La recherche d anticorps anti-glycoprotéines plaquettaires

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1 La recherche d anticorps anti-glycoprotéines plaquettaires Dr C. Picard Laboratoire d Immunogénétique EFS A-M 17/09/10

2 Glycoprotéines plaquettaires et polymorphisme HPA GP Ia-IIa GP IIb-IIIa GP Ib-IX-V HPA-4 HPA-16 HPA-2 HPA-10 HPA-5 HPA-1 HPA-7 HPA-12 HPA-13 HPA-9 HPA-6 HPA-3 HPA-11 HPA-8 S S S S GPIa GPIIa d après Newman PJ, McFarland JG et al 1998 (6) GPIIb GPIIIa GPIX GPIb-b GPIb-a GPV GPIb-b GPIb-a GPIX

3 Nomenclatures des antigènes plaquettaires

4 Les 6 polymorphismes de la sous-unité β3 HPA-1a 0.85 HPA-1b 0.15

5 Les polymorphismes de l intégrine α2 HPA-5 Glu505/Lys505 HPA-13w Thr799/Met799 HPA5-a Brb Bra HPA-5b HPA-13aw HPA-13bw

6 Demandes de recherche d anticorps anti-glycoprotéines plaquettaires Auto? -Thrombopénie inexpliquée - PTI et maladies auto-immunes - Thrombopénie néo-natale Allo? - Suspicion d incompatibilité foeto-maternelle - Purpura Post-transfusionnel

7 TESTS BIOLOGIQUES SPECIFIQUES

8 1/ GENOTYPAGE HPA: PCR SSP Allo-immunisation fœto-maternelle et transfusionnelle 2/ RECHERCHE D ANTICORPS PAR LA TECHNIQUE MAIPA -détection d anticorps fixéspécifiquement sur une des glycoprotéines plaquettaires - grande sensibilité mais durée longue ( environ 20h) -MAIPA direct : Ac fixés sur plaquette - MAIPA indirect : Ac circulants Allo-immunisation et auto-immunité

9 Prélèvements: 1 tube sur EDTA Le génotypage HPA Indications: Déterminer une incompatibilitégroupale : -entre les 2 parents (IFM) -entre la mère et l enfant (TNN) Attention : Incompatibilité groupale /= Présence d allo-anticorps Intérêt: Permettre la sélection de donneurs de plaquettes - dans un but thérapeutique (Inefficacité plaquettaire) - de constituer un panel réactif pour la technique MAIPA

10 Principe de la PCR SSP

11 Génotypage HPA par SSP-PCR Kit Protrans HPA-1a HPA-1b HPA-2a HPA-2b HPA-3a HPA-3b HPA-5a HPA-5b Génotypage : HPA-1a+/b+ HPA-2a+/b- HPA-3a-/b+ HPA-5a+/b-

12 Prélèvements pour MAIPA direct et indirect. 1 tube sec. Plaquettes : > 50 G/l : 30 ml sur EDTA (5x7ml) < 50 G/l : 50 ml sur EDTA (9x7ml). Renseigner la justification de la demande d examen sur le bon

13 Principe de la technique MAIPA (Kiefel et al, 1987)

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15 Thrombopénie néonatale Allo-immune

16 Thrombopénie néonatale allo-immune : Physiopathologie Destruction des plaquettes du fœtus par des allo-anticorps de la mère dirigés contre des antigènes plaquettaires de l'enfant absents chez elle. Ces anticorps, de nature IgG, traversent le placenta dès la 16ème semaine. Présence des Anticorps dès le premier enfant. Elimination des plaquettes fœtales recouvertes d'anticorps par le système réticulo-histiocytaire.

17 cause : Alpes Méditerranée Thrombopénie néonatale allo-immune : Aspects immunologiques -anti-hpa : dans la grande majoritédes cas -Anti HPA-1 a et Anti HPA-5 b sont les plus fréquents chez les européens. -Anti HPA-4 a ou b en Asie centrale. -anti-hla ou ABO : très rare ou non démontrée association entre le groupe HLA DRB3*01:01 et la prédisposition àl'immunisation Anti HPA-1a

18 Fréquences des allo-types HPA dans la population européenne 79% (anti-hpa-1b)? 20% (anti-hpa-5b)?

19 Thrombopénie néonatale allo-immune : clinique Epidémiologie -1 cas sur 2000 naissances -hémorragie intra-cérébrale : 10-20% -décès : 10% des cas -séquelles neurologiques : 20% des cas Clinique - Variable suivant le type d allo-immunisation : HPA-1a Pétéchies généralisées quelques minutes après la naissance. -Critère de gravité: plaquettes < 35 G/l - Aggravation à J3-J5 (maturation post-natale du système monomacrophagique) - Possibilité de thrombopénie in utero.

20 Thrombopénie néonatale allo-immune : Diagnostic Thrombopénie chez le nouveau-né< /L Génotypage HPA : incompatibilitégroupale dans un ou plusieurs systèmes HPA entre le père et la mère recherche d'allo-anticorps maternels dirigés contre les antigènes des plaquettes du père biologique et absents chez la mère, répétée après 3 semaines si négative Prédictivitéévolutive biologique? Génotypage plaquettaire de l'enfant pour vérifier l'incompatibilité3 à6 mois après la naissance. Diagnostic différentiel : - thrombopénie infectieuse -thrombopénie médicamenteuses - thrombopénie auto-immune maternelle

21 Thrombopénie néonatale allo-immune : Suivi familial génotypage plaquettaire des soeurs de la mère (risque familial) typage HLA (prédisposition à l'immunisation) recherche d'allo-anticorps maternels dirigés contre les antigènes des plaquettes du père si incompatibilité.

22 Thrombopénie Auto-Immune

23 THROMBOPENIES AUTO-IMMUNES : Physiopathologie du PTI Formation de complexes antigènes-anticorps fixés àla plaquette par leur récepteur Fc Auto-anticorps dirigés contre des épitopes non polymorphiques des GP plaquettaires IIbIIIa, IbIX, IaIIa Augmentation des immunoglobulines associées aux plaquettes - par leur Fab : reconnaissance spécifique -par leur Fc : immuns complexes - par une liaison non spécifique

24 THROMBOPENIES AUTO-IMMUNES : Diagnostic Technique MAIPA :présence d'ac fixés àla membrane plaquettaire par leur Fab et reconnaissance spécifique des épitopes non polymorphiques des GP plaquettaires. MAIPA direct : spécificitéanti-gp plaquettaires fixés MAIPA indirect : spécificité anti-gp des Ac sériques -sérum du malade + plaquettes du malade : test auto + -sérum du malade + plaquettes témoins : test random + GP IIa-IIIb > GPIb-IX>>>

25 5 cas de recherche d anticorps dans le cadre de thrombopénie

26 MAIPA indirect MAIPA direct IIbIIIa IaIIa IbIX CAL: PLA1/2, Bak a/b AND : Br a/b 139:Ko a/b A B C Temoin + 0,950 + A B C NEY anti PLA 1 1,237 + BEN anti Bra 0,575 + C,,,, Manon 24/02/06 0, ,083-0,082 - B,,,, Quentin 27/02/06 0, , ,452 + S,,,, Pierre 10/02/06 0, ,110-0,098 - C,,,, Laetitia 27/02/06 0,136-0, ,085 - P,,,, Anne 16/02/06 0,139-0,071-0,091 - Temoin A Temoin B 0,03 Temoin C 0,03 C.Manon 24/02/06 0,050-0,030-0,020 - B Quentin 27/02/06 0, ,050-0,130 + S,,,,Pierre 10/02/06 0,056-0,085-0,031 - C Laetitia 20/02/06 0,016-0,002-0,026 - P,,,, Anne 17/02/06 0, , ,124 + Positif : DO > 200 Positif DO > 100

27 Résultats MAIPA Identification N NEY Anti PLA1 A BEN Anti Br a B C,,,,MANON 24/02/06 B,,,, QUENTIN 27/02/06 S,,,, Pierre 10/02/06 C,,, Laetitia 27/02/06 1=139 PLA 1/1, Bak a/b 2=JOU PLA 2/2, Bak a/a 3=PAR PLA 2/2, Bak a/b 4=CAL PLA 1/2, bak a/b 5=125 Br a/a 6=GAR Br b/b 7=SEG Br a/b 8=GAR Ko b/b 9=139 Ko b/b Résultats : DO <150 : NEGATIF 1, , , , ,081-0,008-0, , ,051-0, , ,073-0,068-0, , , ,075-0, ,033-0, ,059-0, ,034-0,045-0, ,051-0,068-0,110-0, ,103-0, ,093-0, ,133-0,096-0,138-0, ,093-0,118 - auto AC auto AC anti-hpa-1a anti-hpa-5b IIb IIIa Ia IIa Ib IX 150<DO <200 :DOUTEUX DO >200 POSITIF

28 La recherche d anticorps anti-glycoprotéines plaquettaires : Conclusion Interprétation clinico-biologique obligatoire Contrôle obligatoire si dissociation avec contexte Autres techniques de détection et d identification