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1 PROTOCOLE DÉTAILLÉ 1. INTRODUCTION. page 2 2. COMPOSITION DU KIT.. page 2 3. STOCKAGE DES REACTIFS... page 2 4. EQUIPEMENTS ET MATERIELS REQUIS (NON FOURNIS DANS LE KIT).. page 3 5. PRECAUTIONS D EMPLOI... page 3 6. PROTOCOLE DE FILTRATION D ECHANTILLONS D EAU ET D EXTRACTION D ADN. page 3 7. CALCULS ET EXPRESSION DES RESULTATS.. page 5 8. PROTOCOLES ALTERNATIFS.. page 6

2 1. INTRODUCTION L eau représente un milieu très propice au développement des bactéries. Bien que la plupart d entre elles ne représentent aucun danger pour la santé humaine, certaines comme par exemple Legionella pneumophila, Salmonella ou certaines souches d Escherichia coli présentent des risques de santé publique. D après les directives de l OMS il est fortement recommandé d effectuer des contrôles réguliers de la qualité microbiologique des eaux sanitaires (eaux de consommation, de piscines, d établissements thermaux ), industrielles (circuits de tours aéroréfrigérantes ) afin de réduire au maximum les risques. Cette surveillance peut porter directement sur les bactéries pathogènes ou sur les indicateurs de contamination fécale comme Escherichia coli. 2 La PCR temps réel est un outil puissant et rapide utilisé pour la détection spécifique de bactéries dans les eaux. Cette méthodologie, très utilisée dans la plupart des pays, fait déjà l objet d une norme NF et d une norme ISO pour la recherche de Légionnelles dans les eaux sanitaires et industrielles. Pour atteindre les performances optimales, la préparation de l échantillon jusqu à l obtention d un extrait ADN est l étape la plus importante. En effet, cette étape doit permettre une élimination efficace des inhibiteurs sans perte d ADN extrait. Le kit DNA PURE-FLASH apporte une solution robuste et fiable qui permet une extraction optimale de l ADN des bactéries présentes tout en assurant l élimination des inhibiteurs en vue d une analyse par PCR en temps réel. 2. COMPOSITION DU KIT Réactifs Quantité par kit Lysis buffer, S1 96 x 1,3 ml Binding buffer, S2 4 x 2,0 ml Elution buffer, S3 4 x 2,5 ml Tubes de résine WCX 96 Microtubes 2,0 ml 96 Microtubes 1,5 ml 96 Cônes effilés STOCKAGE DES REACTIFS Le kit doit être conservé entre +2 C et +8 C. Selon ces conditions, chaque réactif peut être utilisé jusqu'à la date indiquée. Les réactifs de capture (binding buffer, S2) et d élution (elution buffer, S3) peuvent être stockés à -20 C. Cependant, il ne faut pas congeler les tubes de lyse (lysis buffer, S1).

3 4. EQUIPEMENTS ET MATERIELS REQUIS (NON FOURNI DANS LE KIT) Rampe de filtration, Entonnoirs stériles, Membrane en polycarbonate 0,45 μm, Gants, Micropipettes 100 μl et μl, Pointes stérile pour micropipettes 100 μl et μl, Thermomixer (gamme de température : 25 C C / Agitation orbital 1500 rpm), Microcentrifugeuse de paillasse. 3 Optionnel : Pompe à vide Colonne d ultrafiltration 5. PRECAUTIONS Cet essai doit être réalisé par des personnes ayant reçu une formation adéquate. Il est indispensable d utiliser au moins un contrôle négatif d extraction à chaque série d extraction, de préférence en fin de série. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption. 6. PROTOCOLE POUR LE TRAITEMENT D ECHANTILLONS D EAU a. Opérations préliminaires Préchauffer le thermomixer ou un bain-marie à 95 C ± 5 C, Préparer le nombre de tubes de lyse (S1) correspondant au nombre d échantillons à traiter. Note : les tubes de lyse contiennent 1,3 ml de la solution de lyse S1. Préparer sur un portoir le nombre de tubes de résine WCX correspondant au nombre d échantillons à traiter. b. Filtration des échantillons d eau 1. Décontaminer la rampe par flambage à l alcool. Avant manipulation, la rampe doit être sèche et doit avoir refroidie. Cette étape doit être réalisée entre chaque échantillon. 2. Placer la membrane sur le frité et ajouter un entonnoir stérile. 3. Filtrer l échantillon.

4 c. Extraction et purification d ADN 1. Plier délicatement la membrane en huit à l aide d une pince afin d obtenir un cône 2. À l aide d une pointe (1,0 ml) et de la pince, placer la membrane dans le tube de lyse (lysis buffer, S1) de façon à ce que la pointe du cône soit vers le haut du tube. Note : la membrane doit-être totalement immergée dans la solution S1. 3. Incuber à 95 C ± 5 C pendant 15 minutes. Note : cette étape peut être réalisée dans un thermomixer ou un bain marie. Une fois cette incubation terminée, préparer le thermomixer à 75 C ± 5 C pour l étape n À l aide une pointe (1,0 ml) enlever délicatement la membrane, presser sur les parois du tube puis jeter la membrane. 5. Centrifuger les tubes 1 minute entre 500 et 1000 x g ou laisser décanter la résine pendant 5 minutes à température ambiante. 6. Le surnageant contient l ADN extrait. Pipeter 1,0 ml de surnageant (veillez à ne pas prélever de résine) dans un nouveau microtube de 2,0 ml vide. Note 1 : si une fraction de la résine de la solution de lyse (S1) est prélevée, redéposer le surnageant dans le tube et centrifuger à nouveau. Note 2 : si l échantillon à analyser est trop sale (chargé en matière en suspension) prélever un volume inférieur à 1,0 ml (ex : 800 µl). Attention : tenir compte de ce volume dans le facteur Z pour le calcul final (cf. chapitre 7) 7. Ajouter 2 gouttes du tampon de capture (binding buffer, S2) et agiter manuellement le tube par trois retournements. Note : dans le cas ou une ou deux gouttes supplémentaires seraient ajoutées par erreur, la performance du protocole n en sera pas impactée. 8. Transférer la totalité du volume de solution dans un tube de 1,5 ml contenant la résine WCX. 9. Agiter manuellement le tube par 10 retournements. Note : dans le cas d une série importante d échantillon, utiliser un portoir supplémentaire, (voir schéma ci-dessous) afin de réaliser cette étape simultanément pour tous les échantillons. Le temps de réalisation est ainsi d optimisé. 10. Centrifuger 30 secondes entre et x g ou laisser décanter la résine 5 minutes à température ambiante.

5 11. Eliminer la totalité du liquide à l aide du système fourni dans le kit et des pointes types «Gelloading» effilées. Note : la pointe doit être changée entre chaque échantillon. Une pompe à vide peut également être utilisée. 12. Ajouter 100 µl de tampon d élution (élution buffer, S3) Agiter au thermomixer 1500 rpm à 75 C ± 5 C pendant 10 minutes. 14. Centrifuger entre et x g pendant 30 secondes ou laisser décanter 5 minutes à température ambiante. 15. Récupérer 50 μl de l éluât situé au dessus de la résine en prenant soin de ne pas pipeter de résine. Déposer 5 μl par réaction PCR (par exemple) pour chaque échantillon. L échantillon purifié est stable plusieurs mois à -20 C. Note : pour éviter de prélever de la résine, une pointe effilée peut être utilisée. Dans le cas ou de la résine serait prélevée, redéposer le surnageant dans le tube et centrifuger à nouveau. 7. CALCULS ET EXPRESSION DES RESULTATS a. Facteur Z protocole classique Le Facteur Z doit être pris en consideration. Cette valeur est spécifique de chaque méthode d extraction et est calculé de la manière suivante : Etape d extraction et de purification : 1,0 ml de surnageant de S1 est purifié sur les 1,1 ml total de S1. La fraction purifié est de 1 / 1,1 Z 1 = 1,1. Etape d analyse PCR : 5 μl sur les 200 μl totaux d ADN purifiés sont analysés par qpcr. La fraction analysée est de 5 / 200 Z 2 = 40. Le facteur Z de la méthode d extraction DNA PURE-FLASH est Z = Z 1 x Z 2 = 1,1 x 40 = 44. b. Limite de détection (LOD) et de quantification (LOQ) : La LOD de la méthode globale (extraction/purification et détection) est calculée de la manière suivante : LODqPCR Z D Volume filtré (en l) D représente le facteur de dilution si l extrait ADN a été dilué avant le run PCR.

6 De la même manière, la LOQ de la méthode globale : LOQqPCR Z D Volume filtré (en L) 8. PROTOCOLES ALTERNATIFS 6 Pour chaque protocole alternatif, il faut impérativement prendre en compte les changements dans le calcul du facteur Z. Protocole classique avec élimination du surnageant (étape 11) à l aide d une pompe à vide pour toutes matrices Les étapes 1 à 10 sont strictement identiques au protocole classique. La suite du protocole peut être réalisée de la manière suivante : 11. Eliminer le surnageant à l aide d une pompe à vide raccordée par un tuyau à une pointe effilée. Note : La pointe doit être changée entre chaque échantillon. La suite du protocole peut être réalisée selon le protocole classique ou le protocole avec colonne d ultrafiltration. Protocole avec colonne d ultrafiltration pour les eaux propres Les étapes 1 à 14 sont strictement identiques au protocole classique. La suite du protocole peut être réalisée de la manière suivante : 15. Déposer 100 μl de l éluât (situé au-dessus de la résine en prenant soin de ne pas pipeter de résine) dans la colonne d ultrafiltration. Note : pour éviter de prélever de la résine, une pointe effilée, comme utilisée à l étape n 11 peut être utilisée. Dans le cas où de la résine serai prélevée, redéposer le surnageant dans le tube et centrifuger à nouveau. 16. Centrifuger 10 minutes à x g. 17. Retourner la colonne dans un nouveau microtube et éliminer le tube de collection. 18. Déposer dans la colonne 30 μl de tampon d élution (S3). 19. Centrifuger 3 minutes à x g. Note : à cette étape le tube ne peux pas être fermé.

7 20. Conserver le tube de collection qui contient l extrait ADN et éliminer la colonne. L échantillon purifié est stable plusieurs mois à -20 C. Utiliser également 5 μl pour chaque analyse PCR. Protocole classique pour manipulateur aguerri (cas des eaux propres) 7 Les étapes 1 à 5 sont strictement identiques au protocole classique. La suite du protocole peut être réalisée de la manière suivante : 6. Le surnageant contient l ADN extrait. Pipeter la totalité du surnageant, c est à dire 1,1 ml de surnageant (veillez à ne pas prélever de résine) dans un nouveau microtube de 2,0 ml vide. Note : si la résine de la solution de lyse (S1) est pipetée, re-pipeter le surnageant dans le tube et re-centrifuger. La suite du protocole peut être réalisée selon le protocole classique ou le protocole avec colonne d ultrafiltration. Protocole classique cas des eaux sales avec matières en suspension importantes Les étapes 1 à 5 sont strictement identiques au protocole classique. La suite du protocole peut être réalisée de la manière suivante : 6. Le surnageant contient l ADN extrait. Pipeter 800 μl de surnageant (en veillant à ne pas prélever de résine) dans un nouveau microtube de 2,0 ml vide. Note : si la résine de la solution de lyse (S1) est pipetée, re-pipeter le surnageant dans le tube et re-centrifuger. Il est conseillé de réaliser la suite du protocole selon le protocole classique. Calcul du Facteur Z pour le protocole eaux propres Dans le cas du protocole alternatif pour eaux propre, le facteur Z se calcule de la manière suivante : Etape d extraction et de purification : 1 ml de surnageant de S1 est purifié sur les 1,1 ml total de S1. La fraction purifié est de 1 / 1,1. Z 1 = 1,1. Etape de concentration sur colonne : 100 μl d éluât sur les 200 μl totaux sont concentrés sur colonne et élués dans 30 μl. La fraction de concentration est de 100 / 200. Z 2 = 2.

8 Etape d analyse PCR: 5 μl sur les 30 μl finaux concentrés sur colonne sont analysés par qpcr. La fraction analysée est de 5 / 20. Z 3 = 4. Le facteur Z de la méthode d extraction DNA PURE-FLASH est Z = Z 1 x Z 2 x Z 3 = 1,1 x 2 x 4 = 8,8. Calcul du Facteur Z protocole «manipulateur aguerri» 8 Dans le cas du protocole «manipulateur aguerri», le facteur Z se calcule de la même manière que pour le protocole classique, seul Z 1 change : Etape d extraction et de purification : 1,1 ml de surnageant de S1 est purifié sur les 1,1 ml total de S1. La fraction purifié est de 1,1 / 1,1. Z 1 = 1. Le facteur Z de la méthode d extraction DNA PURE-FLASH est Z = Z 1 x Z 2 = 40. Calcul du Facteur Z protocole «manipulateur aguerri» et ajout d une colonne d ultrafiltration Dans le cas du protocole «manipulateur aguerri» et ajout d une colonne d ultrafiltration, le facteur Z se calcule de la même manière suivante : Etape d extraction et de purification : 1 ml de surnageant de S1 est purifié sur les 1,1 ml total de S1. La fraction purifié est de 1,1 / 1,1. Z 1 = 1. Etape de concentration sur colonne : 100 μl d éluât sur les 200 μl totaux concentrés sur colonne sont élués dans 30 μl. La fraction de concentration est de 100 / 200. Z 2 = 2. Etape d analyse PCR : 5 μl sur les 30 μl finaux concentrés sur colonne sont analysés par qpcr. La fraction analysée est de 5 / 20. Z 3 = 4. Le facteur Z de la méthode d extraction DNA PURE-FLASH est Z = Z 1 x Z 2 x Z 3 = 1 x 2 x 4 = 8.

9 Calcul du Facteur Z protocole eaux sales avec matières en suspensions importantes Dans le cas du protocole eaux sales avec matières en suspensions importantes, le facteur Z se calcule de la même manière, seul Z 1 change : Etape d extraction et de purification : 0,8 ml de surnageant de S1 est purifié sur les 1,1 ml total de S1. 9 La fraction purifié est de 0,8 / 1,1. Z 1 = 1,375. Le facteur Z de la méthode d extraction DNA PURE-FLASH est Z = Z 1 x Z 2 = 55.

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