QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Uniquement pour Diagnostics In-Vitro Complexité de CLIA: Haut

Transcription

1 QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Uniquement pour Diagnostics In-Vitro Complexité de CLIA: Haut Application Le coffret QUANTA Lite TM H. pylori IgA est un essai immunoadsorbant basé sur les enzymes (ELISA) destiné à la détection qualitative d anticorps IgA H. pylori (Helicobacter pylori) dans le sérum humain. Ce test est destiné au diagnostic de l infection H. pylori chez des patients adultes âgés d au moins 18 ans présentant des signes et des symptômes cliniques de maladie gastro-intestinale. Le QUANTA Lite TM H. pylori IgA doit être réalisé et interprété en association avec le QUANTA Lite TM H. pylori IgG pour la détection d anticorps IgG de H. pylori. Informations concernant le test La relation de cause à effet entre l infection H. pylori et l ulcère à l estomac a bien été établie depuis sa première mise en évidence en L infection H. pylori est présente chez 95 % des patients présentant des ulcères duodénaux, chez 80 % des patients présentant des ulcères gastriques et elle est associée au carcinome et au lymphome. 2-5 L éradication de l infection H pylori réduit la récurrence de l ulcère. 2-5 Le traitement de l infection H. pylori est recommandé pour les patients atteints d ulcères gastriques et du duodénum et récemment pour la dyspepsie fonctionnelle. 5,6 Le diagnostic de l infection H. pylori comprend des méthodes invasives et des méthodes non-invasives. Les tests invasifs sont les suivants : l endoscopie pour une observation directe de la muqueuse gastrique antrale et pour obtenir des biopsies pour les tests d uréase, la coloration histologique (Warthin-Starry) et la culture. 5,7 La culture est considérée comme la «norme», bien que ce soit le test le moins sensible (70 %-80 % de sensibilité). Les tests histologiques et d uréase ont des sensibilités et des spécificités de 90 %. 5 Les premiers inconvénients des méthodes invasives sont le risque et la gêne pour le patient, leur coût élevé et de faux résultats négatifs dus à l inégale répartition du H. pylori dans l estomac. Les tests non-invasifs comprennent le test respiratoire avec les tests sérologiques et à l urée 14 C ou 13 C. Le test respiratoire est sensible et spécifique mais coûteux. La sérologie offre une alternative peu coûteuse, sensible et spécifique aux procédures coûteuses et/ou invasives telles que l endoscopie et le test respiratoire à l urée 14 C. 2,3,5,8,9 Dans la plupart des cas, la détection des anticorps IgG H. pylori permet d obtenir une détermination précise de l infection H. pylori avec des sensibilités et des spécificités de 90 %. Cependant, environ 2-7 % des patients testés pour les anticorps IgG et IgA H. pylori se sont révélés négatifs aux IgG H. pylori, mais positifs aux IgA H. pylori. 12,15,16,18 En mesurant uniquement les anticorps IgG, certains cas d infection H. pylori peuvent ne pas être détectés et certains patients infectés risquent de ne pas recevoir de traitement ou d être soumis à des procédures de tests souvent invasives et beaucoup plus coûteuses. Outre la détection de patients susceptibles d échapper aux essais des IgG H. pylori, voici d autres études dont l utilité clinique est de mesurer les anticorps IgA H. pylori : 1) les résultats révélant des niveaux élevés d anticorps IgA H. pylori avec de faibles taux sériques de pepsinogène I présentent des facteurs de risque du cancer de l estomac 17, 2) après un traitement, les valeurs des anticorps IgA peuvent diminuer plus vite que les valeurs des anticorps IgG 15, 3) la détection d anticorps IgA H. pylori peuvent permettre de diagnostiquer des individus symptomatiques avec des valeurs d anticorps IgG H. pylori équivoques ou faibles et 4) le rapport entre les valeurs des anticorps IgA/IgG H. pylori peut être lié au taux de gastrite chronique associée au H. pylori 19. Principe du test L antigène H. pylori, purifié est fixé sur les puits d une plaque de microtitration en polystyrène dans des conditions préservant son état natif. Les contrôles pré-dilués et les sérums de dilués patients sont ajoutés dans différents puits. Une étape d incubation permet la liaison entre les anticorps anti-h. pylori présents dans le sérum et l antigène immobilisé dans le puits. Les molécules non liées aux antigènes sont éliminées par lavage. Un conjugué enzymatique anti-iga humaine est alors ajouté dans chaque puits pour révéler les autoanticorps du patient. Après une étape d incubation, le conjugué non fixé est éliminé par lavage. L activité enzymatique résiduelle est quantifiée grâce à l addition d un substrat chromogène suivie d une étape de mesure de l intensité de la coloration ainsi développée. Les résultats peuvent être évalués par comparaison entre la couleur du puits échantillon et celle des puits de contrôle. Contenu du coffret 1. Plaque de microtitration ELISA revêtue d antigène H. pylori, avec portoir de 12 barrettes de 8 micropuits en polystyrène sécables, dans un sachet d aluminium avec un dessiccant 2. Contrôle Négatif pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain sans anticorps humains IgA anti-h. pylori, dans du tampon avec du stabilisateur 3. Contrôle ELISA H. pylori IgA faiblement positif pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps humains IgA anti- H. pylori, dans du tampon avec du stabilisateur 4. Contrôle ELISA H. pylori IgA fortement positif pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain avec des anticorps humains IgA anti-h. pylori, dans du tampon avec du stabilisateur 5. Diluant d échantillons HRP, teinté en rose, 1 flacon de 50 ml contenant du tampon Tris salin, du Tween 20, des stabilisateurs de protéines et des conservateurs 6. Tampon de lavage HRP concentré 40X tampon Tris salin avec du Tween 20, teinté de rouge, 1 flacon de 25 ml. Consulter le paragraphe Méthode pour la dilution 7. Conjugué IgA-HRP, anticorps de chèvre anti-iga humaines dans du tampon avec des stabilisateurs de protéines et des conservateurs, teinté en jaune-clair, 1 flacon de 10 ml 1

2 8. TMB Chromogène, avec stabilisateurs, 1 flacon de 10 ml 9. Solution d arrêt HRP, acide sulfurique 0,344M, non teinté, 1 flacon de 10 ml Avertissements 1. ATTENTION: Le diluant des échantillons, les contrôles et le conjugué contiennent 0,02% de chloramphénicol, considéré comme cancérigène dans l état de Californie. 2. Tout le matériel d'origine humain utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé négatif lors de la recherche d'anticorps anti-vih, anti-antigène de surface de l'hépatite B et anti-virus de l Hépatite C à l'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner une garantie complète quant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. En conséquence, tous les sérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes précautions que celles utilisées pour un matériel potentiellement infectieux L azide de sodium (NaN 3 ) est utilisé comme conservateur. NaN 3 est un poison et il est toxique en cas d ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l exposer aux bases, métaux ou autres composants, réagissant avec les acides. Après l évacuation des réactifs, laver à grande eau afin d éviter des dépôts dans les canalisations. 4. Le conjugué Peroxydase HRP contient un composant chimique dilué qui est un poison corrosif, toxique en cas d'ingestion en grande quantité. Pour éviter des brûlures chimiques, il est recommandé d'éviter tout contact avec la peau ou les yeux. 5. Le chromogène TMB est irritant et peut être toxique en cas d'inhalation, d'ingestion et d absorption en grande quantité. Eviter tout contact avec la peau ou les yeux et toute inhalation. 6. La solution d'arrêt HRP est une solution diluée d'acide sulfurique. Eviter de l exposer aux bases, aux métaux, aux oxydants ou tout autre composé susceptible de réagir avec les acides. L acide sulfurique est toxique et corrosif en cas d absorption. Eviter le contact avec la peau et les yeux pour éviter toute brûlure chimique. 7. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle appropriés. 8. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en vigueur concernant l élimination des déchets. Précautions 1. Ce test est pour un usage diagnostic in vitro. 2. Toute substitution par d autres réactifs que ceux fournis dans le coffret entraîne des variations de résultats. 3. Un lavage incomplet ou insuffisant et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits d ELISA entraînent des imprécisions et un bruit de fond élevé. 4. L automatisation, complète ou partielle, du traitement des échantillons dans ce test peut produire des différences de résultats par rapport au traitement manuel. Chaque laboratoire est responsable de la validation des procédures automatiques afin que les résultats des tests restent dans les limites acceptables. 5. Un certain nombre de facteurs influencent la performance du test: la température initiale des réactifs, la température ambiante, l exactitude et la reproductibilité de la technique de pipetage, la qualité du lavage et de vidange des puits d ELISA, le photomètre utilisé pour mesurer les résultats et la durée des temps d incubation pendant le test. Il est donc recommandé de prêter attention à tous ces facteurs pour obtenir des résultats reproductibles et rigoureux. 6. Il est recommandé de suivre strictement le protocole. Chaque modification est au risque de l utilisateur. 7. La fermeture incomplète de la pochette contenant les puits de microtitration et le dessiccant entraîne la dégradation de l antigène et en conséquence une mauvaise précision des résultats. 8. Des valeurs faibles et inacceptables d absorption peuvent être progressivement observées dès le deuxième prélèvement dans le même flacon de conjugué HRP. Il est donc important de suivre exactement les instructions fournies pour éviter ce risque. 9. Un nettoyage ou rinçage inapproprié des appareils et instruments pourrait provoquer une contamination chimique du conjugué HRP. Des résidus de produits chimiques courants de laboratoire comme le formol, l eau de javel, l éthanol ou les détergents, entraînent la dégradation progressive du conjugué HRP. Il est absolument recommandé de rincer abondamment tous les instruments et appareils après l utilisation des détergents chimiques. Conditions de conservation 1. Conserver tous les réactifs du coffret entre 2-8 C.Ne pas congeler. Les réactifs sont stables jusqu à la date limite d utilisation dans des conditions de stockage et d utilisation conformes. 2. Les puits non utilisés devront être remis dans l emballage en aluminium avec le dessiccant, bien refermé et stocké à 2-8 C. 3. La solution de tampon diluée reste stable une semaine à 2-8 C. Echantillons Ce test doit être réalisé avec des sérums comme échantillons. L addition d azide ou d autres conservateurs aux échantillons peut affecter le bon déroulement de la procédure. Les sérums contaminés par des agents microbiens, prétraités par la chaleur ou contenant des particules visibles ne doivent pas être utilisés. Les sérums ou échantillons hémolysés ou lipémiques sont à éviter. 2

3 Après prélèvement, le sérum doit être séparé du culot. Le document H18-A du NCCLS recommande les conditions suivantes de conservation: 1) Conserver les échantillons à température ambiante pas plus de 8 heures. 2) Si le test ne peut pas être fait dans les 8 heures, conserver les échantillons à 2-8 C. 3) Si le test ne s effectue pas dans les 48 heures ou si on doit envoyer les échantillons, les congeler à 20 C ou à plus basse température. Bien agiter les échantillons décongelés. Les prélèvements congelés et décongelés à plusieurs reprises ne sont pas recommandés. Procédure Matériel fourni 1 Plaque microtitration ELISA H. pylori IgA, (12-1 x 8 puits), avec support 1 1,2 ml Contrôle ELISA Négatif pré-dilué 1 1,2 ml Contrôle ELISA faiblement positif H. pylori IgA pré-dilué 1 1,2 ml Contrôle ELISA fortement positif H. pylori IgA pré-dilué 1 50 ml diluant HRP pour échantillons 1 25 ml tampon de lavage HRP concentré 40X 1 10 ml conjugué anti-iga humaines de chèvre 1 10 ml substrat TMB 1 10 ml solution d arrêt HRP (acide sulfurique 0,344M) Autre matériel nécessaire non fourni Pipettes 5, 100, et 500 µl Cônes jetables Tubes de 4ml pour la dilution de sérum Eau distillée ou déionisée Récipient de 1 litre pour le tampon de lavage HRP dilué Lecteur ELISA avec filtre de 450nm (et 620nm pour les lectures à double longueur d ondes) Méthode Préparation du test 1. Porter tous les réactifs et échantillons à la température ambiante (20-26 o C) et bien les mélanger avant de les utiliser. 2. Diluer la totalité de la solution de lavage (25ml) avec 975 ml d eau distillée (1/40). La solution de tampon diluée reste stable une semaine à 2-8 C. Si la totalité de la plaque de microtitration n est pas utilisée en une seule fois, un plus petit volume de tampon sera suffisant, par exemple pour traiter 16 puits, diluer 2ml de tampon concentré dans 78ml d eau distillée. 3. Préparer les sérums des patients en les diluant au 1/101 dans le diluant d échantillon (5µl dans 500µl). Les sérums doivent être utilisés dans les 8 heures qui suivent leur dilution. Ne pas diluer les contrôles ELISA fortement positif, faiblement positif en H. pylori IgA et négatif. 4. La détermination de la présence ou de l absence de la H. pylori en unités arbitraires nécessitent deux puits pour chacun des trois contrôles et un ou deux puits pour chacun des sérums de patients. Il est recommandé de tester les échantillons en double. Exécution du test 1. PORTER TOUS LES REACTIFS ET LES ECHANTILLONS À TEMPERATURE AMBIANTE (20-26 o C) AVANT DE LES UTILISER. Placer le nombre nécessaire de micro puits ou de barrettes sur le portoir. Remettre immédiatement les barrettes non utilisées dans la pochette en aluminium avec le dessiccant, fermer hermétiquement pour éviter toute condensation de vapeur d eau. 2. Distribuer 100 µl de chacun des contrôles ELISA fortement, faiblement positifs en H. pylori et négatif pré-dilués et de sérums des dilués patients dans les puits. Recouvrir les barrettes et laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Le temps d incubation commence après l ajout du dernier échantillon. 3. Lavage: aspirer le contenu de tous les puits. Ajouter µl de tampon dilué dans tous les puits et l aspirer ensuite complètement. Répéter cette opération deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages. Après le dernier lavage, retourner la plaque en la tapotant sur du papier absorbant, pour enlever tout liquide de lavage résiduel. Pour l'aspiration, maintenir la même séquence que celle utilisée lors de la distribution des échantillons. 4. Distribuer 100 μl de conjugué HRP IgA dans chaque puits. Le conjugué doit être prélevé du flacon dans des conditions aseptiques. Prélever en une seule fois la quantité de conjugué nécessaire à la réalisation de la série. POUR EVITER LE RISQUE DE CONTAMINATION, NE JAMAIS REMETTRE LE RESTE DU CONJUGUE NON UTILISE DANS LE FLACON. Recouvrir les barrettes et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, comme décrit à l étape Lavage: Répéter la procédure décrite à l étape Distribuer 100 µl de chromogène TMB dans chaque puits et laisser incuber à l obscurité 30 minutes à température ambiante. 7. Ajouter 100 µl de solution d arrêt HRP dans chaque puits. Maintenir la même séquence et le même timing lors de l addition de la solution d arrêt que ceux utilisés lors de la distribution du chromogène TMB. Tapoter délicatement les plaques pour bien mélanger le contenu des puits. 8. Lire la densité optique (D.O.) de chaque puits à 450nm dans l heure qui suit l arrêt de la réaction. Pour une lecture bichromatique, la longueur d onde de référence peut être 620nm. 3

4 Contrôle de qualité 1. Les contrôles ELISA fortement positif H. pylori IgA, faiblement positif en H. pylori IgA et négatif doivent être inclus à chaque série de tests afin de s assurer du bon fonctionnement des réactifs et du bon déroulement de la procédure. 2. Etant donné que les contrôles ELISA fortement positifs en H. pylori IgA, ELISA faiblement positifs H. pylori IgA et négatifs sont prédilués, il n est pas possible de valider le procédé de dilution des échantillons. 3. Des contrôles de qualité supplémentaires peuvent être réalisés selon les directives nationales, les réglementations internationales ou celles des organismes d accréditation. Des contrôles appropriés peuvent être obtenus en aliquotant un pool de sérums humains conservé à une température inférieure ou égale à -20 C. 4. Pour valider les résultats obtenus, tous les critères décrits ci-dessous devront être vérifiés. Si un ou plusieurs de ces critères ne sont pas réalisés, le test devra être considéré comme non valide et à refaire. a. La densité optique du Contrôle ELISA fortement positif en H. pylori IgA pré-dilué doit être supérieure à celle du contrôle ELISA faiblement positif en H. pylori IgA pré-dilué. D autre part, la densité optique du contrôle ELISA faiblement positif en H. pylori IgA doit être supérieure à celle du contrôle ELISA négatif pré-dilué. b. La densité optique du contrôle ELISA fortement positif en H. pylori IgA pré-dilué doit être supérieure à 1,0. Celle du contrôle négatif pré-dilué doit être inférieure à 0,2. c. L absorbance du Contrôle ELISA faiblement positif en H. pylori IgA doit être deux fois supérieure à celle du contrôle négatif d ELISA ou supérieure à 0,25. d. Les contrôles ELISA négatif et ELISA fortement positif en H. pylori IgA permettent de contrôler le bon fonctionnement des tests. Le Contrôle ELISA fortement positif en H. pylori n assure pas la précision de la valeur seuil du test. e. L utilisateur du test peut se référer au document C24-A du NCCLS 11 pour des informations supplémentaires concernant le contrôle qualité. Calcul des résultats Déterminer d abord la valeur moyenne des duplicates. La réactivité de chaque échantillon est calculée en divisant la DO moyenne de l échantillon par la DO moyenne du contrôle faible et multiplier le résultat obtenu par la valeur (en unités) affectée au contrôle faible. La valeur en unités est indiquée sur l étiquette du flacon de contrôle ELISA positif faible en H. pylori. DO de l échantillon Valeur de l échantillon = - x valeur du contrôle faible (unités) DO du contrôle faible (unités) La réaction n évolue pas de manière linéaire en fonction de la quantité d anticorps présents dans le sérum. L augmentation et la diminution de la concentration d anticorps se traduisent par une augmentation ou une diminution de réactivité correspondante mais ces modifications du signal ne sont pas proportionnelles (par exemple un doublement de la quantité d anticorps ne fera pas doubler le signal). Pour une évaluation quantitative rigoureuse des anticorps du patient, il faudra réaliser des dilutions sériées du sérum. Dans ce cas, la dernière dilution du sérum qui donne encore un signal positif sera considéré comme étant le titre en anticorps du patient. Interprétation des résultats Le test ELISA est une technique très sensible et peut en conséquence détecter de très faibles différences au sein d un groupe de patients. Les valeurs limites détaillées dans le paragraphe calcul des résultats sont indicatives. Il est recommandé à chaque laboratoire d établir ses propres valeurs seuils d interprétation en fonction de ses techniques, contrôles, équipements et populations de patients. Les échantillons peuvent être interprétés comme négatifs, (negatifs for IgA antibody to H. pylori), douteux, or positif (IgA antibody to H. pylori detected) selon les valeurs en unités détaillées ci-dessous: Unités Négatif 0,0 20,0 Douteux 20,1 24,9 Positif >25 Les échantillons douteux devraient être retestés avant le rendu des résultats. 1. Le QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA doit être réalisé et interprété en association avec l essai QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA pour la détection d anticorps IgG H. pylori. Certains échantillons peuvent être négatifs aux anticorps IgA H. pylori et positifs aux anticorps IgG H. pylori, alors que d autres peuvent être positifs aux anticorps IgA H. pylori et négatifs aux anticorps IgG H. pylori. Les données de performance/interprétation appropriées n ont pas été établies pour les échantillons positifs aux anticorps IgA H. pylori et négatifs aux anticorps IgG H. pylori et une étude complémentaire peut être justifiée. 2. Un résultat positif indique uniquement une exposition immunologique antérieure au H. pylori et ne permet pas de faire la distinction entre une infection au H. pylori active et une infection inactive. Une infection active est mise en évidence par la culture d une biopsie, par le test respiratoire à l urée 14 C ou par d autres méthodes de détection d uréase. 4

5 3. Un prélèvement présentant des niveaux équivoques d anticorps IgA H. pylori ne peut pas être utilisé pour déterminer l état des anticorps. Si les résultats restent équivoques après une répétition du test, le résultat devra être considéré comme équivoque et/ou il conviendra de prélever un échantillon supplémentaire. 4. Un résultat négatif indique l absence d anticorps IgA H. pylori ou des niveaux inférieurs à la limite de détection de l essai. Les niveaux d anticorps IgA ne seront peut-être pas détectables sur des échantillons prélevés trop tôt pendant l infection primaire. Si l on suspecte une infection primaire, un autre échantillon devra être prélevé dans les 4 à 6 semaines et testé simultanément avec le prélèvement d origine. 5. Nous suggérons de rendre les résultats avec la remarque suivante: Les résultats suivants ont été obtenus avec le test ELISA INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA. Les valeurs d anti-h. pylori obtenues avec des tests de différents fabricants ne sont pas interchangeables. Le taux d anti-iga trouvé n est pas corrélé à une titration en point final. Limites du test 1. La présence de Complexes Immuns ou d autres agrégats d Immunoglobulines dans le sérum humain peut entraîner l augmentation d une liaison non spécifique et des résultats faussement positifs. 2. Ce test permet d établir le diagnostic de l infection H. pylori chez les individus présentant des symptômes de maladie gastro-intestinale et n est pas prévu pour être utilisé chez des patients asymptomatiques. 3. Ce test peut être utilisé en complément mais pas en remplacement du dépistage d anticorps IgG H. pylori. Les résultats des IgA H. pylori obtenus à partir des prélèvements ne devront pas être rapportés sans les résultats IgG H. pylori correspondants du prélèvement. 4. Un résultat négatif aux anticorps IgA H. pylori ne permet pas d exclure la présence de H. pylori car de nombreux individus présentant ou ayant présenté une infection au H. pylori peuvent apparaître comme négatifs aux anticorps IgA H. pylori. 5. Un résultat négatif aux anticorps IgA H. pylori ne permet pas d exclure la présence de H. pylori car la concentration d anticorps peut être inférieure à la limite de détection de l essai. 6. Des résultats négatifs peuvent apparaître si les échantillons sont prélevés trop tôt pendant l infection, avant l apparition d anticorps détectables. Si une infection H. pylori est suspectée, de nouveaux échantillons doivent être prélevés 4-6 semaines plus tard et testés en parallèle avec le premier. 7. Un résultat de test positif ne permet pas de distinguer une infection active d une colonisation par le H. pylori. 8. Un résultat de test positif souligne uniquement la présence d anticorps H. pylori et n indique pas nécessairement la présence d une maladie gastro-intestinale. 9. Les résultats obtenus à l aide de ce test devront être corrélés avec les signes cliniques et d autres tests sérologiques. 10. Cet essai n a pas été établi pour les patients âgés de moins de 18 ans. 11. Certaines références ont suggéré la possibilité que des anticorps des espèces de pseudomonas puissent interagir avec le H. pylori. La performance de cet essai avec des sérums contenant des anticorps anti-pseudomonas n a pas été évaluée. 12. Les performances du coffret pour les échantillons autres que les sérums n ont pas été établies. Performances On a estimé qu environ 50 % de la population mondiale était infectée par le H. pylori. Dans les pays en voie de développement, au moins 50 % de la population est infectée par le H. pylori dès l âge de 10 ans alors que dans les pays développés, l infection dès l enfance est peu fréquente. La séroprévalence d anticorps IgG H. pylori augmente d environ 0,5-1,0 % par an avec l âge (soit environ 60 % de séroprévalence pour la catégorie des 60 ans). 3,7,13,14 Les individus infectés ont également présenté des anticorps IgA H. pylori. Un petit nombre d individus (2-7 %) se sont révélés positifs aux anticorps IgA H. pylori et négatifs aux anticorps IgG H. pylori 12,15,16,18. La capacité du test ELISA QUANTA Lite TM H. pylori IgA à détecter des anticorps IgA H. pylori a été évaluée en comparaison avec un ELISA iga H. pylori disponible dans le commerce et en évaluant des échantillons de patients cliniquement définis. Les résultats du test ELISA IgA H. pylori disponible dans le commerce ont été déterminés en fonction des indications du fabricant. Valeur normale Un panel de 120 échantillons prélevés chez des individus asymptomatiques et sains (dont l âge est compris entre 17 et 75 ans, avec une médiane de 35 ans) ont été testés avec l ELISA QUANTA Lite TM IgA H. pylori. Sur les 120 échantillons, 9 % (11/120) se sont révélés positifs aux IgA H. pylori. Une fois les prélèvements positifs ou équivoques aux anticorps IgG H. pylori exclus, 2,8 % (3/105) étaient positifs aux anticorps IgA H. pylori (et négatifs aux anticorps IgG H. pylori). Cela permet d obtenir une spécificité de 97,1 % (102/105) [ 95 %CI= 91,9-99,4]. Caractéristiques Spécifiques de Performance La performance de l essai ELISA QUANTA Lite H. pylori IgA a été comparée à un ELISA IgA H. pylori commercial. 145 échantillons soumis au test des anticorps H. pylori, 8 EQAS (système d évaluation externe de la qualité) et 100 échantillons provenant d individus asymptomatiques et sains ont été testés avec les deux essais. Sur les 253 échantillons, 130 étaient positifs et 91 négatifs avec les deux méthodes. 5

6 Tableau 1 : ELISA IgA H. pylori essentiel + +/ QUANTA Lite % accord positif : 91,5% (130/142) ELISA IgA H. pylori +/ % accord négatif : 90,1% (91/101) Échantillons à l étude Un total de 111 échantillons de sérum archivés prélevés sur des patients infectés par le H. pylori justifiés par une combinaison d UBT, CLO, d histologie et/ou de méthodes de culture ont été testés avec le coffret Quanta life H. pylori IgA ELISA. Tableau 2 : Méthode de référence + QUANTA Lite ELISA IgA H. pylori / 8 3 Sensibilité (sans exclure les équivoques) = 90,1 % (100/111), [95 % CI =83,0 %-94,9 %] Étude de la réaction croisée Une étude d absorption a été réalisée pour évaluer la réaction croisée des antigènes bactériens avec l ELISA INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA. En bref, les sérums comportant différents niveaux d anticorps H. pylori ont été adsorbés avec des antigènes H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, ou E. coli et des échantillons de sérums traités et non traités ont été testés dans l essai IgA H. pylori. Tous les prélèvements séropositifs H. pylori sont restés séropositifs lorsqu ils ont été absorbés par d autres antigènes que les H. pylori. L inhibition moyenne en pourcentage était de 82 % avec l antigène H. pylori et de 10 % avec des antigènes dérivés d autres organismes. La réaction croisée comme résultat de la présence d anticorps anti-nucléaires (3 sérums), du facteur rhumatoïde (3 sérums, de bêta-2 microglobuline (3 sérums) ou d anticorps B. burgdorferi (11 sérums) a également été testée et révèle ne pas affecter la spécificité de l ELISA INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA. Interférences Pour déterminer si la présence de niveaux élevés de bilirubine, d hémoglobine, de cholestérol ou de triglycérides dans les échantillons de sérum interfère avec l ELISA QUANTA Lite TM H. pylori IgA, deux études ont été menées. Dans la première, 6 échantillons de sérum (4 positifs au H. pylori et 2 négatifs) ont été testés avec et sans l ajout de bilirubine (soit 40 fois le niveau normal) ou d hémoglobine (66 fois le niveau normal). Une deuxième étude qui consiste à ajouter un sérum H. pylori positif à un sérum à taux élevé en cholestérol (3), en triglycérides (1) ou en bilirubine (2). Même si aucun taux élevé de bilirubine, d hémoglobine ou de cholestérol n est apparu pour interférer avec l essai, de forts taux de triglycérides (un prélèvement) ont quant à eux provoqué des interférences. Reproductibilité/Précision La performance intra-essais a été évaluée en testant 12 fois 6 échantillons, en particulier un échantillon négatif, un équivoque, un faiblement positif, un légèrement positif et un autre fortement positif. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3. Tableau 3 : Performance intra-essais pour l ELISA QUANTA Lite TM H. pylori IgA Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Sérum 4 Sérum 5 Sérum 6 Moyenn 52, ,84 15,9 7,00 29,6 e S.D. 2,15 2,18 0,72 1,2 0,68 1,19 C.V.% 4,74 3,8 1,77 7,56 9,72 4,03 La performance inter-essais a été évaluée en testant 13 échantillons notamment des échantillons négatifs, faiblement positifs, légèrement positifs et fortement positifs, six fois sur trois jours, soit deux fois par jour, une le matin et une autre l après-midi. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Tableau 4 : Performance inter-essais pour l ELISA QUANTA Lite TM H. pylori IgA Sér 1 Sér 2 Sér 3 Sér 4 Sér 5 Sér 6 Sér 7 Sér 8 Sér 9 Sér 10 Sér 11 Sér 12 Sér 13 Moyenne 53,7 6,1 54, ,5 19,1 43,4 49,4 31,1 5,8 26,7 28,9 36,7 S.D. 1,25 0,25 3,8 3,94 1,65 0,87 1,46 1,97 1,53 0,35 1,38 2,48 2,51 C.V.% 2,3 4,1 6,9 7,4 9,5 4,6 3,4 4,0 4,9 6,0 5,2 8,6 6,9 6

7 Références 1. Marshall BJ: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii , Walsh JH and Peterson WL: The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): , Blaser MJ: Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: , The Eurogast Study Group. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA , Malfertheiner P, et.al.: Current European concept in the management of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2, Hirschl AM, et. al.: Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P: Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13, Patel P, et. al.: Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet. 346: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Internal quality Control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6), Kosunen T, et. al.: Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titers after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 339: , Megraud F, et. Al.: Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: , Veldhuyzen SJO, et. al.: Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:4347, Veenendaal RA: Long term serological surveillance after treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 32: , Jaskowski TD, et. al.: Immunoglobulin A antibodies to Helicobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 35(11): , Aromaa A, et. al.: Circulating Anti-Helicobacter pylori Immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen 1 level are associated with increased risk of gastric cancer. Am. J. Epidem. 144(2): , Granberg C, et. al.: Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by Using Pyloriset EIA-G and EIA-A for Detection of Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA Antibodies. J. Clin. Microbiol. 31(6): , Futagami S: Systemic and local immune responses against Helicobacter pylori urease in patient with chronic gastritis: distinct IgA and IgG productive sites. Gut 43: , Fabricant: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Représentant Autorisé: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service FRA November 2009 Revision 5 7