LAM 3 UN TYPE DE LAM UNIQUE EN SON GENRE. FORUM SIEMENS Jeudi 21 juin 2012 S.Daliphard Laboratoire d Hématologie CHU Reims

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1 LAM 3 UN TYPE DE LAM UNIQUE EN SON GENRE FORUM SIEMENS Jeudi 21 juin 2012 S.Daliphard Laboratoire d Hématologie CHU Reims

2 CAS N 1 PATIENT DES URGENCES SAMEDI 10 H Leucocytes 1 G/L Hb: 114 g/l VGM 93 fl Plaquettes 96 G/L Leucoconcentration effectuée de manière systématique

3 MR KHA. 57 ANS Sang X 100 Diagnostic Blastes: 9 % avec fagots de corps d Auer Mr K

4 MR KHA. 57 ANS Leucocytes 1 G/L Hb: 114 g/l VGM 93 fl Plaquettes 96 G/L Formule leucocytaire: 30 % PN 89 % Lympho 2 % Mono Blastes: 9 % certains avec fagots de corps d Auer -> LAM 3 typique Bilan de CIVD réalisé : - Fibrinogène : 0,5 g/l TQ: 55 % - D Dimères 8,63 mg/l

5 CAS N 2 Mme P., 62 ans, sans ATCD particulier (hystérectomie pour fibrome), pas de traitement antérieur Tuméfaction cervicale gauche et fièvre en début avril, résolution sous antibiotiques Motif d hospitalisation le 25 avril Découverte d une pancytopénie 5

6 CAS N 2 Examen clinique 78 kg, T 36 9 Asthénie et dyspnée d effort Abdomen souple et indolore, pas d hépatosplénomégalie, pas de syndrome tumoral ganglionnaire ou splénique Adénopathies cervicale gauche et sus claviculaire gauche, comblement du creux sus claviculaire Pas d hypertrophie gingivale Hématome spontané du mollet droit (face postérieure), pas de bulle hémorragique endobuccale 6

7 CAS N 2 Examens biologiques samedi NFS GB 0,8 G/l, Hb 78 g/l, VGM 92fL, réticulocytes: 61,2 G/L, Plaquettes: 73 G/L Pancytopénie Hémostase TCA malade 30 s, TQ 68%, fib 2,5 g/l 7

8 Sang leucoconcentration

9 CAS N 2 Frottis sanguin % de blastes à noyau très irrégulier contenant parfois des corps d Auer multiples. Hémostase D-dimères: 6,78 mg/l ( seulement effectués le 27/04 car fibrinogène du 25/04 normal) 9

10 Moelle petit grossissement

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16 Moelle peroxydases

17 De la description morphologique à.. Hillestad, LK (November 1957). "Acute promyelocytic leukemia". Acta Med Scand. 159 (3): Jusque dans les années 70, Mortalité dans 100 % des cas et pas de traitement

18 CLASSIFICATION FAB LAM Basée sur la morphologie (degré de maturation et lignées impliquées) Diagnostic de LAM si % blastes > 30 % des éléments nucléés médullaires sauf * LAM 0 Indifférenciée MPO - LAM 1 Myéloblastique peu différenciée, corps d Auer +/- MPO + Blastes > 90 % LAM 2 Myéloblastique différenciée, corps d Auer +, MPO + Bl astes: %; maturation granuleuse > 10 % des éléments non érythroblastiques LAM 3 Promyélocytaire, corps d Auer en fagots, MPO ++ LAM 3 «typique» hypergranulaire LAM 3 variante hypogranulaire (Bennett et al, 1980) LAM 4 Myélomonocytaire dont LAM 4 variante éosinophile MPO + Blastes % Cellules à différenciation Monocytaire 20 % des éléments non érythroblastiques ou Monocytes 5 G/L et Maturation granuleuse 20 % des éléments non érythoblastiques LAM 5 LAM 6 * Monoblastique Cellules monocytaires 80 % des éléments non érythroblastiques (LAM 5A monoblastique LAM 5B promonocytaire) Erythroleucémie Erythroblastes 50 % Blastes: > 30 % des cellules non érythroblastiques LAM 7 Mégacaryoblastique, MPO -

19 De la description morphologique à l anomalie moléculaire Leucémie aiguë promyélocytaire (expansion clonale d éléments promyélocytaires) définie par: Anomalie chromosomique t(15;17): réarrangement PML-RARA (98 %) Ou Anomalies chromosomiques variantes avec réarrangement impliquant chromosome 17 RARA (2 %)

20 LAM ET NÉOPLASIES ASSOCIÉES CLASSIFICATION OMS 2008 LAM avec anomalies génétiques récurrentes : 20 à 30 % LAM 3: 5 à 8 % des LAM t(8;21)(q22;q22) inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22) t(15;17)(q24;q21) (réarrangement PML/RARA ) et variantes cytogénétiques t(9;11); t(6;9); inv(3) ou t(3;3) Dans le cas d anomalies génétiques récurrentes, le diagnostic de LAM peut être posé quel que soit le pourcentage de blastes médullaires Entités provisoires: LAM avec mutation NPM et LAM avec mutation CEBPA LAM avec caractéristiques associées à une myélodysplasie LAM secondaires post-thérapeutiques LAM (NOS) Sarcômes myéloïdes Proliférations myéloïdes liées au syndrome de Down Proliférations à cellules dendritiques plasmocytoïdes

21 Rôle du biologiste dans la prise en charge d une LAM3. Examens lors du diagnostic: Hémogramme Examens complémentaires pour la prise en charge rapide et le suivi: - Bilan de coagulation - Myélogramme - Immunophénotypage - Caryotype - Biologie moléculaire

22 Rôle du biologiste dans la prise en charge d une LAM3. Hémogramme complet Anémie et thrombopénie Leucopénie (habituelle) ou hyperleucocytose En cas de leucopénie (< 1 G/L), leucoconcentration utile à la recherche de cellules atypiques promyélocytaires caractéristiques (% blastes faibles) Alarmes automates ADVIA 2120: quasi systématique même en cas leucopénie avec blastes en faible quantité <10 %. GI +++ (Granuleux immatures) Ou blastes. o mais pas d aspect caractéristique si leucopénie Si hyperleucocytose à blastes, Graphe assez caractéristique de la morphologie.

23 LA THÉORIE DU «PANDA» Peroxydase Activity and Nuclear Density Analysis Giuseppe d Onofrio, Gina Zini, Guido Mistretta Catholic University of Rome, Department of Hematology and Immunohematology, Rome Présentée en 2001, à Montpellier, au symposium de l ILSH Résumé présenté par le Pr Bryon au symposium Bayer en octobre 2001

24 MODÈLES POUR CHAQUE TYPE DE LA Graphe d activité peroydasique LAM 3

25 Cas N 4 Hyperleucocytose avec alarmes Blastes +++ et GI +++ LAM3

26 Cas N 4 Hyperleucocytose avec alarmes Blastes +++ et GI +++ LAM3

27 Cas N 5 Hyperleucocytose avec alarmes Blastes +++ et GI +++

28 LAM 3 : LAM PROMYÉLOCYTAIRE CYTOLOGIE: DEUX FORMES LAM 3 typique LAM 3 variante Leucopénique habituellement - Grosses granulations cytoplasmiques rouges ou pourpres très foncées recouvrant - Noyau souvent dystrophique (réniforme voire bilobé) +/- granulations plus fines tassées vers le noyau. - Présence de corps d Auer en fagots dans certains d entre eux. - MPO toujours ++ dans tous les promyélocytes recouvrement ++ du cytoplasme et souvent du noyau Hyperleucocytaire Cytoplasme peu granuleux (fines granulations) et noyau bi ou multilobé diagnostic différentiel avec leucémie à différenciation monocytaire - Présence d un petit nombre de promyélocytes anormaux avec granules visibles et/ou des fagots de corps d Auer visibles - MPO ++ ( différent des mono) Sang Moelle Laboratoire d Hématologie CHU Reims

29 LAM 3 typique (moelle) Laboratoire d Hématologie CHU Reims

30 LAM 3 typique (moelle) Laboratoire d Hématologie CHU Reims

31 LAM 3 typique (moelle X100) Laboratoire d Hématologie CHU Reims

32 LAM 3 hyperleucocytaire LAM 3 variante Cas N 4 (sang X 100) Promyélocyte à noyau bilobé avec fagots de corps d Auer, cytoplasme peu granuleux

33 Rôle du biologiste dans la prise en charge d une LAM3. Examens lors du diagnostic: Hémogramme Examens complémentaires pour la prise en charge rapide et le suivi:- Bilan de coagulation - Myélogramme - Immunophénotypage - Caryotype - Biologie moléculaire

34 IMMUNOPHÉNOTYPE Pas indispensable au diagnostic LAM 3 hypergranulaire avec t(15;17) Faible expression d HLA DR et CD 34 Forte expression de CD 33 Expression hétérogène de CD 13 CD 117 (récepteur de c Kit) souvent exprimé Marqueurs de différenciation granulocytaire CD 15 et CD 65 négatifs ou faiblement exprimés o LAM3 avec morphologie microgranulaire ou transcrit bcr3 de PML-RARA Expression plus fréquente de CD 34 et CD 2 20 % des LAM 3 expriment le CD56 (associé à un plus mauvais pronostic)

35 CARYOTYPE Translocation classique et variantes cytogénétiques indispensable au diagnostic de LAM3 Rapidité du résultat ++ (24 heures possible) LAM 3 avec t(15;17)(q24;q21) PML/RARa PML (promyelocytic leukemia) en 15q24 RARa (retinoid acid receptor alpha) en 17q21 Le gène RARa est coupé dans le deuxième intron. Le gène PML peut être coupé à 3 points différents du gène t(15;17) gène chimère récepteur RARa altéré blocage de la différenciation myéloïde

36 ]Modèle historique classique: Réactivation transcriptionnelle RARa: membre de la famille des récepteurs nucléaires Ligand: Acide rétinoïque (forme de vitamine A): régulateur de transcription de l ADN La protéine de fusion se lie avec une affinité augmentée à l ADN bloque la transcription et la différenciation en granulocytes via l interaction avec des co-répresseurs. Ablain, de Thé 2011 Le traitement par ATRA permet une conformation active et les corépresseurs sont remplacés par des co-activateurs transcription de l ADN + différenciation des cellules promyélocytaires en cellules granuleuses matures

37 Cas particuliers des variants cytogénétiques 4 variants: - t(11;17)(q23;q21) gène PLZF en 11q23 morphologie particulière: noyau rond, pas de corps d Auer, hypergranulaire, cellules à noyau pseudo-pelger forme non sensible à l ATRA - t(5;17)(q32;q21) gène NMP en 5q31 - t(11;17)(q13;q21) gène NUMA en 11q13 - t(17;17)(q11.2;q21) gène STAT5/JAK NB: Variantes morphologiques hypercytaires microgranulaires présentent habituellement la t(15;17)

38 Idéogramme t(15;17)(q24;q21) TRANSLOCATION RECIPROQUE Translocation réciproque équilibrée CONSEQUENCES: FUSION PML/RAR der 15 der 17 CHROMOSOMES: 15q+ et 17q- Fusion PML RARA sur chr15 q+ Fusion RARA PML sur chr17 q- Idéogramme t(15;17)(q24;q21)

39 46,XY,t(15;17)(q24;q21) Bandes G I.Luquet CHU Reims

40 46,XY,t(15;17)(q24;q21) Bandes R I.Luquet CHU Reims

41 Cas particuliers des variants cytogénétiques t(11;17)(q23;q21) gène PLZF en 11q23 morphologie particulière: noyau rond, pas de corps d Auer, hypergranulaire, cellules à noyau pseudo-pelger Flandrin Tutorial on Haematopathology 1999

42 HYBRIDATION IN SITU (FISH) Identification de fragment d ADN avec sonde fluorescente sur cellules métaphasiques et interphasiques 1) Confirmation d un réarrangement de RARA notamment le transcrit de fusion PML/RARA. 2) Utile ++ en cas d échec du caryotype 3) Intérêt ++ pour la mise en évidence de translocation cryptique ou de petite insertion non visible sur le caryotype (6 % des cas de LAM3) 4) Eventuellement utilisée en suivi de patients

43 FISH MÉTAPHASIQUE: SONDE PML/RARA DUAL color (VYSIS ) : IDENTIFICATION DE LA FUSION PML RARA PML RARA I.Luquet CHU Reims

44 FISH INTERPHASIQUE:(noyau) identification de la fusion PML RARA PML RARA I.Luquet CHU Reims

45 Biologie moléculaire Confime le diagnostic de LAM3 Indispensable si caryotype normal Identifie le point de cassure (sur PML: trois points de cassure possibles) au diagnostic pour le suivi de la maladie résiduelle. Mais: N identifie que le réarrangement PML/RARA

46 Biologie Moléculaire au diagnostic RT-PCR (protocole EAC) bcr1 Multiplex 1 primer RARA consensuel bcr2 3 primers PML selon le point de cassure(bcr1/2/3) bcr3 Électrophorèse en gel d agarose PML RARA bcr1 bcr2 bcr3 Fréquence (%) 55% 5% 40% Taille attendue avec les primers ENF 903 (bcr1) 129pb Aucune bande Aucune bande ENF 906 (bcr2) 177pb 100pb Aucune bande ENF 905 (bcr3) 476pb 300pb 100pb En fonction du point de cassure sur PML, obtention de différentes tailles d amplicons permettant d identifier le type de transcrit de fusion bcr1, 2 ou 3.

47 Maladie Résiduelle (MRD) et LAM3 Prélèvement : Moelle Méthode : RT-PCR quantitative Timing des suivis : fin d induction, fin conso 1 et 2, entretien (tous les 3 mois la première année, puis tous les 4 mois la 2ème et 3ème année), fin d entretien Points informatifs : suivis post-conso Nbre de copies PML-RARA normalisées = SEUIL PREDICTIF d un RISQUE DE RECHUTE Copies PML-RAR normalisées RR % < > Délai (mois) Reçoivent une thérapie sans attendre la rechute hématologique

48 AUTRES POINTS Anomalies cytogénétiques secondaires existent dans 40 % des cas notamment la trisomie 8 (ne changent rien au bon pronostic) Mutations impliquant FLT3 dans % des LAM 3 Mutations de FLT3 ITD les + communes et associés à un taux plus élevé de leucocytes, morphologie cellulaire microgranulaire et l implication de bcr3 de PML rôle pronostique?

49 Urgence diagnostique car risque de CIVD (risque vital) Risque d activation inappropriée de la cascade de la coagulation Activation de la coagulation initiée par la libération de facteur tissulaire, glycoprotéine transmembranaire secrétée directement dans le flux sanguin à partir des promyélocytes anormaux (McCance & Huether, 2006). Excès de thrombine libérée Plasminogène convertie en plasmine fibrinolyse. Excès de Produits de dégradation de la fibrine conduisant à des hémorragies simultanées et formation de caillots. Rôle de l annexine II? dans les saignements CIVD dans 85 % des cas de LAM 3 Diagnosing Disseminated Intravascular Coagulopathy in Acute Promyelocytic Leukemia". Clinical Journal of Oncology Nursing

50 TRAITEMENT ACTUEL: PRISE EN CHARGE HÉMOSTASE CF RECOMMANDATIONS ELN Bilan de coagulation important +++ Dès la ponction sternale, possible hématome - Si fibrinogène < 0,8-1 g/l et plaquettes effondrées traitement par PFC et transfusion plaquettes pour maintien plaquettes > 50 G/L et éviter accident hémorragique

51 TRAITEMENT DES LAM 3 EN PRATIQUE: RECOMMANDATIONS DE L ELN ATRA combinée avec anthracycline Rémission complète chez % des patients. ATRA à utiliser avec anthracycline car risque de baisse de la survie. Consolidation pendant deux ans avec traitement combinant chimiothérapie et ATRA. Sans traitement de consolidation, risque de rechute Majorité des rechutes survient dans les 3 ans après la consolidation Arsenic (AS2O3) surtout utilisé dans les formes en rechute ou réfractaires mais traitement par As2O3 proposé dans procole APL 2006 dans un des 3 bras possibles pour le traitement de consolidation. Gemtuzumab (Ac-antiCD 33) peut être proposé dans les formes en rechute

52 Conclusion: LAM3, LAM unique en son genre Dans plus de 90 % des cas, patients très leucopéniques Aspect caractéristique des cellules promyélocytaires anormales même dans le sang mais Diagnostic à poser rapidement pour réalisation rapide d examens complémentaire car: Risque de CIVD important Nécessité d une mise en place rapide du traitement (de l hémopathie et correction de l hémostase). Anomalie moléculaire bien caractérisée (oncoprotéine PML/RARA à l origine de la leucémie) Traitement ciblé à mettre en place rapidement o Pronostic de la LAM 3 excellent grâce à deux traitements (acide rétinoïque et l arsenic)

53 MODELE DE MÉCANISMES MOLECULAIRES AR Arsenic Destruction PML RARA Ablain, de Thé 2011 Modèles Rôles majeurs de la dégradation de PML-RARA et de la perte conséquente de la prolifération des cellules de LAM3 But à atteindre: Cibler l auto-renouvellement