Etude de la génotoxicité in vitro de nanoparticules manufacturées sur une lignée bronchique humaine : Exemple des TiO 2

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Sandrine Noël
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1 Etude de la génotoxicité in vitro de nanoparticules manufacturées sur une lignée bronchique humaine : Exemple des TiO 2 Maysaloun MERHI

2 Nombre de produits Introduction Évolution rapide et massive des nanotechnologies. Large gamme d applications (cosmétiques, alimentation, médicaments, textiles, carburant, énergie, ) Évolution du nombre de nano-produits répertoriés au niveau mondial dans le cadre du Nanotech Project (Woodrow Wilson Institute - 25 Août 2009) Exposition professionnelle, des consommateurs et de l environnement. Exposition et développement de pathologies humaines (e.g. maladies pulmonaires). Nécessité des études de toxicité. automobile 7% alimentation et boisson 9% électroménager 4% électronique et informatique 6% maison et jardin 15% produits pour enfants 2% santé et fitness 57% 2

3 Difficultés des études de toxicité des NPs Paramètres physico-chimiques importants à contrôler : Taille, distribution, Composition / pureté, Forme et morphologie (e.g. cristalline ou amorphe, sphérique ou plat,...), Agglomération / agrégation, Propriétés de surface (charge, surface spécifique, enrobage, ), Solubilité. + Propriétés peuvent changer selon : Méthode de production, Processus de préparation, Stockage. Nécessité de : Caractériser les propriétés physico-chimiques déterminantes de l effet de différentes NPs. 3

4 Objectifs du projet de recherche NPs manufacturées présentes sur le marché Effets génotoxiques in vitro sur cellules épithéliales bronchiques humaines : 16HBE14o- Méthodes : Test des comètes Test des micronoyaux Paramètres : présence de sérum, utilisation d une enzyme de réparation de l ADN (Fpg). 4

5 Nanoparticules de TiO 2 Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. Type de NPs Forme cristalline Taille Morphologie Surface spécifique (m 2 /g) Utilisation Dioxyde de titane Anatase 15 nm 240 Sphérique Rutile 50 nm 160 Crème solaire, peintures, encres, plastiques 5

6 Génotoxicité : tests effectués 16HBE14o- Pré-culture 22h Traitement 3h MEM -/+ SVF Lavage au PBS Test des comètes -/+ Fpg MEM + SVF Test des micronoyaux 6

7 Test des comètes in vitro "Single Cell Gel Electrophoresis" (SCGE) Test d altérations primaires de l ADN : détection de différents types de lésions de l ADN sur des cellules individualisées sites alcali-labiles, cassures simple et double brin, coupures résultant des phénomènes incomplets d'excision-resynthèse Optimisation Utilisation Fpg : Augmentation de la sensibilité du test, détection de lésions oxydantes de l ADN 7

8 Test des comètes : images observées 1 2 Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé 3 4 Noyau endommagé Noyau fortement endommagé Apoptose 8

9 Test du micronucleus in vitro Détection des aberrations chromosomiques Récolte Choc hypotonique et fixation Étalement Coloration Giemsa Examen Microscopique 9

10 Résultats Tests de cytotoxicité Concentrations retenues pour les tests de génotoxicité (µg/cm 2 ) SVF (-) SVF (+) Comètes Micronoyaux Comètes Micronoyaux TiO 2 anatase 6,51 à 104,17 1,63 à 26,04 6,51 à 104,17 1,63 à 26,04 TiO 2 rutile 6,51 à 104,17 0,81 à 13,02 6,51 à 104,17 6,51 À 104,17 10

11 TI (médiane / 200 cellules) TI (médiane / 200 cellules) Résultats : Test des comètes TiO 2 Anatase SVF (-) SVF (+) (-) SVF (-) (+) Fpg (-) Fpg (+) SVF (+) * * * * * * * * * ,51 13,02 26,04 52,08 104, ,51 13,02 26,04 52,08 104,17 Traitement (µg/cm 2 ) Traitement (µg/cm 2 ) Test de Mann-Whitney: * p<0,05 p<0,05 SVF (-) : lésions 1 aires surtout oxydantes SVF (+) : lésions 1 aires d autre nature 11

12 TI (médiane / 200 cellules) TI (médiane / 200 cellules) Résultats : Test des comètes TiO 2 Rutile SVF (-) SVF (+) 40 Fpg (-) SVF (-) SVF (+) 40 (+) Fpg (+) * * ,51 13,02 26,04 52,08 104, ,51 13,02 26,04 52,08 104,17 Traitement (µg/cm 2 ) Traitement (µg/cm 2 ) Test de Mann-Whitney: * p<0,05 p<0,05 Comète standard : effet biologique avec SVF Comète modifié : aucun effet biologique 12

13 Proportion de micronoyaux dans les cellules mononucléées ( / ) Résultats : Test des micronoyaux TiO 2 anatase SVF (-) SVF (+) ,63 3,26 6,51 13,02 26,04 Traitement (µg/cm 2 ) Test de Chi-2: * p<0,05 p<0,05 Aucun effet observé (-/+ sérum) 13

14 Proportion de micronoyaux dans les cellules mononucléées ( / ) Proportion de micronoyaux dans les cellules mononucléées ( / ) Résultats : Test des micronoyaux TiO 2 rutile SVF (-) SVF (+) ,81 1,04 1,63 2,08 3,26 6,51 13,02 Traitement (µg/cm 2 ) 0 0 6,51 13,02 26,04 52,08 104,17 Traitement (µg/cm 2 ) Test de Chi-2: * p<0,05 p<0,05 Aucun effet observé (-/+ sérum) 14

15 Synthèse des résultats SANS SVF AVEC SVF Comètes Micronoyaux Comètes Micronoyaux TiO 2 anatase TiO 2 rutile - - +/- - ANATASE RUTILE Lésions 1 aires aberrations chromosomiques effet recouvrement (réparation?) autres mécanismes toxiques? Effet génotoxique limité (comète standard, avec SVF, deux doses) 15

16 CONCLUSIONS Génotoxicité anatase > rutile. Comportement différent selon propriétés physicochimiques difficulté de généraliser à toutes les NPs. Influence du sérum (agrégation? cibles cellulaires?). Test de comètes : marqueur d exposition Importance de l utilisation de la Fpg. Importance de la réalisation du test de micronoyaux en parallèle au test des comètes. 16

17 PERSPECTIVES Etude de l endocytose et de l exocytose des TiO 2 par les 16HBE14o- Etude de leur localisation cellulaire (microscopie électronique) Mécanismes d action? Génotoxité primaire directe (Interaction directe avec l ADN, libération de radicaux libres, ). Génotoxité primaire indirecte (déplétion des systèmes anti-oxydants, augmentation des lésions oxydantes au niveau mitochondriale, inhibition de la réparation de l ADN). Génotoxicité secondaire (relation avec des effets inflammatoires?) Effet génotoxique d autres NPs (SiO 2, CeO 2, NanoAg,..). Autres types cellulaires (BEAS-2B, A 549). Autres enzymes de réparation à l ADN (hogg1). 17

18 REMERCIEMENTS EA 4483, IPL Toxicologie Génétique Alizée Brient, Dr. Fabrice Nesslany, Pr. Daniel Marzin, Pr. Frank Lecurieux, Dr. Anne Platel. EA 4483, IMPRT, IFR 114, Université de Lille 2 Pr. Didier Betbeder, Dr. Jiang Chang, Christophe Dombu. 18

19 MERCI DE VOTRE ATTENTION 19

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