bactéries transformées par 127

128 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR, recombinant pour les mirna-1, mirna-2 et mirna-nég. II-3. Préparation d ADN plasmidique Le coffret Plasmid MIDI prep (Qiagen, Courtaboeuf, France) a été utilisé pour la purification de l ADN plasmidique des bactéries transformées. Une culture bactérienne a tout d abord été réalisée à partir de chacun des clones contenant le plasmide d intérêt dans 20 ml de milieu LB liquide contenant 100 µg/ml de blasticidine pendant 18 h à 37 C sous agitation. La culture a été centrifugée à 6000 g pendant 15 minutes à 4 C. Le culot bactérien a ensuite été repris dans 4 ml de tampon P1 (50 mm Tris-HCl, ph 8 ; 10 mm EDTA ; 100 µg/ml RNAse A) puis les bactéries ont été lysées par ajout de 4 ml de tampon P2 (20 mm NaOH, 1% SDS) et la préparation a été incubée 5 minutes à 20 C. Le lysat a été neutralisé avec 4 ml de tampon P3 refroidi (3 M acétate de potassium, ph 5.5) pendant 15 minutes à 4 C puis centrifugé à 4 C pendant 30 minutes à g. Ainsi, les protéines dénaturées, l ADN chromosomique, les débris cellulaires et le SDS ont été précipités tandis que l ADN plasmidique est resté soluble. Le surnageant contenant les plasmides a été prélevé et à nouveau centrifugé à 4 C pendant 15 minutes à g. Le surnageant a ensuite été déposé sur la colonne Qiagen, constituée d une résine de silice échangeuse d anion, préalablement équilibrée avec 10 ml de tampon QBT (750 mm NaCl ; 50 mm MOPS, ph 7 ; 15% Propanol ; 0,15% triton X-100). Les conditions de salinité et de ph du surnageant permettent la fixation de l ADN à la colonne tandis que l ARN et les métabolites ne sont pas retenus. La colonne a ensuite été lavée deux fois avec 10 ml de tampon QC (1 M NaCl ; 50 mm MOPS, ph 7 ; 15% isopropanol). L ADN a ensuite été élué avec 5 ml de tampon QF de forte salinité (1,25 M NaCl ; 50 mm Tris-HCl, ph 8,5 ; Propanol-2 15%) puis précipité avec 0,7 volume d isopropanol absolu. Après 30 minutes de centrifugation à g, le culot d ADN est repris avec 2 ml d éthanol 70%, centrifugé 10 minutes à g et séché à température ambiante. L ADN ainsi obtenu a été repris dans 200 µl de tampon TE (10 mm Tris-HCl, ph 8 ; 1 mm EDTA). La quantité et la qualité de l ADN purifié ont été contrôlées par spectrophotométrie à 260 et 280 nm, le ratio A260/A280 devant être compris entre 1,7 et 1,9. II-4. Digestion enzymatique d ADN Les digestions d ADN plasmidique par l endonucléase de restriction Bgl II (Promega, Charbonnières les Bains, France) ont été réalisées en utilisant 5 unités d enzyme par µg d ADN. Les réactions ont été effectuées dans un volume final de 10 µl, en présence du 128

129 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones tampon de réaction (6 mm Tris-HCl, ph 7.9 ; 6 mm MgCl2 ; 150 mm NaCl). Les réactions ont été incubées pendant 2h30 à 37 C. II-5. Electrophorèse de l ADN Les oligonucléotides double brins codant les pré-mirna ont été séparés en gel d agarose de bas point de fusion à 4% en tampon TAE (40 mm Tris-acétate, 1 mm EDTA, ph 7,6) et contenant 0,1 µg/ml de bromure d éthidium (BET). Les digestions des ADN plasmidiques ont été séparées en gel d agarose à 0,8% préparé en tampon TAE et contenant 0,1 µg/ml de BET. Avant d être déposés dans le gel, les échantillons ont été mélangés avec 0,1 volume de tampon de charge (0,4% bleu de bromophénol ; 200 mm Tris-HCl ph 6,8 ; 8% de SDS et 40% de glycérol). La migration des fragments d ADN a été effectuée sous 100 ma et l ADN a été visualisé sous UV à l aide du système d acquisition vidéo Gel Doc XR et du logiciel Quantity One (Biorad, Marnes la Coquette, France). Les marqueurs de taille utilisés ont une échelle de 100 pb (Promega) et 1kb (Invitrogen). II-6. Séquençage d ADN Le séquençage de l ADN a été réalisé selon la technique de Sanger et al. (1977) à l aide du coffret Abi Prism BigDye Terminator v1.1 sequencing (Applied Biosystem, Courtaboeuf, France) à partir de plasmides purifiés sur les colonnes Qiagen. Le séquençage du brin sens et du brin anti-sens des oligonucléotides codant les pré-mirna a été effectué par élongation par l ADN Polymérase à partir des amorces de séquençage mirna sens (5 TCC CAAGCTGGCTAGTTAAG 3 ) et mirna anti-sens (5 CTCTAGATCAACCACTTTGT 3 ). Ces amorces reconnaissent les séquences complémentaires présentes sur le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR et encadrant le site d insertion des oligonucléotides codant les mirna. La technique de séquençage a été basée sur l utilisation de didésoxyribonucléotides fluoromarqués (ddntp) qui diffèrent des désoxyribonucléotides par leur incapacité à former des liaisons phosphodiesters avec un autre dntp. Lorsqu un ddntp se fixe sur la chaîne néoformée, l élongation par l ADN polymérase s arrête et donne des fragments de différentes tailles se terminant par un ddntp. La réaction de séquençage a été effectuée dans un volume de 10 µl en présence de 500 ng de plasmide; la solution Terminator Ready Reaction Mix contenant les dntp, les ddntp, du Tris-HCl, du MgCl 2, la Taq Polymérase et 0,3 µm d amorce. L élongation a été réalisée pendant 25 cycles de 10 secondes à 94 C, 5 secondes à 50 C et 4 minutes à 60 C. 129

130 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones Les produits de séquençage ont ensuite été purifiés à l aide du coffret Montage SEQ 96 sequencing reaction clean up (Millipore, Saint Quentin en Yvelines). Ils ont été dilués avec 20 µl de la solution d injection puis prélevés et déposés dans la plaque de filtration. Un vide a été appliqué pendant 3 min, puis 20 µl de la solution d injection ont été déposés dans les puits et une filtration sous vide a été à nouveau effectuée pendant 4 min. Les produits de séquençage ont été repris par 20 µl de la solution d injection et agités pendant 20 min avant d être transférés dans la plaque de séquençage. Les produits de séquençage ont ensuite été prélevés par les capillaires du séquenceur Abi Prism 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems) qui contiennent le gel de migration. Les fragments d ADN ont alors été séparés en fonction de leur taille avec les plus petits fragments qui seront détectés en premier par le laser qui, de plus, différencie les 4 fluorescences émises par les ddntp. Les electrophorégrammes ont ensuite été analysés et alignés avec les logiciels Sequence Analysis et Codon code aligner. III- Obtention des clones cellulaires exprimant les mirna III-1-Lignée cellulaire tumorale pulmonaire utilisée La lignée cellulaire NCI-H460, est issue d un cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules et plus précisément d un carcinome bronchique à grandes cellules (LCG Promochem/ATCC, Molsheim). Les cellules adhérentes NCI-H460 ont été cultivées en milieu RPMI-1640 contenant 2 mm de L-glutamine, 18 mm de bicarbonate de sodium, 25 mm de glucose, 10 mm d HEPES, 1 mm de pyruvate de sodium et 10 6 UI/L de pénicilline et 100 mg/l de streptomycine (Invitrogen). Extemporanément, les milieux de culture ont été supplémentés avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen). Lorsque ces cellules adhérentes ont atteint la confluence, le milieu de culture a été éliminé et le tapis cellulaire a été rincé avec du milieu de Hanks dépourvu de calcium et de magnésium (HBSS) (Invitrogen). Les cellules ont ensuite été détachées du flacon de culture par incubation avec une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02% pendant 3 minutes à 37 C. L activité de la trypsine a ensuite été neutralisée par l addition de SVF en excès. Après centrifugation pendant 10 minutes à 800 g, le surnageant a été éliminé et le culot cellulaire remis en suspension dans 2 ml du milieu de culture. La numération cellulaire a été effectuée à l aide d un hématimètre de Malassez après addition de 130

131 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones bleu Trypan, permettant de différencier les cellules mortes, colorées en bleu, des cellules vivantes, incolores et réfringentes. La lignée cellulaire a été ensemencée en flacon de culture de 75 cm 2 (Greiner, Brumath, France) et placée dans une étuve à 37 C sous une atmosphère de 5% en CO 2. Les cellules ont été régulièrement testées avec le coffret PlasmoTest TM Mycoplasma Detection Kit (InvivoGen, Toulouse, France) permettant de vérifier l absence de contamination par des mycoplasmes. III-2. Transfection des cellules Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules NCI-H460 ont été cultivées dans une plaque 6 puits (TPP, ATGC, Biotechnologie, Marne la Vallée) à raison de cellules par puits, dans du milieu complet frais sans antibiotiques, afin d obtenir 75 à 80 % de confluence le jour de la manipulation. La transfection des cellules a été effectuée à l aide de Lipofectamine (Invitrogen), constituée de lipide cationique. Ainsi, 0,8 µg d ADN ont été mélangés à 50 µl du milieu Opti-MEM I (Invitrogen). En parallèle, 2 µg de Lipofectamine ont été dilués dans 50 µl du même milieu. Les deux tubes ont été placés 5 minutes à température ambiante puis l ADN plasmidique et la lipofectamine ont été mélangés et incubés 30 minutes à température ambiante, permettant la formation des complexes ADN/lipofectamine. La solution de plasmide/lipofectamine a ensuite été déposée sur les cellules en culture dans 500 µl de milieu complet sans antibiotique, puis les cellules ont été incubées à 37 C sous 5% CO 2 pendant 6 h. La lipofectamine fusionne avec les membranes des cellules et permet l incorporation de l ADN plasmidique dans les cellules. Le milieu a ensuite été changé et la plaque a été placée à 37 C, 5% CO 2 pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été détachées avec 100 µl de trypsine-edta (Invitrogen) puis ensemencées en plaque 6 puits (TPP, ATGC) dans du milieu complet supplémenté de 10% de SVF et de 6 µg/ml de blasticidine afin de sélectionner les cellules NCI-H460 transfectées par les différents plasmides. Le milieu a été changé tous les 3-4 jours pendant trois semaines afin de sélectionner les clones cellulaires résistant à la blasticidine. Une condition témoin composée de cellules NCI-H460 non transfectées a également été réalisée afin de vérifier la sensibilité des cellules NCI-H460 sauvages à la blasticidine. L expression du plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR recombinant dans les clones cellulaires résistant à la blasticidine a été vérifiée grâce à l expression de l EmGFP et l observation des cellules NCI- H460 fluorescentes à l aide d un microscope inversé à fluorescence (Leica DMR). Les clones 131

132 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones résistant à la blasticidine et exprimant l EmGFP ont été prélevés et repiqués en plaque de 24 puits pour être cultivés puis amplifiés. III-3. Contrôle de l inactivation du TFPI-2 III-3.1 Retro-transcription et PCR quantitative III Extraction des ARN messagers (ARNm) et transcription inverse Le coffret Dynabeads mrna direct kit (Dynal, Compiègne, France) a été utilisé pour extraire les ARNm totaux des clones cellulaires. Les cellules, ensemencées à raison de 10 6 par puits, ont été lavées avec un tampon phosphate salin (PBS : 137 mm NaCl ; 2,7 mm KCl ; 4,3 mm Na 2 HPO 4 ; 1,4 mm KH 2 PO 4, ph 7.4), puis ont été lysées avec 1,2 ml d'un tampon de lyse (100 mm Tris-HCl, ph 8.0 ; 500 mm LiCl ; 10 mm EDTA, ph 8.0 ; 1% SDS ; 5 mm DTT). Les membranes cellulaires sont dénaturées par un détergent, le SDS, alors que l'adn génomique est cassé par pipetages et relargages successifs. Après une centrifugation pendant 5 minutes à g, 300 µg de billes magnétiques, à la surface desquelles sont fixées des chaînes de 25 nucléotides désoxy-thymidilate oligo(dt) 25, ont été ajoutées au lysat cellulaire. Les billes ont été préalablement lavées 2 fois avec du tampon de lyse. L'hybridation de l'extrémité polyadénylée des ARNm sur les séquences oligo(dt) des billes a été réalisée sous agitation douce, à température ambiante, pendant 5 minutes. Les complexes ARNm-billes ont été lavés deux fois avec 600 µl d'un tampon de lavage avec détergent (10 mm Tris-HCl ph 8 ; 150 mm LiCl ; 1 mm EDTA ; 0,1% LiDS), puis une fois avec 400 µl du même tampon de lavage sans détergent, afin de purifier les ARNm et éliminer les protéines, les lipides et l'adn. Les ARNm fixés aux billes ont été élués avec 20 µl de solution d'élution (10 mm Tris-HCl, ph 8) pendant 2 minutes à 65 C. Les ARN messagers extraits ont ensuite été rétrotranscrits en ADN complémentaires (ADNc) à l'aide de l'amv-rt, transcriptase inverse issue du virus myéloblastique aviaire. La transcription inverse a été effectuée sous un volume final de 45 µl. Aux 20 µl d'arnm ont été ajoutés du tampon AMV-RT 1 fois concentré (50 mm Tris-HCl, ph 8.5 ; 8 mm MgCl 2 ; 30 mm KCl ; 1 mm DTT), 250 mm de dntp et 5 mm d oligo(dt) 20. Après une incubation de 5 minutes à 65 C pour dénaturer l'arn, 24 U d'inhibiteur de RNase (Promega) et 20 U d'amv-rt (Roche Applied Science, Meylan) ont été ajoutées au mélange puis une incubation de 1 heure à 42 C a été réalisée. L enzyme a ensuite été dénaturée avec une incubation à 95 C pendant 5 minutes. Les ADNc ont été stockés à 4 C. 132

133 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones III Etude de l expression génique par PCR quantitative Afin de quantifier le niveau d expression de nos gènes d intérêts par les différents clones, nous avons utilisé une méthode de PCR quantitative (PCRq) qui permet de suivre l amplification à chaque cycle. Pour cela, nous avons utilisé un marqueur fluorescent non spécifique, le SYBR Green (Roche), qui s intercale dans l ADN double brins et émet un signal alors 1000 fois plus élevé qu à l état non fixé. L intensité de la fluorescence reste inférieure au bruit de fond au début de la PCR et augmente à chaque cycle avec l accumulation des amplicons. Le cycle à partir duquel la fluorescence devient supérieure au bruit de fond est appelé cycle de seuil ou treshold cycle (ct). Plus le ct est faible et plus la quantité d ADNc spécifique du gène d intérêt sera élevée. Toutes les PCR ont été effectuées dans un thermocycleur icycler iq detection system (BioRad, Marnes la Coquette) avec l ADNc rétrotranscrit équivalent à cellules pour la quantification des transcrits de la β-actine et du TFPI-2 et à l aide d amorces spécifiques (Tableau VI). En parallèle, une gamme d étalonnage, de 10 8 à 10 2 copies pour la β-actine, et de 10 7 à 50 copies pour les autres transcrits, a été réalisée à partir des dilutions des produits de PCR purifiés et quantifiés. Une relation linéaire existe entre le logarithme du nombre de copies du gène d intérêt et le ct. A partir des données obtenues pour les différentes dilutions de la gamme détalonnage, l efficacité de l amplification est calculée et doit être comprise entre 90% et 100%. Un contrôle négatif est également réalisé en remplaçant les ADNc par de l H 2 0 afin de vérifier l absence de contamination. Chaque échantillon a été déposé en double. La réaction a été effectuée sous un volume final de 25 µl contenant le mélange Platinum Quantitative PCR super Mix-UDG 1 fois concentré (0,75 U Platinum Taq DNA polymérase ; 40 mm Tris HCl, ph 8,4 ; 100 mm HCl ; 6 mm MgCl 2 ; 200 µm de chacun des nucléotides dgtp, datp, dctp ; 400 µm de dutp ; 0,5 U de UDG (uracile DNA glycosylase) (Invitrogen) et du SYBR Green (Roche Applied Sciences) 0,2 fois concentré. Chaque amplification est composée d un cycle de décontamination avec une étape de 2 minutes à 50 C activant l UDG et une étape d inactivation de 2 minutes à 95 C, suivi par x cycles (tableau) à 95 C pendant 20 secondes et à la température d hybridation (tableau) pendant 40 secondes. 133

134 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones Tableau VI: Séquences des amorces utilisées pour les PCR quantitatives en temps réel spécifiques du TFPI-2 et de la β-actine Gène Séquences (5 3 ) TFPI-2 β-actine Sens :AACGCCAACAATTTCTACACCT Antisens : TACTTTTCTGTGGACCCCTCAC Sens : GCCCTAGACTTCGAGCAAGA Antisens : AGGAAGGAAGGCTGAAGAG Produit PCR (pb) T C Hybridation Nombe de cycles Après l amplification, la présence d un amplicon unique est vérifiée à l aide d une courbe de fusion, systématiquement réalisée à la fin de chaque PCR à partir d un cycle de 10 secondes à 75 C suivi de 40 cycles de 10 secondes avec une augmentation de la température de 0,5 C à chaque cycle. La courbe de fusion présentera un pic unique qui correspondra à la température de fusion de l amplicon et qui est dépendante de sa séquence. Le nombre de copies de chaque gène d intérêt présent dans l échantillon a été obtenu à partir de la gamme d étalonnage. Dans notre travail, les résultats de PCR quantitatives ont été exprimés en rapportant le nombre de copies du gène étudié pour 10 6 copies de β-actine (gène utilisé comme contrôle), et le pourcentage d inhibition de chaque clone calculé selon la formule : % inhibition clone = [(nb copies TFPI-2/nb copies β-act) clones * 10 6 ]*100 [(nb copies TFPI-2/nb copies β-act) H460 * 10 6 ] III-3.2 Immuno-empreinte III Extraction des protéines de la matrice extracellulaire Le TFPI-2 étant principalement localisé dans la matrice extracellulaire, les protéines de cette dernière ont été extraites. Les cellules ont été ensemencées en plaque 6 puits à raison de cellules par puits et cultivées pendant 3 jours en milieu supplémenté avec 10% de SVF. Les cellules ont ensuite été détachées par une solution de trypsine/edta, la MEC a été lavée plusieurs fois avec de l HBSS et les protéines ont ensuite été solubilisées pendant 15 min dans 300 µl de tampon TNC (50 mm Tris-HCl, ph7,5 ; 150 mm NaCl ; 1% Igepal). Les lysats prélevés ont ensuite été centrifugés 10 minutes à 800g afin d éliminer tout les débris cellulaires et les surnageants ont été récupérés et stockés à -80 C. 134

135 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones III Dosage des protéines Les protéines ont été dosées à l aide du coffret Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Perbio Science, Brebières, France). Le dosage est basé sur la réaction d un composé contenant de l acide bicinchoninique (BCA) et les ions Cu + issus de la réduction des ions Cu 2+ par les protéines en milieu alcalin (réaction de Biuret). La coloration violette de cette réaction est issue des complexes formés par deux molécules de BCA et un ion Cu +. Une gamme étalon d albumine de sérum bovin (BSA), de 2 mg/ml à 0,0625 mg/ml, a d abord été effecctuée par dilution de deux en deux dans le tampon utilisé pour l extraction des protéines. Dix microlitres de chaque point de gamme et des échantillons ont été déposés en triple dans des puits de plaque 96 puits. Le réactif BCA a été produit en mélangeant 50 volumes de réactif A avec 1 volume de réactif B et 100 µl de cette solution ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque a ensuite été agitée 30 seconde puis incubée 30 minutes à 37 C. La plaque a ensuite été refroidie à température ambiante puis l absorbance des puits a été mesurée à 570 nm sur un lecteur de plaque ELISA (Thermo max, Molecular Devices, St Grégoire, France). La quantité de protéine présente dans chaque échantillon a été calculée à l aide d une droite d étalonnage obtenue avec la gamme étalon de BSA. III Immuno-empreinte Le TFPI-2 a été visualisé en utilisant la technique du Western Blotting. L électrophorèse des protéines a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970). Les protéines ont été diluées dans du tampon échantillon (50 mm Tris-HCl, ph 6,8 ; 2% SDS ; 10% Glycérol ; 0,1% Bleu de bromophenol), chauffées à 90 C pendant 5 minutes puis ont été soumises à une électrophorèse SDS-PAGE 10%. Le marqueur de taille protéique précoloré (BioRad) utilisé est constitué de bandes à 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 et 250 kda, dont deux bandes de référence à 25 kda et 75 kda sont colorées en rose. Le gel de polyacrylmamide est composé d un gel de concentration à 5% d acrylamide (5% d acrylamide ; 0,2 % de bis-acrylamide ; 125 mm Tris HCl, ph6.8 ; 0,1% SDS ; 0,1% persulfate d ammonium ; 0,06% NNN N tetramethylethylene diamine (TEMED)) permettant de concentrer les protéines et d un gel de séparation à 10% d acrylamide (10% acrylamide, 0,33% bis-acrylamide ; 375 mm Tris HCl, ph 8.8 ; 0,1% SDS ; 0,1 % APS ; 0,04% TEMED) permettant la séparation des protéines suivant leur masse moléculaire. La migration a été effectuée à un voltage constant de 150 volts durant une heure. 135

136 Matériels et méthodes-partie A-Production des clones Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 microns (Millipore) à l aide d un appareil de transfert vertical en milieu liquide Mini Trans- Blot Electrophoretic Transfer Cell (BioRad), sous l action d un champ électrique de 70 volts durant 1h15 dans un tampon de transfert (48 mm Tris ; 39 mm Glycine ; 20% méthanol ; 0,0375 % SDS). Le TFPI-2 a été détecté à l aide d un anticorps polyclonal selon la méthode de Blake et al (1984). Après électrophorése, les sites non spécifiques de la membrane de nitrocellulose ont été saturés pendant 1 heure à température ambiante sous agitation par le tampon TNT (10 mm Tris-HCl, ph 8 ; 150 mm NaCl ; 0,05% Tween 20) additionné de 5% de lait écrémé (TNT-lait). La membrane a ensuite été incubée une nuit à 4 C sous agitation avec un anticorps polyclonal de lapin anti-tfpi-2 fourni par le Dr W. Kisiel, (Department of Pathology, University of New Mexico Health Sciences Center, Albuquerque, USA) dilué au 1/3000 dans du TNT-lait 5%. Les anticorps non fixés ont été éliminés par 3 lavages de 5 minutes dans du TNT-lait puis la membrane de nitrocellulose a été incubée durant 2 heures avec le second anticorps, couplé à la peroxydase (IgG Anti-lapin, Sigma) dilué au 1/80000 en tampon TNT-lait 5%. Les anticorps non fixés ont été éliminés par 3 bains successifs de 5 minutes dans du tampon TNT-lait, puis la membrane a été rincée 5 minutes en TNT. Pour la révélation par chimioluminescence, la membrane de nitrocellulose a été incubée, pendant 5 minutes, dans une solution correspondant au mélange volume à volume du substrat : le luminol et du réactif oxydant du coffret Western Lightening Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer TM Life Sciences, Courtaboeuf, France). Elle a ensuite été enveloppée dans du film plastique et exposée à un film d'autoradiographie (Kodak, Paris, France) pendant 10 minutes. Le film a été révélé par des bains successifs d'une minute dans le réactif de développement (Processing Chemicals Kodak GBX Developper/Replenisher, Sigma), l'eau, le fixateur (Processing Chemicals Kodak GBX Fixer/Replenisher, Sigma) puis rincée à nouveau avec de l'eau. L acquisition des images a été réalisée à l'aide du système d'acquisition vidéo GelDocXR (BioRad) et du logiciel QuantityOne (BioRad). III-3.3 Immunofluorescence Le TFPI-2 a été mis en évidence dans les clones mirna à l aide d un immunomarquage. Pour cela, les clones ont été ensemencés 24h avant le marquage à raison de cellules dans 300 µl de milieu complet, dans des puits de Labteck (Brand Products, Fisher Scientific, Illkirch, France). 136

137 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones Les cellules ont ensuite été rincées deux fois avec 200 µl de PBS, puis le tapis cellulaire a été fixé avec 200 µl d une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 10 minutes à température ambiante, et rincé à nouveau deux fois avec 200 µl de PBS. La saturation des sites non spécifiques a été effectuée avec de la solution de saturation préparée extemporanément (PBS/2% BSA) pendant 1h à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1h à température ambiante avec l anticorps polyclonal de lapin anti-tfpi-2, dilué au 1/3000 dans la solution de saturation. Trois rinçages avec 300 µl de la solution de saturation ont ensuite été effectués et les cellules ont été incubées avec l anticorps secondaire couplé à l AlexaFluor 488 (IgG Anti-lapin, Molecular Probes, Invitrogen) dilué au 1/1000 dans la solution de saturation, avant que les cellules ne soient à nouveau rincées cinq fois avec 300 µl de la solution de saturation. Les noyaux ont ensuite été colorés avec 10 µl de solution contenant du DAPI (4',6' DiAmidino-2-Phényl Indole), puis les lames ont été observées avec un microscope à fluorescence (Leica DMR) à 455 nm pour observer les noyaux et à 519 nm pour observer la fluorescence. L acquisition des images a été réalisée avec le logiciel Lucia (Nikon, Champigny sur Seine, France) et la superposition de la fluorescence des noyaux et du TFPI-2 a été effectuée avec le logiciel GIMP. B- CARACTERISATION DES CELLULES TUMORALES PULMONAIRES INACTIVEES POUR LE TFPI-2 I - Migration et invasion cellulaire in vitro La lignée cellulaire HT-1080 (ATCC), issues d un fibrosarcome humain, a été utilisée comme contrôle. Ces cellules ont été cultivées dans un milieu MEM (Minimun Essentiel Medium) dans lequel ont été ajoutés 2 mm de glutamine, 1mM de pyruvate de sodium, 106 UI/L de pénicilline, 100 mg/l de streptomycine, des acides aminés non essentiels une fois concentré et 10 % de SVF. La migration des cellules HT-1080 et des cellules tumorales pulmonaires NCI-H460, inhibées pour le TFPI-2 ou exprimant le mirna négatif, a été évaluée à travers la membrane poreuse d un insert, après 48 heures à 37 C à l aide d une méthode basée sur le principe de la chambre de Boyden. La membrane de polycarbonate, située à la base de l insert, comporte des pores de 8 µm de diamètre et peut être recouverte de Matrigel TM (Beckton Dickinson, St Quentin en Yvelines). Ce dernier est préparé à partir du sarcome murin Engelbreth-Holm- 137

138 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones Swam (EHS), une tumeur riche en protéines de la matrice extracellulaire (Kleinman et al., 1982). Le Matrigel TM permet de reconstituer in vitro, la matrice extracellulaire et la lame basale, permettant ainsi d évaluer le potentiel invasif des cellules tumorales. Dans un tube placé dans la glace, le Matrigel TM a été dilué dans du milieu sans SVF afin de déposer dans l insert 25 µg de Matrigel TM sous un volume de 30 µl. Après 30 minutes dans une étuve à 37 C, l excès de Matrigel TM a été aspiré. Les cellules ont ensuite été déposées dans l insert, recouvert ou non de Matrigel TM, à raison de cellules sous un volume de 400 µl de milieu sans SVF. Un test de viabilité avec du bleu Trypan a été préalablement réalisé afib de vérifier que la mortalité cellulaire était inférieure à 5%. L insert a ensuite été placé dans un puits d une plaque 24 puits contenant 600 µl de milieu de culture additionné de 10% de SVF, utilisé comme chimio-attractant. Pour chaque condition testée, au moins quatre expériences ont été réalisées en triple. Insert Pores (8 µm) Cellules Cellules tumorales tumorales ±Matrigel Milieu sans SVF SVF Milieu + SVF (chimioattractant) 48 h, 37 C, 5% CO 2 Cellules ayant migré SVF Figure 29 : Système d invasion/migration basé sur le modèle de la chambre de Boyden Après 48 heures de migration, le milieu contenu dans l insert a été éliminé et les cellules restant fixées à la membrane poreuse ont été retirées à l aide d un coton-tige. Le milieu contenu dans le puits a été aspiré et conservé, car il contient des cellules ayant migré encore en suspension. Il a été remplacé par 500 µl de trypsine 0,5%-EDTA 0,2% puis l insert a été de nouveau plongé dans le puits et la plaque placée à 37 C pendant 3 minutes. Les cellules ayant adhéré sous l insert et au fond du puits ont ainsi été détachées et rassemblées avec celles présentes dans le milieu du puits. La quantité totale de cellules ayant migré a ensuite été évaluée à l aide d un hématimètre de Malassez. La moyenne des numérations obtenues pour les cellules ayant migré à travers l insert nu ou recouvert de Matrigel TM a été calculée, puis le pourcentage de migration ou d invasion 138

139 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones a été obtenu en effectuant le rapport entre le nombre de cellules ayant migré et le nombre de cellules déposées initialement dans l insert. II -Prolifération cellulaire La prolifération des cellules tumorales pulmonaires inhibées pour le TFPI-2 ou exprimant le plasmide négatif a été mesurée toutes les 24 h, sur une cinétique de 96 h, à l aide du coffret CellTiter 96 AQ ueous One Solution (Promega, Charbonnières les Bains, France). Cette méthode colorimétrique permet de déterminer le nombre de cellules viables présentes dans un milieu de culture. Elle a été réalisée à partir de cellules NCI-H460 ensemencées en plaque 96 puits ou 24 puits. A J0, , , ou cellules NCI-H460 ont été ensemencées en plaque 96 puits dans 200 µl de milieu complémenté avec 10% de SVF et 1, , , ou cellules NCI-H460 ont été placées dans des plaques 24 puits avec 700 µl de milieu supplémenté de 10% de SVF. Après 24, 48, 72, et 96 h, 40 µl ou 140 µl de réactif MTS, composé de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium et d un agent de couplage, le phenazine ethosulphate, permettant d obtenir une solution stable, ont été ajoutés dans chaque puits de plaque 96 ou 24 puits et les cellules ont été incubée 1h à 37 C, sous 5% de CO 2. Le MTS est alors réduit par les cellules viables et forme un produit coloré, le Formazan qui est soluble dans le milieu de culture. Cette conversion est réalisée par le NADPH ou NADH produit par les enzymes déshydrogénases des cellules dont le métabolisme est actif. Deux cent microlitres de milieu réactionnel ont ensuite été prélevés et leur absorbance mesurée à une longueur d onde de 490 nm sur un lecteur de plaque ELISA (Thermo max, Molecular Devices, St Grégoire, France). La quantité de formazan produite est proportionnelle à la quantité de cellules viables en culture. Pour chaque condition testée, quatre expériences ont été réalisées en triple. 139

140 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones III- Mesure de l adhérence des cellules aux protéines de la matrice extracellulaire L adhérence des cellules tumorales pulmonaires inhibées pour le TFPI-2 ou exprimant le plasmide négatif a été évaluée vis-à-vis de cinq protéines de la MEC : la fibronectine, la vitronectine, la laminine, le collagène de type I et le collagène de type IV. Ces mesures ont été réalisées à l aide du coffret CytoMatrix SCREEN Kit (Abcys SA, Paris). Quinze à vingt heures avant l expérience, les cellules ont été ensemencées en flacon de 75cm² dans du milieu supplémenté avec 1% de BSA, sans SVF. A J0, les cellules ont été détachées avec une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02% pendant 3 min à 37 C, centrifugées à 800 g pendant 10 minutes, puis lavées deux fois avec du milieu HBSS dépourvu de calcium et de magnésium. Les cellules ont ensuite été mises en suspension dans 2 ml de milieu supplémenté avec 1% de BSA et agitées pendant 2 h à 37 C, sous 5% de CO 2, afin de permettre la réexpression des intégrines dégradées lorsque les cellules ont été détachées à l aide de la trypsine. Les puits recouverts des différentes protéines de la matrice, ou de BSA pour le contrôle négatif, ont été réhydratés avec 200 µl de PBS dépourvu de magnésium et de calcium. Les cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration de cellules/ml dans du milieu supplémenté avec 1% de BSA et cellules (100 µl de la suspension) ont été ensemencées dans chaque puits et incubées 2 h à 37 C, sous 5% de CO 2. Les cellules ont alors été délicatement lavées trois fois avec 200 µl de PBS contenant du magnésium et du calcium puis les cellules adhérentes ont été fixées et colorées avec 100 µl de solution de crystal violet (0,2% crystal violet ; 10% éthanol) pendant 5 minutes à température ambiante, sous agitation. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec 300 µl de PBS sans magnésium et calcium puis le crystal violet a été solubilisé avec 100 µl de tampon de solubilisation (0,1 M NaH 2 PO 4, ph 4,5 ; 50% éthanol) pendant 5 min à température ambiante. L absorbance obtenue a alors été lue à une longueur d onde de 570 nm à l aide d un lecteur de plaque ELISA (Thermo max, Molecular Devices). L absorbance mesurée lorsque les cellules ont adhéré au fond du puits recouvert de BSA est déduite des absorbances mesurées à partir des puits dans lesquels les cellules ont été en contact avec les différentes protéines de la matrice. L absorbance mesurée est proportionnelle à la quantité de cellules adhérées aux différentes matrices. Pour chaque condition, l expérience a été réalisée quatre fois en triple. 140

141 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones Pour chaque protéine matricielle, les résultats ont été exprimés en pourcentage en rapportant les absorbances obtenues pour les cellules inhibées pour le TFPI-2 à celles mesurées pour les cellules contrôles exprimant le mirna négatif. IV- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN IV-1. Mise au point de la PCR en temps réel spécifique à la MMP-7 IV-1.1. Mise au point de la gamme d étalonnage Afin de mettre au point une PCR quantitative spécifique de la MMP-7, nous avons tout d abord préparé une gamme d étalonnage. Pour cela, une PCR «conventionnelle» spécifique du gène de la MMP-7 a été effectuée, avec des amorces spécifiques permettant d amplifier un fragment «long», de 250 pb. Les PCR ont été réalisées avec 5 µl d ADNc retrotranscrits à partir d ARNm, équivalent à cellules, isolés des lignées cellulaires A549, NCI-H460, NCI-H209, NCI-H23, NCI-H23, NCI-H358 et CCD19-Lu. Ces ADNc ont été précédemment obtenus au sein du laboratoire. Chaque réaction a été effectuée sous un volume final de 50 µl contenant du tampon Taq polymérase une fois concentré (10 mm Tris HCl, ph 9. 0 ; 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2 ; 0,01% gélatine ; 0,1% Triron X-100), 200 µm de dntp, 1 µm de chacune des amorces sens et anti-sens spécifiques de la MMP-7 et 1 U d enzyme Taq polymérase isolée de Thermus aquaticus. Les amorces spécifiques de la MMP- 7 ont été choisies à l aide du logiciel Primer 3 (sens : 3 -AACTCCCGCGTCATAGAAA-5 ; antisens : 3 -GCCAATCATGATGTCAGCAG-5 ). Les PCR ont été effectuées dans un thermocycleur i Cycler (BioRad, Ivry sur Seine). L étape préalable de dénaturation de 3 minutes à 94 C a été suivie d une succession de 35 cycles comprenant une dénaturation des double brins à 94 C pendant 30 secondes, une hybridation des amorces spécifiques de la MMP-7 à 60 C et une polymérisation du brin complémentaire à 72 C durant 30 secondes. Une étape d élongation de 2 minutes à 72 C a enfin été effectuée. Le produit de PCR a été déposé sur un gel d agarose de bas poids de fusion à 2 % en tampon TAE (40 mm Tris acétate ; 1mM EDTA, ph 8.0) contenant 1 µg/ml de bromure d éthidium afin de visualiser et de déterminer la taille des fragments d ADN amplifiés. Après migration durant 60 minutes à ampérage constant (120 ma), les bandes obtenues ont été visualisées à l aide d un systéme d acquisition vidéo Gel Doc 1000 et du logiciel Multi- Analyst (BioRad). Le marqueur de taille utilisé a été l ADN du Phage ΦX174 digéré par 141

142 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones l enzyme de restriction HaeIII donnant 11 fragments de tailles connues (1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72 pb). La bande correspondant au gène de la MMP-7 a été découpée dans le gel, puis l agarose a été dissout à 55 C en ajoutant une solution de capture. La solution obtenue a été déposée sur une colonne GFX (GE Healthcare, Saclay, France) puis centrifugée une minute à 1000 g afin d adsorber l ADN sur la matrice de silice et d éliminer l agarose. Le filtre retient les molécules d ADN. Cing cent microlitres de solution de lavage ont été déposés sur la colonne qui a ensuite été centrifugée pendant 1 minutes à g. L élution a été réalisée par dépôt de 40 µl d eau à 65 C et centrifugation pendant 2 min à g. L absorbance à 260 nm a été mesurée et a permis de déterminer la concentration du produit de PCR. En effet, 1 unité d absorbance correspond à 50 ng d ADN/µL de produit de PCR. Le nombre de copies obtenues a alors été calculé en tenant compte de la concentration et de la taille du produit de PCR. IV PCR quantitative spécifique de la MMP-7 Les amorces de PCR quantitative ont été choisies pour amplifier une séquence interne à la séquence de PCR «conventionnelle» pour avoir une taille inférieure à 150 pb (Tableau VII). Des dilutions de ce produit de PCR ont été effectuées et utilisées comme gamme (de 10 8 à 10 3 copies) lors de la PCR en temps réel pour déterminer la quantité de transcrits spécifiques de la MMP-7 présent dans l échantillon. Une relation linéaire existe entre le logarithme du nombre de copies du gène étudié et le ct. A partir de ces données, l efficacité de l amplification est calculée, elle doit être comprise entre 90 et 100%. L obtention de la courbe d étalonnage pour la MMP-7 a permis de déterminer le nombre de copies de transcrits MMP-7 dans les différents clones cellulaires NCI-H460. Le produit de PCR obtenus avec ces amorces spécifiques a été séquencé afin de vérifier la spécificité du fragment amplifié. De plus, une courbe de fusion a été effectuée afin de vérifier l obtention d un produit d amplification unique. IV-2. Quantification des transcrits des MMP et de l EMMPRIN L extraction des ARNm totaux des clones NCI-H460 exprimant ou non le TFPI-2 et leur retrotranscription en ADNc ont été effectuées selon les techniques décrites précédemment (cf chapitres A-III et 3.1.2). La quantification des différents transcrits 142

143 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones exprimés a été réalisée par PCR quantitative en utilisant les amorces décrites dans le tableau VII. Tableau VII : Séquences des amorces utilisées pour les PCR quantitatives en temps réel spécifiques des MMP et de l EMMPRIN Gène Séquences (5 3 ) MMP-1 sens : CTGCTGCTGTTCTGGGGT antisens : GCCACTATTTCTCCGCTTTTC Produits PCR (pb) 147 T C Hybridation Nombre de cycles MMP-2 MMP-3 MMP-7 MMP-9 MMP-13 MMP-14 EMMPRIN sens : GGCCCTGTCACTCCTGAGAT antisens : CAGTCCGCCAAATGAACCGG sens : ATCCCGAAGTGGAGGAAAAC antisens : GCCTGGAGAATGTGAGTGGA sens : CCGCATATTACAGTGGATCG antisens : GCCAATCATGATGTCAGCAG sens : AGACCGGTGAGCTGGATAG antisens : GTGATGTTGTGGTGGTGCC sens: AGCATGGCGACTTCTACCC antisens:catcaaaatgggcatctcct sens: CGAGGGGAGATGTTTGTCTT antisens:tcgtaggcagtgttgatgga sens: TGCTGGTCTGCAAGTCAGAG antisens:gcgaggaactcacgaagaac IV-3. Quantification de l expression protéique des MMP-1, -3 et -7 IV-3.1. Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte IV Extraction et dosage des protéines cytoplasmiques Les MMP exprimées par les clones ont été recherchées à partir des extractions des protéines cytoplasmiques. Les cellules NCI-H460 exprimant les différents mirna ont été cultivées en plaque 6 puits à raison de 10 6 cellules par puits. Quarante huit heures après l ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec de l HBSS et lysées avec 500 µl de tampon RIPA (25 mm Tris HCl, ph 7.6 ; 150 mm NaCl ; 1% NP40 ; 1% de sodium déoxycholate ; 0,1 % SDS). Après 10 minutes d incubation, les cellules ont été lysées par pipetages-relargages puis les lysats ont été incubés 10 minutes à 4 C, vortexés, remis

144 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones minutes à 4 C, vortexés à nouveau et centrifugés 10 minutes à 800 g pour éliminer tous les débris cellulaires. Les surnageants ont ensuite été prélevés et conservés à -80 C. Les protéines ont ensuite été dosées avec le coffret BCA (cf chapitre A-III-3.2.2). IV Obtention des protéines secrétées Les MMP exprimées par les clones NCI-H460 ont également été recherchées dans les surnageants de culture. Les cellules ont été cultivées en plaque 6 puits à raison de 10 6 cellules par puits dans 500 µl de milieu complémenté avec 1% de Nutridoma. Après 48 h de culture à 37 C, sous 5% de CO 2, le surnageant de culture conditionné a été recueilli et centrifugé 10 min à 800 g. En raison du faible niveau d expression de ces protéases par les cellules NCI- H460, les surnageants cellulaires ont été concentrés cent fois à l aide d un concentrateur Minicon B15 (Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France) avant l immuno-empreinte. En parallèle, le volume recueilli après concentration a été mesuré et les cellules ont été détachées et dénombrées afin de tester pour chaque clone NCI-H460 le volume concentré équivalent au même nombre de cellules. Les surnageants ont ensuite été conservés à -80 C IV Immuno-empreinte Les MMP-1 et -3 ont été caractérisées par immuno-empreinte en utilisant les anticorps monoclonaux indiqués dans le tableau VIII selon le protocole décrit dans le chapitre A-III , à l exception du temps d exposition de l autoradiographie, respectivement de 25 et 5 minutes pour la MMP-1 et la MMP-3. Tableau VIII: Anticorps primaires et secondaires utilisés pour détecter les MMP-1 et -3 par immunoempreinte. Anticorps primaires Protéine références Dilution MMP-1 Ac (Lab Vision Corporation)-lapin 1/100 MMP-3 mac SL-1IID4 (Lab Vision Corporation)-souris 1/200 Anticorps secondaires Anti-lapin Anti IgG de lapin HRP (Sigma) 1/80000 Anti-souris Anti IgG de souris HRP (Perkin Elmer) 1/

145 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones IV-3.2 Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence Les MMP-1, -3, et -7 ont été détectées à l aide d un immuno-marquage par fluorescence. Les clones cellulaires exprimant les différents mirna ont été ensemencés à raison de cellules dans des puits de Labteck dans un volume final de 300 µl, et cultivées pendant pendant 24h à 37 C, sous 5% de CO 2. Le protocole utilisé est ensuite identique à celui décrit dans le chapitre A-III-3.3. Les anticorps utilisés sont décrits dans le tableau IX. Tableau IX : Anticorps primaires et secondaires utilisés pour la détéction des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence Anticorps primaires Protéine références Dilution MMP-1 Ac (Lab Vision Corporation)-lapin 1/100 MMP-3 mac SL-1IID4 (Lab Vision Corporation)-souris 1/200 MMP-7 mac ID2 (Lab Vision Corporation)-souris 1/200 Anticorps secondaires Anti-lapin Anti IgG de lapin AF 488 (Invitrogen) 1/1000 Anti-souris Anti IgG de souris AF 488 (Invitrogen) 1/1000 IV-4. Activité gélatinolytique des MMP-2 et -9 Les MMP-2 et MMP-9 sont des gélatinases dont l activité peut être détectée par zymographie. Une séparation électrophorétique des protéines a été tout d abord réalisée dans un gel de polyacrylamide-sds imprégné de gélatine. Dans un deuxième temps, les gélatinases ont été mises en évidence par leur capacité à dégrader la gélatine contenue dans le gel. Cette activité gélatinolytique se traduit par des bandes blanches sur un fond bleu lorsque le gel est coloré par du bleu de Coomassie (Figure 30). 145

146 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones A- Electrophorèse en condition dénaturante B-Incubation à 37 (Calcium) MMP activées C- Coloration Coomassie/ Décoloration N -term Cys His His Zn SDS His Pro-MMP C -term His His Zn H 2 O Pro-MMP activée His C -term His His Zn H 2 O His MMP C -term Pro - MMP- 9 MMP- 9 Pro - MMP- 2 MMP- 2 zymogramme Figure 30 : Principe d activation des MMP pendant la zymographie. Les échantillons testés ont été les surnageants obtenus après 48h de culture des cellules NCI-H460-miRNA ou nég et concentrés 100 fois. Ces échantillons ont été dilués dans du tampon échantillon (50 mm Tris-HCl, ph 6,8 ; 2 % SDS ; 10 % Glycérol ; 0,1 % Bleu de bromophenol) et ont ensuite été déposés sur un gel de concentration contenant 5% d acrylamide (5% d acrylamide ; 0,2 % de bis-acrylamide ; 125 mm Tris HCl, ph6.8 ; 0,1% SDS ; 0,1% persulfate d ammonium ; 0,06% TEMED). Les échantillons ont ensuite migré dans un gel de polyacrylamide imprégné de gélatine (10% acrylamide / 0,33% bisacrylamide, 375 mm Tris-HCl ph 8,8, 1 mg/ml de gélatine de peau de porc (VWR, Strasbourg), 0,1% SDS, 0,1% APS et 0,04% TEMED). La migration des échantillons en tampon électrophorétique (12,4 mm Tris HCl, 96 mm Glycine, 0,05% SDS) a été réalisée pendant trois heures, sous une intensité constante de 30 ma. Un marqueur de taille protéique (Dual color, BioRad) a été déposé ainsi que des standards, zymogènes et formes actives des MMP-2 et -9 à raison de 3 ng pour la pro-mmp-2, 0,2 ng pour la pro-mmp-9, 2 ng pour la MMP-2 active, et 0,4 ng pour la MMP-9 active (Calbiochem). Le SDS, contenu dans le gel et le tampon échantillon, provoque le clivage de la liaison entre l atome de zinc et la cystéine du pro-domaine (figure 30A) permettant la fixation d une molécule d eau (figure 30B) et ainsi l activation du site catalytique. Les pro-formes de MMP sont alors détectables sans clivage du pro-domaine et leur activité gélatinolytique, tout comme celle des formes actives, sera révélée en présence de calcium (figure 30C). Après électrophorèse, le gel a été placé sous agitation lente dans une solution de Triton X-100 à 2,5% pendant 15 minutes à température ambiante, permettant la renaturation des protéines. Le gel a ensuite été incubé pendant 16 à 20 heures à 37 C dans un tampon de développement (0,05 M Tris-HCl, ph 7,5 ; 5 mm CaCl 2 ) au cours desquelles les pro-formes et les formes actives des MMP-2 et -9 peuvent alors dégrader la gélatine. Le tampon de 146

147 Matériels et Méthodes-Partie B-Caractérisation des clones développement a ensuite été éliminé, le gel rincé avec de l eau distillée puis placé dans 100 ml de tampon fixation/décoloration (45% éthanol ; 10% Acide acétique) pendant 15 minutes sous agitation douce à température ambiante. La coloration du gel pendant 2 h dans une solution de bleu de Coomassie à 0,25% en tampon de fixation/décoloration puis la décoloration dans une solution de fixation/décoloration ont permis la visualisation des plages blanches sur le fond bleu correspondant à la position dans le gel des MMP. Le gel a été mis dans de l eau distillée pour arrêter la décoloration. L acquisition des images a été réalisée à l aide du système d acquisition vidéo GelDocXR (BioRad) et du logiciel QuantityOne (BioRad). C- Interactions entre les cellules tumorales, exprimant ou non le TFPI-2, et les fibroblastes I- Fibroblastes pulmonaires La lignée CCD19-Lu (LGC Promochem) est issue de fibroblastes pulmonaires obtenus à partir d un tissu humain sain. Ces cellules ont été cultivées en milieu Earle s minimum (MEM, Gibco, Invitrogen) contenant des sels de Earle s, additionné de 2 mm L- glutamine, 18 mm de bicarbonate de sodium, 1 mm de pyruvate de sodium, 10 5 UI/L de pénicilline et 100 mg/l de streptomycine et d acides aminés non essentiels 1 fois concentré (Gibco). Extemporanément, les milieux de culture ont été supplémentés avec 10% de SVF. Les cellules ont ensuite été cultivées de la même manière que les cellules NCI-H460. II- Cocultures entre les cellules tumorales et les fibroblastes Des cocultures ont été réalisées entre des cellules tumorales, exprimant ou non le TFPI-2 et des fibroblastes pulmonaires afin d évaluer l impact des interactions entre ces deux types cellulaires sur l expression de différents gènes d intérêts. Deux conditions de cocultures ont été étudiées permettant soit un contact direct entre les cellules, soit un contact indirect, pour laquelle les fibroblastes ont été cultivés en présence de milieu conditionné de cellules tumorales. Les cocultures indirectes permettent ainsi l étude de l effet de molécules solubles présentes dans le milieu sur les fibroblastes. 147

148 Matériels et Méthodes-Partie C-Cocultures II-1. Cocultures directes Le protocole de coculture directe à consisté à mettre en contact les cellules tumorales exprimant ou non le TFPI-2 avec des fibroblastes pulmonaires. Pour cela, les cellules tumorales et les fibroblastes ont été cultivées séparément, en flacon de culture de 75 cm² dans du milieu complet, jusqu à atteindre la confluence. Les cellules ont ensuite été détachées avec un mélange de trypsine 0,05%-EDTA 0,02% et comptées à l aide de l hématimètre de Malassez. Les cellules tumorales et les fibroblastes ont été mélangés en plaque 6 puits à raison d un nombre total de cellules par puits, avec différents rapports CCD19-Lu/NCI- H460 : 1:1, 2:1, 1:2 et laissées en contact pendant 24 h ou 48h en milieu CCD19-Lu complémenté avec 10% de SVF, à 37 C, sous 5% de CO 2. Parallèlement, cellules de chaque clone tumoral et fibroblastes ont été cultivés séparément dans les mêmes conditions afin de réaliser les conditions contrôles. Après l incubation, les ARNm exprimés lors des cocultures directes ont été extraits (cf chapitre A-III-3.1). Les ARNm des conditions contrôles ont également été extraits séparément puis mélangés extemporanément. II-2. Cocultures indirectes La technique de coculture indirecte a consisté à cultiver les fibroblastes pulmonaires en milieu de culture conditionné de cellules tumorales exprimant ou non le TFPI-2 II-2.1. Obtention des milieux conditionnés de cellules tumorales Les cellules tumorales NCI-H460 à confluence dans un flacon de culture de 75 cm² ont été lavées avec du milieu HBSS, puis mises en contact avec le milieu de culture des cellules CCD19-Lu supplémenté avec un substitut de sérum dilué au 1/100 ème, le Nutridoma SP (Roche Applied Sciences, Meylan, France). Après 4h, 6h, 16h ou 24 h de culture à 37 C, sous 5% de CO 2, le milieu de culture conditionné a été recueilli et a été soit conservé non concentré (1X), soit concentré 10 fois (10X) à l'aide d'un concentrateur Minicon B15 (Millipore). Le volume recueilli après concentration a été mesuré. En parallèle, les cellules ont été détachées à l aide de trypsine 0,05%-EDTA 0,02% et dénombrées afin de déterminer le volume de milieu concentré correspondant à 10 7 cellules. Le milieu conditionné a été conservé congelé à -20 C ou a été utilisé frais. Toutes les mises au point concernant le temps de conditionnement, l utilisation de milieu conditionné concentré ou non et d un milieu frais ou congelé ont été réalisées avec les cellules NCI-H460 sauvages et les fibroblastes pulmonaires sains CCD19-Lu. 148

149 Matériels et Méthodes-Partie C-Cocultures II-2.2. Contact du milieu conditionné de cellules tumorales NCI-H460 avec des cellules CCD19-Lu La veille de la coculture indirecte, les cellules CCD19-Lu ont été ensemencées en plaques 6 puits à raison de 10 6 cellules par puits dans le milieu de culture des cellules CCD19-Lu supplémenté avec 10% de SVF. Après 24h de cultures, les fibroblastes ont été lavés avec de l HBSS sans calcium et magnésium. Le milieu conditionné obtenu à partir des différentes conditions a ensuite été mis en contact avec les cellules CCD19-Lu. Afin de réaliser les puits contrôles, les cellules CCD19-Lu ont également été incubées avec un volume de milieu CCD19-Lu concentré 10 fois, ou non, frais ou congelé, identique au volume de milieu conditionné. Les milieux concentrés ont ensuite été complétés avec du milieu CCD19-Lu complémenté avec du Nutridoma SP pour obtenir un volume final de 3 ml par puits. Le milieu conditionné des cellules tumorales a été laissé en contact avec les cellules fibroblastiques CCD19-Lu pendant 24h à 37 C, sous 5% de CO 2. III- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN III-1. Quantification des transcrits Après 24 h de coculture, directe ou indirecte, les cellules ont été lysées et les ARNm totaux extraits et rétro-transcrits selon les techniques précédemment décrites dans les chapitres A-III-3.1 et quantifiés en utilisant les amorces décrites dans le chapitre B-IV-1. III-2. Expression protéique des MMP-1, -3 et -7 en coculture indirecte III-2.1. Détection des MMP-1 et -3 par immuno-empreinte La détection des MMP-1 et -3 a été effectuée après 48h de coculture réalisée selon le protocole décrit dans le chapitre C-II-2. Les techniques et les anticorps utilisés ensuite ont été les mêmes que ceux utilisés dans le chapitre B-IV-2.1. III-2.2. Détection des MMP-1, -3 et -7 par immunofluorescence Les MMP-1, -3, et -7 exprimées par les fibroblastes après 48 h de coculture indirecte avec du milieu conditionné par les cellules tumorales, ont été mises en évidence par immunomarquage. Pour cela, les cellules CCD19-Lu ont été ensemencées à raison de cellules dans des puits Labteck pendant 24h. Le volume des différents milieux conditionnés, 149

150 Matériels et Méthodes-Partie C-Cocultures concentrés dix fois et équivalent à cellules tumorales a été ajouté aux fibroblastes et complété afin d obtenir un volume final de 300 µl. La coculture indirecte a été réalisée pendant 48h à 37 C. Les techniques et les anticorps utilisés par la suite ont été les mêmes que ceux utilisés dans le chapitre B-IV

151 Résultats et discussion -Chapitre I CHAPITRE I : Obtention des lignées clones cellulaires stablement inactivés pour le TFPI-2 L expression du TFPI-2 a été inversement corrélée à la progression néoplasique dans plusieurs cancers et notamment dans différents cancers broncho-pulmonaires (Lakka et al., 2000 ; Rollin et al., 2005). Ainsi, dans les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules, l expression du TFPI-2 est diminuée dans 37 % des cas, le plus souvent à des stades avancés de la maladie, en particulier avec des métastases ganglionnaires (Rollin et al., 2005). Cette étude démontre ainsi un effet de l inhibition du TFPI-2 sur l agressivité de la tumeur dans les CBPNPC. Afin d étudier les mécanismes impliqués dans ces modifications de comportement de la cellule tumorale associées à la diminution d expression du TFPI-2, nous avons mis au point un modèle de lignée cellulaire NCI-H460, issue d un carcinome à grandes cellules, inactivé pour le TFPI-2. Pour cela nous avons développé une stratégie d ARN interférence, basée sur la dégradation de l ARNm cible via l action de microrna (mirna). Deux séquences cibles ont été sélectionnées sur le transcrit du TFPI-2 et les mirna correspondant ont ensuite été dessinés. Les séquences codant les deux mirna ont été ligaturées dans un plasmide permettant leur expression constitutive une fois ce dernier intégré dans le génome de la cellule hôte. La méthode a ensuite été validée en vérifiant l inhibition effective du TFPI-2 au niveau transcriptionnel et protéique dans les cellules NCI-H460 exprimant les mirna. I- L ARN interférence I-1. Les différentes techniques d ARN interférence A la fin des années quatre-vingt, des généticiens firent l observation paradoxale que des plantes portant une copie supplémentaire d un transgène codant pour un pigment produisaient parfois des fleurs très peu colorées (van der Krol et al., 1990 ; Napoli et al., 1990). Ce mécanisme d inhibition par «co-suppression», appelé alors PTGS pour Post Transcriptionnal Gene Silencing, n était pas complètement compris, mais l ARN était déjà suspecté d intervenir dans l inhibition. Peu de temps après, des chercheurs étudiant ce phénomène chez le vers C. elegans, ont testé des ARN sens, antisens ou double brins homologues à un gène donné afin de déterminer la forme la plus active. Ils découvrirent avec 151

152 Résultats et discussion -Chapitre I surprise que ce phénomène était optimal avec les ARN double brins (Fire et al., 1998). Plusieurs autres études révélèrent que de courtes (21-22 nucléotides) séquences d ARN double brins (small interference RNA ou sirna) étaient générées par un système endogène à partir de longs fragments d ARN double brins et provoquaient l inhibition d un gène en entraînant la dégradation de son ARNm (Tuschl et al., 1999 ; Hamilton & Baulcombe, 1999 ; Hammond et al., 2000 ; Zamore et al., 2000). Parallèlement, en 1993, des chercheurs étudiant le développement larvaire du vers C. elegans ont découvert un gène, lin-4, qui codait pour un petit transcrit ARN capable d inhiber la transcription des ARNm d un autre gène, lin-14, en se liant à son extrémité 3 non traduite (Lee et al., 1993). Lin-4 était le premier des gènes de la famille microrna (mirna) à être découvert. De ces mécanismes, trois techniques d ARN interférence ont été mises au point pour être utilisées en laboratoire afin d inactiver efficacement des transcrits spécifiques dans des cellules de mammifère : les small interference RNA (sirna), les short haiprin RNA (shrna) et les microrna (mirna). La première fut mise au point en 2001 quand Elbashir et al. et Caplen et al., découvrirent qu ils pouvaient induire la répression d un gène par sirna sans provoquer une réponse interféron non spécifique, associée à la présence d ARN double brins généralement signe d infection virale. Les sirna sont en effet d assez petite taille pour ne pas déclencher ce système de défense cellulaire, à l inverse de fragment d ARN double brins de plus grande taille qui entrainent, via la réponse interféron, l entrée en apoptose de la cellule transfectée (Elbashir et al., 2001 ; Caplen et al., 2001). Cependant, le principal inconvénient des sirna synthétiques est l effet transitoire de l inhibition transcriptionnelle induite dans les cellules de mammifère. Cet obstacle fut franchi en 2002 quand différents laboratoires ont mis au point les shrna. Ces structures clonées dans un plasmide ou un vecteur viral, sous contrôle du promoteur pol III, s intègrent dans le génome de la cellule hôte permettant une expression constitutive du shrna et ainsi une inhibition durable du gène cible (Hemann et al., 2003 ; Rubinson et al., 2003 ; Tiscornia et al., et al., 2003 ; Scherr et al., 2003). Les shrna sont composés d une structure centrale en double brin parfaitement appariée de 19 à 29 pb, un des brins étant identique à la séquence cible. Ces deux brins sont reliés par une structure en boucle de 9 pb, et le shrna est pris en charge dans la cellule par l enzyme Dicer libérant de la structure le sirna actif permettant à la dégradation de l ARNm cible. Parallèlement, d autres laboratoires ont utilisé une technique d ARN interférence basée sur la voie des mirna. Ces systèmes permettent l expression de mirna artificiels, qui 152

153 Résultats et discussion -Chapitre I comme les mirna physiologiques, sont formés d une structure centrale de 19 à 29 nucléotides composée de deux brins d ARN de tailles différentes et imparfaitement complémentaires, donnant naissance à des structures en boucle. Ces deux brins centraux sont également reliés par une boucle, mais à l inverse du shrna, elle peut être de taille de variable (de 5 à 15 nucléotides). Le mirna artificiel transcrit forme une structure de primirna physiologique ce qui lui permet d être pris en charge par la machinerie cellulaire et de libérer le mirna mature permettant l inhibition transcriptionnelle (Borchert et al., 2006). I-2. Mode d action des mirna Les mirna matures sont de petits ARN simples brins de 21 à 22 nucléotides. La plupart des mirna sont générés à partir de transcrits primaires (pri-mirna) synthétisés par l ARN polymérase II, à l exception de certains mirna localisés dans des régions répétées du génome qui sont transcrits par l ARN polymérase III (Borchert et al., 2006). Le pri-mirna forme une structure en épingles à cheveux. Un complexe protéique nucléaire constitué, entre autres, d une RNase Drosha II et d une protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome Critical Region Gene 8), comportant deux sites de liaison à l ARN double brin, va générer le prémirna par clivage du pri-mirna. Le pré-mirna néo-formé va ensuite être exporté vers le cytoplasme à travers les pores nucléaires via l action de l exportine-5 (Yi et al., 2003). Dans le cytoplasme, le pré-mirna est à nouveau clivé par un complexe protéique contenant une RNase Dicer III qui finit la maturation du mirna en clivant son extrémité en tête d épingle (Hutvagner et al., 2001). L ARN double brins résultant de cette digestion est ensuite déshybridé, grâce à l action de type hélicase de l enzyme Dicer et le brin complémentaire à la séquence cible est incorporé dans un complexe protéique final, nommé mirisc (mirna Induced Silencing Complex), contenant une protéine de la famille des argonautes qui va être responsable de l activité inhibitrice (figure 31). 153

154 Résultats et discussion -Chapitre I Figure 31 : Mode d action des mirna. Le pri-mirna est synthétisé dans le noyau où il est clivé par l enzyme Drosha en pré-mirna, lui permettant ainsi d être exporté vers le cytoplasme par l exportine-5. Il sera à nouveau clivé par l enzyme Dicer et intégré dans le complexe RISC, lui permettant de cibler et dégrader, ou réprimer, le transcrit cible. (Image : ttp:// Contrairement aux sirna, qui requièrent une complémentarité quasi parfaite avec l ARNm qu ils ciblent pour les cliver, la plupart des mirna composent des structures imparfaitement complémentaires comportant des boucles et peuvent entrainer le clivage ou l inhibition de la transcription du messager ciblé (Doench & Sharp., 2004). I-3. Séquences du TFPI-2 ciblées par les mirna Deux séquences codant des mirna ont été sélectionnées pour cibler le transcrit TFPI-2 et l inactiver. Une des deux séquences ciblées sur le transcrit TFPI-2 a été choisie à l aide du logiciel RNAi Designer de Invitrogen. Ce logiciel est conçu pour détecter les séquences accessibles sur le transcrit cible, permettant une inhibition efficace de son expression. L autre séquence cible du transcrit TFPI-2 avait déjà été préalablement choisie dans une étude précédente du laboratoire utilisant un sirna. Dans cette étude, l inactivation transitoire du TFPI-2 dans les cellules NCI-H460 a eut pour effet d augmenter leur pouvoir invasif et la transcritpion de la MMP-1. Cependant, l effet mesuré était limité dans le temps et ne permettait pas de réaliser des études fonctionnelles à long terme. Ce sirna a été 154

155 Résultats et discussion -Chapitre I converti en mirna à l aide du logiciel RNAi Designer. Les séquences codant les mirna sont spécialement conçues pour être incorporables dans le plasmide pcdna TM 6.2- GW/±EmGFP-miR. Deux mirna ciblant deux séquences différentes du transcrit TFPI-2 ont ainsi été choisis et nommés mirna-1 et mirna-2. Le premier cible une séquence dans la partie 3 UTR du transcrit TFPI-2, et le mirna-2 cible une séquence dans l exon 4 du transcrit TFPI-2 qui correspond à la séquence codant le troisième domaine de type Kunitz. II- Clonage des séquences codant les pré-mirna dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR II-1. Plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR Dans cette étude, nous avons utilisé le plasmide pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miR, exprimant le mirna sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus (CMV) humain, démontré comme permettant une forte expression constitutive du gène d intérêt dans une grande variété de lignées cellulaires de mammifères (Boshart et al., 1985 ; Nelson et al., 1987). Ce système a été conçu pour exprimer des mirna dont la structure est basée sur celle du mirna murin endogène mir-155, à l aide de vecteur d expression mirna mis au point dans le laboratoire de David Turner (Chung et al., 2006). II-2. Hybridation des oligonucléotides Les oligonucléotides sens et anti-sens codant les mirna ciblant le transcrit du TFPI-2 ont tout d abord été hybridés pour être ligaturés dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/ EmGFPmiR. L hybridation a ensuite été vérifiée sur gel d agarose à bas point de fusion, permettant la séparation de petits fragments d acides nucléiques, et les bandes visualisées après addition de BET, un agent intercalant de l ADN. Un oligonucléotide sens simple brin (sb, puits 1) a été déposé pour servir de contrôle négatif. Les oligonucléotides hybridés (mirna-1 et mirna-2) ont été déposés dans les puits 2 et 3 (figure 32). 155

156 Résultats et discussion -Chapitre I pb Figure 32 : Hybridation des oligonucléotides double brins codant pour les mirna ciblant le TFPI-2., servant de contrôle négatif. Puits 1 : Oligonucléotide simple brin. Puits 2 et 3 : Produits d hybridation des oligonucléotides des mirna-1 et mirna-2. Les oligonucléotides simple brins, formant des structures en tête d épingle en se repliant sur eux-mêmes, sont détectés autour de pb (puits 1). La bande d environ 60 pb observée dans les puits 2 et 3, a été obtenue après hybridation des oligonucléotides sens et anti sens-codant les mirna. II-3. Ligature des séquences codant les mirna dans le plasmide pcdna TM 6.2- GW/±EmGFP-miR et clonage dans les bactéries stbl3 Les oligonucléotides double brins codant les mirna-1 et mirna-2 ont ensuite été ligaturés dans le plasmide pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miR en utilisant l enzyme T4 ADN ligase. Des bactéries compétentes Escherichia coli stbl3 One Shot TOP 10 ont ensuite été transformées avec la solution de ligature. Les bactéries recombinantes ont été sélectionnées sur un milieu additionné de blasticidine dont le gène de résistance est codé par le plasmide pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miR. Pour chaque construction, cinq colonies bactériennes ont été étudiées. L ADN plasmidique cloné a été purifié sur une colonne échangeuse d anion. Afin de vérifier la présence d ADN plasmidique avant le séquençage, les plasmides ont été digérés avec l enzyme Bgl II coupant en un site de restriction situé à l extérieur de la séquence codant les mirna et permet de linéariser le plasmide (Figure 33). 156

157 Résultats et discussion -Chapitre I pb M mirna-1 mirna Plasmide circulaire Plasmide linéarisé par Bgl II Figure 33 : Digestion par l enzyme Bgl II de deux plasmides codant chacun un des deux mirna. La bande à 5,7 kpb représente le plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miR digéré. Les bandes observées à 5,7 kb après électrophorèse sur gel d agarose à 0,8% correspondent au plasmide pcdna TM 6.2-GW/EmGFP recombinant linéarisé par Bgl II. La bande observé à plus de 12,236 kb correspond à du plasmide non digéré. II-4. Séquençage des plasmides recombinants Chacun des dix plasmides, cinq par construction, a ensuite été vérifié par séquençage à l aide des amorces reconnaissant des séquences de part et d autre du site d insertion. Quelque soit la construction, le séquençage a permis de s assurer que la séquence codant le mirna s est bien intégrée dans le bon sens et ne présente aucune mutation. Puisqu aucune mutation n a été révélée dans les séquences codant les différents mirna, seul un plasmide de chaque construction a été utilisé pour transfecter les cellules NCI-H460. III- Obtention des cellules NCI-H460 exprimant les mirna Cette étape a consisté à produire des cellules NCI-H460 dont l expression du TFPI-2 est inhibée par les mirna exprimés par les plasmides pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP mirna-1 et mirna-2. Parallèlement, des cellules NCI-H460 exprimant un plasmide pcdna TM 6.2- GW/±EmGFP-miR codant un mirna négatif, ne ciblant aucun transcrit, ont également été produites. 157

158 Résultats et discussion -Chapitre I III-1. Efficacité de la transfection Les cellules NCI-H460 ont été transfectées avec 0,8 µg d ADN plasmidique pour chaque construction (pcdna TM 6.2-GW/EmGFP mirna-1, mirna -2 et mirna nég) et l efficacité de transfection a été vérifiée après 48 h grâce à expression de la Green Fluorescent Protein (GFP) codée par le plasmide d expression pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP (figure 34). Figure 34 : Expression de la GFP par les cellules NCI-H460 exprimant le plasmide pcdna TM 6.2- GW/±EmGFP-miRNA-1 48 h après la transfection. Image représentative du taux de transfection pour les trois constructions (X 40). Dès 48h après la transfection, des cellules fluorescentes sont observées, témoignant de l expression de la GFP par les plasmides pcdna TM 6.2-GW/EmGFP. Le taux de transfection, d environ 30% (Figure 34), est sensiblement le même pour chacune des trois constructions, pcdna TM 6.2-GW/±EmGFP-miRNA-1, pcdna TM 6.2- GW/EmGFP-miRNA-2 et pcdna TM 6.2-GW/EmGFP-miRNA-nég. III-2. Sélection et amplification des clones NCI-H460 exprimant les mirna Après trois à cinq semaines de culture dans un milieu contenant 6µg/mL de blasticidine afin d exercer une pression de sélection, les clones cellulaires résistants à la blasticidine ont été isolés (Figure 35A). Cinq clones ont été conservés pour chaque 158

159 Résultats et discussion -Chapitre I construction, et nommés clones NCI-H460 mirna-1a à -1e, NCI-H460 mirna-2a à -2e et NCI-H460 mirna-nég-a à -e. Les colonies ainsi obtenues ont ensuite été prélevées puis cultivées successivement en plaque 24 puits, puis en flacon de culture de 75 cm² dans du milieu contenant 1µg/mL de blasticidine pour maintenir la pression de sélection afin que les cellules conservent le plasmide. L expression de la GFP dans les clones sélectionnés a régulièrement été vérifiée (figure 35B). A B Figure 35 : Expression de la GFP par le clone NCI-H460 mirna-1b. (A) Colonie isolée du clone NCI- H460 mirna-1b (X5). (B) Clones NCI-H460 mirna-1b exprimant stablement le plasmide pcdna TM 6.2- GW/±EmGFP-miRNA-1 après 19 semaines de culture (X20). Les clones NCI-H460 mirna-1c, -1d, -1e ; mirna-2c, -2d, -2e et mirna-négb, - négc, -négd, -nége ont perdu le plasmide après quelques semaines de culture, malgré une augmentation de la pression de sélection exercée avec 6µg/ml de blasticidine. Finalement deux clones de chaque construction mirna-1 (mirna-1a et -1b), mirna-2 (mirna-2a et - 2b) et un clone exprimant le mirna-nég ont été conservés pour les études ultérieures. III-3. Evaluation de l inactivation du TFPI-2 L expression du TFPI-2 a ensuite été évaluée dans les clones cellulaires exprimant stablement les plasmides codant les différents mirna. Ainsi les transcrits ont été quantifiés et la protéine détectée par immuno-empreinte et immunofluorescence, dans chacun des clones. 159

160 Résultats et discussion -Chapitre I III-3.1 Transcrit du TFPI-2 L expression transcriptionnelle du TFPI-2 a tout d abord été quantifiée par PCR en temps réel (PCRqrt) à partir des ADNc obtenus après retro-transcription des ARNm extraits de chaque clone cellulaire. Les transcrits du TFPI-2 et de la β-actine (utilisée comme gène contrôle) ont été quantifiés à partir d une quantité d ADNc équivalent à cellules. Le nombre de copies de TFPI-2 a ensuite été rapporté à 10 6 copies de β-actine. Les coefficients de variabilité intra- et inter-essais ont été préalablement définis au laboratoire et sont respectivement de 1,4% et 2,4% (Rollin J, travaux de thèse, 2006). Le pourcentage d inhibition de l expression du TFPI-2, comparativement aux cellules NCI-H460 sauvages, a ensuite été calculé (figure 36). 100 % Inhibition mirna négatif mirna 1a mirna 1b mirna 2a mirna 2b Figure 36 : Pourcentages d inhibition du TFPI-2 dans les clones cellulaires inhibés pour le TFPI-2 et le clone contrôle. L expression du TFPI-2 a été quantifiée par PCR qrt pour chaque clone exprimant les différentes constructions (mirna-1, mirna-2 ou mirna-nég), comparativement à celle des cellules NCI-H460 sauvages. Le nombre de copies de TFPI-2 a été rapporté à 10 6 copies de β-actine. Les résultats sont la moyenne de quatre expérimentations ± SEM réalisées en double. Le clone cellulaire exprimant le mirna-nég ne montre aucune inhibition du TFPI-2, confirmant que le mirna codé ne cible pas ce transcrit, et que la machinerie mirna sollicitée ne perturbe pas l expression du TFPI-2. Il sera donc utilisé comme contrôle négatif pour la suite de l étude. Parmi les deux clones exprimant le mirna-1, le mirna-1a ne présente pas d inactivation des transcrits TFPI-2. L observation de ce clone par microscopie à fluorescence a révélée une très faible expression de la GFP. En revanche, le clone cellulaire 160

161 Résultats et discussion -Chapitre I NCI-H460 mirna-1b montre une inhibition de 90% du transcrit du TFPI-2, associé à une forte fluorescence. Les clones mirna-2a et -2b montrent également une importante intensité de fluorescence et une inhibition du TFPI-2, respectivement de 74% et 94%. Les clones mirna-1b et mirna-2b ciblant deux séquences différentes du transcrit du TFPI-2 et présentant la plus forte inhibition du TFPI-2 ont été utilisés pour la suite de l étude. III-3.2. Protéine TFPI-2 III Détection du TFPI-2 par immuno-empreinte Les conséquences de l inactivation du transcrit du TFPI-2 sur l expression protéique ont été mises en évidence par immuno-empreinte. Le TFPI-2 étant très majoritairement secrété vers la MEC (60 à 90%) (Rao et al., 1995b ; Liu et al., 1999), nous avons donc solubilisé les protéines de la matrice après élimination des cellules. La concentration de protéines extraites de la MEC de chacun des clones cellulaires a été dosée et la même quantité de protéines a été déposée pour chaque condition. Les protéines ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE, puis la présence de TFPI-2 a été détectée par immuno-empreinte après transfert sur une membrane de nitrocellulose (figure 37). 33 kda 31 kda 27 kda NCI- H460 mirna négatif mirna 1a mirna 1b mirna 2a mirna 2b Figure 37 : Immunodétection du TFPI-2 exprimé dans la MEC extraites des clones cellulaires exprimant les différents mirna. Figure représentative de 4 expérimentations effectuées. Pour chaque condition trois bandes à 27, 31 et 33 kda représentant les trois formes de glycosylation du TFPI-2 sont observées (Rao et al., 1996). Ces trois formes de TFPI-2 ont été retrouvées dans de nombreux types cellulaires, comme par exemple des cellules épithéliales 161

162 Résultats et discussion -Chapitre I et fibroblastiques de la peau, des mélanomes ou encore des gliomes (Rao et al., 1995b ; Liu et al., 1999 ; Rao et al., 2001 ; Nobeyama et al., 2007). L expression du TFPI-2 est égale dans les clones NCI-H460 mirna-nég et les cellules NCI-H460 sauvages, confirmant l absence d impact du mirna-négatif sur l expression du TFPI-2. Le clone NCI-H460 mirna-1a a une expression du TFPI-2 comparable aux cellules contrôles. Ces résultats sont compatibles avec les observations faites au niveau transcriptionnel. Ceci pourrait s expliquer par l hyperméthylation du promoteur CMV contrôlant l expression constitutive du mirna, phénomène variable selon la localisation de l intégration du plasmide (Curradi et al., 2002). La perte du plasmide ou de l insert codant les mirna pourrait également expliquer l absence d inhibition du TFPI-2 dans ce clone. Les clones mirna-1b et mirna-2b montrent une forte inhibition du TFPI-2 et le clone NCI-H460-2a, une diminution moindre de son expression. L analyse de l immunodétection des protéines de la matrice extracellulaire des différents clones confirme donc les résultats observés au niveau transcriptionnel. III Détection du TFPI-2 par immunofluorescence L expression du TFPI-2 a également été vérifiée par immunofluorescence sur les clones précédemment sélectionnés mirna-1b, mirna-2b ainsi que sur le contrôle négatif, mirna-nég (figure 38). mirna-négatif mirna-1b mirna-2b Figure 38 : Détection par immunofluorescence de l expression du TFPI-2 dans les clones NCI-H460 exprimant les différents mirna. Figure représentative de 3 expériences effectuées. 162

163 Résultats et discussion -Chapitre I Le TFPI-2, bien que majoritairement secrété vers la MEC, est également détecté dans le cytoplasme des différents clones cellulaires NCI-H460, à des degrés différents. Une intensité importante de fluorescence est observée dans le cytoplasme des clones NCI-H460 mirna-nég, traduisant une importante expression du TFPI-2. A l inverse, seule une faible fluorescence est observée dans les clones NCI-H460 mirna-1b et NCI-H460 mirna-2b, confirmant l inhibition de l expression du TFPI-2 dans ces deux clones cellulaires. IV- Conclusions Cette première partie de l étude nous a permis de valider la technique d ARN interférence à l aide de mirna utilisés pour inhiber le transcrit du TFPI-2. Les résultats obtenus avec le clone contrôle exprimant le mirna négatif, mis à disposition par le fournisseur, nous ont permis d affirmer que ce mirna n exerce aucun effet sur l expression du TFPI-2, tant au niveau transcriptionnel que protéique. Ce mirna a la particularité de ne cibler aucun gène connu de mammifère et a par ailleurs été utilisé dans d autres études comme contrôle négatif (Li et al., 2006 ; McLaughlin et al., 2007). Cette construction nous a permis de vérifier que la machinerie mirna sollicitée dans les clones NCI-H460 n était pas à l origine de l inhibition du TFPI-2 observée. Ainsi, les cellules exprimant le mirna contrôle, ou mirna-nég, nous ont ensuite servi de contrôle lors de l étude de l impact de l inactivation du TFPI-2 sur les cellules tumorales pulmonaires NCI- H460. Deux clones NCI-H460, exprimant chacun un des deux mirna construits, inhibant de manière stable et efficace le TFPI-2, ont donc été produits. Les clones NCI-H460 mirna- 1b et -2b présentent une inhibition transcriptionnelle du TFPI-2 de 90% et 94% en moyenne, comparativement aux cellules NCI-H460 sauvages. L expression cytoplasmique de la protéine et sa sécrétion vers la matrice extracellulaire est également fortement réduite dans ces deux clones comme il l a été démontré par immunofluorescence et immuno-empreinte. Ces deux clones cellulaires ont été utilisés pour les études suivantes. L inhibition du TFPI-2 associée à la fluorescence des cellules a été contrôlée régulièrement et un nombre maximum de 35 repiquages a été réalisé pour s affranchir de la dérive des cellules. 163

164 Résultats et discussion -Chapitre II CHAPITRE II : Impact de l inactivation du TFPI-2 sur les cellules tumorales pulmonaires NCI-H460 Le TFPI-2 est de plus en plus décrit comme un gène suppresseur de tumeur. En effet, son inhibition est corrélée avec une agressivité accrue dans plusieurs étapes de la progression tumorale (Sierko et al., 2007). A l inverse, sa surexpression est le plus souvent associée, in vitro et in vivo, a un effet anti-angiogénique, anti-invasif et pro-apoptotique (Yanamandra et al., 2005 ; Tasiou et al., 2001). Pour déterminer les mécanismes d action du TFPI-2, nous avons analysé l impact de l inhibition stable de cet inhibiteur de protéase dans la lignée NCI- H460 sur l invasion, la migration, la prolifération, l adhérence et le profil d expression de différents gènes impliqués dans la progression tumorale. I- Impact de l inactivation du TFPI-2 sur les potentiels invasifs et migratoires des cellules tumorales H460 Les potentiels invasif et migratoire de nos clones inactivés pour le TFPI-2 ont été testés à l aide d une expérience basée sur le principe de la chambre de Boyden. Un insert recouvert de Matrigel nous a permis de mimer l invasion cellulaire. En effet le Matrigel est une préparation de membrane basale solubilisée, issue du sarcome murin Engelbreth- Holm-Swam (EHS), une tumeur particulièrement riche en protéines de la MEC (Kleinman et al., 1982). Le Matrigel est principalement composé de laminine (56%) et de collagène IV (31%), mais également de différents facteurs de croissance, en majorité de l IGF-1, du PDGF et du TGF-β (sources BD Biosciences). La présence de plasminogène dans le Matrigel a été détectée à une concentration de 0,2-1 ng/µg de protéine (Farina et al., 1996). De plus l expression de l upa et de son récepteur upar dans la lignée cellulaire NCI-H460 à déjà été documentée (Shetty & Idell., 1999). Le plasminogène présent dans le Matrigel peut donc être activé en plasmine par le système upa/upar exprimé par les cellules tumorales, nous permettant ainsi d étudier l impact de son inhibition par le TFPI-2 sur l invasion tumorale. La concentration de Matrigel à déposer dans les inserts a été préalablement déterminée à l aide de la lignée fibrosarcomateuse HT-1080 connue pour avoir un potentiel invasif de 40 à 50% en présence de ce substitut de MEC et de membrane basale (figure 39). 164

165 Résultats et discussion -Chapitre II Pourcentage (%) Migration Invasion 0 HT-1080 NCI-H460 Figure 39 : Migration et invasion des cellules HT-1080 à travers un insert recouvert de 25 µg de Matrigel. Nous avons ainsi pu déterminer que 25 µg de Matrigel par insert étaient nécessaires pour obtenir une invasion optimale des cellules HT-1080 et nous avons donc appliqué ces conditions à l étude du pouvoir invasif des cellules tumorales pulmonaires NCI-H460. Ainsi, dans ces conditions, l invasion des cellules NCI-H460 à travers la couche de Matrigel, bien que plus faible que celle des cellules HT-1080, était de 8,44% après 48h. Ces cellules présentent par ailleurs une migration de 20%, contre 75% pour les cellules HT Les différences du niveau de migration et d invasion observées dans les 2 types cellulaires s explique par les mécanismes mis en jeu. En effet, la migration cellulaire mimée à travers un insert nu ne met en jeu que la motilité cellulaire. L invasion est un processus dynamique mettant en jeu la motilité cellulaire et une activité protéolytique médiée par différentes protéases, parmi lesquelles les MMP, qui permettent la dégradation de différentes protéines du Matrigel. Les expériences de migration et d invasion des cellules NCI-H460 exprimant les différents mirna ont donc été réalisées selon les conditions définies précédemment, en parallèle et en triple sur une durée de 48h (figure 40). 165

166 Résultats et discussion -Chapitre II Migration *** Invasion Pourcentage (%) * *** *** 0 mirna négatif mirna 1b mirna 2b mirna négatif mirna 1b mirna 2b Figure 40 : Effet de l inactivation du TFPI-2 sur les potentiels invasif et migratoire des cellules NCI- H460. Diagramme représentant le pourcentage de cellules mirna-1b, mirna-2b ou mirna-nég ayant migré à travers un insert nu ou recouvert de Matrigel, après 48h d incubation. Chaque diagramme représente la moyenne de 4 expérimentations ± SEM effectuées en triple. * p<0,05, ***p<0,001 (test t de student). Nous avons pu constater que les pourcentages d invasion (8,91%) et de migration (22,14%) des cellules exprimant le mirna négatif étaient équivalents aux résultats obtenus avec les cellules NCI-H460 sauvages. La transfection stable des cellules par le plasmide codant le mirna négatif n a donc pas altéré leur potentiel invasif. L analyse des résultats nous montre une augmentation significative de la migration des clones de 1,75 fois pour les cellules mirna-1b (p<0,001) et de 1,34 fois pour le mirna- 2b (p<0,05) et ceci par rapport à la migration des clones exprimant le mirna-nég. Le potentiel invasif des cellules mirna-1b a été multiplié par 2,43 (p<0,001) et par 1,74 pour le clone mirna-2b (p<0,001), par rapport aux cellules contrôles. Ces résultats sont en accord avec ceux observés dans l étude de Lakka et al. montrant une augmentation des potentiels invasif et migratoire, lorsque le TFPI-2 est inhibé dans la lignée cancéreuse pulmonaire A549 à l aide d un plasmide codant une séquence anti-sens à celle du transcrit TFPI-2 (Lakka et al., 2000). D autres études, utilisant également un test en chambre de Boyden, ont démontré une diminution du pouvoir invasif de lignées cellulaires tumorales particulièrement agressives issues d un cancer de la prostate, d un mélanome, d un choriocarcinome ou encore d un glioblastome, lorsqu elles surexprimaient du TFPI-2 (Konduri et al., 2000 ; Konduri et al., 2001a ; Jin et al., 2001 ; Yanamandra et al., 2005). Ces travaux démontrèrent également une diminution de la capacité des cellules tumorales à migrer à travers un insert nu lorsqu elles surexprimaient du TFPI

167 Résultats et discussion -Chapitre II Toutes ces études expliquent ces variations du pouvoir invasif par l activité antiplasmine du TFPI-2. En effet, en inhibant cette protéase à sérine, le TFPI-2 pourrait inhiber l activation des prommp-1 et -3 (Rao et al., 1999), dont les formes actives sont elles mêmes impliquées dans l activation d autres prommp, comme l activation de la MMP-9 par la MMP-3 (Ogata et al., 1992) Dans le but de déterminer les mécanismes cellulaires impliqués dans l augmentation du pouvoir invasif des cellules NCI-H460 inhibées pour le TFPI-2, nous avons étudié la prolifération de nos clones NCI-H460 exprimant les différents mirna et leur capacité à adhérer à différentes protéines de la matrice extracellulaire. Nous avons également quantifié leur niveau d expression de différents gènes impliqués dans la dégradation de la MEC. II- Impact de l inactivation du TFPI-2 sur la prolifération des cellules tumorales NCI-H460 Nous avons tout d abord étudié si une modification de la prolifération cellulaire de nos clones inhibés pour le TFPI-2 n était pas à l origine de l augmentation de leurs potentiels invasif et migratoire. En effet, la mesure du le potentiel invasif des cellules tumorales NCI- H460 se déroulant sur 48 h, les variations de croissance cellulaire des clones inhibés pour le TFPI-2 pourrait expliquer les résultats observés. Pour mesurer l impact de l inactivation du TFPI-2 sur la prolifération des cellules NCI-H460, nous avons développé un test MTS permettant de mesurer le métabolisme cellulaire, évaluant ainsi la prolifération cellulaire. Nous avons tout d abord déterminé le nombre de cellules à déposer à J0 dans le puits de plaque 96 puits pour réaliser l expérience sur 96h (figure 41). Pour cela, de à cellules NCI-H460 sauvages ont été déposées par puits et l activité métabolique des cellules a été mesurée toute les 24h pour chaque condition. Les résultats de prolifération obtenus en plaque 96 puits se sont révélés inexploitables, comme le montre la figure 41A, dans laquelle nous voyons que la quantité de cellules viables détectée par ce test n est pas proportionnelle au nombre de cellules en présence et au temps d incubation. Ceci est probablement dû aux effets de bords causés par l étroitesse des puits. 167

168 Résultats et discussion -Chapitre II A 2,5 B 2,5 2 2 Absorbance 1, Absorbance 1, , ,5 0, Temps (h) Temps (h) Figure 41 : Mise au point du test MTS. Différentes quantités de cellules NCI-H460 ont été cultivées en milieu complet pendant 96h en plaque 96 puits (A) ou 24 puits (B) et l activité métabolique a été mesurée toutes les 24h à l aide d un test MTS. Chaque courbe représente 4 expérimentations ±SEM réalisées en triple. Les mêmes expériences ont ensuite été réalisées en déposant de 1, à cellules/puits dans une plaque 24 puits (figure 41B). Seule la condition utilisant 1, cellule par puits à J0 montre une cinétique de croissance proportionnelle. En effet, les cellules atteignent rapidement la confluence lorsqu elles sont ensemencées à plus de par puits, perturbant la cinétique de croissance mesurée (Figure 41B). Ainsi, la mesure de la prolifération des trois clones NCI-H460 exprimant les différents mirna a donc été réalisée dans des plaques 24 puits, en triple, avec 1, cellules ensemencées par puits et sur une cinétique de 96 h avec une mesure de l activité métabolique toutes les 24h (Figure) Absorbance mirna-négatif mirna-1b mirna-2b 0 24h 48h 72h 96h Temps (h) Figure 42 : Impact de l inactivation du TFPI-2 sur la prolifération des cellules NCI-H460. L activité métabolique a été mesurée toutes les 24h à l aide d un test MTS. Chaque courbe représente 4 expérimentations ±SEM réalisées en triple. 168

169 Résultats et discussion -Chapitre II Les résultats ne montrent aucune différence significative de la croissance cellulaire entre les clones exprimant les mirna-1b, mirna-2b et mirna-nég, indiquant que le TFPI-2 n a aucune influence sur la prolifération cellulaire des cellules NCI-H460. En effet, les différentes courbes de croissances obtenues sont parallèles puisqu elles présentent la même pente (a = 0,02), traduisant une cinétique de croissance identique pour les trois clones. Les résultats obtenus avec le test MTS permettent d affirmer que l augmentation des potentiels invasif et migratoire observée avec les clones inhibés pour le TFPI-2 n est pas due à la modification de la prolifération cellulaire de ces clones. Nos résultats sont en accord avec plusieurs études de la littérature. Ainsi l inhibition du TFPI-2 dans la lignée cellulaire tumorale pulmonaire A549 ne modifie pas sa cinétique de croissance (Lakka et al., 2000). De même, la surexpression du TFPI-2 dans les lignées cellulaires HT-1080, issue d un fibrosarcome, et JAR, issue d un choriocarcinome, n a aucune influence sur la prolifération des cellules (Jin et al., 2001 ; Chand et al., 2004b). III- Impact de l inactivation du TFPI-2 sur l adhérence des cellules NCI- H460 aux protéines de la MEC L adhérence des cellules tumorales à la membrane basale et à la matrice extracellulaire est un mécanisme primordial tout au long de la progression tumorale. En effet, de nombreux processus dépendent des interactions entre la MEC et les intégrines, et notamment l invasion cellulaire (Sanders et al., 1999, Larsen et al., 2006). Afin d étudier les effets de l inactivation du TFPI-2 sur l adhérence des cellules NCI- H460, nous avons utilisé une méthodologie permettant l étude des interactions entre les cellules cancéreuses et différentes protéines de la matrice extracellulaire : la fibronectine, la vitronectine, la laminine, le collagène I et le collagène IV. Les différents clones cellulaires à confluence ont été détachés de leur matrice à l aide d une solution de trypsine/edta ce qui dégrade les intégrines cellulaires qui permettaient des liaisons avec les protéines de la matrice. Afin de permettre la réexpression de ces intégrines, les cellules ont à nouveau été cultivées pendant 2 h, sous agitation pour qu elles n adhèrent pas (Enserink et al., 2004). Les cellules ont ensuite été déposées dans les puits recouverts des différentes protéines de la matrice ainsi que dans les puits contrôles recouverts de BSA. Les cellules établissent des liaisons avec les différentes protéines de la matrice pendant 2h, puis les cellules non adhérentes sont éliminées 169

170 Résultats et discussion -Chapitre II par lavage des puits tandis que les cellules adhérées sont colorées au crystal violet. Des puits recouverts de BSA servent de conditions contrôles permettant d évaluer le bruit de fond correspondant à des interactions non spécifiques. Les absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules ayant adhérées aux différentes protéines de matrice. Les résultats représentés dans la figure 43 sont exprimés en pourcentage relatif d adhérence du clone inhibé pour le TFPI-2 (mirna-1b ou mirna-2b) par rapport à l adhérence relative du clone contrôle (mirna-nég) % relatif d adhérence mirna-1b mirna-2b 0 fibronectine vitronectine laminine collagène I collagène IV Figure 43 : Effet de l inactivation du TFPI-2 sur l adhérence des cellules NCI-H460. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de l adhérence relative des clones inhibés pour le TFPI-2 par rapport au clone contrôle et sont représentatifs de 4 expériences réalisées en triple. Les résultats montrent une augmentation de l adhérence des clones mirna-1b et mirna-2b vis-à-vis de toutes les protéines de la MEC testées, allant de 10% à 105%, comparativement au clone contrôle exprimant le mirna négatif. Nous avons de plus observé un comportement similaire des deux clones inhibés pour le TFPI-2 envers les cinq protéines de la matrice étudiées. L adhérence des clones mirna-1b et -2b au collagène de type I n est peu ou pas modifié comparativement aux cellules contrôles. En revanche, une augmentation de 25% à 30% de l adhérence à la fibronectine et de 18% à 30 % à la vitronectine a été observée pour ces deux clones. 170

171 Résultats et discussion -Chapitre II Enfin, une augmentation de plus de 100% de l adhérence à la laminine et de 80% au collagène IV a été observée pour les clones cellulaires inactivés pour le TFPI-2. Seules quelques études avaient déjà étudié le rôle du TFPI-2 sur l adhérence de cellules tumorales. Ainsi une expérimentation avait montrée que le TFPI-1 pouvait favoriser l adhérence de cellules tumorales à une matrice de fibronectine en interagissant via son domaine Kunitz 1 avec le facteur de coagulation VIIa et son récepteur cellulaire, le facteur tissulaire (FT) (Fischer et al., 1999). Cette équipe a émis l hypothèse que le TFPI-2, possédant une homologie de structure de 32% avec le TFPI-1, pourrait avoir un effet similaire dans la MEC en établissant des liaisons entre les sulfates d héparane de la matrice, phénomène démontré par l équipe de Y. Liu (Liu et al., 1999), et les cellules tumorales, via le récepteur cellulaire FT. Ce mécanisme supposerait donc que le TFPI-2 favoriserait l adhérence de cellules tumorales à la matrice extracellulaire en interagissant directement avec la MEC et des récepteurs à la surface cellulaire. Cependant, une autre expérimentation démontra que l adjonction de 25 nm à 200 nm de TFPI-2 recombinant ne modifiait pas l adhérence des cellules tumorales HT-1080 au Matrigel, invalidant ainsi l hypothèse de l équipe de Fisher (Rao et al., 1998). Selon cette étude, le TFPI-2 n agirait donc pas directement sur l adhérence des cellules tumorales. L hypothèse la plus probable pour expliquer nos résultats serait donc que l inhibition du TFPI-2 influencerait l expression de protéines d adhérence par les cellules tumorales, leur permettant d interagir avec différentes protéines de la MEC. De nombreuses études ont reliées l adhérence cellulaire à l expression de différentes intégrines. Ainsi, l adhérence au collagène est principalement médiée par les intégrines β1 (Humphries et al., 2006). Ces intégrines permettent notamment l adhérence de cellules tumorales Calu-1, issues d un CBPNPC, au collagène IV (Mukhopadhyay et al., 2004). L adhérence à la laminine est également médiée par différentes intégrines β1 et par l α6β4. Quatre intégrines β1, les intégrines α1, α2, α10 et α11 -β1, sont de plus particulièrement intéressantes puisqu elles permettent l adhérence à la fois au collagène et à la laminine, mais n interagissent pas avec les autres protéines étudiées dans nos travaux (Humphries et al., 2006). Cette famille d intégrines pourrait donc être impliquée dans la forte augmentation d adhérence envers ces deux protéines observées dans nos deux clones NCI-H460 inhibés pour le TFPI-2. De la même manière, l adhérence à la fibronectine et à la vitronectine est influencée par différentes intégrines, parmi lesquelles l αdβ2, l αvβ3, l α8β1 et l αiibβ3 interagissent spécifiquement avec la fibronectine et la 171

172 Résultats et discussion -Chapitre II vitronectine (Humphries et al., 2006) sans influencer l adhérence à la laminine et au collagène. Ces intégrines pourraient donc être impliquées dans l augmentation d adhérence à ces deux protéines, observée avec les clones NCI-H460 mirna-1b et -2b. IV- Expression des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13, -14 et de l EMMPRIN par les cellules tumorales NCI-H460 inactivées pour le TFPI-2 La surexpression de métalloprotéases matricielles a souvent été décrite comme un facteur favorisant l invasion tumorale (Deryugina & Quigley, 2006). De plus, il a déjà été démontré que le TFPI-2, en inhibant la plasmine, pouvait limiter l activation des MMP-1, -2, - 3 et -9 (Herman et al., 2001 ; Kong et al., 2004). En revanche, l impact du TFPI-2 sur l expression transcriptionnelle des MMP et de l EMMPRIN n a jamais été étudié. De plus, le récepteur membranaire EMMPRIN, surexprimé dans différents types de cancer, est impliqué dans la surexpression de différentes MMP (Klein et al., 2002 ; Nabeshima et al., 2006a). Nous avons donc étudié le profil d expression génique par PCR en temps réel des MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13 et -14, et de l EMMPRIN par les cellules NCI-H460 exprimant les différents mirna. Nous avons également étudié l expression des protéines correspondantes par immunofluorescence et immuno-empreinte. IV-1. Quantification de l expression transcriptionnelle des MMP par PCR en temps réel Les PCR en temps réel permettant de quantifier l expression des MMP-1, -2, -3, -9, - 13, -14 et d EMMPRIN avaient préalablement été mises au point au sein du laboratoire. En revanche, nous avons mis au point lors de ces travaux le protocole de PCR en temps réel pour quantifier spécifiquement l expression de la MMP-7. En effet, cette protéase est de plus en plus décrite comme prenant part dans différents processus de la progression tumorale, tels que l apoptose, l angiogenèse, la croissance et l invasion cellulaire. La MMP-7 est de plus synthétisée à la fois par les cellules tumorales mais également par les cellules du microenvironnement, et notamment par les fibroblastes (Li et al., 2006). 172

173 Résultats et discussion -Chapitre II IV-1.1 Mise au point de la PCR en temps réel spécifique de la MMP-7 La quantification des transcrits par PCR en temps réel est réalisée à l aide d une gamme d étalonnage. Afin d obtenir cette gamme, une PCR standard spécifique du gène de la MMP-7 a été effectuée, avec des amorces permettant d amplifier un fragment «long», de 250 pb. Cette PCR a été réalisée à partir des ADNc présents dans le laboratoire et provenant de la rétro-transcription d ARNm isolés de différentes lignées cellulaires tumorales pulmonaires, NCI-H460, A549, NCI-H209, NCI-H23, NCI-H358, et fibroblastique, CCD19- Lu. Les produits de PCR ont ensuite été déposés sur un gel d agarose à 1,6 % (Figure 44). Pb M H460 H209 H23 H358 CCD19 A549 Cont MMP-7 (250 pb) Figure 44 : Détection de l expression de la MMP-7 dans différentes lignées cellulaires par PCR. Les produits de PCR, de 250 pb, ont été visualisés sur gel d agarose à 1,6% en présence de BET. Après PCR, nous observons une bande de 250 pb, taille attendue du produit de PCR spécifique de la MMP-7. L expression des transcrits MMP-7 est détectée dans 50% des lignées cellulaires testées : les cellules NCI-H460, NCI-H23 et A549. Le transcrit MMP-7 est de plus particulièrement exprimé dans les cellules tumorales A549, issues d un adénocarcinome bronchioalvéolaire. Le fragment de 250 pb, correspondant au transcrit MMP-7 amplifié à partir de l ADNc des cellules A549, a ensuite été purifié, puis dosé afin de déterminer le nombre de copies d ADN/µL de produit de PCR. Nous avons mesuré une concentration de 9, µg/µl, ce qui correspond pour un produit de PCR de 250 pb à 3, copies/µl de copies d ADNc de MMP-7. Les dilutions de la gamme d ADNc MMP-7 de 10 8 à 10 3 copies ont été effectuées extemporanément à partir d aliquots concentrés afin d éviter des problèmes d instabilité liés aux congélations-décongélations successives. 173