Nouvelle thérapie génique pour la myopathie de Duchenne
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- Alain St-Louis
- il y a 7 ans
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1 Nouvelle thérapie génique pour la myopathie de Duchenne Evaluation pré-clinique chez le chien GRMD et réseau de compétences Caroline Le Guiner Colloque AFSTAL - Lyon - 25/11/10
2 La myopathie de Duchenne La plus fréquente des dystrophies musculaires (1/3500 naissances de petits garçons) Maladie génétique héréditaire liée à l X : mutation dans le gène codant pour la protéine Dystrophine La Dystrophine est indispensable à l intégrité des membranes des fibres musculaires Muscle sain Muscle myopathe Dystrophine = ciment du muscle Absence de Dystrophine
3 La myopathie de Duchenne Absence de Dystrophine Détérioration des fibres musculaires Affaiblissement progressif des muscles Mort prématurée (20 à 30 ans) A ce jour: Pas de thérapie
4 La thérapie génique gène muté pas de protéine maladie Gène «sain» protéine fonctionnelle pas de maladie Comment amener le gène «sain» dans la cellule? Utiliser d un «vecteur», viral ou non viral raav = Vecteur dérivé de l Adéno-Associated Virus
5 L Adeno-Associated Virus et les vecteurs raav AAV WT AAV WT ITR REP CAP ITR raav ITR TRANSGENE THERAPEUTIQUE ITR
6 raav et muscle squelettique Expression à long terme du transgène (> 10 ans) après une administration unique d un raav
7 Thérapie génique de la myopathie de Duchenne LE MEDICAMENT Thérapie génique «conventionnelle»: Grâce à un raav, transfert du gène correct de la Dystrophine dans les muscles du patient. -> Problème: le gène de la dystrophine (ou son cdna) est trop grand pour tenir dans un raav cdna dystrophine: bases raav: contenance maximale, 4700 bases «Thérapie génique correctrice»: Plutôt que de remplacer le gène défectueux, on va aller «réparer ses pièces défectueuses» Parmi les techniques de réparation: le SAUT d EXON
8 Le saut d exon Gène normal Intron 1 Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Gène muté Intron 1 * Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Epissage Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 1 Exon 3 Exon 4 Protéine normale «La phrase contient tous les mots» Protéine anormale «La phrase est interrompue et ne veut plus rien dire» MALADIE
9 Le saut d exon Gène de la dystrophine muté (patient Duchenne): Intron 1 * Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Petite séquence «snrna U7» apportée artificiellement et capable de venir bloquer l inclusion de l exon 3 Exon 1 Exon 4 «Quasi» Dystrophine «La phrase est incomplète mais a toujours la même signification» DIMINUTION des SYMPTOMES
10 Le saut d exon Gène de la dystrophine muté (patient Duchenne): * Intron 1 Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Petite séquence «snrna U7» apportée artificiellement et capable de venir bloquer l inclusion de l exon 3 Taille = 1000 à 2000pb raav: contenance maximale, 4700 bases NOTRE MEDICAMENT = raav/snrna-u7
11 Thérapie génique de la myopathie de Duchenne LA VOIE D INJECTION Objectif thérapeutique: toucher tous les muscles de l organisme (dont le cœur et le diaphragme) Injection Intramusculaire Injection Intraveineuse Locorégionale Injection Intraveineuse Garrot
12 Objectif «Essai Clinique» PRODUIT THERAPEUTIQUE: raav/snrna-u7 MODE D INJECTION: IV locorégionale (avant bras) Années Validation du concept thérapeutique Développement pré-clinique Etude de toxicologie Essai clinique In vitro Chez la souris mdx (20g) Chez le chien GRMD (10kg) Modèle pathologique plus proche de l homme Adaptation d un mode d injection pertinent cliniquement Détermination de la dose thérapeutique (dose «active»)
13 Production de l AAVr Utilisation d un système de production baculovirus/cellules d insectes Contrôles qualité exhaustifs Conditions adaptables à une production en «grade clinique»
14 Etude chez le chien GRMD en 2010/2011 IV locorégionale raav8/snrna-u7 IRM Naissance des chiots (Centre de Boisbonne ou CEDS) Test de Force Test de Force Suivi clinique hebdomadaire Test de Force J -120 à -90 J0 J+45 à 60 J+90 à 120 Production des vecteurs AAV + contrôles qualités Prélèvements sanguins et de fluides (salive, lacrymal, nasal, urine): - Etude de la dissémination du vecteur dans les fluides - Etude de l éventuelle réponse immune anti-aav et anti-dystrophine Biopsie musculaire intermédiaire: - Correction de la Dystrophine? Euthanasie: - Correction de la dystrophine dans chaque muscle du membre injecté? - Correction de la pathologie musculaire locale? - Présence du vecteur dans les autres organes? Format «PRE-CLINIQUE REGLEMENTAIRE»: Notions de qualité et de traçabilité aidant à la constitution d un dossier de demande d essai clinique auprès des agences règlementaires (AFFSAPS/EMEA)
15 Injections Cathéter dans la veine céphalique + Garrot pneumatique atraumatique au dessus du coude + Injection du vecteur raav - dilué dans gros volume de tampon(12ml/kg) - sous pression - en l absence de tout agent perméabilisant + «Infusion» pendant 15 min 10 chiens myopathes déjà injectés (3 doses d AAVr + témoins avec tampon) Déjà plus de 1500 échantillons à analyser
16 Pathologie locale Chien GRMD non injecté Chien GRMD Dose 1 3,5 mois post-injection
17 Expression de la Dystrophine Chien GRMD non injecté Chien sain Biopsies musculaires intermédiaires (5-7 semaines post-injection) Extensor digitorum communis Nombre de fibres Dys + Chien GRMD + Dose 1 Chien GRMD + Dose 1/5 Chien GRMD + Dose 1/ % 50-80% 30-45%
18 Test de Force Méthode non invasive (stimulation électrique) Mesure du couple de force extension/flexion du carpe
19 Analyse RMN Chien sain Examen qualitatif et quantitatif Chien GRMD
20 Objectif «Essai Clinique»! Années Agences Réglementaires Validation du concept thérapeutique Développement pré-clinique Etude de toxicologie Essai clinique In vitro Chez la souris myopathe Chez le chien GRMD Primates, souris Durée: 7 ans Coût total estimé: 11,5 Millions
21 - Plus de 80 personnes impliquées sur 5 sites - Médecins, Scientifiques, Vétérinaires, Ingénieurs STUDY DESIGN Thomas Voit Philippe Moullier Luis Garcia Caroline Le Guiner Yves Fromes Vector production & QC Dog colony Quality Assurance ADNA Mehdi Gasmi AFM / CEDS Ariane Kobrine Anne Douar Rob Kotin INJECTIONS Jack-Yves Deschamps Yves Fromes Caroline Le Guiner Yan Chérel Clinical safety Sophie Moullec Phentotypic assessment Jean-Yves Hogrel Imagery Pierre Carlier Pathology Yan Chérel Vector expression Yan Chérel (IF) Maud Beuvin (WB) Biodistribution study Caroline Le Guiner Virginie François Immunological study Carole Masurier Oumeya Adjali Institut of Myology Généthon Nantes PI: Thomas Voit & Philippe Moullier Coordination Nantes + réseau: Caroline Le Guiner Coordination Généthon: Marie Montus Coordination Institut de Myologie: Laurent Servais
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