Etude non invasive du remodelage bronchique chez la souris

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1 Etude non invasive du remodelage bronchique chez la souris M. Lederlin, M. Montaudon, P. Berger, A. Ozier, F. Laurent Laboratoire de physiologie cellulaire respiratoire INSERM U885, Bordeaux 2 Unité d imagerie thoracique et cardiovasculaire, Hôpital Haut-Lévèque, CHU Bordeaux

2 Contexte Asthme = pathologie fréquente dont l incidence augmente régulièrement En recherche préclinique : nécessité d outils diagnostiques applicables au petit animal, si possible non invasifs

3 Le remodelage bronchique Modifications complexes de la paroi bronchique, secondaires à une inflammation chronique Anapath : hypertrophie et hyperplasie des cellules musculaires lisses, dépots de collagène au niveau de la membrane basale, desquamation épithéliale, hyperplasie des glandes à mucus, et angiogénèse. Clinique : la présence d un remodelage bronchique est significativement associé à un phénotype d asthme + sévère (diminution de la fonction respiratoire, obstruction bronchique partiellement réversible) Pepe C et al, J Allergy Clin Immunol. 2005;116(3):544-9

4 Imagerie du remodelage bronchique Chez l homme, le remodelage peut être reconnu et quantifié en scanner, sous la forme d un épaississement des parois bronchiques Grenier et al, Eur Radiol Niimi et al, Am J Respir Crit Care Med Chez l animal, de nombreux modèles d asthme ont été développés, notamment chez la souris. Ces modèles sont essentiels pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques Epaississement des parois bronchiques chez un patient asthmatique sévère Cependant, à ce jour, l étude de la paroi bronchique du petit animal est histologique et nécessite le sacrifice de l animal Il n existe pas actuellement de technique non-invasive permettant l évaluation du remodelage bronchique chez le petit animal

5 Objectifs Définir un nouveau paramètre scanographique reflétant le remodelage bronchique chez la souris asthmatique Mettre en évidence des différences de ce paramètre entre un groupe de souris asthmatiques et un groupe contrôle Corréler les anomalies morphologiques TDM aux critères histologiques du remodelage et de l inflammation bronchique

6 Design de l étude 12 souris EFR initiales 6 souris asthmatiques EFR, LBA 6 souris témoins Micro-CT Histologie

7 Modèle murin d asthme 12 souris BALB/c femelles de 5 semaines (Elevage Janvier, Le Genest St Isle, France) Sensibilisation initiale à J0 et J14 par 2 injections intrapéritonéales de 100 μg d ovalbumine (/NaCl 0,9 % pour groupe contrôle) Instillation intranasale d OVA/NaCl à J14, J27, J28, J29, J47, J61, J73, J74, et J75 Henderson et al, Am J Respir Crit Care Med 2002; 165(1):108-16

8 EFR Mesure de l hyperréactivité bronchique : Réalisée à J0 et à J76 (avant et après induction d asthme) Mesure de la réponse à une inhalation de métacholine Chambre de pléthysmographie barométrique corporelle (Emka Technologies, Paris, France) Mesure du Penh (enhanced Pause parameter) 30 secondes après inhalation d un aérosol de métacholine Cet index est obtenu à partir de la courbe de pression inspi-expi enregistrée par le pléthysmographe. Son calcul est basé sur le temps de pause (càd la durée du signal expiratoire). Le Penh est corrélé à la résistance des voies aériennes chez la souris Balb/C Adler et al J. Appl. Physiol. 97:

9 Histologie à J77 LBA à J77 puis sacrifice des 12 souris Prélèvement du poumon gauche de chaque souris Fixation dans la paraffine Colorations HES Actine Trichrome de Masson Calcul pour chaque souris Surface bronchique totale Surface pariétale bronchique Surface interne bronchique Surface du muscle lisse bronchique Surface du muscle lisse vasculaire Espace péribronchovasculaire % de fibrose Taille de la membrane basale Nombre de noyaux

10 Micro-CT Microscanner GE Healthcare explore Locus Equipement vétérinaire Minerve Respirateur Alphalab Module de régulation de température (33 ) Pompe de circulation d air Cellule technique pour imageur CTI 120

11 Anesthésie des souris : Injection intrapéritonéale Kétamine (50 mg/kg) + Xylazine (5 mg/kg) ( analgésie + sédation pour une durée d environ 1 h ) Paramètres de ventilation : Micro CT (adaptés à une acquisition de 17 minutes, et un temps d exposition de 400 ms) Intubation = cathéter 22 G FIO2 = 50% Fréquence respiratoire = 40 cycles/min Volume courant = 2-2,2 ml/cycle (soit l/min) Pression d insufflation = 20 mbar Pression de sécurité = 25 mbar Rapport I/E = ½ INSPI EXPI Acquisition scanographique synchronisée au respirateur images acquises en expiration (cage thoracique relâchée) temps disponible pour l acquisition

12 Micro CT Paramètres d acquisition du protocole retenu : Tension du tube RX = 80 kv Intensité du tube RX = 450 μas Temps d exposition = 400 ms Nombre de projections = 720 Angle d incrément = 0,5 degrés Nombre de passages = 1 Résolution spatiale = 46 μm Temps d acquisition = 17 min Dose reçue = 0,26 Gy

13 Micro-CT 1 cm Axiales natives Images DICOM FOV = 230 mm Matrice = 512² 300 images / examen (poumon inclus dans 180 images) minip Les différentes reconstructions montrent bien l absence d artefacts de mouvement, lié à la bonne synchronisation respiratoire VRT os

14 Post-traitement des images Lumen area = 0,247 mm² Lumen density = -554 HU ROI density = -371 HU 1. Pour chaque souris, les 12 mêmes bronches ( ) sont étudiées 2. Exemple : bronche postérobasale du poumon gauche ( ) 3. Reconstruction de 2 MPR orthogonaux passant par le grand axe de la bronche étudiée 4. Reconstruction d un MPR strictement orthogonal au grand axe de la bronche étudiée 5. Contourage premier de la lumière bronchique 6. Contourage manuel d une couronne péribronchique dont l épaisseur est égale au diamètre de la lumière. Puis mesure de la densité scanographique de cette région d intéret

15 Le concept de densité péribronchique Chez l homme Chez la souris Normal Asthme Contrôle Asthme Chez l homme, la plupart des auteurs utilisent le concept d épaississement des parois bronchiques et mesurent donc des épaisseurs et/ou des surfaces de parois bronchiques En effet les limites externes de la bronche sont biens définies par rapport au parenchyme pulmonaire environnant et donc faciles à contourer par un opérateur (ou à segmenter par un logiciel) Chez la souris, malgré une excellente résolution spatiale et un signal suffisant, la frontière entre paroi bronchique et poumon environnant est beaucoup plus floue, ceci essentiellement pour 2 raisons : - d une part, l acquisition en expiration augmente la densité du parenchyme pulmonaire environnant - d autre part, l infiltrat cellulaire péribronchique est beaucoup plus diffus que chez l homme, ce que confirme l examen des coupes histologiques

16 Résultats Mesures réalisées sur 5 souris Asthme et 5 souris Control (1 souris asthmatique DCD après microct, 1 souris saine insuffisamment anesthésiée artefacts de mouvements rendant l examen ininterprétable) Contrôle Asthme 2 opérateurs ont réalisé les mesures scanographiques (12*10 = 120 bronches) en aveugle du statut histologique de chaque souris Compte-tenu des petits effectifs, des tests non paramétriques ont été utilisés

17 Résultats Souris asthmatiques Souris contrôle P (Wilcoxon) Données pléthysmographiques Penh à J ± 1 2 ± Penh à J ± ± 1.8 <0.01 Micro-CT Volume pulmonaire total (cm 3 ) 0.67 ± ± Densité pulmonaire totale (UH) -467 ± ± Σ surfaces luminales (mm²) 3.73 ± ± Moy densités luminales (HU) ± ± Moy densités péribronchiques (HU) -210 ± ± significatif

18 Résultats Données histologiques P (Wilcoxon) Surface bronchique totale Surface du muscle lisse bronchique Surface du muscle lisse vasculaire Surface du muscle lisse vasculaire/perimètre interne vasculaire Espace péribronchovasculaire % de fibrose Surface du muscle lisse bronchique / Taille de la membrane basale Surface du muscle lisse bronchique / Surface interne bronchique Surface pariétale bronchique/ Surface interne bronchique Nombre de noyaux significatif

19 Analyse par bronche p value (t test) B3G B transmed T Int LSD B10D LID L Moy B6G LIG LSG B4G B1G <0,001 0,001 0,004 0,009 0,013 0,013 0,027 0,039 0,039 0,040 0,053 0,06

20 Corrélations micro-ct / histologie Donnés histologiques Surface bronchique totale Surface pariétale bronchique Surface du muscle lisse bronchique Surface du muscle lisse vasculaire Surface pariétale / Surface interne Surface pariétale / Surface du muscle lisse bronchique Surface muscle bronchique / longueur membrane basale Σ Surfaces pariétales / Σ surfaces internes Surface muscle bronchique / surface interne Σ surfaces muscle bronchique / Σ surfaces internes Surface muscle vasculaire / périmètre interne vasculaire Espace péribronchovasculaire Nombre de noyaux Coeff corrélation de Spearman (P) 0.63 (0.048) 0.67 (0.033) 0.72 (0.018) 0.55 (0.098) 0.63 (0.048) 0.67 (0.033) 0.81 (0.005) 0.71 (0.022) 0.67 (0.033) 0.62 (0.053) 0.44 (0.201) 0.69 (0.025) 0.47 (0.174) significatif

21 Concordance inter/intra observateur

22 Conclusion L étude, en microscanner in vivo, de la densité de l atmosphère péribronchique permet de déterminer si une souris est asthmatique ou non Il existe une corrélation positive entre la densité péribronchique et plusieurs paramètres histologiques du remodelage bronchique Perspectives : - études longitudinales ("monitoring" du remodelage) - évaluation de nouvelles molécules thérapeutiques