GDR IMOPHYS. Rapport d'activité Novembre 2003 Octobre 2007

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1 GDR IMOPHYS "Intégration de réponses MOléculaires et PHYSiologiques aux contaminants chimiques en milieu côtier" Rapport d'activité Novembre 2003 Octobre Novembre R.INT-DCN-BE/ /Nantes Université de Bordeaux Université du Havre Université de Brest LABORATOIRE D ECOTOXICOLOGIE BE/CN & LGP LA TREMBLADE UPRES-A-CNRS 5472 LEMA EA 3222 EQM Rennes

2 Rapport d activité du GDR IMOPHYS D écotoxicologie marine Novembre 2003 à Octobre 2007 Coordinateur : Thierry Burgeot Ifremer Département de Biogéochimie et écotoxicologie Nantes Rue de l Ile d Yeu, BP 21105, Nantes Coordinatrice adjointe : Hélène Budzinski ISM UMR CNRS 5255 Groupe LPTC Université Bordeaux crs de la Libération Talence - FRANCE Rapport rédigé en collaboration avec les membres du conseil de groupement et les responsables de thèmes du GDR IMOPHYS : M. Auffret, J. Laroche, T.Caquet, L. Lagadic, J. Cachot, C. Minier, F. Leboulenger, J. M. Danger, J. Forget-Leray, G. Bocquené Remerciements à tous les acteurs du GDR IMOPHYS répertoriés dans le tabbleau 1. Convention constitutive du GDR d écotoxicologie marine IMOPHYS : N/Ref : Contrat Ifremer n 05/ /N Rapport d'activité du GDR IMOPHYS octobre

3 Sommaire 1. Equipes participantes Introduction Organigramme Personnel et compétences Activités scientifiques et organisation Approche conceptuelle Sites ateliers et espèces modèles Démarche cognitive Programmes supports Transfert méthodologique Animation de la recherche Conseils de groupement Séminaires annuels Partenariat Collaborations internationales Collaborations nationales Thèses de Doctorat et accueil de Post Doctorants Production scientifique Publications Communications à des congrès Bilan Perspectives pour un nouveau GDR EXECO Etat de l art Objectifs Sites ateliers et études en mileu contrôlé Résultats attendus Partenariat Bibliographie Rapport d'activité du GDR IMOPHYS octobre

4 1. EQUIPES PARTICIPANTES Département Biogéochimie et écotoxicologie, Ifremer, rue de l Ile d Yeu, BP 21105, Nantes Cedex Fax Ifremer BP 70, Plouzané, Fax Laboratoire de Génétique et Pathologie, Ifremer BP La Tremblade Fax LEMA, Laboratoire d Ecotoxicologie-Milieu Aquatique, UPRES-EA 3222, IFRMP 23, Université du Havre, 25 rue P. Lebon, BP , Le Havre Cedex. LEMA EA Fax LPTC, Laboratoire de Physico-et-Chimie des systèmes naturels, ISM-UMR CNRS Université Bordeaux Fax Laboratoire des Sciences de l Environnement Marin LEMAR, UMR CNRS 6539 Université de Bretagne Occidentale, Technopôle Brest-Iroise, Plouzané Fax: Équipe Écotoxicologie et Qualité des Milieux aquatiques UMR 985 INRA-Agrocampus Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux 65 rue de Saint Brieuc - CS Rennes Cedex 4

5 2. INTRODUCTION La convention constitutive du GDR IMOPHYS a été rédigée en novembre 2003 et les crédits ont été affectés aux différentes équipes partenaires en juin Fondé sur l association d un nombre restreint d équipes universitaires, du CNRS et de l Ifremer, puis ultérieurement de l Inra, le GDR IMOPHYS avait pour objectif d impulser une dynamique de recherche et de fédérer une communauté nationale sur un sujet d écotoxicologie ciblé. Le GDR s est intéressé au défi de changement d échelle visant a évaluer les effets biologiques des contaminants chimiques à partir des interactions moléculaires jusqu aux perturbations physiologiques au sein des individus issus de populations naturelles (site web, /Imophys). Un projet de recherche cognitive couplée à une recherche finalisée a permis de mettre en œuvre une démarche unique en France qui a débouché sur des recommandations dans le domaine de la surveillance des effets biologiques des contaminants chimiques en milieu estuarien. Une production scientifique conséquente grâce à l encadrement de thèses a permis l acquisition de connaissances spécifiques à la dynamique et aux effets des contaminants en milieu estuarien. Les activités de recherche développées ont été construites sur la base d une solide expérience du groupe pour l évaluation du stress environnemental. Ce socle de compétences a permis d aborder un sujet original reposant sur l étude des mécanismes de toxicité en utilisant des approches moléculaires (génomique, protéomique) replacées au sein d une démarche démo-écologique (Snape et al., 2004). Le GDR a intégré l équipe d écotoxicologie aquatique de l Inra de Rennes à la fin de l année Cette intégration a renforcé la composante écologique de nos recherches. Les premiers travaux ont été initiés à l échelle du continuum écologique entre eau douce et eau marine. Deux volets structuraient les travaux du GDR IMOPHYS : 1)-Démarche cognitive : a) Impulser une dynamique de recherche pluridisciplinaire sur deux estuaires pilotes pour répondre à la question : «Quelles sont les conséquences sur les populations, des transformations moléculaires et des perturbations cellulaires induites par un stress chimique chronique?». Deux thématiques de recherche ont été développées pour répondre à la question posées (Fig 1) : - Etude des altérations des structures moléculaires ciblées sur une évaluation des effets génotoxiques et sur la modulation de l expression génique et du polymorphisme génétique - Etude des perturbations fonctionnelles des systèmes immunitaires et endocriniens ainsi que du comportement natatoire. - b) Développer une approche intégrée sur des estuaires pilotes (principalement les estuaires de la Seine et de la Vilaine).. 2)- Transfert méthodologique : Fédérer un groupe de recherche venant en appui de l évaluation du risque chimique et de la surveillance des écosystèmes marins, afin de positionner l écotoxicologie française au sein des enjeux de la préservation durable des ressources et de l environnement. 5

6 Stress environnemental Modification structure primaire & performances des populations - Génotoxicité - Expression génique et polymorphisme génétique Perturbations fonctionnelles & performances des populations - Immunotoxicité - Neurotoxicité - Perturbations endocriniennes Approche intégrée Sites ateliers : estuaires de la Seine et de la Vilaine Modélisation Application Biosurveillance Risque chimique Figure 1 : Schéma d organisation du GDR sur la base de trois volet 1) recherche, 2) approche intégrée et 3) Application : transfert méthodologique. 3. ORGANIGRAMME L organigramme a été modifié lors du conseil de groupement qui s est tenu à Bordeaux en juillet Hélène Budzinski, responsable du LPTC de Bordeaux, a été nommée coordinatrice adjointe en remplacement de Philippe Garrigues. L implication active du laboratoire Ecotoxicologie et qualité des milieux aquatiques de l Inra, a été confirmée par la nomination de Laurent Lagadic et Thierry Caquet comme membres du conseil de groupement. Thierry Caquet a été nommé responsable d action thématique en Vilaine en remplacement de Gilles Bocquené (décision du conseil de groupement en juillet 2005). L Inra a entériné son intérêt pour le GDR IMOPHYS en accordant un crédit de fonctionnement de 6 K en Coordination Thierry Burgeot Ifremer BE/CN Adjointe Hélène Budzinski LPTC Bordeaux Comité d experts extérieurs - Dr. L. Tremblay, Landcare Research, Nouvelle Zélande -Prof.M.Fournier, INRS-IAF Montréal, Canada -Prof L. Gauthier, Université P. Sabatier, Toulouse Responsables thématiques Génotoxicité, modulation de l expression génique et polymorphisme génétique: J. Cachot, J. Laroche & J. M. Danger Perturbations fonctionnelles Immunotoxicité : M. Auffret Neurotoxicité : J. Forget Perturbations endocriniennes: C. Minier Comité de groupement Prof. Jean Michel Danger, LEMA Le Havre Prof. Christophe Minier, LEMA Le Havre Prof. Jérome Cachot, LPTC Bordeaux Prof. Jean Laroche, LEMAR Brest Dr. Michel Auffret, LEMAR Brest Dr.Hélène Budzinski, LPTC Bordeaux Prof. FrançoisLeboulenger, LEMA Le Havre Dr. Thierry Burgeot, Ifremer BE/CN Dr. L. Lagadic, Inra Rennes Dr. T. Caquet, Inra Rennes Responsables d actions intégrées Estuaire de Seine: J.Cachot Estuaire de la Vilaine: T. Caquet Estuaire de la Gironde: J. Laroche 6

7 4. PERSONNEL IMPLIQUE DANS LE GDR ET COMPETENCES Affectation du Laboratoire Nom Statut Compétences Université de Brest LEMAR MT. Thébault M. Auffret J. Laroche D. Moraga L. Quiniou A. Marhic A. Tanguy I. Boutet G.Charrier J. Marchand E. David M. Duchemin Prof MCF-HDR MCF-HDR MCF-HDR IE HDR AI Post-Doc Doctorante Doctorant Doctorante Doctorante Doctorant Biochimie Immunotoxicologie Génétique des populations Génétique moléculaire Ecophysiologie/génétique Biologie/bactériologie Génétique moléculaire Génétique moléculaire Génétique des populations Génétique/génotoxicité Génétique moléculaire Immonotoxicologie Université du Havre LEMA F. Leboulenger JM. Danger C. Minier J. Cachot J. Leray-Forget B. Rocher F. Durand C. Galap F. Le Foll S. Lacroix A. Poret T. Monsijon F. Bultelle A. Siah H. Manduzio J. Couteau X. Denier M. Marin B. Loup P. Maltret D. Masson T. Knigge Prof Prof Prof MCF MCF MCF MCF MCF MCF IE Technicienne MCF MCF Post-doc ATER Doctorant Doctorant Doctorant Doctorant Doctorante Doctorant Post Doc Ecophysiologie/Endocrinologie Génétique moléculaire Ecotoxicologie Ecogénotoxicité Ecotoxicologie Biochimie/protéomique Ecophysiologie Ecotoxicologie Electrophysiologie moléculaire Biochimie/protéomique Biochimie/culture cellulaire Génétique moléculaire/biochimie Physiologie cellulaire Génétique moléculaire Génétique moléculaire Biochimie/protéomique Génétique moléculaire Ecotoxicologie Ecotoxicologie Ecotoxicologie /Electrophysiologie Ecotoxicologie Perturbations endocriniennes Université de Bordeaux LPTC H. Budzinski P. Garrigues B. Morin B. Davail JF. Narbonne M. Daubèze K. Le Menach S. Augagneur O. Mazéas A. Togola K. Cailleaud (co/dir LEMA) P. Labadie N. Aarab O. Champeau S. Lardy DR DR MCF MCF Prof IE AI IE Doctorant Doctorante Doctorant Doctorant Doctorante Doctorant Doctorant Chimie de l environnement Chimie de l environnement Ecotoxicologie Ecophysiologie/endocrinologie Toxicologie/biochimie Toxicologie Chimie analytique( GC/MS) Chimie analytique( GC/MS) Métabolites HAP Substances pharmaceutiques Perturbations fonctionnelles Chimie des stéroïdes Toxicologie des stéroïdes Ecotoxicologie Perturbateurs endocriniens 7

8 M. Le Du A. Crespo N. Bodin N. Tapie J. Justyna J. Iordache P. Pardon A.L. Scolo L. Peluhet Doctorante Doctorante Doctorante Post Doc Doctorante Doctorant IR Doctorante Technicienne Métabolisation HAP Devenir HAP Bioaccumulation-transfert trophique Chimie et régime alimentaire Métabolisation HAP Chimie sub. pharmaceutiques Chimie analytique(lc/ms) Perturbateurs endocriniens Ecotoxicologie Ifremer Biogéochimie & Ecotoxicologie T.Burgeot F. Akcha D.Menard F. Geret F. Quiniou X. Caizey S. Rousseau E. Farcy V. Loizeau A.M. Leguellec CR CR Technicien Post-doc CR Technicien Technicienne Post Doc CR Technicienne Ecotoxicologie-écophysiologie Ecogénotoxicité-génotoxicité Ecotoxicologie-génotoxicité Ecotoxicologie-stress oxydatif Ecotoxicologie-bioessais Ecotoxicologie-bioessais Ecotoxicologie Ecotoxicologie Bioaccumulation Bioaccumulation Ifremer cellule ARC (risque chimique) G.Bocquené A. James I. Guérit CR IE Ineris Doctorante Ecotoxicologie & Risque chimique Risque chimique Risque chimique Ifremer de La Tremblade LGP T. Renault S. Lapègue B. Gagnaire (Co/dir écotox Nantes) CR CR Doctorante Immunologiste/Pathologiste Ecogénotoxicité Immunologie/écotoxicologie Écotoxicologie et Qualité des Milieux aquatiques L. Lagadic T. Caquet M.-A. Coutellec V. Ducrot C. Gorzerino M. Heydorff M. Roucaute P. Le Goff DR2 CR1 CR1 CR2 AI TR TR TR contractuel Ecotoxicologie et écophysiologie Ecotoxicologie des communautés Ecotoxicologie évolutive Démo-écotoxicologie Ecotoxicologie phytoplancton Biochimie toxicologique Ecotoxicologie invertébrés Ecotoxicologie invertébrés Tableau 1 : Personnel impliqué dans chaque unité et compétences spécifiques des 82 personnes du GDR. 8

9 5. ACTIVITES SCIENTIFIQUES «Quelles sont les conséquences sur les populations, des transformations moléculaires et des perturbations cellulaires après un stress chimique chronique?» 5.1. Approche conceptuelle La force intégrative du groupe de recherche repose tout d abord, sur l étude de la biodisponibilité et des effets biologiques des contaminants chimiques au niveau moléculaire en milieu estuarien. L originalité de la démarche s appuie sur l étude mécaniste au niveau moléculaire en lien avec la modification des performances des populations dans leur habitat naturel (Fig 2). Deux thématiques sont développées pour relever le défi d échelle entre des réponses précoces mesurées au niveau moléculaire et des effets à plus long terme sur les performances des individus au sein des populations. La première thématique repose sur le développement de techniques moléculaires et chimiques (génomique et protéomique) pour évaluer l impact des contaminants sur la structure de l ADN (génotoxicité, et modulation de l expression génique). La seconde thématique est focalisée sur les perturbations fonctionnelles résultant d une assimilation des contaminants chimiques (biotransformation, immunotoxicité, perturbations endocriniennes). La spécificité du GDR porte sur des recherches focalisées sur la zone estuarienne. Une stratégie de comparaison intra- et inter-sites est ainsi développée en combinant l acquisition de données sur le terrain et des expérimentations complémentaires visant à caractériser les réponses spécifiques des organismes-modèles. Ecodynamique des contaminants Matière organique dissoute Assmilation Matière organique Polluant particulaire chimique Elimination Sédiment Biodisponibilité Organisme Ecotoxicologie Toxicité Récepteurs ADN Toxicité membranaire Perturbation homoéostasie Inhibition/activation enzymatique Effets Bioaccumulation moléculaires Performances Croissance Reproduction fertilité Mutagénicité Cancérogénicité Adaptation Survie Effets populations Figure 2 : Devenir des contaminants (biodisponibilité) et effets biologiques de l individu (Bioaccumulation, biotransformation et effets moléculaires) jusqu aux populations (modification des performances) (d après Fent 2004). Les actions de recherche menées au sein du GDR sont articulées suivant l étude du devenir des contaminants dans le milieu aquatique puis son assimilation par les organismes qui bioaccumulent et qui biotransforment les contaminants. Le transfert du contaminant à partir du milieu aquatique vers l organisme repose sur le tryptique «biodisponibilité, bioaccumulation et biotransformation». Le contaminant alors biotransformé provoque des effets d abord évalués au niveau moléculaire puis au niveau des performances physiologiques populations. Le schéma conceptuel de Fent 2004 illustre le lien entre des effets précoces mesurés au niveau moléculaire et des effets à plus long terme sur les grandes fonctions physiologiques. Ce concept a été adopté par le GDR IMOPHYS. 9

10 5.2. Sites ateliers et espèces modèles Sites ateliers Trois estuaires macrotidaux de la façade atlantique française ont été retenus dans l objectif d étudier l impact biologique intra-site d une contaminantion chimique issue du bassin versant ou bien de comparer les réponses biologiques de quelques espèces modèles vivant sur des estuaires de typologie spécifique (Fig 3). - L estuaire de la Seine a été sélectionné car il figure parmi les estuaires les plus contaminés d Europe et parce qu il bénéficie d un niveau de connaissance accru grâce au programme Seine Aval créé en 1995 pour «fournir les connaissances nécessaires à la compréhension du fonctionnement de l écosystème estuarien» (Lafite et al., 2001). La forte contamination chimique par des composés organiques promoteurs de tumeurs (PCB) et des composés mutagènes (HAP) constitue la base du questionnement sur le risque d effets biologiques. - L estuaire de la Vilaine, représente le plus vaste bassin versant de Bretagne, caractérisé par des activités agricoles intenses et diversifiées. La contamination chimique de l estuaire de la Vilaine est essentiellement liée à la présence de pesticides. Un suivi de la qualité des eaux de la Vilaine dans la retenue d eau du barrage d Arzal montre une élévation constante du niveau de diuron entre 1999 et 2003 (données de l'usine d'eau du Drézet, 2005). - L estuaire de la Gironde est caractérisé par une contamination diffuse avec cependant, une forte contribution des métaux lourds (Masson et al., 2006) Espèces modèles Les espèces modèles ont été sélectionnées en fonction de leur distribution dans trois sites ateliers ainsi que sur la base des connaissances physiologiques et écotoxicologiques déjà acquises. - Les poissons benthiques ont été choisis pour leur vie en contact avec le sédiment contaminé. Le flet Platichthys flesus est le principal modèle retenu pour les études de terrain car il est le plus largement réparti dans les trois estuaires. Le turbot Scophthalmus maximus, la truite Oncorhynchus mykiss et le medaka japonais Oryzias latipes ont également été étudiés en conditions contrôlées comme espèces complémentaires pour la caractérisation de certains mécanismes moléculaires d activation induits à différents niveaux d organisation biologique. - Les mollusques bivalves comptent parmi les espèces modèles les plus utilisées en écotoxicologie. La moule Mytilus edulis et l huître Crassostrea gigas présentent l avantage d être sessiles et faciles à collecter. L étude des bivalves est également réalisable sur le terrain et en conditions contrôlées. La connaissance des mécanismes d adaptation au stress chimique de bivalves répond à des préoccupations à la fois environnementales et aquacoles. - Le copépode Eurytemora affinis a été sélectionné car il est représentatif d espèces estuariennes vivant dans le bouchon vaseux. Son cycle de vie court et sa petite taille favorisent des études allant de l individu à la population. 10

11 Estuaire de Seine Estuaire de Vilaine Estuaire de Gironde Figure 3 : Sites ateliers sélectionnés sur la façade atlantique française Démarche cognitive Effets génotoxiques, modulation de l expression génique et du polymorphisme génétique Responsables de thème J. Cachot, J. Laroche et J.M Danger Contribution des équipes du GDR : Cachot J., Danger J.M., Bultelle F., Durand F., Vince E., Letendre J., Loup B., Masson R., Siah A. & Leboulenger F., LEMA, Université du Havre, EA-3222, 25 rue Philippe Lebon, BP, 540, Le Havre cedex Budzinski H., Le Menach K., Peluhet L., Morin B., Mazéas O., Le Du M., ISM-LPTC CNRS UMR (ex UMR 5472 CNRS), Université Bordeaux I, 351 cours de la libération, Talence Laroche J., Marchand J., Evrard E., Quiniou L., Moraga D., David E., Boutet I., Laboratoire LEMAR, UMR CNRS 6539, Université de Bretagne Occidentale Place Copernic, Plouzané Akcha F., Burgeot T., Ménard D., Rousseau S., IFREMER Nantes, rue de l Ile d Yeu, BP 21105, Nantes Cedex Introduction Ce volet d étude s intéresse à l étude des dommages induits par des composés chimiques sur des populations naturelles de poissons benthiques (flets, limandes, soles), bivalves (huîtres, moules, scrobiculaires, dreissènes) et copépodes (eurythémora). Une étude mécanistique des réponses moléculaires à la présence de contaminants chimiques est réalisée sur des espèces de même phylum maintenues en aquarium (truite, turbot, médaka) pour suppléer la méconnaissance des mécanismes sur les espèces sauvages. La sélection de différents modèles biologiques est inévitable car d une part les réponses moléculaires varient suivant les espèces et leur habitat et d autre part, certaines espèces ne 11

12 peuvent être étudiées en conditions contrôlées, ce qui nécessite d étudier des espèces du même phylum mieux adaptées aux études en aquarium. Les dommages observés incluent des effets directs tels que les modifications de la structure de l ADN ou de l expression des gènes mais également des effets indirects tels que la sélection de génotypes résistants. Ces recherches s appuient d une part sur les concepts et outils développés en écogénotoxicologie et écotoxicogénomique et d autre part ceux utilisés en génétique des populations. Les objectifs de l écogénotoxicologie étaient de : - Mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la génotoxicité des contaminants organiques et métalliques chez des espèces sentinelles telles que des poissons plats (flet et limande) et des bivalves (moule, huître et dreissène) - Développer et valider de nouveaux outils pour l évaluation du risque génotoxique associé aux polluants persistants - Identifier les facteurs de risques environnementaux associés aux effets génotoxiques observés au niveau d un nombre limité de sites pilotes incluant notamment l estuaire de Seine. Les objectifs de l écotoxicogénomique visaient principalement à identifier des acteurs moléculaires de réponses au stress chez une espèce de poisson (Plathicthys flesus) et quatre espèces de bivalves (Crassostrea gigas, Mytilus edulis, Dreissena polymorpha et Mya arenaria). C est travaux ont permis : - D identifier les gènes différentiellement régulés en réponse aux pesticides, aux hydrocarbures ou à l hypoxie et construire des banques dites soustractives. - De réaliser des macro-puces à ADN à partir de Mytilus edulis et Dreissena polymorpha exposées aux effets des contaminants et aux effets tidaux. Les objectifs de type génétique de populations menés sur les modèles poissons et bivalves étaient : - De caractériser le polymorphisme de gènes candidats impliqués dans la réponse au stress chimique (métabolisme énergétique, détoxication, ), - D identifier le polymorphisme génétique de différentes populations estuariennes plus ou moins contaminées. - D évaluer l évolution des fréquences alléliques étudiées parallèlement à la nature et à l intensité du stress chimique dans ces populations. - De détecter des liens entre la variabilité génétique et certaines composantes de la fitness à l aide de couplages génotypes-phénotypes afin d émettre des hypothèses sur les caractères possibles de «résistance» voire de «sensibilité» de certains génotypes vis à vis des xénobiotiques Caractérisation du potentiel génotoxique des sédiments de l estuaire de Seine et identification des composés chimiques impliqués par une approche TIE (Toxicity Identification Evaluation) Deux campagnes de prélèvements de sédiments ont été réalisées en juin 2001 et juin 2003 au niveau 10 stations de l estuaire et de la baie de Seine. Ces sédiments ont été caractérisés d un point de vue chimique et toxicologique. Cette étude a permis de montrer que les sédiments de la partie amont de l estuaire renferment des teneurs élevées en hydrocarbures aromatiques polycycliques (jusqu à ng/g sec) dont une fraction importante est constituée par des composés potentiellement génotoxiques (jusqu à 82%). L utilisation d un test de génotoxicité in vitro, le SOS Chromotest a permis de démontrer que seuls les extraits organiques préparés à partir des sédiments collectés dans l estuaire de Seine présentent une activité génotoxique (Fig 4). Cette activité n est révélée qu en 12

13 présence d une fraction microsomale S9, ce qui exclu a priori la présence de génotoxiques directs mais suggère en revanche la présence de pro-génotoxiques. Facteur d'induction SOS estuaire baie baie Yville Oissel La Bouille I La Bouille II La Bouille III Caudebec Villerville Le Havre Antifer Le Moulard Figure 4 : Potentiel génotoxique d extraits organiques de sédiments collectés en juin 2003 dans l estuaire et la baie de Seine. Yville et le Moulard sont des sites de référence non pollués. Ces mesures ont été réalisées au moyen du SOS Chromotest après ajout d une fraction microsomale S9. Les analyses ont été réalisées à partir d une quantité d extrait équivalente à 0,7 g de sédiment par essai. Les valeurs indiquées correspondent à la valeur moyenne de trois analyses +/- l écart-type. Les traits pleins et pointillés indiquent les valeurs seuil de facteur d induction. Les sites clairement ou plus modérément génotoxiques sont indiqués en noir ou en gris respectivement. Un des sédiments a fait l objet d un fractionnement plus fin en utilisant des solvants organiques de polarités différentes. Le potentiel génotoxique ainsi que la composition chimique de chaque sousfraction a été déterminée faisant apparaître très clairement que la sous-fraction contenant les HAP est de loin la plus génotoxique (Fig 5). Une seconde sous-fraction contenant des composés polaires encore non identifiés apparaît également génotoxique (Cachot et al., 2006). Facteur d'induction fraction brute fraction polaire fraction aliphatique alcanes HAPs composés polaires 0 Al-F1 Al-F1 blanc Al-F2 Al-F2 blanc Al-F3 Al-F3 blanc Si-F4 Si-F4 blanc Si-F5 Si-F5 blanc Si-F6 Si-F6 blanc Fractions organiques Figure 5 : Potentiel génotoxique de différentes fractions organiques d un même sédiment collecté à La Bouille (estuaire de Seine amont) en juin Ces mesures ont été réalisées au moyen du SOS Chromotest après ajout d une fraction microsomale S9. Les analyses ont été réalisées à partir d une quantité d extrait équivalente à 1 g de sédiment sec par essai. Les valeurs indiquées correspondent à la valeur moyenne de trois analyses +/- l écarttype. Les traits plein et pointillé indiquent les valeurs seuil de facteur d induction. Les sites clairement ou plus modérément génotoxiques sont indiqués en noir ou en gris respectivement. 13

14 Etude des phénomènes de bioaccumulation/biotransformation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) par les organismes aquatiques (poissons); Relation exposition-génotoxicité Deux projets complémentaires ont été conduits sur le thème des relations exposition et génotixicité. 1- Ce projet a pour objectif d étudier les phénomènes de biodisponibilité, de bioaccumulation et de biotransformation des HAP chez des poissons marins par le dosage des métabolites biliaires chez la limande et le turbot. Il se propose également d étudier in situ chez la limande de la Baie de Seine la relation entre (1) la présence de HAP dans le milieu marin, (2) l absorption et la biotransformation des HAP par les poissons et (3) l expression d effets génotoxiques. Axé exclusivement sur les HAP, ce projet permet notamment d étudier le profil de bioaccumulation et biotransformation des HAP dans les muscles de turbots exposés pendant 10 jours à un mélange de 9 HAP parents (phénanthrène, fluoranthène, pyrène, anthracène, benzo(a)anthracène, chrysène, benzo(a)pyrène, benzo(e)pyrène, 2-methylchrysène) à des concentrations de l ordre de la dizaine de ng/l. La cinétique de bioaccumulation montre une concentration de l ordre de 550 ng/g de muscles 12 à 24 heures après exposition. A partir du 3 ème jour s engage une biotransformation rapide pour redescendre à des concentration de l ordre de 10 ng/g de muscle le 10 ème jour. La mesure des HAP hydroxylés dans la bile de turbots permet de dresser plus précisément le devenir des HAP après biotransformation. La méthode de dosage développée permet de doser la totalité des métabolites recherchés avec une limite de détection de 0,5 à 6 ng/g de bile. Le 1-hydroxypyrène (1OHP) est un bon indicateur d'exposition aux HAP en raison du mécanisme de biotransformation simple et rapide du pyrène (12 heures suffisent pour observer la contamination) et de son excrétion rapide dans la vésicule biliaire. La contribution du 1-OHP est relativement constante chez le turbot, suivant le sexe et l âge (15%) excepté chez les mâles adultes les plus exposés (46%). Les dommages oxydatifs provoqués par l exposition à l ADN ont été évalués par mesure de bases oxydées. Les premiers résultats originaux de bases oxydées (8-oxodG ) représentatives du stress oxydatif évalués chez le turbot et la limande révèlent un taux normal de 10 lésions pour 10 6 bases normales. Ce projet permet également d évaluer de façon beaucoup plus précise le niveau d exposition des limandes aux HAP dans leur habitat naturel via la mesure de leurs métabolites biliaires. Il devra permettre de confirmer ou non un rôle pour les HAP dans la formation de dommages à l ADN des limandes Limanda limanda de la baie de Seine (adduits, cassures de brins). L implication de cette classe de contaminants chimiques dans les lésions génotoxiques mesurées n avait en effet pu être démontrée lors du précédent projet. Le dosage chimique des composés parentaux dans les différents tissus de la limande n avait pas permis de déterminer le niveau d exposition aux HAP des individus analysés. En 2005 et 2006, deux campagnes d échantillonnage ont été réalisées en baie de Seine au mois de mars et septembre. Les résultats obtenus ont confirmé un effet significatif de l âge et du sexe de la limande sur le niveau de dommage à l ADN ainsi qu une interaction entre ces deux facteurs. Au laboratoire, des turbots ont également été exposés aux HAP par la voie sédimentaire, par du pétrole ainsi que par un mélange de HAP dans la phase dissoute. Pour chaque mode d exposition, un effet génotoxique a été observé à l issue du 4 ème jour d exposition. A l issue d une période d élimination de 6 jours, une réparation des dommages à l ADN a été observée pour les poissons exposés au mélange de HAP et au sédiment contaminé. Chez ces poissons, l absorption et la biotransformation des HAP a été parallèlement suivi par le dosage des métabolites biliaires. Les mesures de génotoxicité par le test des comètes et les résultats du dosage des métabolites biliaires de HAP seront prochainement analysés de façon conjointe de manière à étudier la relation exposition/effets. 2-. Ce projet porte sur la Détermination des voies de bioactivation des hydrocarbures aromatiques polycycliques chez la sole (Solea solea) et l étude du profil métabolique et de 14

15 génotoxicité. Les travaux de recherches sont proposés dans le cadre d une thèse Ifremer ( N. Wessel) menée en collaboration avec le LPTC de l Université de Bordeaux 1 et l Unité Xénobiotiques de l INRA de Toulouse (UMR 1089). Les objectifs de cette thèse visent une meilleure connaissance des voies d activation des HAP chez les poissons marins en identifiant notamment les métabolites réactifs pour le matériel génétique. Ils viendront compléter les recherches du laboratoire réalisées en aval sur l étude des effets génotoxiques des HAP et leurs conséquences sur la dynamique des populations exposées. L identification structurale des adduits à l ADN devrait permettre le développement d adduits HAP standards. La mise à disposition de ces standards permettrait de déterminer de façon non équivoque l implication des HAP dans les effets génotoxiques mesurés in situ chez les organismes sentinelles du milieu marin. Cet outil de diagnostic pourrait ainsi être utilisé en biosurveillance en tant que marqueur spécifique d exposition et d effets des HAP. Sur la base des travaux déjà réalisés au sein de l Ifremer sur la bioaccumulation des contaminants chimiques chez le merlu et la moule, il sera possible d utiliser les données toxicocinétiques obtenues pour développer chez la sole un modèle Bilan d Energie Dynamique (DEB) en y intégrant un volet contaminant. L identification des métabolites génotoxiques permettra par la suite d augmenter le degré de complexité de ce modèle en y ajoutant une variable «effet» et de le faire évoluer ainsi vers un modèle de type DEB-TOX (au sein du programme Solebemole) Caractérisation des effets des HAPs sur un poisson modèle, le medaka japonais Impact biologique d un sédiment contaminé par un mélange d HAP sur les embryons du médaka japonais Oryzias latipes Une première série d expériences a été conduite sur des embryons de la lignée transgénique Lambda cii du médaka japonais, Oryzias latipes. Cette étude avait pour objectifs de simuler les conditions d exposition des embryons de poissons se développant au contact direct du sédiment dans l estuaire de Seine puis de caractériser les effets induits à différents niveaux d organisation biologique. Les embryons ont été exposés pendant 10 jours à des sédiments artificiellement contaminés avec soit le solvant DMSO seul, soit avec un HAP modèle le benzo[a]pyrène (B[a]P) à 30 ppm soit avec trois concentrations différentes (0,3X 1X ou 2X) d un extrait organique de sédiment collecté dans la partie amont de l estuaire de Seine (Oissel juin 2004). La mortalité, les anomalies de développement, la croissance ainsi que les pathologies externes ont été suivies pendant 8 mois après exposition. Par ailleurs, les mutations somatiques induites au locus cii ont été déterminées dans le foie des juvéniles âgés de dix semaines. Ces travaux ont fait apparaître que Le B[a]P à des concentrations élevées n a pas d effet sur la survie à court ou moyen terme des médakas (Fig 6 et 7 ni sur l apparition de malformations squelettiques (Fig 8)). En revanche ce composé augmente de façon significative (x1,6) le taux des mutations induites dans le foie des poissons juvéniles par rapport aux poissons contrôle (Fig 9) et conduit au développement de tumeurs hépatiques (1/25). L extrait organique de sédiment aux concentrations environnementales (1X) augmente significativement la mortalité des juvéniles (x 2,5 ; Fig 7) ainsi que l incidence des malformations squelettiques (+6,4% ; Fig 8) et les mutations hépatiques induites au locus cii (x1,9 ; Fig 9) par rapport au traitement DMSO seul. Ce même traitement conduit au développement de lésions pré-tumorales hépatiques (1/24) et de tumeurs gonadiques (1/24). Ce même extrait de sédiment à une concentration 2 fois supérieure (2X), augmente significativement la mortalité embryonnaire (x5,7) et post-embryonnaire (x5,0), la durée de développement embryonnaire (+1,5 j) et le taux de mutations dans le foie des juvéniles (x2,0) par rapport au traitement DMSO seul. Le spectre des mutations induites par cet extrait organique correspond majoritairement à la signature moléculaire des HAP (Transversions au niveau de sites G:C). Il apparaît clairement qu il existe un risque écologique réel associé aux polluants organiques et 15

16 notamment aux HAP présents dans les sédiments de l estuaire de Seine vis à vis notamment des espèces piscicoles dont tout ou partie du développement embryonnaire se déroule au contact du compartiment sédimentaire. Mortalité embryonnaire (%) * 0 Pas de sédiment Sédiment seul DMSO B[a]P 30ppm Extrait organique 0,3X Extrait organique 1X Extrait organique 2X Figure 6 : Mortalités cumulées des embryons de médaka après exposition à des sédiments contaminés. Les poissons ont été exposés pendant 10 jours au stade embryonnaire à un sédiment de référence amendé avec soit le solvant DMSO, soit avec 30 ppm de B[a]P soit encore trois concentrations différentes d extrait organique de sédiment de Seine. La mortalité cumulée a été calculée sur 17 jours. Les valeurs indiquées correspondent aux moyennes ± écarts-types calculées pour trois réplicats. Une astérisque indique des différences significatives par rapport au témoin DMSO au risque de 5%. Mortalité des juvéniles (%) * * * 0 sédiment seul DMSO B[a]P 30ppm Extrait organique 0,3X Extrait organique 1X Extrait organique 2X Figure 7 : Mortalités cumulées juvéniles de médaka après exposition des embryons à des sédiments contaminés. Les poissons ont été exposés pendant 10 jours au stade embryonnaire à un sédiment de référence amendé avec soit le solvant DMSO, soit avec 30 ppm de B[a]P soit encore trois concentrations différentes d extrait organique de sédiment de Seine. La mortalité cumulée a été calculée au cours des trois premiers mois. Les valeurs indiquées correspondent aux moyennes ± écarts-types. calculées pour trois réplicats. Une astérisque indique des différences significatives par rapport au témoin DMSO au risque de 5%. 16

17 Déformations squelettiques (%) /55 0/66 0/64 1/54 * 3/47 2/13 Sédiment seul DMSO B(a)P 30ppm Extrait organique 0,3X Extrait organique 1X Extrait organique 2X Figure 8 : Fréquence des déformations de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de dix semaines. exposés pendant 10 jours au stade embryonnaire à un sédiment de référence amendé avec le solvant DMSO, 30 ppm de B[a]P ou encore trois concentrations différentes d extrait organique de sédiment de Seine. Fréquence de mutations (x 10-5 ) Sédiment seul DMSO B[a]P 30ppm Extrait organique 0,3X * Extrait organique 1X Extrait organique 2X Figure 9 : Fréquence de mutations du gène cii dans le foie de médakas âgés de 10 semaines. Les poissons ont été exposés pendant 10 jours au stade embryonnaire à un sédiment de référence amendé avec soit le solvant DMSO, soit 100 ppm de B[a]P soit encore trois concentrations différentes d extrait organique de sédiment de Seine. Les valeurs indiquées correspondent aux moyennes ± écarts-types. calculées pour trois réplicats. Une astérisque indique des différences significatives par rapport au témoin DMSO au risque de 5% Transfert trophique et effets biologiques des HAP Une deuxième série d expériences a été conduite afin d étudier le transfert trophique et les effets biologiques induits à différents niveaux d organisation biologique par les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs). Dans ce but une chaîne trophique simplifiée comprenant un microcrustacé, Artémia salina (artémies) et un poisson modèle, le médaka japonais Oryzias latipes a été reconstituée en laboratoire. Les juvéniles de médaka ont été nourris pendant un mois avec des nauplii d rtemia. 17

18 salina exposés à différentes doses de benzo[a]pyrène (0,005 à 5 µg/ml) ou à un extrait organique (0,005 à 0,5%) préparé à partir d un sédiment prélevé à Oissel en juin A la suite de cette exposition, les poissons ont été placés en eau propre, nourris à base de nauplii non contaminés et examinés quotidiennement pendant huit mois. Des prélèvements biologiques ont été réalisés au bout d un mois (T0+1mois), 3 mois (T0+3mois) et en fin d expérimentation (T0+9mois). Les HAPs et PCBs ont été dosés dans l eau, les tissus des artémies et des médakas. Les macro-adduits à l ADN, les adduits d oxydation (8-oxodG) les mutations au locus cii ont été dosés dans le foie des médakas à T0+1mois et/ou T0+3mois. Enfin un examen histopathologique approfondi des médakas a été réalisé à T0+9mois afin de déterminer la localisation tissulaire, le stade et la fréquence des tumeurs induites. Les premières données obtenues font apparaître que les nauplii d A. salina exposés au B[a]P accumulent des quantités très élevées de ce composé qui peuvent aller jusqu à plusieurs centaines de milliers de ng/g (plus de ng/g sec). Ces mêmes nauplii exposés à l extrait organique de sédiment de Seine accumulent des quantités très élevées de HAPs (jusqu à ng/g sec) et dans une moindre mesure des PCBs (jusqu à 890 ng/g sec). Malgré ces très forts niveaux de HAPs, aucun accroissement de mortalité n a été observé parmi les artémies exposées au B[a]P ou à l extrait organique de sédiment. L alimentation des juvéniles de médaka à base de nauplii d artémies contaminées en HAPs ne conduit pas à un accroissement de la mortalité des poissons. Par ailleurs, il apparaît clairement que seule une concentration très élevée de B[a]P (5 µg/ml) conduit à une augmentation significative du taux d adduits à l ADN (Données non présentées) et de la fréquence de mutations cii dans le foie des poissons exposés par rapport aux poissons contrôle (Fig 10A). Le taux de 8-oxodG dans ce même tissu augmente significativement avec la dose de B[a]P (Données non présentées). L accroissement est significatif dès la plus faible concentration en B[a]P testée (0,005 µg/ml). Les deux doses les plus fortes d extrait organique de sédiment (0,05 et 0,5%) conduisent à un accroissement mais non significatif du taux d adduits et à une augmentation faible mais significative de la fréquence de mutations dans le foie des poissons (Fig 10B). Le spectre des mutations induites par l extrait organique de sédiment se caractérise par un très net accroissement des transitions A/T vers G/T. Ce type de spectre est sensiblement différent du spectre des mutations spontanées qui se caractérise par une prépondérance des transitions G/C vers A/T mais il se différencie également du spectre des mutations induites par le B[a]P qui se caractérise par une prépondérance des transversions G/C vers T/A. Enfin, il apparaît clairement que le B[a]P comme l extrait organique de sédiment sont cancérigènes pour les poissons. Ces deux traitements aux doses les plus élevées conduisent au développement de tumeurs bénignes et malignes à des fréquences élevées (jusqu à 22% des poissons atteints) principalement au niveau d organes impliqués dans la filtration et la détoxication du sang, le foie et les reins (Fig 11). Les femelles de médaka japonais apparaissent deux fois plus atteintes que les mâles. Ces données confortent l implication des HAPs dans l étiologie des tumeurs hépatiques sporadiques dans la population de flet de baie de Seine et confirment l existence d un risque génotoxique en estuaire de Seine. 18

19 70 A Fréquence mutations cii (x10-5 ) T0+1mois T0+3mois * * 0 0 0,05 0,5 5 B[a]P en µg/ml Fréquence mutations cii (x10-5 ) T0+1mois T0+3mois * * 0 0,005 0,05 0,5 * B Extrait organique (%) Figure 10 : Fréquence des mutations cii dans le foie de juvéniles de medaka nourris pendant 1 mois avec des artémies exposées au B[a]P (A) ou à un extrait organique de sédiment de Seine (B). Les analyses ont été effectuées immédiatement après la fin de l exposition (T0+1mois) ou 2 mois après la fin de cette exposition (T0+3mois). Chaque valeur est la moyenne ± erreur standard de 8 à 11 analyses individuelles. Une astérisque indique une différence significative par rapport aux poissons exposées au seul DMSO (p 0,05, test de Cochran- Armitage unilatéral). Prévalence (%) FCA Adénome Carcinome DMSO 0,5% Extrait organique 0,5% B[a]P 5 µg/ml Figure 11 : Fréquence des lésions tumorales malignes (carcinome) ou bénignes (adénome) et des lésions prénéoplasiques (FCA = foyers de cellules altérées) en fonction du type de traitement subi par les médakas. L examen histopathologique a été réalisé huit mois après la fin de l exposition sur quarante cinq poissons âgés de 10 mois pris aléatoirement dans chaque traitement (moyenne +/- écart-type, n=45). 19

20 Réponses moléculaires des poissons aux pesticides : approches expérimentales et in situ Gènes candidats et profil d expression chez le flet Platichtyhs flesus Les travaux menés au LEMAR sur le flet visaient à explorer les mécanismes utilisés par les organismes pour faire face à un stress de type pesticides. La technique des banques soustractives a permis d identifier les gènes différentiellement régulés (sur-exprimés ou inhibés) chez le flet, lors d une exposition expérimentale à différents pesticides (atrazine, diuron, isoproturon et glyphosate). Cette approche sur l exploration des réponses moléculaires du flet aux pesticides a permis d identifier un certain nombre de gènes candidats et leur profil d expression, et de dégager ainsi les premières voies métaboliques impliquées dans la réponse physiologique précoce du flet. Dans un deuxième temps, nous avons testé la validité de ces marqueurs génétiques en milieux naturels, et plus particulièrement sur l estuaire de la Vilaine qui présente une contamination massive par les pesticides ; rappelons que c est à partir des données de cet estuaire que le choix des molécules et de leurs concentrations, a été déterminé pour réaliser la contamination expérimentale. Les premiers résultats d expression de gènes in situ indiquent une bonne concordance avec les résultats obtenus en conditions expérimentales (Travail conduit dans le cadre d une thèse au sein du GDR : Marchand et al., 2003, 2004) Voies d activation et effets moléculaires des pesticides chez la truite Oncorhynchus mykiss Les travaux conduits dans le cadre d une Action Incitative INRA-Ifremer visaient à caractériser par une approche pluridisciplinaire couplant génomique, génotoxicologie, toxicologie cellulaire et physiologie les impacts cellulaires et moléculaires de deux pesticides (atrazine et sulcotrione) chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Ce projet coordonné par F. Akcha a été réalisé en collaboration avec l INRA (R. Rahmani de l UMR ROSE et A. Devaux de l ENTPE de Lyon), et B. Morin du LPTC de l Université de Bordeaux 1. Il avait pour objectifs de contribuer à une meilleure connaissance des voies d activation et des effets moléculaires des pesticides chez les poissons pour une estimation plus précise des risques liés aux rejets de ces substances actives dans les systèmes aquatiques. Cette étude a montré que l atrazine et la sulcotrione ne présentent pas, quelle que soit la dose ou le temps d exposition testé, de cytotoxicité majeure pour les deux modèles cellulaires utilisés (lignée SOB-15, hépatocytes en culture primaire). Les résultats obtenus par le test des comètes ont montré que l atrazine et la sulcotrione induisent de faibles niveaux de dommages à l ADN sur les deux types cellulaires. Les données obtenues par la mesure de la 8-oxodG semblent plus en accord avec le test des comètes pour les hépatocytes de truite en culture primaire que pour les cellules de la lignée SOB-15. Toutefois, compte tenu des contraintes techniques, ces résultats restent à confirmer. Aucun adduit à l ADN n a été détecté après exposition à chacun de ces deux herbicides. L approche toxicogénomique globale réalisée par l utilisation de puces à ADNc permet d émettre l hypothèse que l atrazine serait responsable, sur primo-culture d hépatocytes de truite, d une diminution de l adhésion cellulaire, d un accroissement du stress oxydant (résultats en adéquation avec les tests de génotoxicité), d une dérégulation des processus apoptotiques et des systèmes endocriniens. La sulcotrione entraînerait également une diminution de l adhésion des hépatocytes, perturberait la régulation des processus apoptotiques et participerait à la croissance cellulaire. Ces résultats nécessitent néanmoins d être validés par une approche plus sensible et quantitative via l utilisation de RT-PCR quantitative (résultats en cours d analyse). En conclusion, il apparaît que les deux herbicides présentent des effets différents selon le modèle cellulaire testé. Néanmoins, une tendance générale et 20

21 commune à l atrazine et à la sulcotrione ressort de cette étude, à savoir qu ils n entraînent pas de cytotoxicité majeure et qu ils possèdent un faible pouvoir génotoxique. (Un rapport a été rédigé par Akcha et al., 2007) Suivi épidémiologique des pathologies tumorales dans la population de flet Platichthys flesus de l estuaire et de la baie de Seine. Ces travaux avaient pour cadre l estuaire et la baie de Seine (cinq sites échantillonnés) ainsi qu un estuaire de référence peu contaminé en Finistère sud, l estuaire du Ster. Seize campagnes de pêche au chalut ou au filet ont été réalisées entre avril 1996 et mai Plus de 1500 flets ont été échantillonnés et 520 individus ont été soumis à un examen histopathologique approfondi (Y. Cherel, ENV Nantes). Seules les données obtenues au cours des cinq premières campagnes conduites entre avril 1996 et juin 1997 ont été analysées à ce jour. Parmi les 815 poissons échantillonnés jusqu en juin 1997, 245 poissons ont été soumis à un examen histopathologique. Trois individus présentaient un adénome hépatocellulaire (1,2% des captures) et huit, un ou plusieurs foyers de cellules altérées (3,3% des captures). Il a été démontré que les foyers de cellules altérées (FCA) hépatiques peuvent évoluer vers des adénomes puis vers des carcinomes et peuvent à ce titre être considérés comme des lésions pré-néoplasiques (Myers et al., 1987). Ces lésions hépatiques tumorales et pré-tumorales sont totalement absentes chez les flets immatures mais concernent 5,1% des flets de 2 ans et plus. En outre, les femelles sont 3,5 fois plus atteintes que les mâles. Aucun carcinome hépatocellulaire ni aucun cholangiome n a en revanche été observé. Des résultats sensiblement identiques ont été obtenus sur les côtes néerlandaises (Vethaak et Jol, 1996 ; Vethaak et Wester, 1996). Dans cette dernière étude sur un total de poissons adultes analysés, 0,1% présentaient un carcinome hépatocellulaire, 1% un adénome hépatocellulaire et 4,4% des FCA. Ces lésions hépatiques tumorales et pré-tumorales ont été mises en évidence en milieu naturel chez de nombreuses espèces de poissons téléostéen (pour revue Mix, 1986). Ces lésions ont également été obtenues lors d expositions de poissons en conditions contrôlées à des sédiments naturellement ou artificiellement contaminés (Metcalfe et al., 1988 ; Vethaak et al., 1996). Enfin, il a été démontré que l exposition à des HAP pouvait conduire au développement de tumeurs hépatiques chez diverses espèces de poissons (Hendricks et al., 1985 ; Hawkins et al., 1988 ; Reddy et al., 1999). Les HAP sont fortement suspectés comme étant un des facteurs de risque majeur impliqué dans la genèse des tumeurs hépatiques sporadiques chez les poissons (Malins et al., 1987, 1988 ; Baumann et Harsharger, 1995). En estuaire et baie de Seine, la répartition des flets porteurs de tumeurs ou de lésions prétumorales apparaît très inégale. En effet, seuls les poissons de la partie aval de l estuaire, de l embouchure de Seine et du secteur d Antifer sont atteints. Cette disparité est probablement liée à une répartition très inégale des différentes classes d âge sur l ensemble de la zone d étude. En effet les flets juvéniles (moins de 2 ans) se concentrent uniquement dans la partie estuarienne alors que les poissons adultes se répartissent entre l embouchure et la baie de Seine. L exposition aux mutagènes et cancérogènes environnementaux semble s opérer principalement dans la partie amont de l estuaire et pendant les premiers mois de vie des flets. Les taux d adduits à l ADN apparaissent 3 à 10 fois plus élevés dans le foie des juvéniles de la partie amont de l estuaire que dans celui des adultes de la baie. Ces adduits sont pour l essentiel (66 à 82% des adduits mesurés) distribués le long de la diagonale radioactive et sont donc de ce fait attribuables aux HAP (Reddy et al., 1991) Réponses génétiques et physiologiques de populations de flets au stress chimique en milieu estuarien Une première approche a été menée ici sur les réponses génétiques et physiologiques de populations de flet au stress chimique, dans différents estuaires plus ou moins contaminés de la façade atlantique française. L estuaire de la Seine et de la Loire présentent des contaminations complexes (métaux lourds, hydrocarbures, PCB, pesticides). Les estuaires de la Gironde et de la Vilaine 21

22 présentent des contaminations dominées respectivement par les métaux lourds et par les pesticides. L estuaire du Ster est considéré comme étant très peu contaminé, et assimilé à un milieu de «référence». Nos travaux suggèrent que les populations de flets en estuaires contaminés présentent globalement une variabilité génétique ainsi que des valeurs moyennes de taux de croissance, indice de condition et fécondité, plus réduites par rapport au système peu contaminé. Les réponses des poissons ont été analysées individuellement au sein de chaque population en recherchant, par des analyses multivariées, des liaisons possibles entre la présence de certains allèles ou génotypes (pour des locus de type allozyme) et des paramètres considérés comme des composantes potentielles de la «fitness» d un organisme, à savoir le niveau d intégrité de l ADN (CV), le taux de croissance (GR) et l indice de condition (K). Précisons que la cytométrie de flux a été utilisée ici pour l évaluation de la génotoxicité chez le poisson, au niveau des dommages chromosomiques. Le protocole de cytométrie en flux consiste à mesurer les variations du contenu en ADN des noyaux des cellules sanguines de flets grâce à l iodure de propidium, fluorochrome qui se fixe spécifiquement sur les acides nucléiques. Un coefficient de variation (CV), reflétant la variabilité du contenu en ADN, est calculé en utilisant le logiciel WinMDI 2.8. Plus les CV sont élevés, plus la variabilité dans le contenu en ADN des cellules sanguines est importante, et donc plus les dommages à l ADN sont importants. Les résultats des analyses multivariées effectuées sur les échantillons des différents estuaires ont été synthétisés dans le Tableau 2 et publiés dans la cadre de la thèse de Marchand et al., Les grandes tendances détectées sur les différents estuaires Seine : Les analyses synthétiques de Hill & Smith réalisées sur les échantillons de la Seine (2001 et 2003) indiquent une corrélation positive entre CV (dommages chromosomiques) et GR (taux de croissance) (2001 et 2003), ainsi qu'avec K (indice de condition) et F (fécondité) (2003). Un certain nombre de génotypes apparaissent également associés à de faibles CV (PGM-85/85, MPI-95/100, IDH-90/100, AAT1-95/100 et PGM-85/100) ou à l'inverse à de forts CV (PGM-100/100 et AAT2-90/100). Une relation négative entre CV et H (hétérozygotie individuelle multilocus) a également été mise en évidence sur les échantillons de 2001 (Tableau 2). Loire : Les analyses synthétiques de Hill & Smith réalisées sur les échantillons de la Loire (2002 et 2003) indiquent qu'un certain nombre de génotypes apparaissent associés à de faibles CV (PGM- 85/85, AAT1-95/100, AAT2-90/100 et AAT ) ou à l'inverse à de forts CV (PGM-100/100, MPI-100/105, IDH-90/100 et IDH-90/90) (Tableau 2). Vilaine : L analyse synthétique de Hill & Smith réalisée sur l échantillon de la Vilaine (2002) indique une corrélation négative entre CV et H. Les génotypes PGM-85/100, MPI-90/100, MPI-100/105 et AAT1-95/100 sont également corrélés à de faibles CV ; à l'inverse, le génotype PGM-100/100 est corrélé à de forts CV (Tableau 2). Gironde : Les analyses synthétiques de Hill & Smith réalisées sur les échantillons de la Gironde en 2003 indiquent une corrélation positive entre CV et GR, tous deux étant négativement corrélés à K et F. Un certain nombre de génotypes apparaissent également associés à de faibles CV (MPI-90/100 et PGM-100/100) ou à l'inverse à de forts CV (PGM-85/100 et IDH-100/110) (Tableau 2). Ster : les analyses synthétiques de Hill & Smith réalisées sur les échantillons du Ster (2001, 2002 et 2003) indiquent une corrélation positive robuste entre CV et GR (2001/2002 et 2003), tous deux négativement corrélés à K (2003). Les génotypes PGM-85/85 (2001/2002) et PGM-85/100 (2003) sont également associés à de forts CV sur cet estuaire (Tableau 1). Au final, les couplages génotypes-phénotypes effectués sur les échantillons issus des différents estuaires ont permis de formuler l hypothèse d une pression sélective exercée par la contamination chimique sur les locus PGM (phosphoglucomutase) et AAT (aspartate aminotransférase) et plus particulièrement sur les variants alléliques PGM-85 et AAT1-95. Les individus porteurs de ces allèles 22

23 présentent vraisemblablement : (1) des performances physiologiques liées à la «fitness» supérieures relativement aux autres variants génétiques (notamment une génotoxicité réduite), et (2) une allocation d énergie orientée vers la résistance et la survie. Le caractère de «résistance» associé à ces allèles est conforté par l augmentation de leur fréquence en environnements contaminés par rapport au site de référence. On remarque également que si des convergences apparaissent clairement dans les relations génotypes-phénotypes entre les estuaires contaminés, les spécificités observées dans ces relations sont à relier avec la nature du cocktail polluant associé à chacun des estuaires Polymorphisme de l ADN et couplages génotypes-phénotypes sur différents gènes candidats La caractérisation du polymorphisme de gènes candidats dans les populations de flets a été initiée dans le cadre du GDR IMOPHYS. Il s agit de rechercher d éventuelles modifications de la variabilité génétique associées à ces gènes dans des estuaires différentiellement contaminés. Parallèlement aux résultats obtenus dans la première partie de nos travaux, on observe ici que certains locus, notamment p53, semblent subir une pression sélective sur les grands estuaires contaminés de la façade atlantique française ; les individus porteurs de l allèle p53-a présentent ainsi une génotoxicité réduite et augmentent en fréquence dans les estuaires contaminés par rapport à l estuaire de référence. Enfin, les locus BHMT (bétaine homocystéine méthyltransférase) et PGDS (prostaglandine D synthase) semblent quant à eux subir une pression sélective plus spécifique sur l estuaire de la Vilaine (allèles BHMT-A et PGDS-A augmentant en fréquence sur cet estuaire par rapport à l estuaire de référence ; les individus portant ces allèles présentant une meilleure intégrité de l ADN), vraisemblablement liée à l existence d une contamination de type pesticides agissant sur cet estuaire. 23

24 Contamination HAP et PCB diffuse Contamination diffuse Contamination pesticides Contamination métaux lourds diffuse Contamination faible Tableau 2 : Tableau synthétique présentant les couplages génotypes-phénotypes chez le flet au niveau de différents estuaires. * contamination chimique soutenue. CV : niveau d intégrité de l ADN, GR : Taux de croissance, K : indice de condition, H : hétérozygotie individuelle multilocus, F : fécondité Caractérisation de nouveaux marqueurs moléculaires impliqués dans la réponse aux stress multiples chez l huitre creuse Crassostrea gigas Introduction Dans cette étude, nous avons cherché à identifier un certain nombre de gènes impliqués dans la réponse physiologique de l huître creuse Crassostrea gigas exposée à des polluants de type hydrocarbures et pesticides et à un stress environnemental de type hypoxie. Le but de cette étude est de rechercher de nouveaux marqueurs génétiques spécifiques de la réponse des organismes face au stress chimique ou abiotique afin de déterminer par la suite d éventuelles relations entre le polymorphisme de ces gènes et le degré de contamination en hydrocarbures et en pesticides ou le niveau de stress dans les populations. En dépit de la large utilisation commerciale des pesticides et des composés de type HAP, il existe encore peu de données moléculaires concernant leurs effets sur les mollusques marins dans la 24

25 littérature scientifique. Les processus de résistance aux pesticides décrits pour le moment chez les invertébrés montrent certaines corrélations entre l activité d enzymes de type FMO, GST, AChE ou encore les estérases. De même, la réponse moléculaire de l huître à l hypoxie reste peu décrite dans la littérature. La technique que nous avons choisie pour identifier les gènes différentiellement régulés en réponse aux pesticides, aux hydrocarbures ou à l hypoxie consiste à construire des banques dites soustractives. Le principe de ces banques est de comparer les gènes exprimés dans deux échantillons (ici : individus exposés et individus témoins) par soustraction des gènes non régulés entre les deux échantillons. Il est ainsi possible de séparer les gènes sur-exprimés et les gènes inhibés par les pesticides, les hydrocarbures ou l hypoxie Identification des gènes régulés par les pesticides Deux banques soustractives dites forward (caractérisation des gènes sur-exprimés) et reverse (caractérisation des gènes inhibés) ont été réalisées sur le pool d ARN de la glande digestive et de branchies de C. gigas exposées au cocktail atrazine-diuron-isoproturon. Deux banques similaires ont été réalisées sur les mêmes tissus d huîtres exposées au glyphosate après 30 jours d exposition. Un total de 137 séquences uniques a été obtenu, 56 correspondant à des gènes connus et identifiés chez différentes espèces et 81 correspondant à des gènes non identifiés (EST) (Tanguy et al., 2005). Les principaux résultats montrent que les pesticides agissent sur différents processus physiologiques et que la réponse de l huître à leur présence implique la participation d une grande variété de gènes impliqués dans la détoxication de xénobiotiques, la régulation des acides nucléiques et des protéines, la chaîne respiratoire, la communication cellulaire et le système immunitaire, le cytosquelette et le métabolisme énergétique. D autre part, un certain nombre de protéines ribosomales sont également régulées. Il est à noter que le cocktail atrazine-diuron-isoproturon semble perturber davantage le métabolisme de l huître que le glyphosate seul. L ensemble des gènes identifiés au cours de cette expérience sont présentés dans la figure 12A et les résultats ont été publiés par Burgeot et al., gènes potentiellement régulés par les pesticides A gènes potentiellement régulés par les hydrocarbures B détoxication des xénobiotiques régulation des lipides protéines de stress protéines de stress cytosquelette cytosquelette chaine respiratoire et oxidation chaine respiratoire et oxidation régulation des protéines régulation des protéines Régulation des acides nucléiques communication cellulaire communication cellulaire protéines ribosomales protéines ribosomales métabolisme énergétique métabolisme énergétique EST EST ADI down ADI up glyphosate down glyphosate up régulation des lipides protéines de stress cytosquelette chaine respiratoire régulation des acides nucléiques détoxication des hydrocarbures régulation des protéines communication cellulaire métabolisme énergétique protéines ribosomales EST inhibé 21 jours induit 21 jours inhibé 7 jours induit 7 jours Figure 12 : Résultats des banques SSH pesticides (A) et hydrocarbures (B) chez C. gigas (Burgeot et al., 2007). 25

26 Identification des gènes régulés par les hydrocarbures Le séquençage des quatre banques (après 15 et 30 jours d exposition) a permis d'obtenir un total de 252 séquences différentes de gènes régulés par les hydrocarbures (Boutet et al., 2004). Les différents mécanismes cellulaires régulés au cours de cette exposition sont présentés dans la figure 12B. Il est à noter que les enzymes et les protéines impliquées dans les différentes étapes de la biotransformation (à l'exception de la phase III), ainsi que dans la protection contre le stress oxydatif et la protection cellulaire sont présents dans ces quatre banques. Il faut également remarquer que les gènes codant pour les protéines du cytosquelette ne sont pas inhibés par les hydrocarbures. De même, aucun gène codant pour des protéines de stress n'est inhibé après une semaine d'exposition, alors que les gènes codant pour les protéines du métabolisme énergétique sont surexprimés après 3 semaines d'exposition ce qui prouve une régulation énergétique accrue des organismes face au stress. Les résultats de cette étude ont permis de mettre en évidence les mécanismes mis en place par les huîtres en réponse à une exposition aux hydrocarbures. Les enzymes et protéines induites et inhibées semblent être les mêmes que ceux décrits chez les autres espèces : une étape de biotransformation divisée en 2 phases. La phase I est caractérisée par l'induction des cyp1a1, cyp3a4, FMO-2, MAO A et cytochrome b 5 et la phase II par l'induction des GSTs omega et mu et l'inhibition des GSTs pi et sigma (Boutet et al., 2003c) et de la sulfotransferase. la mise en place de mécanismes de protection contre le stress oxydatif. Induction de la Cu/Zn SOD. l'induction de protéines de stress. Induction des chaperons moléculaires HSP70 et HSP90 et induction de la glutamine synthétase. la régulation d'enzymes impliquées dans le métabolisme des lipides. Inhibition de la 9 désaturase la régulation d'enzymes impliquées le métabolisme énergétique. Induction de l'aspartate aminotransferase Identification des gènes régulés par l hypoxie La réponse au stress hypoxique a été appréhendée au niveau du transcriptome sur des huîtres non différenciées génétiquement. Des banques soustractives ont été réalisées après une exposition expérimentale à une hypoxie de 30% de saturation pendant 7-10 et 24 jours (David et al., 2005). Le séquençage des clones obtenus a permis d obtenir 616 séquences partielles d ADNc correspondant à des gènes dont l expression s est trouvée potentiellement régulée par ce type de stress environnemental, gènes associés à 12 fonctions physiologiques majeures : reproduction, protéines de stress, régulation des protéines, régulation des acides nucléiques, chaîne respiratoire, structure, métabolisme des lipides, métabolisme énergétique, métabolisme des acides aminés, communication cellulaire, détoxication et développement (Fig 13). Parmi ces séquences, une majorité correspondait à des gènes codant pour des enzymes ou des protéines impliquées dans la communication cellulaire, la régulation des protéines ou dans le métabolisme énergétique. Ces résultats sont en accord avec les observations d Hochachka et collaborateurs (1996) qui décrivaient une cascade de processus moléculaires et physiologiques en réponse à l hypoxie chez les organismes tolérants à ce stress, avec en premier lieu une mobilisation des systèmes de réception et de transmission de signal induisant des séries de régulations parmi lesquelles la diminution des synthèses protéiques. Dans notre étude, un grand nombre de séquences codant pour des protéines ribosomales a aussi été obtenu. Une validation des résultats de ces banques a ensuite été réalisée par suivi de l expression de certaines des séquences régulées selon le temps d exposition à l hypoxie, par RT-PCR semi-quantitative. 26

27 Gènes sur-exprimés après 7-10 jours d'exposition à l'hypoxie 57% 4% 5% 3% 1% 1% 2% 2% 6% 3% 15% Gènes sous-exprimés après 7-10 jours d'exposition à l'hypoxie 1% 50% 4% 5% 1% 4% 2% 10% 2% 1% Cytosquelette, structure, matrice Chaîne respiratoire Régulation des acides nucléiques Détoxication Métabolisme des acides aminés Métabolisme énergétique 58% Régulation des protéines Communication cellulaire, système immunitaire,... Protéines de stress Reproduction Métabolisme des lipides Développement, différenciation Protéines ribosomales Fonctions inconnues ESTs Gènes sur-exprimés après 24 jours d'exposition à l'hypoxie 58% 3% 4% 2% 2% 2% 2% 7% 9% 5% 1% 1% 2% 5% Gènes sous-exprimés après 24 jours d'exposition à l'hypoxie 1% 2% 1% 1% 7% 5% 2% 1% 1% 1% 7% 13% 10% 8% Figure 13 : Identification de gènes régulés par l hypoxie ( Travaux de thèse de David et al., 2005). Parmi les séquences nucléotidiques obtenues, plusieurs codent pour des enzymes impliquées directement ou indirectement dans le métabolisme oxydatif, en particulier des enzymes anti-oxydantes (glutathione peroxidase, glutathione-s transferase, superoxide dismutase, métallothionéine), ce qui confirme une relation étroite entre hypoxie et stress oxydatif (Richier et al., 2003). Le gène de la glutathione peroxidase non sélenium s est par exemple révélé être activé dès 7 jours par une exposition expérimentale à l hypoxie (Fig 14). La glutathione peroxidase est une des principales enzymes anti-oxydantes. Alors qu il est souvent considéré que l hypoxie favorise une diminution du stress oxydatif de par la diminution du substrat de nombreuses réactions d oxydation qu est l oxygène, l activité de certaines enzymes anti-oxydantes comme la glutathione peroxidase a été décrite alternativement inhibée ou activée par l hypoxie. Une augmentation de la transcription du gène correspondant telle que nous l avons observée peut être expliquée par une possible préparation de l huître à un éventuel stress oxydatif qui surviendrait lors de la réoxygénation du milieu (Hermes-Lima et al., 1998). Cette étude contribue à améliorer la compréhension des réponses adaptatives de C. gigas à des conditions de stress hypoxique, et à la caractérisation de nouveaux marqueurs de stress impliqués dans différentes voies métaboliques chez cette espèce. Expression relative * * * * Temps d exposition (jours) Figure 14: Expression différentielle du gène de la glutathione peroxidase seleno-indépendante dans le manteau chez C. gigas en conditions d hypoxie. L expression est présentée en ratio calculé DO gene /DO 28S après RT-PCR. La courbe en pointillés représente le contrôle, la ligne continue les échantillons soumis à hypoxie. * : différence significative entre contrôle et échantillons soumis à hypoxie (David et al., 2005). 27

28 Caractérisation de marqueurs moléculaires particuliers Une caractérisation moléculaire complète de certains des gènes identifiés dans les banques SSH a été réalisée chez Crassostrea gigas : les 4 glutathione-s transferases GSTs pi, sigma, mu et omega, la Mono Amine Oxygenase et la Flavine Mono Oxygenase, l Aspartate Amino Transférase, la Glutamine Synthétase, la Glutathione Peroxidase Séléno-Indépendante (ou peroxiredoxine 6) et la Métallothionéine 4. Une étude de l expression de ces marqueurs a été réalisée dans plusieurs tissus de C. gigas en réponse à différents stress afin de déterminer s il existait des régulations différentielles de ces gènes en réponse aux facteurs du milieu (Travaux de thèse de Boutet et al., 2003) Application et utilisation de ces marqueurs en milieu naturel Les marqueurs mis au point expérimentalement ont ensuite été utilisés afin d en suivre le polymorphisme et de rechercher des relations entre génotypes et phénotypes, pour associer aux différents variants génétiques des performances individuelles différentielles en terme de fitness en milieu naturel anthropisé a. Echantillonnage Des prélèvements d huîtres Crassostrea gigas ont été effectués sur trois estuaires contaminés chimiquement et présentant des typologies contrastées, la Vilaine, la Loire et la Gironde, en janvier et juin-juillet Des prélèvements d huîtres ont été également réalisés sur l estuaire considéré comme de «référence» pour ce mollusque, celui de la rivière du Belon, en janvier et juin b. Polymorphisme génétique Les gènes de la glutamine synthétase (GS) (enzyme du métabolisme de l azote et des acides aminés), de la glutathione peroxidase seleno-indépendante aussi appelée peroxiredoxine 6 (Prx6) (enzyme anti-oxydante) et de la métallothionéine 4 (MT4) (protéine de détoxication et protection cellulaire) ainsi qu une séquence codante partielle du gène de la delta-9 désaturase (D9) (enzyme du métabolisme des lipides) ont été choisis parmi les séquences obtenues dans les différentes banques exposées plus haut pour être utilisés pour des études de polymorphisme génétique. Le gène de la phosphoglucomutase (PGM) a également été étudié. Le polymorphisme a été suivi sur certains exons de ces 5 gènes par la méthode de PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). Le suivi de ces marqueurs génétiques potentiels a permis de mettre en évidence une réponse génétique à la contamination en terme de structuration génétique des populations. Des modifications inter site et saisonnières des fréquences alléliques ont été observées traduisant des mortalités différentielles des individus en fonction de leurs allèles et de leurs génotypes. Les variations de fréquence inter population ont montré une sélection de l allèle C de la glutamine synthétase dans les populations des estuaires de la Loire et de la Vilaine par rapport à l estuaire de référence, suggérant que l allèle C de la glutamine synthétase puisse être associé à une meilleure tolérance à la contamination. Inversement, l allèle B de la delta-9 désaturase, l allèle A de la peroxiredoxine 6, l allèle 95 de la PGM et l allèle C de la métallothionéine 4 peuvent au contraire être considérés comme associés à une plus forte sensibilité, dans la mesure où les fréquences alléliques ont montré une contre-sélection des individus porteurs de ces allèles en milieu contaminé. L allèle C du gène de la MT4 a semblé particulièrement associé à la sensibilité aux métaux dans l estuaire de la Gironde. Nous avons observé que le stress environnemental affectait aussi la diversité génétique : une diminution de l hétérozygotie observée a été notée dans les trois estuaires les plus contaminés 28

29 (Ho=0,354 ; Ho=0,379 ; Ho=0,368 pour la Vilaine, la Loire et la Gironde respectivement) par rapport à l estuaire de référence du Belon (Ho=0,422) c. Paramètres physiologiques Des paramètres physiologiques ont aussi été analysés dans cette étude afin de détecter d éventuelles performances différentielles entre les populations estuariennes. Cette étude a montré que les populations d huîtres estuariennes soumises à des stress environnementaux multiples présentaient une réponse physiologique et génétique au stress accrue par rapport aux populations du système de référence. La réponse physiologique s est manifestée en terme d augmentation de la synthèse de protéines de stress (Métallothionéines et Heat Shock Proteins 70) et de l expression de gènes d intérêt de réponse au stress. En conséquence de l exposition à la contamination, une génotoxicité accrue a aussi été soulignée. Le dosage des protéines de protection cellulaire (MT métallothionéines et HSP Heat Shock Proteins 70) n a révélé de différence entre les 4 estuaires pour le mois de janvier que pour les HSP dont les quantités détectées étaient alors plus fortes sur certains estuaires contaminés (Gironde et Loire) que sur l estuaire de référence (Fig 15A). En juin les dosages effectués sur les individus du Belon, de la Loire et de la Vilaine ont montré une augmentation significative de la quantité de HSP, augmentation très importante pour la Vilaine. Pour les MT, on observe une augmentation nette du signal en juin, particulièrement au niveau de la Vilaine (Fig 15B). Les individus issus de la Gironde montrent quant à eux une diminution d expression des MT de l hiver vers l été. Une telle augmentation de protéines de stress (Belon, Loire et Vilaine) en période de reproduction pour l huître peut être expliquée par la nécessité pour l organisme d accroître ses défenses en cette période où il est fortement fragilisé face aux agressions de l environnement. Le niveau élevé des protéines de protection cellulaire dans la Vilaine suggère un stress peut être plus important dans cet estuaire (travaux valorisés par Boutet et al., 2002 ; 2003). La diminution observée dans la Gironde peut être due au fait que dans des sites fortement pollués par les métaux (tels que la Gironde) la synthèse des métallothionéines peut être inhibée (travaux valorisés par Boutet et al., 2002). HSP mg/gprot * * * Gironde Loire Vilaine Belon * A 0,5 Janvier 2005 Juin 2005 * B 0,4 mgmt/gwwt 0,3 0,2 0,1 * * 0,0 Gironde Loire Vilaine Belon Figure 15 : quantification (A) des HSP70 et (B) des MTs par test ELISA pour les différentes populations estuariennes, en hiver et en été (n=36). Les barres d erreur représentent les intervalles de confiance à 5% d erreur. * indique une différence significative à p=0,05 par rapport à l estuaire du Belon. indique une différence significative entre l hiver et l été. 29

30 L expression de gènes candidats obtenus dans les banques soustractives construites en conditions expérimentales a également été suivie par PCR semi-quantitative sur les individus des mêmes populations. L expression de 6 gènes impliqués dans différentes voies physiologiques a été suivie sur les huîtres de chacun des quatre estuaires, dans les branchies et la glande digestive : gènes de l anhydrase carbonique (flux gazeux et synthèse de carbonates), delta-9 désaturase (métabolisme des lipides), glycogène phosphorylase (métabolisme énergétique), BTF3 (transcription), peroxiredoxine 6 et métallothionéine 4 (protection cellulaire et détoxication). Pour tous les gènes étudiés, des différences significatives ont été observées entre les estuaires en terme d expression (Fig 16). Excepté pour le gène de l anhydrase carbonique en hiver, les niveaux d expression se sont révélés généralement les plus faibles dans l estuaire de référence du Belon que dans les trois estuaires les plus contaminés. Ces résultats concordent avec l induction de l expression de ces différents gènes par le stress environnemental et les différences inter-estuaire observées dans les niveaux de transcription pouvant être reliés aux différences de typologie des différents estuaires étudiés. Par exemple, le gène de la peroxiredoxine 6 a montré des niveaux d expression plus forts dans les trois estuaires les plus contaminés, taux d expression probablement liés aux forts niveaux de contamination rencontrés sur ces trois sites. La peroxiredoxine 6 présente une activité peroxydase et une augmentation de l expression chez les populations des estuaires les plus contaminés peut refléter une réponse au stress oxydatif probable chez les organismes soumis à une contamination d origine anthropique diverse. En effet, les hydrocarbures, les pesticides, les métaux lourds et autres contaminants chimiques sont connus pour induire une production accrue de ROS chez les organismes qui vivent dans des zones ainsi polluées (Regoli et al., 2003 ; Almeida et al., 2007). En été pourtant, une diminution très forte de l expression de ce gène a été observée dans les quatre estuaires. Cette diminution de l expression entre l hiver et l été peut être due à l état physiologique des huîtres en fin de gamétogenèse en été. La reproduction peut en effet influencer les profils de transcription de gènes, puisqu une grande part de l énergie est alors mobilisée pour le développement des gamètes et la préparation à la ponte, ce qui limite l énergie disponible pour les autres fonctions physiologiques. L absence de diminution des niveaux d expression du gène Prx 6 dans la Vilaine en été pourrait quant à elle être reliée aux épisodes hypoxiques qui peuvent advenir en été sur cet estuaire (Menesguen et al., 2001). Cependant, d autres gènes comme le gène codant pour la métallothionéine 4 ont montré le même type de profils d expression inter-estuaire, avec toutefois, une augmentation de leur expression en été. Les gènes de métallothionéines sont connus pour être induits pendant l exposition à divers stress chez les organismes marins : la température, l anoxie l hypoxie ou la contamination par les métaux lourds. De la même façon que les concentrations en protéines ont ici été induites dans les estuaires les plus contaminés en réponse aux stress environnementaux correspondants, le gène de MT4 apparaît ici répondre à la contamination comme un indicateur potentiel du stress. Une inhibition de la transcription des MTs par de forts taux environnementaux en métaux a de nouveau été observée sur l estuaire de la Gironde. 30

31 branchies Janvier 2005 Juin 2005 glande digestive Expression relative Expression relative 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 A * * * Gironde Loire Vilaine Belon B * * * * Gironde Loire Vilaine Belon 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 * * * Gironde Loire Vilaine Belon * Gironde Loire Vilaine Belon Figure 16: Expression relative mesurée dans les branchies et la glande digestive de C. gigas pour les différentes populations estuariennes, en hiver et en été (n=36 individus). A : gène de la peroxiredoxine 6, B : gène de la métallothionéine 4. * indique une différence significative par rapport à l estuaire du Belon. indique une différence significative entre l hiver et l été. Les barres d erreur représentent les intervalles de confiance à 5% d erreur d. Couplages phénotypes-génotypes La recherche de corrélations éventuelles entre phénotypes et génotypes a été réalisée à l aide du logiciel ADE-4 (Chessel et al., 1995) qui permet d analyser conjointement des données quantitatives et des données qualitatives obtenues sur différents individus d une population donnée. Une analyse en composantes principales (ACP) a dans un premier temps été réalisée sur les données quantitatives. Une analyse des correspondances multiples (ACM) a ensuite été réalisée sur les variables qualitatives, c'est-à-dire les génotypes caractérisant les différents loci mais aussi les stades de maturation sexuelle des individus déterminés par une analyse histologique. Enfin, une analyse synthétique de Hill et Smith (Hill et Smith, 1976) a été réalisée à partir des résultats de l ACP et de l ACM précédemment citées, afin d établir des liaisons entre les deux types de variables. Des données individuelles de génotoxicité évaluée par la mesure des dommages chromosomiques par cytométrie en flux mais aussi des mesures de bioaccumulation des métaux (cuivre, plomb et cadmium) dans la glande digestive ont été utilisées pour les analyses de couplage. Le couplage des phénotypes individuels aux génotypes des différents loci étudiés a montré que des génotypes porteurs des allèles contre sélectionnés pouvaient être associés à des performances physiologiques différentielles. Par exemple, les génotypes porteurs de l allèle Prx-A semblent présenter des caractéristiques physiologiques défavorables bien qu aucune des variables physiologiques étudiées n ait permis de conclusion plus précise. D autres analyses incluant des paramètres physiologiques plus directement liés au stress oxydatif (dosage de ROS, activité d enzymes anti-oxydantes) seront nécessaires pour affiner cette conclusion. D autre part, deux génotypes du locus MT4 porteurs de l allèle MT-C ont pu être associés à des réponses physiologiques particulières. La sensibilité du génotype MT-CC a pu être associée à une faible intégrité de l ADN et de plus fortes quantités de métallothionéines dans l estuaire le plus fortement contaminé par les métaux (la Gironde). 31

32 La sensibilité du génotype MT-CD a été associée à une faible intégrité de l ADN et de faibles quantités de HSP70, suggérant une réponse moins efficace pour faire face à la contamination. Enfin, des couplages réalisés pour les individus de l estuaire de la Gironde, estuaire le plus fortement contaminé par les métaux, en hiver ont montré que les individus qui portaient l allèle C du gène de la MT4 ou l allèle 95 de la PGM présentaient une forte bioaccumulation (Pb, Cd), un faible taux de MTs et un faible taux d ARNm codant le gène MT4 (Fig 17). Les allèles MT4-C et PGM-95 avaient préalablement été associés à la sensibilité des individus aux métaux sur l estuaire de la Gironde. La sensibilité des individus portant ces allèles semblent donc être liée à une plus forte bioaccumulation et une plus faible détoxication métallique. Figure 17: analyses de Hill et Smith reliant les variables quantitatives (dosages de Cu, Cd, Pb ; MT ; ARNm de MT4) et les données qualitatives (génotypes aux différents loci) réalisées sur les individus de la Gironde prélevés en janvier Pour des analyses futures, l intégration de paramètres de la croissance pourrait permettre d améliorer ce type de couplage. La réalisation des analyses de Hill et Smith séparément pour chaque stade de maturité et pour chaque sexe devrait permettre de déceler des relations entre phénotypes et génotypes plus robustes, et de renforcer les résultats obtenus. D autre part, il s avère désormais nécessaire de réaliser des recherches de polymorphisme au niveau des promoteurs des gènes afin de mener des analyses de couplage entre expression de gène et polymorphisme du promoteur des mêmes gènes Caractérisation de nouveaux marqueurs moléculaires impliqués dans la réponse aux stress chez les moules bleues et zébrées et chez la mye a Introduction Il s agissait de mettre en œuvre des méthodologies de toxicogénomique, analyse du transcriptome et du protéome chez les bivalves afin d identifier des biomarqueurs pertinents chez deux espèces bioindicatrices classiquement utilisés en Ecotoxicologie. Par ailleurs, des activités enzymatiques du stress oxydant ont été mesurées dans ce contexte b. Analyse du transcriptome b-1. Effets du tributyletain sur le transcriptome des gonades de Mya arenaria 32

33 Le Dr A. Siah, qui a préparé sa thèse à l Université du Québec de Rimouski au Canada, a effectué un stage post-doctoral au laboratoire, dans le cadre du Réseau France-Québec d Ecotoxicologie. Le programme de Mr A. SIAH concernait la recherche des acteurs moléculaires impliqués dans la réponse des tissus gonadiques d un bivalve marin endogé, Mya arenaria, à un perturbateur endocrinien notoire, le tributylétain (TBT). L approche choisie était la construction de banques soustractives par SSH chez des animaux, mâles et femelles, exposés ou non au TBT en microcosmes. Au total, 4 banques soustractives ont été construites et l ensemble des clones obtenus a été séquencé. Il a ensuite focalisé ses travaux sur l un des transcrits isolés. Les clones identifiés peuvent être arbitrairement divisés en plusieurs catégories fonctionnelles. Ainsi, apparaissent comme différentiellement exprimés des gènes codants pour des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, dans la formation de la matrice extracellulaire ou du cytosquelette, la chaîne respiratoire, le catabolisme des protéines et la détoxication cellulaire. A titre d exemple, nous avons pu isoler des transcrits de mye présentant des similitudes de séquence avec le récepteur nucléaire à l acide rétinoïde RXR («Retinoid X Receptor») et avec une protéine comme RACK-1 («Receptor Activated C kinase») qui, bien qu historiquement associée à l activation de la protéine kinase C, semble être impliquée dans la communication croisée avec différentes voies de transduction intracellulaire. Dans le but de cloner entièrement RACK1 dans la gonade de Mya arenaria, nous avons recherché les portions manquantes de l ADNc par RACE-PCR («Rapid Amplification of cdna Ends»). La séquence totale de RACK1 correspond à un ADNc de 1085 pb. A partir de la séquence nucléotidique, on a déduit une protéine de 318 acides aminés de poids moléculaire 34,6 kda et de point isoélectrique théorique de 7,09. L analyse de cette séquence peptidique de RACK1 nous a permis d identifier cinq domaines de répétition des couples d acides aminés tryptophane-aspartate (WD 40) caractéristiques de cette famille de protéines. RACK1, chez Mya arenaria, présente une grande homologie de séquence peptidique avec celle des autres espèces, non seulement avec la séquence d un mollusque tel que Bomphalaria mais aussi avec celles de vertébrés supérieurs (poissons, rat et homme). L analyse phylogénétique de RACK1 fait apparaître deux groupes distincts : un groupe composé essentiellement de protozoaires tels que Crithidia/Leishmania, Toxoplasma/Trypanosoma et Plasmodium et un autre groupe représenté par une plus large diversité d espèces allant de la levure Schizosaccharomyces jusqu à l Homme en passant par les invertébrés tels que Mya arenaria. Néanmoins, la séquence peptidique de RACK1 de mye présente une homologie plus forte avec la séquence RACK1 de Drosophila qu avec celle de Bomphalaria. Finalement, grâce à la technique d hybridation in situ (marquage à la digoxigénine) l expression du gène codant pour cette protéine a été mise en évidence dans les cellules germinales mâles et femelles Mya arenaria mâtures. Cette observation laisse présager une implication de cette protéine dans les mécanismes moléculaires qui interviennent dans la maturation des cellules germinales chez Mya arenaria (Siah et al., 2007) b-2. Effets des contaminants chimiques chez Mytilus edulis et Dreissena polymorpha La recherche de transcrits différentiellement régulés par un mélange complexe de contaminants chimiques a été effectué par construction de banques soustractives par SSH. Au total, 10 banques ont été élaborées suivant le schéma indiqué figure 18, après exposition des deux espèces de bivalve au même mélange, le paramètre de tidalité étant pris en compte chez l espèce marine. La stratégie retenue visait trois objectifs : i) déterminer les transcrits impliqués dans la réponse au stress purement induit par les xénobiotiques ; ii) l effet tidalité (anoxie/hyperoxie) et iii) la comparaison bivalve eau douce/eau de mer (prise en compte du continuum). 33

34 Figure 18: Banques d ADNc construites par SSH. Le nombre de clones obtenus est indiqué pour chaque soustraction. Au total, près de 5000 clones ont été obtenus et chacun d eux a été séquencé. La recherche de similitudes dans les bases de données a été effectuée à l aide d un outil bioinformatique (ForEST) spécialement conçu au LEMA. Les transcrits isolés peuvent être divisés en 3 grandes catégories : i) ceux qui ne présentent pas de similitudes statistiquement significatives avec un transcrit connu chez une autre espèce ; ii) ceux qui possèdent une similitude avec un transcrit répertorié chez une autre espèce mais dont la fonction physiologique est inconnue et, iii) ceux qui possèdent clairement un orthologue. La figure 19 dresse une comparaison chez Dreissena polymorpha et chez Mytilus edulis. Les transcrits identifiés chez les deux espèces codent pour des protéines qui recouvrent un large spectre de fonctions cellulaires. Figure 19: Diagramme illustrant quelques exemples de clones obtenus chez la moule zébrée (en vert) et la moule bleue (en bleu). Elles incluent la signalisation cellulaire, la transcription, la traduction, la détoxication, la réparation des macromolécules. 34

35 b-3. Macro-puces à ADN chez Mytilus edulis et Dreissena polymorpha Afin de vérifier l expression différentielle de chacun des clones isolés par SSH, des macropuces à ADN ont été imprimées sur des membranes de Nylon. Pour cela, un «spotter» d ADN prototype a été utilisé avec le soutien de J.P. Salier (INSERM U519, CHU et Université de Rouen). L objectif principal était cependant de créer un outil de type multi-biomarqueur permettant la mesure simultanée des niveaux de plusieurs milliers de messagers. Compte tenu des contraintes de construction de ces puces - densité de clones «imprimables» sur une macro-puce et, nécessité de disposer d éléments permettant de normaliser les mesures -, nous avons entrepris, d une part, de rechercher et d éliminer les transcrits redondants et, d autre part de construire des banques d ADNc non soustraites. La recherche et l élimination des redondances a été effectuée par bioinformatique en examinant les homologies entre chacun des clones de moules bleues et zébrées. Les banques d ADNc ont fait l objet d une construction relativement complexe visant à mimer au plus près possible la structure des ADNc clonés par SSH. Enfin, plusieurs clones obtenus chez une espèce tierce (Arabidopsis thaliana) ont également été utilisés comme contrôle interne des puces à ADN. Ces puces à ADN comportent près de 3400 ADNc et sont donc proches de la densité maximale pouvant être atteinte par la technologie «Nylon». Afin de tester ces puces et d examiner les effets propres de chaque classe de contaminant sur l expression du panel de transcrits que nous avons construit, des animaux ont subi des expositions, en conditions contrôlées en laboratoire, aux xénobiotiques pris individuellement. Bien sûr, les conditions d exposition (concentration, temps, régime de marée) étant identiques à l expérimentation initiale. Après extraction des ARN et marquage radioactif par rétrotranscription, les sondes obtenues ont servi à l hybridation des puces. Une image exemple est présentée figure 20. Figure 20 : Autoradiogramme (en négatif) d une macro-puce à ADN hybridée avec une sonde marquée au 33 P. Après mesure densitométrique de chacun des «spots», traitement de normalisation des données et analyse statistique, les niveaux relatifs de messagers ont pu être mesurés. La figure 21 illustre les résultats qui peuvent être obtenus par cette technologie. 35

36 Figure 21 : Exemple d analyse des ratios de messagers présents chez la moule bleue dans les conditions témoins (TE) et après exposition au PCB 153. Les points situés au dessus de la droite correspondent à des messagers plus exprimés après exposition au PCB. L expression différentielle des clones obtenus par SSH est confirmée pour la majeur partie d entre-eux, même si les macro-puces ont tendance à induire un «écrasement» des ratios d expression. Par ailleurs, les patrons d expression diffèrent suivant les conditions d exposition utilisées (effet contaminant chimique et effet tidal). Certains clones (voir tableau exemple ci-après) se distinguent par des réponses qui apparaissent comme spécifiques. Il est également à noter l existence d une hybridation croisée entre ADNc de moule zébrée et de moule bleue. L intérêt d une telle hybridation interspécifique devra cependant être validé en utilisant des méthodes plus fines de mesure directe des niveaux relatifs de transcrits comme la RT-PCR quantitative en temps réel. La technologie des macro-puces à ADN semble donc extrêmement prometteuse pour le suivi multimarqueur de l état de santé biologique des eaux douces et marines b-4. Analyse du protéome Au niveau traductionnel, les acteurs moléculaires impliqués dans la réponse au stress chimique ont été repérés par analyse différentielle des protéomes en utilisant la technologie d électrophorèse bidimensionnelle b-4.1. Etablissement de cartes protéomiques de référence de branchies de Mytilus edulis Grâce à l acquisition d un système d électrophorèse multigels, nous avons pu établir une carte protéomique de référence des protéines solubles de la branchie de moule bleue, dans la gamme de ph 3-10 (Fig 22). 36

37 Figure 22 : Carte 2D type des protéines cytosoliques de branchie de moule bleue après séparation par électrophorèse bidimensionnelle. Ce gel est représentatif de l ensemble des cartes protéiques obtenues, qui comprennent chacune de 600 à 700 taches (spots). Ces spots sont distribués sur l ensemble du gel, dans une gamme de ph comprise entre 4 et 8,5 et de poids moléculaire entre 5 et 90 kda. Cependant, la majorité des spots se situe dans une gamme de ph comprise entre 4 et 7 unités pour les protéines de faibles poids moléculaires et, aux alentours de 5,5 pour celles de hauts poids moléculaires. La comparaison des coordonnées de certains spots (pi/pm) avec les données existantes en électrophorèse bidimensionnelle et avec les séquences génomiques (ExPASy) de Mytilus edulis, a permis de poser des hypothèses sur les protéines correspondantes (Tableau 3). Tableau 3 : Identification de spots protéiques isolés à partir de cartes 2D d extraits cytosoliques de branchie de moule bleue Mytilus edulis. Ces hypothèses ont été ensuite vérifiées grâce à l identification par spectrométrie de masse et/ou microséquençage. (L analyse par spectrométrie de masse a été réalisée au Centre Universitaire 37

38 de Spectroscopie en collaboration avec le Dr. C. LANGE, de l UMR 6044 CNRS, équipe de l IFRMP 23, à l Université de Rouen, à l aide d un appareil MALDITOF TOFSpecE (Micromass, Manchester UK) doté d un laser azote (λ=337 nm, mode réflectron). L identification par microséquençage s est faite en collaboration avec P. COSETTE et T. JOUENNE de l UMR 6522 CNRS (IFRMP 23, Université de Rouen)) b-4.2. Etude in situ sur des effluents de centrale thermique EDF Suite aux résultats d une étude sur le stress oxydant réalisée sur différents sites du port du Havre, les empreintes protéomiques branchiales de moules prélevées aux sites d entrée (S5) et de sortie (S2) du système de refroidissement de la centrale thermique du Havre ont été comparées. La figure 23 fournit une représentation schématique des spots différentiellement exprimés, lesquels sont distribués de façon homogène sur l ensemble du gel. Figure 23 : Expression différentielle des protéines solubles de branchies de moules bleues vivant à l entrée (s5) et en sortie (s2) du circuit de refroidissement de la centrale thermique EDF du Havre. La figure donne une représentation schématique du mode d analyse quantitative des taches protéiques localisées sur les gels 2D de protéomes branchiaux. Pour chaque graphe, les barres d histogrammes correspondent au volume optique d un même spot présent sur chacun des 8 gels d électrophorèse exploités, 4 pour les animaux du site s5 (bleu) et 4 pour ceux du site s2 (rouge). La comparaison des empreintes protéiques des tissus branchiaux de moules prélevées à l entrée (S5) et à la sortie (S2) des conduites d eau de refroidissement de la centrale thermique de EDF située dans le port du Havre a permis de mettre en lumière des variations significatives d expression de certaines protéines. Différents cas de figures apparaissent : des spots protéiques détectés au niveau du site d entrée de la centrale mais qui ne le sont plus au niveau du site de sortie ou inversement, présents au site de sortie mais pas au site d entrée, des spots communs aux deux groupes mais qui présentent des différences significatives de volume entre les deux groupes se traduisant soit par une 38

39 expression plus faible soit par une expression au contraire plus forte dans les branchies des animaux issus du site S2 (sortie) comparativement à ceux du site S5 (entrée) (Fig 23) b Etude portant des expositions au pétrole brut seul ou en mélange Une double exposition de moules bleues à des produits pétroliers a été réalisée en coopération avec le laboratoire Akvalmijø du centre RF-Rogaland Research (Stavanger, Norvège). La première condition a consisté en une contamination sous flux continu, de moules bleues par 0,5 ppm de pétrole brut de Mer du Nord (un mélange de HAP dont le composé majoritaire est le naphtalène). La seconde expérimentation a été réalisée avec un mélange de 0,5 ppm de pétrole brut complémenté par 0,1 ppm des principaux HAPs et de 0,1 ppm d un mélange d alkylphénols, surfactants injectés dans les puits de pétrole par les industriels et retrouvés dans les eaux usées, qualifiées d eau de production pétrolière. Ce mélange est représentatif du contexte polluant rencontré aux abords des plateformes offshore en Mer du Nord. L expérience d exposition au pétrole brut de Mer du Nord a été menée au laboratoire Akvamiljø (RF-Rogaland Research, Stavanger, Norvège) dans le cadre du programme européen BEEP (Biological Effects of Environmental Pollution in marine coastal Ecosystems). Les moules bleues ont été prélevées sur le site de référence Førlandsfjorden, au large des côtes norvégiennes. L analyse protéomique des échantillons de moules exposées au pétrole brut de Mer du Nord comparativement aux témoins a porté sur 410 spots. Parmi ces spots, 56 protéines c est-à dire environ 14% des spots, présentent une modification significative. De même que précédemment, ces 56 spots se subdivisent eux-mêmes en catégories distinctes : (i) des spots qui ne sont détectés que dans l un ou l autre des groupes (apparition ou disparition) ; (ii) des spots qui sont détectés dans les deux conditions expérimentales mais qui présentent des variations significatives d intensité entre les deux groupes comparés (augmentation ou diminution). La comparaison par rapport aux témoins des moules exposées durant 21 jours au mélange de pétrole brut (0,5 ppm), de HAP (0,1 ppm) et d alkylphénols (0,1 ppm) destiné à mimer l eau de production pétrolière a porté sur un total de 341 protéines. Comme précédemment, les protéines sont en majorité communes aux deux conditions expérimentales et sur l ensemble des spots comparés, 76 (22,3% des spots comparés) sont différentiellement exprimés. Ainsi, la comparaison des protéomes branchiaux de moules exposées soit à du pétrole brut, soit à un mélange à base de pétrole, d HAP et d alkylphénols, a permis de mettre en lumière des variations d expression de certaines protéines. Parmi ces protéines cinq ont été identifiées. Quatre d entre elles ont une expression significativement diminuée après exposition aux polluants ; il s agit de deux protéines du cytosquelette, l actine et la tropomyosine et de deux protéines du métabolisme énergétique cellulaire, la fructose biphosphase aldolase et la malate deshydrogènase. La cinquième protéine identifiée est une «heavy metal binding protein» dont l expression est de façon cohérente augmentée lors de l exposition aux polluants. Il est à noter que la comparaison des variations protéomiques induites par ces deux expositions a permis de montrer la présence possible de spots induits ou réprimés à la fois dans les branchies des animaux exposés au pétrole brut et exposés au mélange de contaminants. De plus, certains de ces spots semblent correspondre à des protéines nouvellement exprimées ou réprimées dans les branchies des moules soumises à l effluent aqueux de la centrale thermique EDF du Havre. Cependant, ces observations demandent une confirmation par identification précise des spots b Effets sur le protéome des contaminants chimiques et des conditions de tidalité chez Mytilus edulis Cette recherche est effectuée dans le cadre du programme DECIME (ACI ECOTDYN). Les analyses d empreintes protéomiques obtenues sur les branchies de moules prélevées in situ sont en cours. D ores et déjà, au niveau du site témoin, elles mettent en évidence des modifications de l expression du protéome branchial en fonction du régime tidal (Fig 24). 39

40 Figure 24: Empreinte protéomique de la branchie de Mytilus edulis. Les flèches indiquent les spots protéiques identifiés a priori à partir des travaux de Manduzio (2004). Les spots entourés de vert présentent des variations d expression entre la fin d une émersion de 5 heures et 2 heures de réimmersion. 1: «ATP synthase chain» 55,2kDa/4,6; 2 : «Actin» 42,2kDa/5,48 ; 3: «Replication factor C» 37,1kDa/7,63 ; 4: «Cyclin D1» 33,5kDa/5,35 ; 5: «Cyclin D1» 30,7kDa/5,48. L analyse protéomique montre notamment que 11% des protéines révélées présentent des modifications d expression suite à la phase de réimmersion : 12 apparitions, 6 protéines surexprimées, et 59 sous-exprimées (Fig 25). Dès lors, cette approche indique que l utilisation des empreintes protéiques dans l évaluation des niveaux de contamination de sites naturels ne peut s affranchir des phénomènes purement physiologiques associés au régime de tidalité (travaux publiés par Manduzio et al., 2005a et 2005b). Figure 25 : Localisation et intensité relative des spots protéiques différentiellement exprimés dans les branchies de Mytilus edulis du haut de l estran d Yport, échantillonnés à la fin d une émersion de 5 heures et 2 heures après la réimmersion. 40

41 Biochimie des enzymes du système anti-oxydant L objectif était de suivre des activités de défense cellulaire en tant que marqueurs potentiels de stress chimiques chez la moule, afin de mieux comprendre la réponse au stress oxydant de cette espèce. Ce travail a donné lieu à la publication d une revue sur le stress oxydant. Quatre enzymes antioxydantes ont ainsi fait l objet de notre étude, la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion-réductase (GRd), la glutathion peroxydase (GPx) et la catalase (CAT) ainsi qu une enzyme de détoxication, la Glutathion S-transférase (GST). La SOD assure la destruction de l anion superoxyde par dismutation en peroxyde d hydrogène. La catalase permet ensuite l élimination du peroxyde d hydrogène formé. Une seconde voie de destruction du peroxyde d hydrogène fait intervenir la glutathion peroxydase. Cette réaction est couplée à l oxydation du glutathion qui est ensuite régénéré par réduction au cours d une réaction faisant intervenir la glutathion réductase. Afin de comparer leurs niveaux d activités, ces activités ont été mesurées dans les tissus de moules issues de différents sites du port du Havre à plusieurs périodes de l année, ou exposées à des conditions contrôlées de pétrole brut additionné ou non d HAP et d alkylphénols. Les analyses concernant la SOD ont été réalisées après séparation par isoélectrofocalisation et révélation sur gel des échantillons. Dans ces conditions, nos études précédentes ont en effet mis en évidence, chez la moule bleue, au moins trois isoformes de superoxyde dismutase, dont une forme inductible a. Comparaison inter-sites de l activité SOD La comparaison de l ensemble des modifications des activités enzymatiques observées, dans la glande digestive et les branchies de moules prélevées sur différents sites du port du Havre, a fait tout particulièrement ressortir le site correspondant à la zone d évacuation des eaux provenant de la centrale thermique canalisées à ce niveau par des palplanches. Les variations sont moins importantes chez les animaux issus de sites correspondant soit à une zone de dilution importante des effluents de la centrale, soit à une zone en amont de la station de pompage de l eau de refroidissement de ce complexe industriel. Par ailleurs, ces variations sont plus prononcées au cours de l été. Les résultats obtenus pour la superoxyde dismutase présentent un intérêt particulier. Si peu de variations significatives de l activité totale (la somme des contributions des trois isoformes) sont notées, l analyse de chaque isoforme prise séparément montre une induction de la forme SOD-3 à de nombreuses reprises dans les échantillons provenant des sites les plus pollués. De plus, l étude de la participation de chaque isoforme à l activité totale permet de souligner d autres changements apparaissant chez les animaux des sites contaminés, à la fois dans les branchies et dans la glande digestive. Ainsi, la contribution de l isoforme SOD-1 semble diminuer, alors que celles de l une et/ou l autre des deux isoformes augmentent, suggérant le caractère interconvertible de ces isoformes b Exposition à un mélange d hydrocarbures Les conditions testées sont celles décrites plus haut, c'est-à-dire une exposition de moules bleues à deux contextes de contamination environnementale : une eau contaminée par, soit du pétrole brut, soit par un mélange de pétrole additionné d HAP et d alkylphénols afin de mimer la pollution induite par l eau de production aux abords des plateformes pétrolières. L activité de la glutathion réductase est significativement diminuée après exposition des animaux au pétrole brut. Cette réduction est de même ordre dans les deux tissus (environ - 40%). En présence du mélange de contaminants, la réduction n est retrouvée que dans la glande digestive, mais son amplitude est plus prononcée (-57%). Aucune variation de l activité totale de la superoxyde dismutase n est observée à la suite de ces expositions. Cependant, l activité de l isoforme SOD-1, comme sa contribution à l activité totale, sont significativement diminuées dans les deux tissus des animaux exposés au mélange pétrole, HAP et alkylphénols. Dans la glande digestive, cette réduction est accompagnée d une augmentation parallèle de l isoforme SOD-3, situation qui n est pas retrouvée dans les branchies. L activité glutathion S- transférase n est pas significativement modifiée dans les deux contextes contaminants comparativement aux animaux témoins, même si les valeurs mesurées en présence de pétrole tendent à être inférieures. Cette diminution est en revanche significative comparativement aux mesures réalisées 41

42 chez les animaux exposés au mélange de pétrole, HAP et alkylphénols (mimant l eau de production pétrolière). L enrichissement du pétrole par les HAP et les alkylphénols semble ainsi bloquer l effet inhibiteur induit par le pétrole seul sur l activité GST. Enfin, la glutathion peroxydase ne présente aucune variation d activité dans le cadre de cette étude. En résumé, l exposition des moules bleues au pétrole brut et au pétrole complémenté par des HAP et des alkylphénols pour mimer l eau de production, induit des variations complexes. L absence de modification de l activité glutathion peroxydase conduirait à éliminer une réponse de type stress oxydant. Cependant, les changements de contribution des isoformes de la superoxyde dismutase semblent démentir cette hypothèse. Les résultats suggèrent également l existence d une certaine spécificité tissulaire des réponses, avec une sensibilité supérieure de la glande digestive par rapport aux branchies c. Mécanismes anti-oxydants lors d un double stress lié à l exposition aux xénobiotiques et à la tidalité L objectif est principalement de rechercher les effets propres des xénobiotiques et de la tidalité sur l activité des enzymes clés de lutte contre le stress oxydant. A cette fin, une approche expérimentale conduite sur le dispositif décrit plus haut est combinée avec une étude in situ, afin de confronter les résultats obtenus c-1. Approche expérimentale en conditions contrôlées de laboratoire L analyse des activités des mécanismes anti-oxydants a été réalisée sur les branchies et la glande digestive de moules échantillonnées à la fin de la période d émersion (après 5h), pour les animaux en régime tidal, et simultanément pour les animaux maintenus immergés. Dans ces conditions, peu de différences significatives des niveaux d activité sont enregistrées entre les animaux exposés au mélange de contaminants et les témoins quelque soit le régime tidal ou subtidal imposé. Cependant, il apparaît que l activité de la SOD branchiale des animaux exposés présente une inversion de tendance décalée dans le temps, au cours de la première semaine pour les moules immergées, à la fin de 14 jours d exposition pour les animaux en régime tidaux (Fig 26). Dans ce tissu, le niveau de l activité GST est nettement supérieur chez les organismes tidaux et exposés par rapport aux autres conditions testées (Fig 27). Dans la glande digestive, une augmentation transitoire de l activité SOD apparaît chez les animaux exposés. Dans ce tissu, l activité GRd est accrue chez les organismes exposés aux contaminants quelles que soient les conditions expérimentales (figure 27). Figure 26 : Evolution de l activité de la SOD et de la GST dans les branchies de Mytilus edulis au cours d une exposition au mélange de contaminants et en régime tidal. Valeurs moyennes ± ESM, n = 10. (Rouge : moules exposées ; Bleu : témoins ; Carré : régime tidal ; Rond : régime subtidal). 42

43 Figure 27 : Niveau d activité de la GRd dans la glande digestive de Mytilus edulis au cours d une exposition au mélange de contaminants et en régime tidal. Valeurs moyennes ± ESM, n = 10. (Rouge : moules exposées ; Bleu : témoins ; Carré : régime tidal ; Rond : régime subtidal). Au cours des expositions, les animaux ont été également échantillonnés juste avant l exondation pour les moules en régime tidal, et simultanément pour les animaux maintenus immergés. Les mesures d activités enzymatiques en cours, montrent d ores et déjà des différences de profil d activité de ces différents mécanismes. Il apparaît notamment que l activité de la GPx est très fortement augmentée dans la glande digestive après 14 jours d exposition lorsque les animaux sont échantillonnés en période d immersion. L étude comparative des protéomes des branchies, visant à identifier des protéines différentiellement exprimées en fonction des conditions expérimentales, est en cours. Les premières analyses tendent à montrer des différences notables entre les individus, différences pouvant être attribuées spécifiquement au régime tidal imposé et/ou à l exposition aux contaminants c-2. Approche in situ L étude in situ a été réalisée sur les moulières de l estran naturel d Yport (Seine-Maritime) et de la digue Sud de l avant-port du Havre, choisis respectivement comme site de référence et site contaminé. Sur chaque site, deux stations, en haut et en bas de la zone de répartition verticale de la moulière, ont été échantillonnées à différents temps du cycle de marée. Les animaux sont disséqués sur place dès leur collecte et les tissus conditionnés, immédiatement plongés dans l azote liquide. Cette partie de l étude nous permet d apprécier le niveau de variation/variabilité des différents mécanismes anti-oxydants en fonction d une dimension spatiale et d une dimension temporelle. La dimension spatiale vise à évaluer, i) la variabilité au sein d un même site de prélèvement (comparaison intra-site) traduisant pour les stations d un même site des périodes d exondation différentes subies par M. edulis, ii) les variations entre des sites différemment exposés à la contamination (comparaison inter-site). La dimension temporelle vise à apprécier au sein de chaque site, les variations du niveau d activité de ces mécanismes au cours i) du cycle tidal d alternance émersion/immersion, et ii) du cycle saisonnier. Les activités de cinq enzymes intervenant directement ou indirectement dans la détoxication des espèces réactives de l oxygène et des peroxydes organiques (superoxyde dismutase, SOD, catalase, CAT, la glutathion péroxydase, GPx, glutathion réductase, GRd et la glutathion-stransférase,gst) ont été mesurées dans les branchies et la glande digestive des moules échantillonnées. Les résultats obtenus mettent en évidence plusieurs facteurs pouvant entraîner des différences spatiales et temporelles. Sur le plan spatial, il apparaît que les niveaux d activité des mécanismes anti-oxydants sont globalement plus élevés dans les tissus des moules de haut-estran (différence intra-site), les écarts étant plus marqués lorsque les animaux sont échantillonnés avant leur phase d émersion. Des profils similaires sont observés pour les deux sites. Toutefois, on constate d une part que certaines activités paraissent plus élevées dans les moules du site contaminé (Fig 28) pour un positionnement vertical équivalent entre Yport et Le Havre et d autre part, que les niveaux 43

44 d activité de la GPx et de la GRd apparaissent plus élevés dans la glande digestive des moules de bas niveau du site contaminé. Figure 28 : Niveau d activité de la catalase dans les branchies de Mytilus edulis en fonction de sa répartition spatiale sur les estrans d Yport (barre pleine) et du Havre (barre hachurée) avant l émersion (PRE-E) et après deux heures d émersion (E = 2H) en février Valeurs moyennes ± SEM, n = 10. En rouge, haut niveau d estran, en bleu, bas niveau d estran. Sur le plan temporel, des fluctuations d activité de la plupart des enzymes sont observées au cours du cycle tidal, variations intervenant majoritairement au cours des phases de transition (i.e. passage en émersion et/ou faisant suite à la ré-immersion, figure 29). Figure 29 : Evolution de l activité de la catalase dans les branchies de Mytilus edulis au cours de l émersion et en fonction de sa répartition spatiale sur l estrans d Yport en octobre Valeurs moyennes ± SEM, n = 10. En rouge, haut niveau d estran, en bleu, bas niveau d estran. Des variations similaires ont pu être observées au cours de la phase expérimentale par un suivi de l activité de ces enzymes au cours d un cycle tidal complet. Par ailleurs, les niveaux d activité des enzymes présentent pour les deux sites des fluctuations saisonnières marquées, et notamment durant le printemps (avril-mai) où les niveaux atteints semblent maximaux. Enfin, la technique utilisée pour évaluer l activité SOD (méthode semi-quantitative par révélation après migration électrophorétique) révèle une interconversion des isoformes de cette enzyme associée avec le cycle tidal, modifications déjà observées et préalablement attribuées à un niveau élevé de contamination. Les analyses d empreintes protéomiques obtenues sur les branchies de moules prélevées in situ sont en cours. Les travaux réalisés mettent en évidence chez Mytilus edulis les interactions entre d une part, les processus d acclimatation permettant de supporter les contraintes du régime tidal via 44