AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003

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1 AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE - PHYSIOLOGIE Premier jour OSTEOBLASTES ET PHOSPHATASE ALCALINE L os est un tissu en perpétuel renouvellement. Les ostéoclastes sont responsables de la lyse osseuse alors que les ostéoblastes synthétisent la matrice osseuse. Les biomarqueurs, qui représentent une évaluation globale du remodelage osseux, sont de deux types : marqueurs d ostéogenèse et marqueurs d ostéolyse. La phosphatase alcaline est un marqueur de choix de l activité ostéoblastique, c est pourquoi sa synthèse et ses propriétés présentent un intérêt dans l étude des maladies osseuses. Le sujet comporte deux parties : - la première consiste en une détermination des caractéristiques cinétiques de la phosphatase alcaline (AP) en vue de fixer les conditions de mesures d activités ; - la seconde est une réalisation d une culture d ostéoblastes primaires de souris, ces derniers étant caractérisés par leur activité AP. 1. LA PHOSPHATASE ALCALINE La phosphatase alcaline (AP) (EC ) est une enzyme à activité monophosphoestérasique. Le substrat choisi pour les mesures cinétiques est le sel disodique du nitro-4-phénylphosphate dont l hydrolyse conduit au nitro-4-phénol dosable par photométrie d absorption moléculaire à 405 nm. Selon les données bibliographiques, la constante de Michaëlis (K M ) de cette enzyme en tampon diéthanol amine (DEA) ph 9,8 à 35 C à l égard du nitro-4-phénylphosphate est voisine de 400 µmol/l. Cette enzyme ne présente pas d inhibition par apport excédentaire de substrat. L objectif de cette partie consiste à : - déterminer la durée de vitesse initiale par un suivi en continu d une cinétique d hydrolyse. Il s agit d apprécier la durée de réaction ( t) utilisable pour des mesures de vitesse initiale en deux points ; - déterminer précisément le K M dans les conditions de mesure proposées. Les candidats sont invités à compléter le protocole proposé, à justifier leurs choix et à rédiger le mode opératoire préalablement à la réalisation de la manipulation. 1

2 1.1. Détermination de la durée de la vitesse initiale par un suivi en continu d une cinétique Protocole expérimental Introduire dans une cuve pour photométrie, thermostatée à 35 C : tampon DEA 1,5 ml nitro-4-phénylphosphate X ml eau distillée qsp 2,75 ml Préincuber 3 minutes à 35 C dans le porte-cuve thermostaté du spectrophotomètre. Introduire 100 µl de phosphatase alcaline (extrait AP). Suivre la variation de l absorbance à 405 nm pendant une durée maximale de 4 minutes. Compte-rendu Justifier le choix du volume X de substrat utilisé. Déterminer la durée de vitesse initiale. Choisir un intervalle de temps ( t) convenable pour les mesures en deux points. Justifier. Extrait AP 1.2. Détermination du K M Protocole expérimental Introduire en tubes à essais : tampon DEA nitro-4-phénylphosphate eau distillée 3 ml Y ml qsp 5,5 ml Préincuber 5 minutes à 35 C en bain thermostaté. Introduire 200 µl de l extrait AP. Incuber pendant le temps t déterminé précédemment. Arrêter la réaction par ajout de 1 ml de solution d hydroxyde de sodium à 2 mol/l. Mesurer rapidement l absorbance à 405 nm contre un témoin de compensation convenable. Compte-rendu Justifier le choix des volumes Y. Etablir un tableau complet de la manipulation réalisée. Déterminer le K M. Extrait AP Solution d hydroxyde de sodium à 2 mol/l 2

3 1.3. Détermination de la concentration d activité catalytique de la phosphatase alcaline sérique Il s agit de comparer la concentration d activité catalytique de la phosphatase alcaline d un sérum témoin et d un sérum échantillon. On considérera que le K M moyen de toutes les isoformes de la phosphatase alcaline sérique est identique à celui précédemment déterminé. La mesure sera réalisée par une méthode cinétique discontinue (méthode en deux points). Déterminer les concentrations d activités catalytiques des sérums en U/mL et conclure. Données : - coefficient d absorbance molaire du nitro-4-phénol à 405 nm = 1860 m 2.mol l unité d activité enzymatique (U) est définie comme la quantité d enzyme catalysant une micromole de nitro-4-phénylphosphate en une minute dans le standard expérimental défini. Sérum témoin Sérum échantillon Solution d hydroxyde de sodium à 2 mol/l 2. CULTURE D OSTEOBLASTES PRIMAIRES Préparer cinq tubes stériles de 15 ml contenant chacun 0,5 ml de sérum de veau fœtal (SVF), les numéroter et les placer dans la glace Prélévement des calvariens (os de la partie supérieure du crâne) Cette manipulation sera conduite à un poste de sécurité microbiologique (PSM). A partir de quatre souriceaux de 4 à 5 jours, euthanasiés, préléver les calvariens : - tremper la tête du souriceau dans l éthanol à 70% (v/v), - inciser latéralement la peau du crâne, la rabattre vers l avant, - prélever les deux calvariens. Placer l ensemble des calvariens prélevés dans un tube stérile de 15 ml contenant 5 ml de tampon de rinçage. Agiter manuellement. Aspirer et éliminer la solution de rinçage en prenant soin de ne pas endommager les calvariens. Rincer une seconde fois Préparation des suspensions cellulaires Ajouter 5 ml de milieu de digestion. Agiter 10 minutes à 37 C à l aide de l agitateur mécanique à disposition. Nettoyer soigneusement l extérieur du tube à l éthanol à 70%. Laisser sédimenter sous la hotte. Aspirer le surnageant et transférer dans le tube numéro 1 préalablement préparé et placé dans la glace. 3

4 Réaliser à nouveau cette opération quatre fois en récupérant les surnageants dans les autres tubes numérotés placés dans la glace. Centrifuger les cinq tubes finalement obtenus à g (1 500 rpm avec le matériel utilisé). Eliminer les surnageants. Reprendre chaque culot avec 250 µl de milieu de culture Mise en culture des cellules Les cultures seront réalisées dans deux séries de cinq puits. Dans les puits de la première série : - placer une lamelle stérile, - ajouter 500 µl de solution de gélatine à 0,1 %, - attendre 30 minutes, - éliminer la solution, - laisser sécher, couvercle entrouvert. Ajouter dans tous les puits 900 µl de milieu de culture. Ensemencer un puits de chaque série par tube numéroté avec 100 µl de suspension cellulaire. Incuber à 37 C sous atmosphère à 5% de CO 2. Solution de gélatine à 0,1 % Tampon de rinçage : tampon PBS (Phosphate Buffer Salt) + 1% pénicilline/streptomycine Milieu de digestion : - MEM (Minimum Essential Medium) - collagénase type IA 1g.L -1 - dispase type II 2 g.l -1 SVF : sérum de veau foetal Milieu de culture : MEM + 1% pénicilline/streptomycine + 10% SVF 4

5 AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE - PHYSIOLOGIE Second jour OSTEOBLASTES ET PHOSPHATASE ALCALINE 1. Détection in situ de l activité phosphatase alcaline ostéoblastique Note préalable : réaliser toutes les opérations délicatement afin de ne pas décoller les cellules des lamelles. Rincer deux fois 5 minutes avec 1 ml de tampon TBS les cinq puits contenant les lamelles. Fixer 30 secondes avec la solution de fixation. Eliminer le fixateur. Rincer deux fois 5 minutes avec 1 ml de tampon TBS. Rincer deux fois 5 minutes avec 1 ml de tampon NTMT. Préparer extemporanément le réactif de révélation en tube à hémolyse : Tampon NTMT 5 ml NBT 22 µl BCIP 16 µl Ajouter 800 µl de réactif de révélation par puits. Incuber à l abri de la lumière jusqu à l apparition du signal. Laver rapidement trois fois avec 1 ml de tampon TBS. Retirer la lamelle avec une pince, y déposer une goutte de milieu de montage et la retourner sur une lame. Observer au microscope. TBS : Tris Buffer Salt, Tris 0,1 mol/l ph 8, NaCl 150 mmol/l, KCl 2,5 mmol/l NTMT : NaCl 0,1 mol/l, Tween 0,1%, MgCl 2 50 mmol/l, Tris 0,1mol/L, ph 9,5 NBT : Nitro Blue Tetrazolium BCIP : Bromo-Chloro Indolyl Phosphate Milieu de montage : PBS/glycérol (v/v) Solution de fixation : acétone, citrate de sodium à 30 mmol/l, méthanal à 37 % (65v/25v/8v) 5

6 2. Mesure de l activité phosphatase alcaline totale des cultures Rincer deux fois 5 minutes avec 1 ml de tampon TBS les cinq autres puits. Suspendre les cellules dans 500 µl de tampon de lyse et aspirer - refouler énergiquement. Mesurer l activité phosphatase alcaline de chaque lysat selon le protocole ci-dessous. Introduire en tubes à essais : Tampon DEA ph 9,8 nitro-4-phénylphosphate 5mmol/L 3 ml 2,5 ml Préincuber 5 minutes à 35 C en bain thermostaté. Introduire 200 µl de lysat cellulaire. Incuber pendant 2 minutes. Arrêter la réaction par ajout de 1 ml de solution d hydroxyde de sodium à 2 mol/l. Mesurer rapidement l absorbance à 405 nm contre un témoin de compensation convenable. TBS : Tris Buffer Salt, Tris 0,1 mol/l ph 8, NaCl 150 mmol/l, KCl 2,5 mmol/l Tampon de lyse : Tris 10 mmol/l, Triton X-100 0,5%, ph 9,5 3. Compte-rendu Présenter l ensemble des résultats sous forme d un tableau. Analyser et conclure. 6

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