UE 2V311 TD Construction et criblage d une banque d ADN génomique d un phage.

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1 UE 2V311 TD Construction et criblage d une banque d ADN génomique d un phage. Buts du TD: Connaître et comprendre toutes les étapes du clonage moléculaire, depuis la préparation de l'adn à cloner jusqu'à l'obtention des clones recombinants. Connaître la technique d'amplification par PCR et savoir choisir des amorces pour amplifier une séquence d'adn particulière. Documents utiles: Schémas "clonage", "amplification par PCR" du polycopié de cours. Le génome du bactériophage delta est un ADN circulaire double brin de paires de bases. Le but des expériences réalisées ci-après est d'obtenir une banque d'adn génomique du bactériophage delta. Pour réaliser cette banque, nous avons à notre disposition une préparation de l'adn génomique du bactériophage et un vecteur de clonage bactérien de type plasmide, puc19 (Figure 1). MCS Figure 1 : Structure de puc19. Le vecteur puc19 contient: une origine de réplication procaryote (rep) ; le gène bla codant pour la ß-lactamase, qui confère la résistance à l'ampicilline; le gène lacz codant pour la ß-galactosidase. Le site de clonage multiple (MCS ou "polylinker") se situe au début de la séquence codante du gène lacz et contient plusieurs sites de restrictions uniques. Dans un premier temps, on réalise une digestion complète du génome du bactériophage delta par l'enzyme de restriction BamHI. Celle-ci coupe au niveau de la séquence palindromique 5'-Gê GATCC-3' et génère des extrémités dites cohésives. 1

2 Les fragments d'adn obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse en gel d'agarose et visualisés grâce à un agent intercalant fluorescent, le bromure d'éthidium. Les résultats de cette expérience sont présentés sur la figure 2. Figure 2. Fragments d'adn obtenus après digestion du génome du bactériophage delta par l'enzyme de restriction BamHI. Q1. D'après le nombre de fragments observés, combien y a-t-il de sites BamHI sur le génome du bactériophage delta? A partir de la séquence complète du génome du phage delta, les tailles des fragments obtenus ont été calculées et sont les suivantes: 5505 pb, 5626 pb, 6527 pb, 6770 pb, 7233 pb et pb. Q2. Complétez la figure 2 en indiquant la taille de toutes les bandes observées. Afin de réaliser le clonage souhaité, le mode opératoire représenté sur la figure 3 a été suivi. 2

3 Figure 3. Protocole de préparation de la banque d'adn génomique de delta. Q3. Pourquoi est-il important de digérer le vecteur avec la même enzyme de restriction? Q4. Est-il possible de cloner ainsi tous les fragments obtenus après digestion de l'adn du bactériophage delta? Q5. Quelle est l'activité enzymatique de la phosphatase? Q6. Pour quelle raison est-il important de traiter le vecteur avec de la phosphatase? Q7. Quel est le rôle de la ligase? Combien de types de produits différents de réaction seront obtenus à l'issue de cette réaction de ligation? Des bactéries Escherichia coli compétentes sensibles à l'ampicilline et dépourvues du gène lacz sont transformées avec le mélange de ligation, puis étalées sur un milieu riche contenant de l'ampicilline et un substrat chromogène de la ß- galactosidase, le X-gal. Celui-ci est transformé en un produit bleu sous l'action de la ß-galactosidase. Q8. Quels éléments du vecteur sont importants pour assurer la multiplication des bactéries sur le milieu utilisé? 3

4 Q9. Justifier l'utilisation de l'ampicilline et du X-gal. Quel est le phénotype des colonies qui constituent la banque et seront utilisées pour la suite des expériences? Plusieurs colonies blanches sont récupérées et mises en culture en milieu liquide afin de réaliser une extraction plasmidique. Les plasmides obtenus sont ensuite digérés avec l'une ou l'autre des enzymes de restriction BamHI ou EcoRI, présentes dans le MCS de puc19. Le résultat de la séparation par électrophorèse en gel d'agarose des produits de digestion est présenté pour deux clones en figure 4. Figure 4 : Profil de digestion par BamHI et EcoRI des plasmides issus des clones 1 et 2. Q10. Le profil de digestion par BamHI permet-il de déterminer de manière certaine quel fragment a été inséré dans chaque plasmide? Q11. D'après les digestions par BamHI et EcoRI, ces deux vecteurs recombinés sont-ils identiques? Q12. Dessiner la carte de restriction de ces plasmides, sachant que la taille des fragments obtenus après digestion avec l'enzyme EcoRI est de 2585 pb et 7334 pb pour le clone 1 et de 4690 pb et 5229 pb pour le clone 2. 4

5 Choix d'amorces pour la PCR. Après des expériences complémentaires, un plasmide contenant un fragment d'adn portant le gène chichepermoutz a été isolé de la banque. Afin d'analyser la fonction de ce gène, nous voulons produire une grande quantité de la protéine codée par celui-ci. Pour cela, il est nécessaire d'amplifier par PCR la séquence codante de ce gène afin de la cloner dans un vecteur d expression. Le début et la fin de la séquence codante du gène chichepermoutz sont présentés dans la figure 5. 5'-ATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAA AGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGGCTGA-3' Figure 5 : Début et fin de la séquence codante du gène chichepermoutz. Q13. Proposer un couple d'amorces de 20 nucléotides chacune permettant d'amplifier la séquence codante de chichepermoutz incluant le codon STOP. FIN DU TD Pour vous entrainer : SUP1 : Répondez de nouveau à toutes les questions (si possible) en considérant qu'on utilise l'enzyme EcoRI qui coupe le génome du phage delta en 5 fragments de 24756, 7421, 5804, 5643 et 4878 pb. SUP2 : Proposer un couple d'amorces de 20 nucléotides chacune permettant d'amplifier la séquence codante suivante incluant le codon STOP. 5'-ATGGCTTTGCGTTCGCGCTTTCGAACTTTCGT CCCGTCGATATCGTCTAGCTTAGCTAGGTGA-3' Pour aller plus loin après la Q13... Le produit de PCR ainsi obtenu a été purifié pour pouvoir etre cloné dans le vecteur d'expression p2v311 (permettant la transcription et la traduction) schématisé sur la figure 6. A) B) EcoRV : 5'-GATê ATC-3' HindIII : 5'-Aê AGCTT-3' SacI : 5'-GAGCTê C-3' SmaI : 5'-CCCê GGG-3' XmaI : 5'-Cê CCGGG-3' Figure 6 : Vecteur d'expression p2v311. A) Représentation schématique. B) Enzymes de restriction ayant un site unique de reconnaissance dans le "polylinker". 5

6 Q14sup. Quel type d extrémités va produire chacune de ces enzymes? Parmi les 5 enzymes proposées, lesquelles pourront être utilisées pour digérer le vecteur de manière à cloner le produit de PCR obtenu? Des bactéries compétentes E. coli ont été transformées avec le mélange de ligation entre le produit de PCR et le vecteur. Cette souche de coli a la particularité d'exprimer l'arn polymérase du bactériophage T7. Les différents clones obtenus après transformation ont été classés en trois catégories A, B et C en fonction du type de plasmide présent dans ces clones et de leur capacité à produire la protéine CHICHEPERMOUTZ. Ces caractéristiques sont présentées ci-dessous : Catégorie de clones Taille du plasmide Expression de CHICHEPERMOUTZ A B C 3935 pb 3425 pb 3935 pb Q15sup. Comment expliquer la différence de tailles entre les différents plasmides obtenus? Q16sup. Comment détecter l expression de la protéine? Q17sup. Interpréter les différences entre les clones des catégories A et C. Q18sup. Une autre stratégie de clonage aurait-elle permis d'éviter d'obtenir les deux types de clones A et C? 6

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