Technicien en biologie moléculaire au sein d un institut de recherche privé

Transcription

1 William MERRE Département Biotechnologies 4ieme Année IRSEA Route du Chêne, Quartier Salignan APT Technicien en biologie moléculaire au sein d un institut de recherche privé Rapport de stage ouvrier dans l entreprise IRSEA 3 Août Septembre 2015 Responsable : Dr. Cécile BIENBOIRE-FROSINI Année universitaire

2 Remerciements J aimerais remercier tout particulièrement le Dr. Cécile BIENBOIRE-FROSINI de m avoir accueilli au sein de son département pour effectuer ce stage et pour le temps qu elle m a accordé. Merci à toute l équipe du département de biologie cellulaire et moléculaire pour leur gentillesse, leur accueil et leur aide. Je remercie tous les employés de l IRSEA pour leur accueil, leur sympathie et toutes leurs explications lors des rencontres pendant l intégration dans l entreprise.

3 Sommaire I. Introduction... 1 II. Présentation de l entreprise... 1 a) Historique... 1 b) Le groupe aujourd hui... 1 c) L institut de recherche... 2 d) Le Département de Biologie Cellulaire et Moléculaire... 3 III. Activité de technicien en biologie moléculaire... 3 a) Contrôle de la pureté d acides nucléiques et quantification... 3 b) Conception d amorces... 4 c) Programmation du thermocycleur... 5 d) Réalisation de PCR et mise au point de protocole... 5 e) Dépôt et migration des échantillons... 9 f) Activités hors manipulations IV. Conclusion...11 V. Références webographiques...12 VI. Liste des annexes...12

4 Glossaire Sémiochimiques : signaux chimiques émis par les êtres vivants à des fins de communications interou intra-espèces. Ethologie : étude du comportement des animaux. Outils zootechniques : outil visant à l étude technique et économique des productions animales et de l élevage en général. Royalties : redevances dues au propriétaire d un brevet. Pool : regroupement, mise en commun.

5 I. Introduction Actuellement étudiant en deuxième année du cycle ingénieur au département Biotechnologie s de Polytech Marseille, j ai effectué mon stage ouvrier au sein de l institut de recherche IRSEA. Mon choix s est tourné vers cette entreprise car j avais déjà rencontré le Dr. Cécile BIENBOIRE-FROSINI lors de ma première année de DUT et leurs activités m avaient beaucoup intéressées. Pouvoir découvrir le monde de la recherche et développement dans un institut privé me semblait être une excellente opportunité pour compléter mes expériences précédentes. De plus, le parcours du Dr. Cécile BIENBOIRE-FROSINI est très semblable au mien, car elle a effectué un IUT avant d intégrer l ESIL et cela permettait de voir un cas concret d évolution possible après l école. J ai donc effectué un stage ouvrier de 5 semaines au sein du département de biologie cellulaire et moléculaire. Après une première semaine d intégration dans l entreprise, j ai occupé le poste de technicien en biologie moléculaire afin de réaliser et mettre au point des protocoles de PCR. Une présentation de l entreprise sera effectuée avant d exposer les activités qui m ont été confiées au cours du stage. Ayant signé un accord de confidentialité, les détails des résultats obtenus ou des tests effectués ne seront pas divulgués. II. Présentation de l entreprise a) Historique L IRSEA (Institut de Recherche en Sémiochimie et Ethologie Appliquée) est un institut de recherche et développement privé situé à APT (84) et crée en 1995 par Patrick PAGEAT (directeur scientifique) et Hughes LUCAS de LEYSSAC (directeur financier) sous le nom de Phérosynthèse [1]. Il deviendra IRSEA en Cet institut a pour ligne directive l étude des communications chimiques entre les êtres vivants dans le but de développer de nouveaux outils thérapeutiques et zootechniques. Il en est aujourd hui le leader mondial dans ce domaine avec environ 200 brevets internationaux déposés et un chiffre d affaire de 2,5M en L institut est autofinancé et ses revenus reposent essentiellement sur les brevets internationaux. En effet, ces brevets sont pour la plupart associés à des produits commercialisés (Feliway par exemple) pour lesquels l IRSEA perçoit des royalties. L entreprise compte à ce jour une cinquantaine d employés (techniciens, chercheurs, ingénieurs ) et collaborateurs. b) Le groupe aujourd hui Depuis sa création l institut connait une croissance forte et régulière qui se matérialise par l agrandissement du groupe IRSEA avec de nombreuses entités développées autour de l institut de 1

6 recherche comme le montre la figure 1. Parmi celles-ci, on retrouve Semiokeys qui est chargée du développement et de la commercialisation des produits issus de la recherche et destinés aux animaux de rente. Il existe également IRSEA ARC (Aquaculture Research Center) qui est un laboratoire de recherche situé en Norvège et axé autour des élevages de salmonidés. IRSEA CECBA est le Centre d Ethologie Clinique et Bien-être Animal, destiné à proposer des consultations comportementales d animaux domestiques appartenant à des particuliers, en collaboration avec les vétérinaires de la région, et à proposer des formations. De plus, l institut a développé d autres entités comme IRSEA School, dédié à la formation, qui est, par exemple, partenaire d un master d Ethologie Clinique avec l université de Pise ; IRSEA Edition destiné à éditer leurs ouvrages ; Ethics commitee qui est le comité d éthique évaluant les protocoles de recherche. Enfin la WWLPS (World Wildife library of Pheromones and Semiochemicals) est une entité de soutien aux programmes de préservation de la faune sauvage (réintroduction des chevaux de Przewalski en Mongolie, partenariats avec des zoos etc.) dans laquelle l IRSEA met à disposition ses connaissances et ses moyens techniques. En plus des entités citées ci-dessus, l IRSEA travaille en collaboration avec d autres laboratoires de recherche universitaires, comme l université d Aix-Marseille par exemple. c) L institut de recherche L institut de recherche est divisé en différents départements et services travaillant tous en collaboration et dans lesquels on retrouve animaliers, techniciens, ingénieurs, chercheurs, chefs de département etc. (figure 2). Le conseil de recherche et enseignement, qui est un conseil hebdomadaire, est composé de tous les titulaires d un doctorat impliqués dans un processus d obtention de l Habilitation à Diriger des Recherches et a pour but de discuter et organiser la politique de recherche de l IRSEA. Il y a trois départements de recherches : Ethologie et Neurosciences (DEN), Biologie Cellulaire et Moléculaire (DBCM) et Identification des Sémiochimiques et Conception d Analogues (DISCA). Le plus important en terme d effectif est le DEN qui articule ses projets autour de l influence de sémiochimiques donnés sur le comportement des êtres vivants. Il est divisé en trois unités de recherche : écologie chimique des invertébrés, l éthologie clinique, sémiochimie des interactions sociales et attachement. Le DBCM, lui, est dédié à l étude au niveau moléculaire et cellulaire des mécanismes d action et des effets des sémiochimiques. Enfin, le DISCA a pour but de formuler des analogues de sémiochimiques donnés après les avoir identifiés, et d élaborer diverses formes galéniques de ceux-ci. La direction Recherche et Enseignement supervise le travail de ces trois départements. Elle gère également plusieurs services ayant un rôle de soutien aux activités de recherche et d enseignement réalisées par les 3 départements précédemment cités : statistiques, plateforme d expérimentation animale et la chargée des essais techniques. Le service statistique et 2

7 gestion des données travaille avec tous les départements de recherche dans l analyse statistique des résultats et la mise au point des protocoles. C est aussi ce service qui met en place la stratégie de déroulement des tests pour respecter le travail en aveugle et ainsi éviter tout biais de résultats. On retrouve enfin la direction générale composée du service administratif, de la chargée de communication et les services de maintenance et d entretien. d) Le Département de Biologie Cellulaire et Moléculaire Le DBCM, département dans lequel a été effectué ce stage ouvrier, est dirigé par le Dr. Cécile FROSINI et est composé de Camille CHABAUD (technicienne), Pietro ASPRONI (vétérinaire et chercheur, docteur de l université de Pise) et Antoine VERON (doctorant à l université d Aix- Marseille). Ils mènent diverses activités de recherche qui portent sur la culture cellulaire et l utilisation de cellules souches adultes en thérapie, l étude histologique des organes impliqués dans la communication chimique et notamment dans le cas de pathologies, l étude d expressions de gènes dans différents tissus d intérêts et plus généralement les mécanismes d action des sémiochimiques et leurs effets ainsi que les différents acteurs impliqués (protéines de transport, protéines réceptrices, neurotransmetteurs ) dans ces mécanismes d actions. Le DBCM travaille également en collaboration avec les autres équipes de recherche de l institut en réalisant les manipulations de biochimie (dosage ELISA, analyse SDS-PAGE et Western-Blot, etc.) et de biologie moléculaire (PCR notamment) dont ces derniers ont besoin. III. Activité de technicien en biologie moléculaire Toutes ces manipulations sont réalisées dans le laboratoire de biologie moléculaire et biochimie qui est divisé en 4 salles séparées. On y trouve les deux salles de biologie moléculaire «avant PCR» et «après PCR» (figure 3). Une blouse est disposée dans chaque salle et ne doit pas en sortir pour éviter toute contamination. Le travail se fait sur des ADNc de 4 tissus (glandes lacrymales, parotides, rétro-mandibulaires, et anales) dont l ARN a été préalablement extrait et reverse transcrits en ADNc en 2010 et provenant de 8 chats (5 femelles et 3 mâles). Les manipulations sont réparties de manière à optimiser la journée (PCR le matin et migration l après-midi dans la mesure du possible) et diverses activités sont pratiquées durant les périodes où il n y a pas de manipulations à effectuer. a) Contrôle de la pureté d acides nucléiques et quantification Avant de commencer toute manipulation, la pureté des acides nucléiques extraits doit être vérifiée et ceux-ci doivent être quantifiés. A cette fin, l absorbance à 260 nm et le ratio A260/A280 3

8 est mesuré à l aide du spectrophotomètre SmartSpec Plus de chez Bio Rad. L appareil mesure directement l absorbance à 260 nm et converti cette valeur en concentration d ADN qui est envoyée dans le rapport imprimable (annexe 1). Le ratio A260/A280, où A280 est l absorbance des protéines, doit être proche de 2 (compris entre 1,8 et 2) et donc l écart par rapport à cette valeur permet de visualiser la propreté des échantillons. Selon le même principe, on peut également faire un ratio A260/A230 où l absorbance à 230 nm est celle due aux composés organiques. Le spectrophotomètre disponible à l institut possède une fonction «ratio A280/A260» qui calcule directement ce ratio et l imprime également sur le rapport. Il est possible de modifier les longueurs d onde à tester dans les paramètres de l appareil afin d obtenir de la même manière le ratio A260/A230. Ici, les échantillons de 8 chats ont été contrôlés (4 glandes par chat soit 32 au total). Les résultats ont montré que de l ADNc était présent dans tous les échantillons en plus ou moins grande quantité, et que seuls les prélèvements issus de la glande anale présentaient une légère contamination (rapport A260/A280 d environ 1,7). b) Conception d amorces Cela se fait grâce au logiciel Primer3plus en ligne (figure 4). La séquence d intérêt est rentrée dans le logiciel, puis les paramètres (concentration en Mg2+ qui sera utilisée, taille minimum et maximum des amorces, Tm désirée) et les conditions de la recherche (zone à inclure ou exclure, zone cible, etc.) sont définis. La recherche est lancée et le logiciel renvoie des paires d amorces ainsi que leurs caractéristiques. La paire d amorce qui convient le plus est choisie en se basant notamment sur certains paramètres : taille du fragment désirée, taille de l amorce, Tm, scores d appariement non spécifique. La figure 5 montre deux paires d amorces (Pair 1 et Pair 2) trouvées par le logiciel pour une séquence quelconque. Si on prend l exemple de la paire n 1, on peut voir la position où s hybride chacune des amorces (surlignage violet et jaune sur la séquence), la température médiane de fusion (Tm) et le pourcentage de bases G et C. Ce pourcentage est important dans la détermination du Tm car les interactions entre les bases G et C sont plus fortes que celles entre les bases A et T donc le Tm sera plus élevé. On observe aussi que la séquence est donnée. Enfin, on remarque 2 scores affichés dans la fenêtre de résultats : SELF et ANY. Ces scores correspondent respectivement à l autocomplémentarité en 3 et au score total d auto-complémentarité de l amorce et doivent être le plus faible possible. Les amorces sont ensuite commandées auprès d EUROGENTEC. Après passage de la commande, la fiche technique de chaque amorce est donnée et on peut y retrouver le Tm, la séquence, la concentration en solution etc. (annexe 2). 4

9 c) Programmation du thermocycleur Les PCR nécessitent des cycles de température précis dont dépend grandement le rendu de la réaction. Ces cycles comprennent une première étape de dénaturation totale de l ADN. Viennent ensuite trois étapes : une de dénaturation (30 secondes ou 1 minute), l étape d hybridation des amorces (température à définir pendant 1 minute) et l étape d élongation (30 secondes à 2 minutes en fonction de la longueur du brin à synthétiser). Ce sont ces trois étapes qui sont répétées un nombre X de fois pour faire les cycles thermiques nécessaires à la PCR. Enfin, une fois les cycles terminés on a une étape d élongation finale de tous les brins en cours de synthèse. Pour réaliser ces cycles on utilise donc un thermocycleur MJ MINI Gradient Thermal Cycler de Bio-Rad. Un nouveau programme est créé en se rendant dans le menu du thermocycleur, onglet «New». On rentre ainsi les informations (température et durée) étape après étape en sélectionnant «TEMP». Afin de faire le cycle de trois étapes, il faut introduire une boucle après la quatrième étape de manière à revenir à la seconde. Il faut donc cette fois-ci sélectionner «GOTO» et rentrer le numéro de l étape à laquelle on veut revenir puis le nombre de cycle, exemple : GOTO 2, 29 times. Puis on reprend la procédure précédente pour terminer le programme. De plus, lorsque de nouvelle amorce sont reçues, il faut tester différentes température d hybridation pour voir laquelle offre le meilleur résultat. L appareil utilisé ici possède un programme qui permet de faire un gradient de température et donc tester différentes températures en un seul «run». Pour ce faire, on rentre le programme comme précédemment à une exception près. Lorsqu on arrive à l étape correspondant à l hybridation des amorces, on ne choisit pas «TEMP» mais «GRAD». Il suffit alors de rentrer les deux températures extrêmes et le gradient est calculé et mis en place automatiquement par l appareil de bas en haut de la plaque chauffante avec une température pour chaque ligne. Il est ensuite possible de visualiser les températures appliquées à chacune des lignes. Deux programmes sont présentés en exemple, l un avec gradient et l autre sans (figure 6). Le champ «Lid» correspond à la température du couvercle, qui permet d éviter l évaporation et la formation de gouttes durant la réaction. Les différentes étapes du cycle thermique de la PCR sont retrouvées. La différence entre un programme sans gradient et un avec se trouve à la troisième étape. Dans le cas où il n y a pas de gradient une température est affichée (57 ici) alors qu en présence d un gradient les deux températures extrêmes sont affichées (54 /58 ici). d) Réalisation de PCR et mise au point de protocole Les composants d une réaction de PCR sont les suivants [2] : MgCl2 : sel très important, cofacteur de l ADN polymérase 5

10 Tampon : maintien du ph, concentration en sel etc. Amorce sens : amorce s hybridant sur le brin sens Amorce anti-sens : amorce s hybridant sur le brin anti-sens Nucléotides : sont incorporés pour la synthèse de l ADN ADN : matrice de la réaction ADN polymérase thermostable Eau de qualité biologie moléculaire pour ajuster les volumes et les concentrations finales Les ADN polymérases utilisées sont appelées «Hot-Start», ce qui signifie qu elles ne sont pas actives à basse température. Cela permet de commencer l élongation seulement une fois que les amorces sont bien fixées sur les brins d ADN et cela augmente la spécificité de l amplification. De plus, des contrôles négatifs sans amorces et/ou sans matrice sont réalisés à chaque manipulation pour attester de la validité des résultats observés. 1) Test de validité des kits PCR Avant de commencer les manipulations, il faut contrôler le bon fonctionnement de tous les réactifs contenus dans le kit GoTaq de PROMEGA. Pour cela, un contrôle interne est fourni avec de l ADN, des amorces et un protocole à suivre. Le mix ci-dessous est réalisé en commençant par les composants les moins sensibles à la dégradation et de plus gros volume, à savoir l eau et le tampon. Ce sont ensuite les sels qui sont ajoutés avant les amorces puis la matrice ADN et enfin l enzyme. Composition du mix : MgCl2 3 µl Tampon 10 µl Nucléotide Mix 1 µl Primer sens 3.3 µl Primer anti-sens 3.3 µl ADN 1 µl Cycles du thermocycleur : Etape 1 : 95 C, 2 minutes Etape 2 : 95 C, 1 minute Etape 3 : 60 C, 1 minute Etape 4 : 72 C, 2 minutes Etape 5 : 72 C, 5 minutes Etape 6 : conservation à 4 C Enzyme Taq polymérase 0.25 µl L amplification d un fragment de 323 pb est attendue. Ce fragment est bien observé après migration par électrophorèse sur gel d agarose (Cf. Dépôt des échantillons et migration) donc le kit est en état de fonctionnement et sera utilisé dans la suite des manipulations. 6

11 2) Réalisation d une première PCR sur les échantillons Il s agit ici d évaluer la qualité des ADNc obtenus par extraction et transcription inverse en On souhaite avoir une idée sur une éventuelle dégradation de l ADNc avec le temps et suite aux congélations/décongélations accidentelles successives. Aussi, lors de la réaction de transcription inverse, il se peut que l enzyme (Reverse transcriptase) ne transcrive pas l ARN en ADN sur toute sa longueur. Cela veut dire que l on a potentiellement des brins d ADNc «incomplets», c est-à-dire plus court par rapport à l ARN dont ils proviennent. Par exemple, prenons un fragment d ARN d une taille de 400 pb, l ADNc que l on s attend obtenir est lui aussi de 400 pb. Seulement, l enzyme n ayant pas une fiabilité de 100%, il se peut que cette dernière s arrête autour de la base 150 (figure 7). Des amorces s hybridant à l intérieur des brins d ADN recherchés, et non aux extrémités, ont été conçues. Le but est d optimiser les chances d observer les ADNc, même ceux éventuellement incomplets. Comme les quantités d ADNc obtenues en 2010 sont assez faibles, un «pool» des ADNc de chaque glande est réalisé, en commençant par les femelles. On rassemble 2 µl de l échantillon de chaque chat et on obtient un «pool» d ADNc de chaque tissu. La PCR réalisée pour les 4 glandes utilise des amorces nouvelles qui ont été conçues avec le Dr. Cécile FROSINI. Il faut donc introduire un gradient de température à l étape d hybridation des amorces (Cf. Programmation du thermocycleur). Le protocole réalisé est présenté ci-dessous. Les étapes 2 à 4 sont répétées 39 fois, soit 40 cycle au total, toujours dans le but de maximiser les chances d observer une amplification : Composition du mix PCR : MgCl2 2 µl Tampon 10 µl Primer sens 5 µl Primer anti-sens 5 µl ADN 1 µl ( 0,45 µg) Enzyme Taq polymérase 0.25 µl Cycle du thermocycleur : Etape 1 : 95 C, 2 minutes Etape 2 : 95 C, 1 minute Etape 3 : Gradient de 50 à 57 C, 1 minute Etape 4 : 72 C, 2 minutes Etape 5 : 72 C, 5 minutes Etape 6 : conservation à 4 C Après réaction, une amplification est observée pour 3 des 4 glandes testées à toutes les températures testées. Cela signifie que la qualité des matrices est bonne pour 3 des 4 glandes et que les conditions de réaction peuvent servir de base pour être améliorées par la suite. En ce qui concerne la température d hybridation, on choisit la plus élevée parmi celles testées pour être le plus spécifique 7

12 possible, soit 57 C. La même manipulation, mais une fois mise au point (Cf. Mise au point du protocole PCR), est réalisée sur un «pool» d ADNc provenant des chats mâles et les mêmes résultats sont obtenus. 3) Mise au point du protocole avec un ADNc commercial a. Mise au point avec une nouvelle ADN polymérase Un échantillon d ADNc commercial issu de la peau du chat a été acheté pour pouvoir affiner différents aspects du protocole. Cela permet de ne pas utiliser notre matrice inutilement car les volumes disponibles sont peu élevés. La mise au point du protocole porte essentiellement sur la quantité d ADN matrice à introduire et le nombre de cycles suffisants pour obtenir une bonne amplification en un temps plus restreint et en utilisant le moins d ADNc de nos échantillons possible. Aussi, dans le but de séquencer par la suite les produits PCR obtenus, une nouvelle ADN polymérase a été achetée (Hotstar Hifidelity polymerase kit de QIAGEN). Cette dernière est capable de faire une «relecture» du travail qu elle effectue et introduit donc moins d erreurs dans la séquence qu elle synthétise, ce qui est préférable en vue d un séquençage. Le premier paramètre testé est la quantité de matrice. Il faut pour cela garder le même protocole et ne faire varier que la quantité de matrice entre les différentes réactions. Des tubes de réactions ont donc été préparés avec des quantités de matrice allant de 0,5 µg à 0 µg avec un pas de 0,1 µg. On observe une bonne amplification avec toutes les quantités testées. Cela indique donc que pour les prochaines réactions la quantité de matrice peut-être diminuée à 0,1 µg au lieu des 0,45 µg utilisés jusque-là. La seconde étape est de diminuer le nombre de cycles et de comparer les résultats obtenus avec la nouvelle polymérase par rapport à ceux obtenus avec l ancienne (PROMEGA). A cette fin, la réaction a été réalisée en utilisant chacune des deux enzymes, avec une quantité de matrice de 0,1 µg et en diminuant le nombre de cycles à 30 au lieu de 40. Le but est de voir les résultats obtenus dans les conditions les moins «favorables». Les résultats montrent qu une amplification est obtenue avec l ancienne enzyme mais pas ou très peu avec la nouvelle (figure 8). Le nombre de cycles est donc remis à 40 et une amplification est observée avec chacune des deux enzymes même si celle obtenue avec la nouvelle est plus faible. Les conditions retenues pour le protocole sont donc 40 cycles et une quantité de matrice de 0,1 µg pour essayer d en utiliser le moins possible mais elle peut être augmentée si besoin. 8

13 b. Mise au point avec des nouvelles amorces Les nouvelles amorces conçues (3 couples) visent à amplifier toute la séquence d ADNc dans le but de la faire séquencer. Il faut faire une première PCR afin de déterminer la meilleure température d hybridation. Le protocole réalisé est semblable à celui présenté dans la partie «réalisation d une première PCR sur les échantillons». Notons seulement que la quantité d ADN utilisée est ici 0,1 µg, le gradient de température va de 54 C à 58 C et l ADN polymérase utilisée est celle de QIAGEN. Avec le premier couple d amorces testé, on observe une amplification. Avec le second couple, une amplification est observée mais une bande nette de produit non spécifique est visible sur le gel. Enfin, dans le dernier cas une amplification très faible, à peine visible, est observée. Dans un second temps, on s intéresse à la réaction avec le premier couple d amorces. Deux températures sur le gradient précédent pour lesquelles on observe une amplification plus spécifique, même si elle est plus faible, sont choisies (56 et 57 C). Une augmentation de la quantité de matrice est testée de manière à essayer d amplifier notre signal spécifique à ces températures. La quantité utilisée était de 0,1 µg, donc on va cette fois ci utiliser 0,2 et 0,3 µg de matrice. Les résultats sont concluants puisqu une bonne amplification spécifique est obtenue à 56 C avec 0,2 et 0,3 µg de matrice. On connait donc maintenant la quantité de matrice (0,3 µg par sécurité) et la température d hybridation (56 C) qui semblent donner les meilleurs résultats. 4) Réalisation du protocole mis au point sur nos échantillons d ADNc Cette étape correspond à l aboutissement de l ensemble des mises au point précédentes. Les conditions permettant d obtenir une bonne amplification et spécifique sont utilisées (Cf. Mise au point de nouvelles amorces). Des résultats satisfaisants sont obtenus et les produits PCR sont conservés dans le but de les faire séquencer ultérieurement. e) Dépôt et migration des échantillons Pour faire migrer les échantillons, ces derniers doivent être préalablement «traités». Du tampon de charge est ajouté au milieu réactionnel. Ce dernier a pour but d alourdir nos échantillons afin de les faire tomber dans le fond des puits du gel d agarose et éviter ainsi que ces derniers ne se perdent dans le tampon de migration. Il permet aussi de suivre l avancement de la migration. Le tampon de charge utilisé est le Blue/Orange Dye de PROMEGA. Ce tampon de charge est initialement concentré 6 fois, il faut le diluer au 1/6eme pour l obtenir à la bonne concentration. Le dispositif utilisé pour faire migrer les échantillons est le E-Gel ibase avec les E-Gel with SYBRsafe d INVITROGEN. Les gels sont prêts à l emploi et contiennent directement le révélateur (SYBRsafe ). L E-Gel ibase est associé à l imageur EGel SafeImager qui consiste donc 9

14 respectivement en une partie destinée à la migration des échantillons (générateur de courant) et une seconde (transilluminateur) qui permet la révélation des acides nucléiques avec une lumière LED émettant dans le bleu à 480 nm (figure 9). Un exemple d observation avec l E - Gel Safe-imager est montré dans la figure 10. Dans chaque migration, il faut utiliser un marqueur de poids moléculaire (TrackIt DNA 100 pb de INVITROGEN) afin de déterminer si les bandes obtenues correspondent à celles dont la taille est attendue. f) Activités hors manipulations 1) Mise au propre des protocoles et des résultats Il s agit ici de rassembler les éléments du protocole et les résultats sur une feuille unique. Cela permet de synthétiser les manipulations effectuées, de regrouper protocoles et résultats et d avoir une feuille simple par manipulation sur chaque projet (annexe 3). Le but est de permettre à n importe quelle personne travaillant sur le projet d avoir une idée simple mais claire sur ce qui est effectué et les résultats associés. Cela représente la majeure partie des activités en dehors des manipulations. La mise au propre des protocoles et des résultats est souvent réalisée en fin de journée après avoir fait une réaction PCR et la migration qui est associée. 2) Recherche et comparaison de produits Avant de commander un produit dont on a besoin, il faut faire un état des lieux de ce qui est proposé sur le marché et comparer les éventuelles variations de protocoles, de fiabilité et de prix. Cela est fait lors des commandes des kits PCR, des kits de purification de produits PCR etc. Cette étape est réalisée, par exemple, avant l achat de la nouvelle polymérase QIAGEN (Cf. Mise au point du protocole avec un ADNc commercial) pour voir des éventuelles différences dans les tampons proposés, les avis etc. La fréquence de mauvaise incorporation des nucléotides, le contenu du tampon et du kit, le protocole préconisé, pour qu il ne diffère pas trop de celui mis au point, sont les principaux critères regardés. Cette recherche est aussi effectuée sur des produits qui ne sont pas nécessaires dans l immédiat mais plutôt en vue de futur manipulations, il s agit dans le cadre du stage de kits d extraction d acides nucléiques et de reverse transcription. Ceci est également valable lorsqu on recherche un service comme, par exemple, lors de la recherche d une entreprise qui propose de faire du séquençage. Cela permet de se renseigner sur les prix et les méthodes utilisées mais aussi le conditionnement des produits que l on veut faire parvenir (concentration à laquelle ces derniers doivent être envoyés, emballage...). 10

15 3) Réception de commandes Lors de la réception des commandes, une fiche récapitulative est fournie dans le colis. Cette dernière doit être transmise à la technicienne titulaire qui met ainsi les fichiers de suivi de commandes à jour au fur et à mesure. De plus, le numéro de la commande et la date de réception du colis doivent être inscrits sur chaque emballage de manière à avoir une meilleure traçabilité des produits lorsque ceux-ci sont disposés dans la salle de stocks. IV. Conclusion Ce stage ouvrier au sein de l IRSEA a eu de nombreux apports au niveau de mes connaissances sur les entreprises. Premièrement, j ai découvert le fonctionnement d une entreprise au niveau de la gestion des projets et du suivi de l avancement de ceux-ci grâce à des réunions hebdomadaires. De plus, j ai pu remarquer que malgré le fait que l institut soit divisé en plusieurs départements, chacun est au courant des différents projets qui se déroulent et est susceptible d y apporter sa contribution. Cela montre que l esprit d équipe est une valeur importante dans le but d atteindre un objectif commun qui est la réussite de l entreprise. Il est d autant plus présent au sein de l IRSEA où j ai pu avoir de bonnes relations avec l ensemble des employés y compris avec les supérieurs car tout le monde est considéré de la même manière. Aussi, contrairement à mes expériences précédentes, j ai pu réellement prendre part à la vie de l équipe. J ai assisté aux réunions de département organisées dans le but de faire part de l avancée de mon travail mais aussi d être informé des autres projets de l équipe. D autre part, ce stage a permis au département de relancer des projets de biologie moléculaire jusqu alors arrêtés. Au total, une trentaine de PCR ont été réalisées pour un projet en particulier. Cela a permis une bonne avancée sur ce dernier puisque les produits des dernières PCR réalisées ont été conservés en vue d un séquençage. D autres travaux nécessitaient des PCR mais elles n ont pas pu être réalisées par manque de temps. Néanmoins, les protocoles mis au point et les différentes recherches de produits pourront être utilisés dans les futurs projets de l équipe. 11

16 V. Références webographiques [1] consulté le 02/09/2015 [2] consulté le 10/08/2015 VI. Liste des annexes Annexe 1 : Exemple de rapport imprimé par le spectrophotomètre lors de la vérification de la qualité des acides nucléiques. Annexe 2 : Exemple de feuille d information fournie lors de la commande d amorces. Annexe 3 : Format de feuilles de résultats à rendre après chaque manipulation. 12

17 Annexe 1 : Exemple de rapport imprimé par le spectrophotomètre lors de la vérification de la qualité des acides nucléiques. Facteur de conversion de la valeur d absorbance pour obtenir la concentration en ADN Valeur du «bruit de fond» retranchée à chaque valeur mesurée

18 Annexe 2 : Exemple de feuille d information fournie lors de la commande d amorces.

19 Annexe 3 : Feuille de résultats type à rédiger après chaque manipulation. R Manipulation : Feld1 1 21/08/15 Identifiant du projet Pool ADNc Femelles Composition du Master Mix pour les 4 glandes : Eau 942,3 µl Tampon 360 µl MgCl 2 72 µl ([] finale = 1 mm) Nucléotide 36 µl ([] finale = 200 µm each) Ajout des primers: Primer sens : 180 µl Primer anti-sens : 180 µl Quantité de matrice : 0,4 µl (0,45 µg) Volume polymerase : 0,25 µl Programme Thermocycleur: FD1. G C, 2: C, 1:00 3. Grad Lower 50 C ; Upper 57 C Time 1: C, 1:00 5. GOTO 2, 39 times C, 5: C, 0 8. END Mélange dépôts : 3,5 µl Blue/Orange Loading Dye + 16,5 µl produit PCR Ladder Trackit DNA 100 pb Invitrogen : 4 µl dans 16 µl d eau Dilution du marqueur de poids moléculaire Puits : Ladder 57 C 56 C 55 C 54 C 53 C 52 C 51 C 50 C

20 Résumé Ce rapport rend compte du stage ouvrier effectué sous la direction du Dr. Cécile BIENBOIRE- FROSINI, chef du département de biologie cellulaire et moléculaire, durant le mois d août Avec le changement de locaux qu a connu l institut durant l année 2014, l espace disponible, les installations et les équipements se sont améliorés. Le département de biologie cellulaire et moléculaire avait des projets laissés en suspens nécessitant des manipulations de biologie moléculaire et j ai donc intégré l équipe en tant que stagiaire au poste de technicien en biologie moléculaire. Mon rôle principal a été de réaliser des protocoles de PCR puis de les mettre au point pour obtenir de meilleurs résultats et optimiser le temps et les réactifs nécessaires. Les résultats obtenus ont été discutés et rédigés au propre sous la forme de fiches de résultats. Enfin, la recherche d informations sur différents kits de réaction et services de séquençage a aussi fait partie de mes activités de technicien en biologie moléculaire.