APOPTOSE. Rappel : l apoptose est une forme de mort cellulaire dite programmée. C est un processus physiologique qui a plusieurs rôles :

Transcription

1 APOPTOSE Rappel : l apoptose est une forme de mort cellulaire dite programmée. C est un processus physiologique qui a plusieurs rôles : - Permet le sculptage des différents organes dans la morphogénèse. - Organisation correcte des tissus par élimination des cellules surnuméraires. - Suppression des cellules dangereuses pour l organisme. (cellules cancéreuses) I) Effecteurs et mécanisme de l apoptose A) Les effecteurs Les effecteurs principaux sont les caspases (protéases) capables par clivage d un substrat de l activer (ex :DNAses)ou de l inactiver(ex :protéines du cytosquelette). Elles sont produites sous forme de précurseurs inactifs qui par des mécanismes de clivage et de réarrangement donneront des caspases actives. Leur activité est régulée à plusieurs niveaux : - Par leur niveau d expression - Activation par auto-catalyse (comme la caspase 8 recrutée sur les récepteur de la mort et qui va s auto-clivée pour engendrer une cascade de caspase) - Interaction avec d autres facteurs (caspase 9 doit se lier à APAF 1 et au cytochrome C pour être activée) - Interaction avec des Icad (inhibiteur qui induit leur dégradation par le protéasome) B) Le mécanisme L évènement majeur est la sortie du cytochrome C de la mitochondrie. Lorsque celui-ci est libéré dans le cytosol il s associe à APAF 1 et à la caspase 9 pour former l apoptosome. Cela entraîne l activation de cette caspase qui va pouvoir activer les caspases effectrices. La sortie du Cyt C dépend des protéines de la famille Bcl2. Dans cette famille on distingue 2 groupes : - Les protéines pro-apoptotiques (BAX) - Les protéines anti-apoptotiques (Bcl2) Ces protéines s associent à la membrane de la mitochondrie pour permettre la libération du cytochrome C pour la 1 ère ou pour l empêcher pour la 2 nd. (remarque : cette famille joue aussi un rôle important au niveau du réticulum endoplasmique pour réguler les flux calciques) Là encore ces protéines sont régulées à plusieurs niveaux : - Leur niveau d expression détermine le ratio entre les pro-apoptotiques et les antiapoptotiques. - Il existe des spécificités tissulaires d expression. - L interaction avec le cytosquette qui inhibe ou active leur transport vers la mitochondrie. - Régulation par des modifications post-traductionnelles (phosphorylation et clivages).

2 L autre voie permettant l activation de l apoptose passe par les récepteurs membranaires de la famille du récepteur du TNF (FAS). Après liaison du ligand il y a trimérisation des récepteurs qui recrutent des protéines adaptatrices qui possèdent des «death domaines» afin d activer la caspase 8. Certains de ces récepteurs (TNFR 1) peuvent aussi activer de voies anti-apoptotiques comme NFkb. Conclusion : La cellule est soumise à différents signaux. Elle entre en apoptose soit par manque de signaux de survie soit parce qu elle a reçu des signaux apoptotiques. Les voies apoptotiques sont complètement intégrées dans la signalisation générale de la cellule. II) Mise en évidence et étude des cellules apoptotiques : Les cellules en apoptose expriment précocement à leur surface des PS (phosphatidylsérine) ce qui leur permet de lier l annexine V. On va ensuite pouvoir attacher à l annexine V un fluorochrome pour détecter les cellules en apoptose. (cytométrie de flux et microscopie optique). Cependant ce processus est réversible, c est-à-dire que toutes les cellules qui lient l annexine V n entre pas en apoptose. Les cellules en apoptose subissent un certain nombre de modifications morphologiques : - Rétrécissement de la cellule - Condensation du cytoplasme - Perte des contacts cellulaires - Compaction de la chromatine Il est possible d utiliser l échelle d ADN pour les détecter. On marque les extrémités 3 de l ADN avec un fluorochrome ainsi plus l ADN sera fragmenté plus le signal sera fort. - Formation de corps apoptotiques III) L apoptose dans le tissu osseux Pour sculpter un organe la coordination et la coopération entre les cellules qui prolifèrent et les cellules en apoptoses est indispensable. Une grande partie des facteurs jouant un rôle dans cette coopération à un rôle important dans l apoptose des cellules osseuses chez l adulte. L os est un tissu dynamique renouvelé en permanence grâce à 2 types cellulaires, les ostéoclastes et les ostéoblastes. Les 1 er lysent l os puis il y a recrutement de précurseurs ostéoblastiques qui vont déposer de l os neuf qui sera ensuite minéralisé. A la fin du cycle de remodelage les ostéoclastes sont détachés de la surface cellulaire et inactivés avant d entrer en apoptose. Les ostéoblastes peuvent soit être piégés dans la matrice minéralisée et devenir un ostéocyte soit entrer en apoptose. Les facteurs indispensables à la différentiation et l activité des ostéoblastes sont impliqués dans le phénomène d apoptose, par exemple le RANK-L (famille du TNF) ou des cytokines comme le MCSF. La plupart des inhibiteurs comme l ostéoprotégérine produite par les ostéoblastes modulent à la fois la différentiation et l apoptose. La liaison de RANK-L à son récepteur induit l activation de voie de survie classiques sarc, PI3K/AKT, RAF RAS et mapk ainsi que le facteur de transcription NFkb. De même le MCSF agit en

3 activant la voie PI3K/AKT qui conduit à la dégradation de BID (pro-apoptotique) mais aussi à une activation de CREB et donc à une augmentation de Bcl2 Les ostéoclastes créent un compartiment hermétique en s accolant à la matrice extracellulaire et ce mécanisme est dépendant des intégrines. Expérience : invalidation de souris pour la chaîne béta des intégrines, ou inhibition de sarc in vivo. Résultats : forte augmentation de l apoptose des ostéoclastes et une forte diminution de la résorption osseuse. Les ostéoblastes sont issus de cellules souche mésenchymateuses qui doivent s engager dans la voie ostéoblastique et proliférer pour donner des précurseurs puis des ostéoblastes matures qui déposent la matrice extra cellulaire. Enfin une majorité des ostéoblastes entre en apoptose. Pour augmenter la formation osseuse on a historiquement cherché des facteurs de prolifération des cellules puis des facteurs de différentiation des cellules enfin des facteurs modulants la survie des ostéoblastes (Wnt, TGFbeta). On a identifié des facteurs ayant des rôles différents selon la maturité des cellules ostéoblastiques et des situations où les ostéoblastes entraient en apoptose (carence oestrogénique). Un des facteurs important pour les ostéoblastes est Wnt. Il existe deux voies : - Voie canonique : fixation de Wnt à son récepteur recrute LRP5 => inactivation du complexe GSK3/APC /axin qui dégrade la béta cat => béta caténine passe dans le noyau et induit la transcription des gènes cibles - Voie non canonique Cette signalisation Wnt est importante pour la survie des cellules ostéoprogénitrices et au fur et à mesure de la différentiation les cellules plus matures vont produire des inhibiteurs de cette voie. Expérience : le traitement des ostéoblaste avec différents facteurs Wnt prévient de l apoptose quelques soit le degré de maturité (ERK,Sarc). Ceci est indépendant de la voie canonique de LRP5 car chez une souris KO LRP5 il n y a pas d altération de l apoptose. - Chez une souris dont l activité de LRP5 a été augmentée on constate une augmentation de la survie. - Le niveau d expression du récepteur soluble de Wnt (inhibiteur) corrèle avec le niveau de mort cellulaire dans les ostéoblastes - Certains inducteurs de l apoptose comme les glucocorticoïdes augmentent l expression de ce récepteur soluble. - Très forte altération de l apoptose chez des souris KO pour cet inhibiteur Conclusion : Wnt rôle important dans la survie et ce quelques soit le degré de maturation cellules. Expérience : Le FGF protège les ostéoblastes de l apoptose induite par l activation de sérum - Une mutation activatrice des récepteurs au FGF accélère la maturation des ostéoblastes ainsi que leur apoptose.

4 Conclusion : Le FGF joue un rôle différent en fonction du degré de maturité de la cellule. Il protège les cellules peu matures et induit l apoptose des cellules plus différenciées. Expérience : Le BMP2 possède les mêmes propriétés. La survie des ostéoblastes dépend également de facteurs hormonaux : Les oestrogènes préviennent de l induction de l apoptose par le TNF (inhibition des caspases et augmentation de la survie des ostéoblastes) Expérience : chez des souris ayant subies une ablation des ovaires on observe une augmentation de l apoptose ostéoblastique. Cette action ne dépend pas de l interaction avec des récepteurs nucléaires mais d une interaction avec des récepteurs membranaire (voie PI3K/AKT/MAPK). La PTH qui possède des effets anaboliques sur l os induit l expression de gènes de survie comme Bcl2 et l inactivation de protéines pro-apoptotiques comme BAX. Lien établi entre la diminution de la masse osseuse et l apoptose des ostéoblastes. Observation : effet inverse des glucocorticoïdes et des oestrogènes sur l induction de l apoptose (œstrogènes protecteurs/glucocorticoïdes inducteurs). Expérience : souris sur-exprimant Bcl2 dans les ostéoblastes. Résultats : surprise! On observe une réduction de la taille des souris et de leur masse osseuse malgré une diminution du nombre de cellules apoptotiques. En fait on a aussi une diminution de la capacité des ostéoblastes à produire de la matrice (ce qui explique les résultats). Les micro-fissure dans l os induisent l apoptose des ostéocytes => activation des précurseurs ostéoblastiques => augmentation de la résorption osseuse => réparation de l os. Donc en ciblant l apoptose des ostéocytes on va avoir une accumulation d os micro-fracturé. Conclusion : l apoptose n est pas qu un processus de mort cellulaire c est un stade tardif de maturation des cellules. Donc essayer d augmenter la durée de vie des cellules matures n est peutêtre pas une bonne stratégie pour améliorer la formation osseuse. IV) Nouvelles stratégies : Les nouvelles stratégies essayent d utiliser des cellules souches mésenchymateuses pour réparer l os. Ces cellules multipotentes (capacité à donner plusieurs lignées) sont capables d auto-renouvellement et ont de grande capacité de résistance au stress. Leur phénotype est sous le contrôle de mécanismes épigénétiques, de facteurs de transcription spécifiques ainsi que de l interaction avec la niche (micro-environnement cellulaire). Dans cette niche on trouve de chimiokines qui attirent les cellules, des cytokines qui induisent la signalisation. Au sein de la niche les cellules vont être en contact avec d autres cellules et la matrice extracellulaire. Les cellules souches les plus étudiées sont les cellules souche hématopoïétiques localisées dans la niche ectoblastique.

5 Ces niches sont en générale en hypoxie (faible proportion d oxygène) ce qui permet : - D augmenter l activité de la télomèrase => diminue la sénescence réplicative - Favoriser l auto-renouvellement - Maintenir l état de quiescence de la cellule ce qui la protège du stress On peut trouver des cellules souches mésenchymateuses avec un pouvoir ostéogénique dans de nombreux organes comme la moelle osseuse. Ces cellules sont identifiées par des marqueurs (la plupart encore très discutés). On connaît des facteurs qui induisent leurs différentiations en cellules ostéoprogénitrices mais nos connaissances sur les conditions qui permettent la maintenance d un pool de cellules souche sont très limitées. V) APOPTOSE ET CHIMIORESISTANCE : L ostéosarcome est un cancer des os long, survenant chez des enfants ou de jeunes adultes. Ce sont des tumeurs qui résistent aux radiothérapies et aux chimiothérapies. Actuellement un protocole est proposé, il associe une chirurgie conservatrice et différents agents de chimiothérapie. Ces agents agissent en bloquant la réplication, la transcription ou en endommageant l ADN. Les différents mécanismes responsables de cette chimiorésistance mettent en œuvre : - Une augmentation des systèmes de transport et de détoxification pour faire sortir l agent cytotoxique de la cellule - Une augmentation des systèmes d inactivation des systèmes. (Désolé la prof marmone on n entend rien.) - Une augmentation des systèmes de réparation de l ADN - Des perturbations des points de contrôle du cycle cellulaire - Modifications des facteurs impliqués dans le processus d apoptose Tout cela conduisant à une diminution de l apoptose d où la résistance au traitement. Remarque : Les chercheurs ont mis en évidence la présence de cellules souches cancéreuses au sein de tumeurs très hétérogènes, ces cellules seraient capables d auto-renouvellement et donc responsables de la résistance au traitement. L os est un site privilégié pour les cellules cancéreuses car elles détournent les mécanismes impliqués dans le remodelage osseux. Elles vont activer les ostéoblastes ce qui va activer la résorption osseuse et permettre la libération de nombreux facteurs de croissance de la matrice qui vont profiter aux cellules tumorales. (C est un cercle vicieux) On constate une accumulation des altérations des gènes p53, et des gènes contrôlant la différentiation ostéoblastique dans les cellules atteintes d ostéosarcome. Ces altérations entraînent une perte du contrôle du cycle cellulaire.

6 La signalisation Wnt semble aussi perturbée. En effet on a montré que l expression de LRP5 dans des tumeurs humaines corrèle avec la présence de métastases et une survie réduite des patients. De plus si on inhibe la fonction de LRP5 avec un dominant négatif cela diminue la croissance tumorale et la survenue des métastases. Conclusion : Tout cela semble suggérer que la signalisation Wnt est impliquée dans le développement de l ostéosarcome. Ce qui est moins évident c est le rôle de la Beta caténine. Certaines étude montrent une accumulation dans le cytoplasme ou à la membrane ce qui est peu compatible avec une augmentation de l activité transcriptionnelle de la voie Wnt. D autres montrent une accumulation au niveau du noyau. Enfin certains auteurs ont montré que l activité transcriptionnelle de la voie Wnt est peu importante dans les cellules d ostéosarcome par rapport à d autres cancers. Expérience : comparaison de l activité transcriptionnelle du TCF issu de cellules d os normal et d un ostéosarcome. Résultats : forte activité du TCF dans les cellules d ostéosarcome. Ils se sont ensuite intéressés au syndecan 2, un protéoglycane polymérisant à la surface des cellules. Ils possèdent une grande chaîne d héparane sulfate qui lui permet de moduler l activité de facteur de croissance et sa liaison à la matrice extra-cellulaire. Le syndecan 2 est donc impliqué dans la régulation de la différentiation, de la prolifération et de l adhésion à la matrice extra-cellulaire. L équipe a montré que le syndecan 2 dans les cellules d ostéosarcome module la signalisation cellulaire pour induire l apoptose. De plus si on injecte des cellules sur exprimant le syndecan 2, on diminue la croissance tumorale. Ils ont aussi montré qu il existe un déficit en syndecan 2 dans les cellules d ostéosarcome. Donc le syndecan 2 semble jouer un rôle suppresseur de tumeur dans les ostéosarcomes. Pour comprendre ce déficit ils ont étudié le promoteur du syndecan 2 et ont montré qu il existe différents sites de liaison pour les facteurs de la famille. (elle marmone). On a aussi montré qu une sur expression TCF induit une forte diminution de l activité du promoteur alors qu à l inverse une inhibition des TCF augmente l expression du syndécan. De même un traitement des cellules par de Wnt recombinant ou de la beta-caténine constitutivement active on inhibe l expression du syndecan 2. Donc la voie canonique de Wnt semble agir comme un répresseur de l expression du syndecan 2. Les chercheurs se sont demandés si cette régulation du suppresseur de tumeur par la voie Wnt peut jouer un rôle dans la chimiorésistance? Expérience : sélection de cellules résistante à la doxoréducine. On a montré qu il n y a pas de modification importante du niveau d expression du syndecan 2 dans les cellules résistantes mais que la doxoréducine induit une augmentation d expression du syndecan

7 2 dans les cellules sensibles mais pas dans les cellules résistantes. Ainsi une sur-expression du syndecan 2 dans les cellules résistantes rétabli le processus normal d apoptose. Conclusion : - Dans les cellules sensibles à la doxoréducine on a une compétition entre cette dernière et la signalisation Wnt mais la doxoréducine augmente l expression du syndecan 2 qui va favoriser la réponse à la doxoréducine ce qui crée une boucle amplification de la réponse aux agents cytotoxique. - Dans les cellules résistantes la doxoréducine n induit pas l expression du syndecan 2 ce qui brise la boucle d amplification. Expérience : inhibition de la voie Wnt par différents inhibiteurs Résultats : seul 1 de ces inhibiteurs donne une réponse à la doxoréducine (PKF) car les autres (dkk1 et récepteur frizzled soluble) induisent une diminution de la beta-cat qui est nécessaire à l action de la doxoréducine. Donc le PKF diminue la survie des cellules d ostéosarcome. Expérience : in vivo on a traité des animaux à qui on avait injecté des cellules tumorales : Soit avec de la doxoréducine seule qui a peu d effet sur le volume tumoral Soit avec du PKF seul qui diminue fortement le volume tumoral Soit avec une association des 2 qui réduit encore plus le volume tumoral. NB : La prof n a pas voulu donner son diaporama, c est pour ca qu il n y a malheureusement aucun schéma. Pas de panique nous avions le dictaphone. Bon courage à tous.