Protocoles biochimiques «consensus» Table ronde: diagnostic des maladies mitochondriales
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- Dominique Thierry Grenon
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1 Protocoles biochimiques «consensus» Table ronde: diagnostic des maladies mitochondriales Dr Anne Lombès CRICM U975 4ème colloque «Meetochondrie» Aussois, 9-12 mai 2010
2 Les protocoles biochimiques dans les maladies mitochondriales Buts? Méthodes? Résultats?
3 Buts : 1) Diagnostic (pronostic, traitement) Les maladies mitochondriales sont dues à une altération des oxydations phosphorylantes (OXPHOS) High lactate 2% 17% 4% ± suggestive, muscle morphology 10% 24% 15%) 2% Defective activity 100% RRF, COX- 50% Genetic identification
4 Méthodes : complexité des OXPHOS Les oxydations phosphorylantes impliquent de multiples facteurs, de multiples étapes, dans un contexte intramembranaire
5 Diversité des protocoles POLAROGRAPHIE Consommation d oxygène en présence de substrats o Avantages : Analyse globale avec couplage o Inconvénients : Tissu frais, Faible sensibilité SPECTROPHOTOMETRIE Consommation ou production de substrat (densité optique) o Avantages : Etapes séparées, Sensibilité, Tissu congelé o Inconvénients : Pas d étude du couplage, Vmax HISTOCHIMIE Précipitation de sel couplée à une oxydo-réduction o Avantages : Etapes séparées, Sensibilité, Tissu congelé Quantité tissulaire minime o Inconvénients : Seulement CII and IV, (V?), faible sensibilité AUTRES : Spectre des cytochromes, Production d ATP, Substrats radiomarqués
6 Méthodes différentes entre centres diagnostiques Méthodes employées Spectrophotométrie Histochimie Polarographie Protocoles des méthodes Type de tissu (muscle, foie, fibros) Frais ou congelé Population urbaine Centre diagnostique
7 Évaluation des conséquences de la diversité des protocoles pour les essais spectrophotométriques Citrate Synthase COX! ! ! ! ! ! ! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! 8! 9! Activités en nmoles/min/mg proteines mesurées sur une préparation unique de mitochondries de cœur de boeuf
8 Tentative de consensus pour les essais spectrophotométriques 1) DISCUSSIONS BUTS : Activité spécifique élevée, Cinétique linéaire, Proportionnalité vitesse/quantité de protéines MÉTHODES : Température, tampons, concentrations 2) VALIDATION EXPÉRIMENTALE Mitochondries de cœur de bœuf, Quadriceps de souris, Muscle humain, Fibroblastes cutanés humains F. Medja, S. Allouche, P. Frachon, C. Jardel, M. Malgat, B. Mousson de Camaret, A. Slama, J. Lunardi, J.P. Mazat, A. Lombès (Mitochondrion, 2009)
9 Quelques surprises Beef heart mitochondria Activity (nmol.min -1.mg -1 ) MAN CPT CCA Citrate synthase Complex IV
10 Quelques surprises IV activity (nmol.min -1.mg -1 ) Human muscle Phosphate Human fibroblasts Phosphate
11 Des difficultés plus attendues Complexe IV Absorbance Cœur de boeuf Cyt c (µm) Muscle humain Time (minutes) Protein (µg/assay)
12 Résultats : 1)Protocoles et leur validation mis à disposition 2)Reproductibilité entre centres démontrée Human muscle (n=89 1 / 39 2 / 26 3 ) Human liver (n=30 1 / 21 2 ) I II III IV 42±16 / 42±8 / 56±31 27±12 / 36±12 61±22 / 68±20 / 79±38 125±59 / 169±24 166±72 / 301±77 / 252±119 84±35 / 80±28 184±64 / 210±42 / 205±98 69±31 / ND La Salpêtrière Paris 1, CHU d'angers 2, CHU de Caen 3
13 Résultats : 3)Application des protocoles En France Angers, Bordeaux, Caen, Grenoble, Lille, Paris (La Salpêtrière), Rennes A l étranger Padoue (Italie), Barcelone (Espagne), Afrique du Sud, Hongrie 4)Discussion, échanges entre centres Lots commerciaux, erreurs dans les protocoles, Comparaison/discussion des résultats
14 Conclusion-Perspectives 1) CONTRÔLE DE QUALITÉ - Indispensable pour accréditation - Echantillons contrôles normaux et pathologiques? - Centres n appliquant pas les protocoles «consensus»? 2) AMÉLIORATION DES PROTOCOLES - Spectrophotométrie (complexe III) - Autres : Polarographie Préparation des mitochondries (complexe V) Gels natifs
15 Conclusion-Perspectives 3) NÉCESSITÉ DE L APPROCHE «CONSENSUS»? - Un seul centre de référence? Incidence des maladies mitochondriales ~ 1/5000, des mutations pathogènes de l ADN mit ~ 1/ nouveaux patients/an, ~ patients à analyser/an «débrouillage» indispensable - Chacun fait selon son protocole? Diversité considérable des maladies elles-mêmes Organisation diagnostique (EPU, réseaux ) Projets «ciblés» (recrutement multi-centrique indispensable)
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