THÈSE présentée par :

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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE SST EA 4245 Cellules dendritiques, Immunomodulation et Greffes THÈSE présentée par : Caroline PILON soutenue le : 4 Février 2009 pour obtenir le grade de : Docteur de l université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie/ Immunologie Analyse de la réponse allogénique chez le porc : orientation de la réponse lymphocytaire T effectrice par les cellules dendritiques et étude de la régulation de la réponse immune THÈSE dirigée par : M. BARON Christophe Maitre de conférences Praticien hospitalier (HDR), Université François Rabelais, Tours RAPPORTEURS : M. HAUET Thierry Professeur, Université de Poitiers, Poitiers M. BLANCHO Gilles Professeur, Université de Nantes, Nantes JURY : M. BARON Christophe Maitre de conférences, Université François Rabelais, Tours M. BLANCHO Gilles Professeur, Université de Nantes, Nantes M. HAUET Thierry Professeur, Université de Poitiers, Poitiers Mme. JUILLARD Véronique Docteur, Mérial, Lyon M. LEBRANCHU Yvon Professeur, Université François Rabelais, Tours M. SALMON Henri Directeur de Recherche, INRA, Tours

2 Remerciements Je tiens à remercier le Pr. Yvon Lebranchu pour m avoir accueillie dans son laboratoire et avoir accepté de faire parti de mon jury de thèse. Florence pour les conseils et l aide précieuse que vous avez pu m accorder durant ces années de thèse. Christophe, le directeur de ce travail, avec qui les discussions sont parfois sans fin mais toujours agréables et pertinentes. Vraiment un grand merci pour le temps que tu m as accordé et pour la rigueur scientifique que tu cherches à nous transmettre. Je tiens également à remercier le Pr Gilles Blancho et le Pr. Thierry Hauet pour avoir accepté d évaluer mon travail de thèse en tant que rapporteur. Un merci au Dr. Henri Salmon pour avoir accepté d examiner cette thèse et pour la collaboration entretenue durant ce travail. Le docteur Véronique Juillard, tout d abord pour avoir accepté d évaluer ce travail et aussi par l intermédiaire de Mérial pour m avoir fourni les cytokines porcines ayant permis la réalisation des expériences sur les cellules dendritiques. Les membres de l unité Lymphocytes et Immunité des Muqueuses de l INRA, pour leur collaborations dans ce travail. Un merci particulier à Benoit pour toutes les PCR quantitatives et à François pour tes conseils et ton aide. Merci aux membres de l UMR Physiologie de la Reproduction et des comportements et ceux de la Plateforme d Infectiologie Expériementale de l INRA de Tours pour les prélèvements de sang de porc. Merci au Dr Yves Le Vern et au Dr Dominique Kerboeuf du service commun de cytométrie de l INRA de Tours, pour les expériences de tri cellulaire. Merci au Dr. Julie-Déchanet Merville de l Université de Bordeaux pour les lignées fibroblastiques murines ainsi qu au Dr. Brigitte Arbeille et à madame Claude Lebos pour le travail effectué en microscopie électronique. Je remercie vivement Artur Summerfield pour m avoir accueillie chaleureusement dans son laboratoire pendant 3 semaines me permettant de découvrir un autre environnement de recherche scientifique avec des personnes très accueillantes dont je garderai d agréables souvenirs. Merci aux membres, ex-membres ou futurs ex-membres du laboratoire : Christine, Cyrille, Roxane, Romain, Angélique, Philipe, Thomas et les autres, merci pour votre aide, votre soutien et aussi pour l ambiance agréable qui règne dans ce laboratoire. Je tiens également à remercier : - Audrey pour les coups de main lors des nombreuses «manips» et pour les différentes discussions, voire vocalises réalisées sous la hôte les jours de «Boudin». Ta constante bonne humeur et ta joie de vivre furent très agréables à partager. 1

3 - Sylvie pour la réalisation des manips ainsi que pour le temps et l aide précieuse que tu m offres surtout pour la rédaction de ce manuscrit pour tes qualités humaines. Merci également pour ta générosité et tes confitures. - Laurence pour avoir partagé un certain temps de cette thèse ensemble, pour les relectures, ton sourire permanent et et tout le reste qui fait que l on restera amie. - Delphine, un énorme MERCI et bon séjour dans mon pays, je suis sûre que tu t y plairas ; finiras-tu peut être par le trouver ton mari canadien Bonne chance dans tes futures recherches (scientifiques bien sûr!!). Merci à mes coéquipières de handball qui se sont montrées très conciliantes, surtout pour les absences que j ai pu avoir à l entrainement. Un grand merci à mes amies (de vraies!!!) que je ne nommerai pas mais qui se reconnaitront, elles ont enduré ces durs mois de rédaction, voire d hibernation sans jamais se plaindre ni s éloigner Et surtout, je remercie mes parents et mon frère préféré, sans lesquels je ne serai pas là, toujours étudiante à presque 30 ans et qui m ont toujours encouragée et soutenue dans les choix que j ai pu faire dans ma vie, même celui de m éloigner d eux de quelques 6000 km. 2

4 Résumé En transplantation rénale, la réponse immune de l hôte contre son donneur reste une cause très importante de perte de greffons. Ainsi, un meilleur contrôle de la réponse allogénique par induction d une tolérance spécifique reste l une des priorités en transplantation humaine. A ce jour, l apport des modèles de transplantation chez le petit animal pour des protocoles d induction de tolérance chez l homme est assez limité. Par conséquent, un projet de créer un modèle pré-clinique chez le gros animal visant à explorer les possibilités d induction de tolérance aux allogreffes d organe s avère pertinent. Dans ce travail nous avons étudié plus particulièrement la réponse alloimmune chez le porc. Nous avons tout d abord étudié la réponse allogénique induite par des cellules dendritiques (DC) porcines activées par des agents d origine variée (CD40L ou la combinaison de TNFα, d INFα et de LPS). Ces agents augmentent l expression des molécules B7 et induisent l expression de novo de CD25 sur les DC ainsi qu une augmentation de la capacité à stimuler des lymphocytes allogéniques. Par ailleurs, le CD40L ou la combinaison TNF+INF+LPS induit des DC orientant la réponse allogénique vers Th1 et Th17 respectivement, alors que les DC immatures orientent vers Th2. Notre travail suggère aussi fortement l existence d une balance Th1-Th17 chez le porc. D autre part, nous avons mis en évidence les lymphocytes T régulateurs naturels CD4 + CD25 + porcins qui expriment Foxp3 et représentent environ 3% des cellules mononucléées du sang. Enfin, une stimulation de lymphocytes CD4 + par la phytohémagglutinine (PHA) et l IL-2 en présence de TGFβ induit fortement l expression de Foxp3. L ajout de rapamycine renforce l activité suppressive tout en maintenant l expression de Foxp3 induite par le TGFβ. A l inverse, la rapamycine seule n induit pas l expression de Foxp3 mais bloque la production d IL-17 induite par le TGFβ en présence de PHA et d IL-2. Cet effet pourrait expliquer le renforcement de l activité suppressive par la rapamycine. Mots-clés : greffe d organe, cellules dendritiques porcines, orientation de la réponse immune T, lymphocytes T régulateurs, modèle animal 3

5 Résumé en anglais In kidney transplantation, host immune response against donor still remains a major cause of graft loss. A better control of allogeneic response through the induction of specific tolerance is a major goal in human transplantation. Up to now translation into the clinic of results obtained in rodents has been disappointing. It therefore seems relevant to create a preclinic model in large animals to explore tolerance induction possibilities. In this work, we studied the alloimmune response in swine. We firstly studied the allogeneic response induced by swine dendritic cells (DC) activated by different agents (CD40L or a combination of TNFα, IFNα and LPS). These agents increased the expression of B7 molecules and induced de novo expression of CD25 on DC associated with an increase of allogeneic lymphocyte stimulation ability. In addition, CD40L and TNFα+IFNα+LPS induced DC polarizing to Th1 and Th17 response respectively, whereas immature DC directed lymphocytes to a Th2 response. Furthermore our results strongly suggest the existence of a Th1-Th17 balance in pig. We also revealed swine natural CD4 + CD25 + regulatory T cells which expressed Foxp3 gene and accounted for about 3% of the peripheral blood mononuclear cells. Stimulation of CD4 + cells with phytohaemagglutinin (PHA), IL-2 and TGFβ strongly induced the Foxp3 expression. Addition of rapamycin increased the suppressive activity with maintenance of the Foxp3 expression induced by TGFβ. However, the rapamycin alone did not induce Foxp3 expression, but impaired the IL-17 production induced by TGFβ, PHA and IL-2. This effect might explain the increase of the suppressive activity caused by rapamycin. Keywords: organ transplantation, swine dendritic cells, T cell orientation, regulatory T cells, animal model. 4

6 Table des matières Remerciements... 1 Résumé... 3 Résumé en anglais... 4 Table des matières... 5 Liste des tableaux... 9 Liste des figures Liste des annexes Liste des abréviations INTRODUCTION I- Préambule : contexte général de notre travail II-Les cellules dendritiques Généralités & rappels historiques sur les cellules dendritiques Biologie des cellules dendritiques : collecte et interprétation des signaux environnementaux, initiation de l immunité adaptative Maturation et activation des DC in vivo et in vitro a- Généralités sur le processus de maturation b- Induction de la maturation des cellules dendritiques et les récepteurs impliqués Récepteurs impliqués dans la reconnaissance des motifs conservés associés aux pathogènes Activation par des molécules endogènes (DAMP) Activation par des cytokines inflammatoires c- Voies de signalisation activées durant la maturation de la cellule dendritique d- Modifications d expression des molécules de surface et de la synthèse de cytokines et de chimiokines induites par la maturation e- Maturation des cellules dendritiques porcines Rôle des cellules dendritiques dans l activation des cellules de l immunité innée et adaptative a- Activation des cellules NK b- Activation des lymphocytes B c- Processus de présentation antigénique aux lymphocytes T Différentes sous-populations de cellules dendritiques: origine et différenciation a- Différentes sous-populations

7 3b- Sous-populations de cellules dendritiques porcines c- Ontogénie et différenciation des cellules dendritiques Modèles de différenciation de cellules dendritiques in vitro III- Les lymphocytes T Les différentes sous-populations de lymphocytes T L activation du lymphocyte T a- Récepteur des cellules T TCR b- Les molécules de co-stimulation dans l activation T c- Synapse immunologique d- Activation polyclonale des lymphocytes T Orientation de la réponse immune a- Orientation de la réponse Th b- Orientation de la réponse Th c- Orientation de la réponse Th d- Lymphocytes T régulateurs e- Interconnexion des différentes orientations et notion d équilibre IV- Vision intégrée de l organisation de la réponse immune adaptative : plasticité de la cellule dendritique, rôle de l environnement et trafic cellulaire dans l organisme Rôle des cellules dendritiques dans l orientation de la réponse immune Le concept de cellules dendritiques tolérogènes Migration des cellules dendritiques V-Immunologie de la greffe Différents types de rejets Différentes voies d alloreconnaissance Les immunosuppresseurs Tolérance immune a- Mécanismes généraux b- Les lymphocytes T régulateurs Le porc comme modèle animal d étude de l allogreffe Objectifs de l étude MATERIELS ET METHODES DE L ETUDE Animaux Réactifs Cellules dendritiques porcines

8 Différenciation des monocytes en cellules dendritiques Maturation des cellules dendritiques Microscopie électronique Analyse de la phosphorylation de p38mapk Isolement des lymphocytes Activation lymphocytaire Cytométrie en flux Mesure de la sécrétion de cytokines par ELISA PCR quantitative Analyse Statistique RESULTATS A- Caractéristiques des cellules dendritiques porcines avant et après activation par divers agents en présence ou non d immunosuppresseurs I- Etude de la morphologie, du phénotype de surface et des cytokines Changements morphologiques des cellules dendritiques porcines induits par le CD40L Modification phénotypique des DC porcines après activation par différents agents: expression de novo du CD Analyse des cytokines produites : le CD40L et le mélange TNF-LPS-IFN induisent la production d IL-12p40 par les cellules dendritiques Etude de la phosphorylation de p38mapk par le LPS et le mélange TNF-LPS-IFN113 II- Influence des différentes conditions d activation sur la capacité allostimulatrice des cellules dendritiques porcines Etude quantitative de la capacité allo-stimulatrice des cellules dendritiques porcines Analyse phénotypique des lymphocytes porcins après stimulation par des DC allogéniques III-Effet des immunosuppresseurs sur les cellules dendritiques porcines Effet de l acide mycophénolique sur les capacités allostimulatrices des cellules dendritiques Effet de la rapamycine sur la maturation et l activation des cellules dendritiques IV-Orientation de la réponse immune par les cellules dendritiques B- Exploration de la réponse immune T régulatrice et Th17 chez le porc I- Caractérisation des lymphocytes T régulateurs naturels porcins

9 Répartition des cellules CD25 + et Foxp3 dans les lymphocytes circulants Mise en évidence de la fonction régulatrice des lymphocytes T CD4 + CD25 + circulants Capacité proliférative des Treg naturels du porc après stimulation par des agents mitogènes II- Orientation de la réponse immune vers la régulation par activation polyclonale de lymphocytes CD4 + en présence de TGFβ et de rapamycine Effet du TGFβ et de la rapamycine sur la prolifération induite par la PHA Induction de l expression de Foxp3 par le TGFβ Augmentation de CD25 et de SLA-DR par la PHA : effet de la rapamycine et du TGFβ Activité suppressive des lymphocytes T CD4 + en présence de TGFβ et de rapamycine Effet de la rapamycine et du TGFβ sur la stimulation de lymphocytes CD4 + CD25- par de la PHA et de l IL III- Modulation de l orientation Th17 par l IL-6 et la rapamycine DISCUSSION CONCLUSION Résumé Résumé en anglais

10 Liste des tableaux Tableau I : anticorps utilisés pour l analyse des cellules dendritiques et des lymphocytes porcins par cytométrie en flux Tableau II : Séquences des amorces, température d hybridation des paires d amorces ( C), tailles des fragments attendus (bp) et numéros d accession

11 Liste des figures Figure 1 : Les TLR et quelques uns de leurs ligands Figure 2 : Différentes voies de signalisation impliquées dans la maturation des cellules dendritiques Figure 3 : Différentes modifications des cellules dendritiques suite à la maturation Figure 4 : Précurseurs des cellules dendritiques humaines. (Adapté de Shortman, et al, Nat. rev. Immunol., 2002) Figure 5 : Voies de signalisation impliquées dans l activation du lymphocyte T Figure 6 : Molécules de co-stimulations de la famille B7-CD28 et TNF-TNFR Figure 7 : Molécules impliquées dans la synapse immunologique entre la cellule dendritique et un lymphocyte T Figure 8 : Différentes orientations de la réponse immune T CD Figure 9 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th Figure 10 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th Figure 11 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th Figure 12 : Cytokines de la famille de l IL-12 et leurs récepteurs Figure 13 : Différentes voies d alloreconnaissance Figure 14 : Différents mécanismes d action des Treg. (Adapté de Vignali, et al, Nat. rev. Immunol., 2008) Figure 15 : L activation des cellules dendritiques porcines par du CD40L entraîne des modifications morphologiques Figure 16 : Caractéristiques phénotypiques des cellules dendritiques stimulées par différents agents maturants Figure 17 : Synthèse d IL-12p40 et d IL-10 par les DC porcines activées Figure 18 : Détection de la phosphorylation de p38mapk dans les cellules dendritiques porcines Figure 19 : Comparaison de la prolifération de lymphocytes porcins par des DC allogéniques maturées par différents agents Figure 20 : Analyse phénotypique des PBMC après leur activation par des DC allogéniques Figure 21 : Analyse phénotypique des lymphocytes CD4 + ou de PBMC dépourvues de cellules CD4 + après leur activation par des DC allogéniques

12 Figure 22 : Effet de l acide mycophénolique sur la fonctionnalité des cellules dendriques porcines Figure 23 : Effet de la rapamycine sur le phénotype et la production de cytokines des cellules dendritiques porcines Figure 24 : Analyse de l orientation des cellules T auxiliaires par les DC porcines Figure 25 : Répartition des marqueurs CD25 et Foxp3 dans les PBMC porcins Figure 26 : Mise en évidence du phénomène de lymphocytes T régulateurs naturels chez le porc Figure 27 : Capacité proliférative des T régulateurs naturels après stimulation par des agents mitogènes Figure 28 : Activation et prolifération induite par la stimulation PHA en présence d IL- 2 et d agents immunomodulants Figure 29 : Induction de l expression de Foxp3 par le TGFβ Figure 30 : Pourcentage et nombre de cellules exprimant Foxp Figure 31 : Le TGFβ et la rapamycine augmentent l expression de CD25 et de SLA-DR Figure 32 : Analyse de la fonction suppressive et de la prolifération des cellules T CD4 + après culture en présence de TGFβ et de rapamycine Figure 33 : Analyse de la fonction suppressive des cellules T CD4 + après culture en présence de TGFβ et de rapamycine Figure 34 : L activité suppressive est dépendante du nombre du ratio T : PBMC Figure 35 : Effet du TGFβ et la rapamycine sur l activation de cellules CD4 + CD25 - par la PHA Figure 36 : Modulation par le TGFβ de l orientation de la réponse immune induite par la PHA et l IL Figure 37 : Modulation de l orientation de la réponse immune par le TGFβ et la rapamycine Figure 38 : Schéma hypothétique sur les effets de la rapmycine et du TGFβ sur l orientation de la réponse immune chez le porc

13 Liste des annexes Annexe 1: CD40 engagement strongly induces CD25 expression on porcine dendritic cells and polarizes the T cell immune response toward Th Annexe 2: Induction of porcine regulatory cells by mycophenolic acid-treated dendritic cells Annexe 3 : Porcine CD4 + CD25 + natural regulatory T cells express Foxp3 and suppress polyclonal activation Annexe 4 : Inhibition of TGFβ-induced Th17 differentiation by rapamycin favors induction of regulatory T cells Annexe 5 : Bibliographie personnelle

14 Liste des abréviations ADN : Acide DésoxyriboNucléique Ag : Antigène ARN : Acide RiboNucléique ATP : Adénosine TriPhosphate BCR : B Cell Receptor BDCA: Blood Dendritic Cell Antigen CD : Classe de Différenciation cdc : Cellule Dendritique conventionnelle CFSE : CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester CLIP: Class II associated Invariant chain Peptide CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité CPA : Cellule Présentatrice d Antigène CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte-associated Antigen-4 DAMP : Damaged Associated Molecular Patterns DC : Dendritic cells utilisé pour Cellule Dendritique DC-SIGN: Dendritic Cell Specific Intracellular adhesion molecule Grabbing non-integrin dsrna : ARN double brin ELISA : Enzyme Linked Immonosorbant Assay ERK: Extracellular signal-related Kinase FcR : Récepteur du Fragment Fc Flt3 : FMS-like tyrosine kinase 3 Foxp3 : Forkhead box p3 GITR : Glucocorticoid Induced Tumor necrosis factor Receptor GM-CSF : Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor HPRT-1: Hypoxanthine PhosphoRiblosyl-Transferase 1 HSP : Heat Shock protein ICAM : Inter Cellular Adhesion Molecule ICOS : Inducible T cell CO-Stimulator IFN : interferon Ig : Immunoglobuline IL : InterLeukine IMF: Intensité Moyenne de Fluorescence IRAK : Interleukin 1 Receptor Associated Kinase IRF: Interferon Regulatory Factor JNK: c-jun N-terminal Kinase LFA-1: Lymphocyte Function-associated Antigen-1 LPS : LipoPolySaccharide 13

15 MAPK : Mitogen Activated Protein Kinases MLR: mixed leukocyte reaction MMF: Mycophenolate Mofetil MPA: Acide Mycophénolique mtor: mammalian Target Of Rapamycin Myd88: Myeloid differentiation primary response gene (88) NFAT : Nuclear Factor of Activated T-cells NF-κB : Nuclear Factor κb NK : natural killer NLR : NOD Like Receptor NOD : Nucleotide Oligomerization Domain OLS : Organe Lymphoïde secondaire PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns PBMC : Peripheral Blood Monocytes PBS : phosphate buffered saline pdc : Cellule Dendritique plasmacytoïde PDL-1 : Programmed Death 1 Ligand PGE2 : ProstaGlandine E2 PHA : PhytoHémAgglutinine PI3K : PhosphatidylInositol 3-Kinase PMA : Phorbol Myristic Acetate PRR : Pathogen Recognition Receptor RE : Réticulum Endoplasmique RPL-19 : Ribosomal Protein L 19 STAT : Signal Transducers and Activators of Transcription SVF : sérum de veau fœtal TAP : Transporter Associated with antigen Processing TBP-1 : Tata Box Binding Protein 1 TCR : T cell receptor TGF-β : Transforming Growth Factor β Th : T helper TLR : Toll Like Receptor TNF-α : Tumor Necrosis Factor α 14

16 INTRODUCTION 15

17 I- Préambule : contexte général de notre travail La transplantation est une thérapeutique efficace de prolongation de la vie chez des malades gravement menacés ou d amélioration de la qualité de vie liées à la défaillance d un organe. En 2007, 4600 transplantations d organes ont été réalisées en France dont 2900 greffes rénales. Des progrès substantiels ont été accomplis au cours des vingt dernières années dans la prévention du rejet aigu de greffe rénale survenant actuellement chez environ 15% des patients. Ces progrès ont été principalement obtenus grâce à de meilleures stratégies thérapeutiques (nouveaux immunosuppresseurs, amélioration de la prise en charge des donneurs et des receveurs). Ceci s est traduit par une nette amélioration de la survie des greffons à un an de greffe. Cependant, sur le long cours (après un an) environ 4% des greffons sont encore perdus chaque année et ce chiffre a peu changé au cours des dernières années. La raison principale en est la néphropathie chronique d allogreffe, dont le rejet chronique constitue une cause importante, que les traitements actuels n arrivent pas à maîtriser efficacement. Ainsi la réponse immune de l hôte constitue encore actuellement un obstacle majeur à la survie des greffons à long terme. Les stratégies actuelles basées, presque exclusivement sur une immunosuppression au long cours par des produits chimiques ou biologiques, semblent être arrivées à un plateau d efficacité comme en témoigne l infléchissement des courbes de survie récentes. Les facteurs expliquant cette observation sont multiples. Quoiqu il en soit, même si la recherche de nouvelles cibles moléculaires de l immunosuppression chimique ou biologique doit être poursuivie, il faut garder en mémoire que toute nouvelle immunosuppression chronique pourrait se traduire par une augmentation du niveau d'immunosuppression globale avec pour conséquence probable un accroissement inacceptable des effets secondaires graves à long terme (risques de tumeurs et d infections, virales notamment). Si on ajoute à ce constat la pénurie relative actuelle d organes par rapport au nombre de receveurs potentiels et le coût financier de chaque année de dialyse induit par la perte d un greffon rénal, les recherches pour allonger la survie des greffons constitue une priorité. La recherche d une immunosuppression sélective pour les antigènes du donneur associée à une immunosuppression «classique» générale temporaire constitue un axe de 16

18 recherche plus que jamais nécessaire pour l avenir de la greffe. De nombreux protocoles ont permis d induire de la tolérance aux allogreffes chez les rongeurs mais il n'y a guère de preuves de cette tolérance chez les grands animaux ou chez l homme. La relative facilitée avec laquelle la tolérance à une allogreffe peut être induite chez les rongeurs limite l intérêt de ces animaux comme modèles précliniques pour initier directement des essais cliniques. Ainsi, des modèles de tolérance en transplantation établis chez des gros animaux non primates pourraient constituer une alternative pertinente comme modèles pré-cliniques. Le porc comme modèle d allogreffe a été exploré par certaines équipes (Baron et al., 2001 ; Blancho et al., 1995 ; Gianello et al., 1993 ; Jayle et al., 2006; Sonntag et al., 2001 ). Le rejet de greffe tout comme probablement la tolérance aux allotransplantations nécessitent une présentation des antigènes du donneur aux lymphocytes du receveur. Les cellules dendritiques jouent probablement un rôle central dans ce processus. La grande plasticité des cellules dendritiques fait de la manipulation de ces cellules un champ d investigation pour une potentielle thérapie cellulaire par des DC pro-tolérogènes afin de moduler la réponse immune. Il nous paraît donc pertinent d étudier l alloréponse induite par des cellules dendritiques et de caractériser l orientation de la réponse immune par différents types de cellules dendritiques chez le porc dans la mesure où cela a encore été peu étudié chez cet animal. Par ailleurs, l étude de la régulation de la réponse immune est une étape très importante avant d établir des modèles d induction de tolérance. En effet, les lymphocytes T régulateurs apparaissent actuellement comme un outil prometteur pour l induction d une tolérance immune spécifique en transplantation et actuellement les travaux chez le porc dans ce domaine sont très rares. Notre travail a donc porté sur ces deux aspects de la réponse immune chez le porc. 17

19 II-Les cellules dendritiques Notre introduction fera le point sur les connaissances actuelles sur le rôle de l interaction des cellules dendritiques et les lymphocytes lors de la réponse immune soit effectrice soit tolérogène. La majorité des données présentées ont été acquises chez l homme et la souris cependant lorsque des informations/ résultats plus spécifiques ont été rapportées chez le porc elles seront présentées dans des encadrés séparés. Généralités & rappels historiques sur les cellules dendritiques En 1868, Paul Langerhans a été le premier à décrire des cellules dendritiques à partir de la peau humaine bien qu à l époque il croyait qu il s agissait de cellules nerveuses cutanées. Environ 100 ans plus tard, Steinman et Cohn découvraient ces cellules dans la rate de souris et les nommèrent cellules dendritiques du fait de leur morphologie particulière en forme d arbre ou de dendrites (du grec «dendron», signifiant arbre) (Steinman and Cohn, 1973). Cependant, la faible fréquence dans l organisme (1-2% des leucocytes totaux) et le manque de marqueurs spécifiques ont posé problèmes pour la purification des cellules dendritiques et ont ralenti les progrès dans leur caractérisation durant les 20 années qui suivirent leur découverte. L émergence de techniques de différenciation ex vivo à partir de différents précurseurs et l apparition d anticorps monoclonaux spécifiques ont permis de faciliter la purification et l étude de leur développement ainsi que leur fonctionnalité (Banchereau et al., 2000). Les cellules dendritiques (DC) forment un groupe très hétérogène de leucocytes dérivés de cellules de la moelle osseuse, distribuées dans l ensemble des tissus de l organisme. Leur rôle est de filtrer les informations provenant de leur environnement dans les tissus pour en extraire les antigènes vis-à-vis desquels elles initieront, une fois activées, la réponse immune visant : à éliminer le danger ou au contraire à participer activement au maintien de la tolérance. Elles sont d une certaine façon «les donneuses d ordre» pour initier ou non la réponse immune. Ces cellules sont tout à fait originales, tant au plan de leur fonction que de leur ontogenèse. Elles se caractérisent in vivo par une très grande hétérogénéité traduisant différents stades fonctionnels d'activation et de maturation mais aussi 18

20 par différentes voies de différenciation à partir de progéniteurs soit myéloïdes soit lymphoïdes. Au stade immature de leur développement, les DC agissent comme sentinelles au niveau des tissus périphériques, sondant continuellement l environnement antigénique grâce à leur capacité de capture d antigène très diversifiée et à des récepteurs (comme TLR, «Toll Like Receptor», lectines de type C et NLR «NOD Like Receptor). Toute rencontre avec certains produits provenant soit de micro-organismes soit de tissus endommagés initie la migration et la maturation des DC vers les organes lymphoïdes secondaires (OLS), ganglions lymphatiques et rate entre autres. Lors de ce processus, l antigène capturé dans un contexte identifié par la DC comme «danger» est apprêté pour être présenté par les molécules du CMH (Complexe Majeur d Histocompatibilité) sous forme de peptide à la surface de la cellule, pour initier une réponse immune adaptative (Banchereau et al., 2000). L expression de plusieurs molécules de co-stimulation est nécessaire pour engendrer une réponse immune efficace et adaptée des cellules de l immunité adaptative comme les lymphocytes T (Greenwald et al., 2005; Quezada et al., 2004 ) dans les OLS notamment. La cellule T grâce à un récepteur spécifique pour le complexe peptide-cmh exprimé par la DC va initier un programme d activation génique complexe qui conduira à une réponse immune T cytotoxique et/ou auxiliaire pour éventuellement éliminer l antigène étranger. Les DC sont aussi importantes dans l initiation de l immunité humorale grâce à leur propriété d activer directement les lymphocytes B (Bergtold et al., 2005 ; Wykes et al., 1998). Enfin, les DC ont aussi la capacité d activer les cellules de l immunité innée comme les cellules NK («Natural Killer») et NKT («Natural Killer T cells») (Fujii et al., 2002; Gerosa et al., 2002 ). Aux cotés de ces DC migratoires, dites conventionnelles, des DC résidentes capables de capter des informations dans les OLS (provenant non seulement des DC migratoires mais aussi des antigènes solubles diffusant au ganglion) ont été identifiées récemment (Itano et al., 2003). Outre leur activité «immunogène», les cellules dendritiques ont aussi été décrites comme étant impliquées dans la tolérance immune à la fois centrale et périphérique. Les DC «tolérogènes» présentent les antigènes aux cellules T spécifiques mais échouent dans la délivrance d un signal efficace d activation des effecteurs (procurant soit un signal inhibiteur soit un signal incomplet) pour l activation et la prolifération des cellules T. Les grandes caractéristiques des cellules dendritiques ont été principalement décrites à partir des DC murines puis humaines. Cependant, depuis la fin des années 90, la caractérisation de cellules dendritiques chez d autres espèces a été rapportée comme chez le 19

21 singe, le porc, le chien, le bovin, le mouton et le cheval notamment (Miranda de Carvalho et al., 2006). Biologie des cellules dendritiques : collecte et interprétation des signaux environnementaux, initiation de l immunité adaptative L immunité innée utilise des mécanismes qui ne sont pas spécifiques à un pathogène particulier. Elle est la première ligne de défense durant la période critique suivant l exposition de l hôte à un pathogène grâce 1) à la mobilisation précoce, entre autres, des cellules phagocytaires et de certains systèmes ancestraux comme le complément et 2) à la collecte et à l interprétation des informations contenues dans l environnement, fonction assurée essentiellement par les DC qui pourront ensuite informer l immunité adaptative en stimulant des cellules possédant un récepteur dont la diversité est considérable (répertoire TCR («T Cell Receptor») et BCR («B Cell Receptor»)), afin de développer une réponse immune spécifique d antigènes et d élaborer une mémoire immunitaire. Pour exercer pleinement ces fonctions d initiation de la réponse immune la DC doit recevoir des signaux lui permettant de déclencher un processus moléculaire de reprogrammation et d activation génique appelé processus de maturation. Les DC se métamorphosent de cellules capturant les antigènes en cellules présentatrices d antigènes (CPA). 1- Maturation et activation des DC in vivo et in vitro 1a- Généralités sur le processus de maturation. Les cellules dendritiques capturent des antigènes (incluant les cellules apoptotiques), par des mécanismes très diversifiés. Citons la pinocytose et la phagocytose détaillée ci dessous au chapitre capture de l antigène. Les antigènes peuvent également être acquis par une infection directe des DC ; ou suite à leur liaison à des fragments Fc des immunoglobulines, à des glycoprotéines ; ou par les récepteurs du complément. Lorsque les DC sont exposées à un pathogène ou des lésions dans les tissus périphériques elles vont lier, par des récepteurs, certaines molécules produites par ces agents pathogènes ou libérées lors de lésions tissulaires (appelées respectivement PAMP : «Pathogen Associated Molécular Pattern» et DAMP : «Damaged Associated Molécular 20

22 Pattern»). Ces récepteurs sont très divers et ont la capacité de «transduire» des signaux d activation à la DC via différentes voies de signalisation, qui finiront par activer des facteurs de transcription de la réponse immune effectrice dont les plus connus sont les MAP kinases («Mitogen-Activated Protein Kinase»), NF-κB («Nuclear Factor κb»), et les différents IRF («Interferon Regulatory Factor» ). Cette signalisation a été popularisée par Matzinger sous le terme global de signal «danger» (Matzinger, 1994). Cette activation, dénommée sous le terme générique de processus de maturation, va entraîner des modifications coordonnées et considérables dans la cellule : 1) des changements morphologiques comme la perte des structures adhésives ; 2) la diminution d expression des récepteurs de capture d antigène ; 3) la sécrétion synchronisée de chimiokines ; 4) l augmentation d expression des molécules de co-stimulation, comme par exemple CD40, CD80/86 ; 5) l augmentation de la capacité de présentation aux lymphocytes T auxiliaires par la translocation des molécules de CMH de classe II des compartiments à la surface cellulaire ; 6) la production de cytokines, participant à l initiation de la polarisation de la réponse immune effectrice ; 7) l acquisition d une forte mobilité pour permettre la migration vers les tissus lymphoïdes secondaires. A leur arrivée dans le ganglion, les DC qui présentent alors des peptides qui reflètent la situation antigénique du site où ils ont été acquis, vont interagir avec les lymphocytes et les DC résidentes du ganglion. Il faut tout de suite mentionner que l expression de molécules de surface caractéristiques de cellules dendritiques matures n indique pas nécessairement que ces cellules sont «immunogènes». De plus, la migration des DC depuis les tissus périphériques n indique pas non plus nécessairement l acquisition d une capacité immunogène puisqu il semble que des DC transportent en permanence des cellules apoptotiques épithéliales de l intestin vers les ganglions mésentériques pour participer au maintien de la tolérance (Huang et al., 2000). Ainsi les concepts de DC matures et immatures ont donné lieu parfois à un certain nombre de simplifications excessives de la réalité et pose actuellement des problèmes terminologiques (une DC mature et DC «immunogène» ne sont pas synonymes). Des travaux ont montré que les DC, pour participer à la tolérance, ont besoin de recevoir un signal d activation par exemple pour exprimer le CCR7 nécessaire à leur migration (Ip and Lau, 2004). De plus, il a été montré qu à l état de repos et d équilibre (en dehors de toute inflammation) de nombreuses DC des tissus périphériques ont reçu un signal de maturation afin de les rendre capables de présenter les antigènes (Vermaelen et al., 2001). De ce fait, actuellement, il est difficile d évaluer le nombre de DC réellement immatures dans un tissu 21

23 périphérique non lymphoïde. Ainsi le concept qui associe DC immature à tolérance et DC mature à immunogénicité est aujourd hui battu en brèche. En conséquence, répondre à la question qu est ce qu une DC mature devient de plus en plus difficile. Dans la suite de ce travail, le mot de maturation ne sera donc pas employé pour désigner nécessairement des DC immunogènes mais seulement des DC qui auront reçu un signal de remodelage de leur fonction. Il faut cependant observer que ce processus a été le plus étudié par induction avec des substances capables de générer essentiellement des DC immunogènes. Ce sont donc surtout ces aspects que nous allons détailler dans ce chapitre. 1b- Induction de la maturation des cellules dendritiques et les récepteurs impliqués. On distingue 4 grandes familles de molécules capables d induire des signaux de maturation vers la DC : les motifs conservés associés aux pathogènes (PAMP), les molécules associées aux dommages cellulaires (DAMP), les cytokines synthétisées par les cellules de l environnement où se déclenche la réponse immune qui peuvent donc provenir des cellules épithéliales, des cellules de l immunité innée ou des fibroblastes et enfin l engagement du CD40 à la surface de la DC. Récepteurs impliqués dans la reconnaissance des motifs conservés associés aux pathogènes Lorsqu un micro-organisme entre en contact avec les cellules de l hôte, il doit être détecté comme agent étranger par les cellules du système immunitaire. Cette reconnaissance fait intervenir des récepteurs de l immunité innée qui ont été nommé PRR (récepteurs de reconnaissance des pathogènes) (Medzhitov and Janeway, 1997). Les PRR reconnaissent des motifs moléculaires conservés (PAMP) qui ne sont exprimés que par les micro-organismes. Ces récepteurs permettent ainsi de distinguer les micro-organismes étrangers des cellules de l hôte. Les PAMP sont relativement invariants entre les espèces de micro-organismes et sont essentiels pour leur survie. Les motifs les plus connus sont les composants des cellules bactériennes et fongiques comme le LPS (LipoPolySaccharide) et les peptidoglycanes, les ARN double brins des virus ou encore les motifs CpG non méthylés caractéristiques des génomes des micro-organismes. Les récepteurs de ces PAMP (PRR) sont actuellement regroupés en 4 grandes familles : les TLR («Toll Like Receptor»), les lectines de type C et les récepteurs intracellulaires NLR («NOD Like Receptor») et RLH («RIG Like Helicase»). Les différentes sous populations de cellules dendritiques expriment différemment 22

24 ces récepteurs permettant la reconnaissance des pathogènes et leur intervention au niveau de la réponse innée. «Toll Like Receptor»: TLR Initialement identifiés comme étant des homologues des protéines Toll décrites chez la drosophile, les TLR sont des récepteurs soit de surface, soit intracytoplasmiques (Iwasaki and Medzhitov, 2004). La famille des TLR décrite chez les mammifères compte actuellement 13 membres chez la souris, et 10 chez l homme. Une dizaine de gènes orthologues porcins des TLR humains ont été identifiés (Uenishi and Shinkai, 2008). Plusieurs caractéristiques de la biologie des TLR contribuent à la détection efficace des micro-organismes par les cellules immunes (figure 1). Tout d abord, chaque TLR reconnaît des motifs moléculaires distincts de composants microbiens (Takeda et al., 2003). Citons comme exemple le TLR4 qui reconnaît le LPS (Medzhitov et al., 1997 ; Poltorak et al., 1998), le TLR9 pour l ADN bactérien riche en motif non méthylés (CpG) (Hemmi et al., 2000) et le TLR3 pour les ARN doubles brins (mimés dans les études in vitro par le poly (I:C)) (Alexopoulou et al., 2001). Diacyl lipopeptide Zymosan acide lipotéichoïque Triacyl lipopeptide Flagelline LPS Peptidoglycane Figure 1 : Les TLR et quelques uns de leurs ligands 23

25 Les TLR sont situés au niveau des membranes dans différents compartiments cellulaires. La plupart des TLR sont présents à la surface, seuls les TLR sont compris dans les compartiments endosomiaux (Ahmad-Nejad et al., 2002 ; Heil et al., 2003 ; Matsumoto et al., 2003). Finalement, les TLR sur les DC sont exprimés sous forme d homodimères ou d hétérodimères et essentiellement de façon constitutive ; mais peuvent faire l objet d une régulation transcriptionnelle, ce qui détermine leur capacité à détecter les produits microbiens (Jarrossay et al., 2001; Kadowaki et al., 2001 ). Notons que le répertoire d expression des TLR permet de distinguer certaines sous familles de DC (voir le chapitre sur les différentes sous-populations de cellules dendritiques). L engagement d un TLR par son ligand active différents voies de signalisation menant à l activation des MAPK, de certains IRF et du facteur de transcription NF-κB (la signalisation est détaillée dans le chapitre II-1c) impliqués dans l induction de nombreux gènes principalement pro-inflammatoires comme le TNFα («Tumor Necrosis Factor»), l IL- 1, l IL-6 et des molécules de co-stimulation comme CD80 et CD86. L engagement des TLR sur les cellules dendritiques entraîne aussi une augmentation de l expression des complexes CMH-peptide. Tous ces effets ont une influence importante sur la stimulation et la différenciation des cellules T (Reis e Sousa et al., 2001). Lectines de type C Les lectines de type C (CLR) sont des molécules définies par leur capacité à fixer les résidus glucidiques de façon calcium dépendante (Weis et al., 1998). Les membres de cette famille partagent un domaine de reconnaissance des sucres (CRD pour «Carbohydrates Recognition Domain» ). Les cellules dendritiques expriment différentes sortes de CLR à leur surface qui servent d ancrage à une grande quantité de micro-organismes incluant des virus, des bactéries, des parasites et des champignons et permettent leur internalisation. De façon similaire aux TLR, différentes sous-populations de cellules dendritiques expriment différentes lectines. Ainsi la molécule BDCA2 («Blood Dendritic Cell Antigen») semble plus spécifiquement exprimée par les DC plasmacytoides (pdc), la langerine/cd207 plutôt par les cellules de Langherans et DC-SIGN/CD209 («DC-Specific Intercellular adhesion molecule-3 Grabbing non-integrin») par les cellules dendritiques interstitielles. Les autres CLR comme le récepteur au mannose/cd206, dectin1-2, DEC205/CD205 sont plutôt exprimés de façon uniforme entre les différentes sous-populations de cellules dendritiques. La liaison simultanée de TLR et des CLR par des agents microbiens peut influencer l activation de la DC et la synthèse de cytokines. 24

26 Ces molécules ont par ailleurs de nombreuses autres fonctions par exemple DC-SIGN est aussi une molécule d adhésion qui interagit avec ICAM2 («Inter Cellular Adhesion Molecule») pour faciliter la migration des DC (Geijtenbeek et al., 2000a), ou avec MAC1/CD11b pour participer à l activation des neutrophiles par la DC (van Gisbergen et al., 2005) ou avec ICAM3 pour participer à l activation du lymphocyte T (Geijtenbeek et al., 2000b). Par ailleurs, certains CLR comme DC-SIGN et Dectin-1 par exemple ont été montrés comme induisant un signal activateur dans la DC grâce à un motif ITAM («Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs») (Geijtenbeek et al., 2000b). En revanche, certains CLR comme le récepteur au mannose ne serait peut être seulement impliqué que dans l endocytose. Chez le porc, le clonage et le séquençage de la molécule DC-SIGN viennent d être publiés (Huang et al., 2008). Son rôle dans la réponse immune ou son implication dans la physiologie de la cellule dendritique porcine n est pas encore établi. Récepteurs intracellulaires de reconnaissance des micro-organismes Récemment deux autres familles de PRR ont été décrites comme étant impliquées dans la reconnaissance intracellulaire des PAMPs dérivés notamment des virus et des bactéries. Il s agit des NLR et des RLH. Contrairement aux TLR qui sont liés à une membrane cellulaire, de surface pour la majorité ou bien d un compartiment intracellulaire, les NLR et les RLH sont des protéines solubles qui surveillent le cytoplasme pour détecter la présence de PAMP intracellulaires. Les deux premiers membres de la famille des NLR à avoir été décrits sont NOD1 («Nucleotide Oligomerization Domain») et NOD2 (Inohara et al., 1999 ; Ogura et al., 2001). La famille des NLR compte actuellement plusieurs membres incluant, entre autres, des molécules NOD et des membres du clan NALP («NACHT/LRR/Pyd-containing Proteins») (Martinon and Tschopp, 2005). L implication des protéines NOD dans l immunité antimicrobienne a été récemment décrite grâce à l étude de souris déficientes en molécules NOD. Les souris déficientes en NOD1 ont une plus forte susceptibilité aux infections par Helicobacter pylori (Viala et al., 2004) alors qu une diminution de la clairance de Listeria monocytogenes est observée chez les souris déficientes en NOD2 (Kobayashi et al., 2005). Les récepteurs NOD reconnaissent les pathogènes par des motifs du peptidoglycane bactérien grâce à leur domaine LRR («Leucin Rich Repeat») riche en leucine menant à la transduction de signaux via leur domaine CARD («CAspase Recruitment Domain») dont l activation du facteur de transcription NF-κB (Inohara et al., 2003 ; Viala et al., 2004). Les agonistes de TLR ainsi que ceux des NLR peuvent agir en synergie dans l induction de la maturation des cellules dendritiques (Fritz et al., 2005 ; Tada et al., 2005). 25

27 La réponse innée contre les virus repose également sur la détection de PAMPs viraux et une production de cytokines antivirales telles que les interférons de type I. Des études récentes ont montré qu il existe des récepteurs cruciaux autres que le TLR3 dans la détection des ARNdb. En effet, les RLH, dont les deux membres principaux sont RIG-I (ou DDX58) et MDA5 (ou Helicard), partagent deux domaines N terminaux CARD suivis d un domaine RNA hélicase. Ces récepteurs ont aussi été décrits comme étant importants dans la reconnaissance des ARN simple-brins (ARNsb) positifs ou négatifs. La reconnaissance de l ARN viral par ces protéines induit la production d interféron de type I via l activation de NF-κB (Andrejeva et al., 2004; Yoneyama et al., 2004 ). Chez le porc, Tohno et collaborateurs, ont récemment cloné et caractérisé la molécule NOD2 qui semble aussi impliquée dans la reconnaissance d un composant du peptidoglycane, le MDP (Muramyl DiPeptide) (Tohno et al., 2008). Activation par des molécules endogènes (DAMP) Des signaux provenant des cellules mortes ou de lysats cellulaires sont capables d induire la maturation des DC (Gallucci et al., 1999). Les molécules capables d induire ces signaux sont classées sous le vocable de DAMP ; «Damage Associated Molecular Pattern» (Seong and Matzinger, 2004).Un certain nombre de molécules de cette famille a été identifié : les protéines de stress ou HSP («Heat Shock Proteins»), la protéine HMGB1 ( «High Mobility Group Box 1» (libérée par les cellules nécrotiques)), la β défensine (peptide anti-microbien), certains composants de la matrice extracellulaire comme l acide hyaluronique et l acide urique (Biragyn et al., 2002 ; Lotze and Tracey, 2005 ; Rock et al., 2005; Srivastava and Maki, 1991 ). Ces molécules sont, soit exprimées de façon constitutive et libérées par les cellules nécrotiques ou soit induites lors d un stress cellulaire en réponse à l infection par exemple. Plusieurs études ont montré que ces signaux pouvaient induire l activation et la maturation des cellules dendritiques (Biragyn et al., 2002 ; Gallucci et al., 1999; Zheng et al., 2001 ). L activation des cellules dendritiques par ces molécules semble en partie dépendante des récepteurs de l immunité innée comme les TLR (surtout les TLR2 et 4) et les NLR. Ainsi, Li et collaborateurs ont montré que l activation par des cellules nécrotiques engendrait une activation de NF-κB dépendante de TLR2 (Li et al., 2001). Il faut cependant porter attention aux travaux effectués par des protéines recombinantes in vitro car la contamination de ces protéines par du LPS par exemple, pourrait être la cause de l activation via le TLR4. La fixation de ces ligands entraîne une signalisation intracellulaire menant à la production de 26

28 cytokines, ainsi qu à l augmentation de l expression des molécules du CMH, et des molécules de co-stimulation. Cependant la reconnaissance des corps apoptotiques, contrairement aux cellules nécrotiques, s effectue entre autre par certains récepteurs comme le récepteur de la phosphatidylserine (Fadok et al., 2000) et les récepteurs éboueurs (Harshyne et al., 2003) et n induit pas d inflammation mais plutôt un état de tolérance (Gallucci et al., 1999 ; Peng et al., 2007; Sauter et al., 2000 ). Activation par des cytokines inflammatoires. Lors d une infection, les pathogènes activent les cellules dendritiques non seulement directement mais aussi indirectement par une grande quantité de facteurs tissulaires inflammatoires qui sont produits par les cellules en réponse à l invasion par les pathogènes. Par exemple, les polynucléaires neutrophiles et les macrophages sécrètent des cytokines proinflammatoires comme l IL-1 et le TNFα suite à la reconnaissance des pathogènes. La PGE2 (Prostaglandine E2) et les interférons peuvent être libérés par les cellules NK. Ces cytokines peuvent entraîner la maturation des cellules dendritiques humaines et murines (Jonuleit et al., 1997). D autre part, les interférons de type I, comme l interféron alpha (IFNα) produits suite à une infection virale par les pdc par exemple, peuvent également activer d autres DC (Siegal et al., 1999). Par ailleurs, des cellules NK activées peuvent aussi induire la maturation des mo-dc par un mécanisme nécessitant la production d IFNγ et un contact cellulaire (Gerosa et al., 2002). Maturation induite par l engagement de CD40 par le CD40L Des interactions cellule à cellule sont aussi capables d activer les DC. Par ailleurs, l engagement de CD40 par la molécule CD40L (CD154) exprimée notamment sur les lymphocytes activés, est important pour la pleine maturation des DC. La molécule CD40 est une glycoprotéine membranaire de la famille des récepteurs au TNF, exprimée sur les lymphocytes B, les macrophages, les cellules dendritiques, des cellules épithéliales, certains lymphocytes T activés et des précurseurs hématopoïétiques (Quezada et al., 2004). Son ligand, CD40L, est exprimé sur les lymphocytes T et les lymphocytes B activés ainsi que sur les plaquettes activées. Par ailleurs, durant la réponse inflammatoire, CD40L est également induit à la surface des cellules endothéliales, des cellules musculaires lisses et des macrophages (Quezada et al., 2004). L activation des DC par l engagment du CD40 entraînent la production de cytokines inflammatoires, l augmentation des molécules de CMH- II et l augmentation de la survie DC (van Kooten and Banchereau, 2000). D autre part, des 27

29 études ont montré que des anticorps agonistes de CD40 induisaient une autoimmunité systémique ou abolissait l état de tolérance et que cet effet était lié à l action sur les cellules dendritiques (Ichikawa et al., 2002 ; Roth et al., 2002 ; Sotomayor et al., 1999). Ces travaux indiquent de plus que l organisme peut passer relativement aisément de l état de tolérance à celui d immunité et que le statut des cellules dendritiques joue un rôle important dans le maintien de cet équilibre in vivo. 1c- Voies de signalisation activées durant la maturation de la cellule dendritique Transduction par les TLR L engagement des TLR entraîne une signalisation qui est contrôlée majoritairement par la molécule adaptatrice MyD88 («Myeloid Differentiation primary response protein 88») (figure 2) qui contient un domaine TIR et un domaine de mort DD («Death Domain») (Medzhitov et al., 1998). La signalisation induite dépend de deux voies : une voie dépendante de la molécule adaptatrice MyD88 et d une autre voie indépendante de MyD88 (Akira and Takeda, 2004). MyD88 est une des cinq molécules adaptatrices ayant une activité prépondérante dans la transduction de signaux induits par les TLR. MyD88 peut s associer à tous les TLR à l exception du TLR3 et est indispensable à la synthèse d IL-6 et d IL-12p40 (Kaisho and Akira, 2006). Elle possède un domaine TIR lui permettant d interagir avec le TLR et un domaine de mort menant au recrutement de kinases associées aux récepteurs de l IL-1 (IRAK). Ainsi le recrutement d IRAK-4 par MyD88 induit celui d IRAK-1 entraînant par la suite sa liaison avec la molécule TRAF-6 («TNFR-Associated Factor-6»). Le complexe TRAF-6/IRAK-1 se désengage ensuite de son récepteur pour interagir avec le complexe TAK1 («TGFβ-Associated Kinase-1»), TAB1 («TAK-1 Binding protein-1») et TAB2 situé au niveau de la membrane plasmique. IRAK-1 est ensuite dégradé puis le complexe restant subit une translocation dans le cytosol où il se lie avec des ligases ubiquitine : UBC13 («UBiquitin-Conjugating enzyme-13») et UEV1A («Ubiquitinconjugating Enzyme E2 Variant 1»). Ceci mène à l ubiquitylation de TRAF-6 induisant l activation de TAK1. Cette dernière conduit à l activation d IKK («Inhibitor of nuclear factor-kb-kinase2) qui va à son tour phosphoryler les IκBs. Cette phosphorylation mène à la dégradation d IκB et à la libération de NF-κB (Akira and Takeda, 2004). Cette voie de signalisation résulte aussi en l activation des MAPK dont p38mapk (Kaisho and Akira, 2006), JNK («c-jun N-terminal Kinase»), et ERK («Extracellular signal Related Kinase»). En effet, le complexe TAK-1/TAB1/TAB2 permet aussi de phosphoryler la MKK4/7 («Map 28

30 Kinase Kinase») qui va ensuite activer JNK. L activation de p38mapk est induite par la phosphorylation en amont de MKK3/6 par TRAF-6 (Akira and Takeda, 2004; Kaisho and Akira, 2006 ). Les TLR activent aussi la MAPKKK : Cot/Tpl2 entraînant ainsi l activation de MEK1/2 qui va à son tour phosphoryler ERK. Les TLR agissent enfin sur la voie PI-3K («Kinase PI3») par la formation d un complexe entre MyD88 et PI3K. Ce complexe va ensuite induire la phosphorylation de PIP2 (Phosphatidylinositol biphosphate) en PIP3 menant à l activation de PDK-1 puis à celle d Akt (Hazeki et al., 2007). L engagement des ligands de TLR3 et TLR4 induit le recrutement de molécules de transduction indépendantes de Myd88 mais nécessitant une autre molécule adaptatrice TRIF («TIR domain containing Adapter Protein inducing IFN»). TRIF induit l activation de TRAF-6 ou de RIP-1 entraînant l activation des IKK afin d activer NF-κB. Par ailleurs, TRIF induit la phosphorylation du facteur de transcription IRF3 («Interferon Regulatory Factor 3») nécessaire à la production d IFN-β (Interferon) (Jiang et al., 2004b). Transduction par le récepteur au TNF Les effets du TNFα («Tumor Necrosis Factor alpha») peuvent être régulés par deux récepteurs distincts exprimés à la surface TNF-R1 et TNF-R2 mais seul le TNF-R1 semble impliqué dans les changements fonctionnels et phénotypiques des cellules dendritiques (Sallusto et al., 1995) (figure 2). Le TNF-R1 est exprimé à la surface des cellules sous forme de trimère. La liaison du TNFα au TNF-R1 permet la fixation de la protéine TRADD («TNFR-Associated DD protein»), protéine cytoplasmique contenant une région DD. TRADD est à l origine de la transduction de signaux via le recrutement de deux autres protéines : RIP-1 («Receptor-Interacting Protein»), contenant une région DD et TRAF-2. Ensuite le complexe TRADD/TRAF-2/RIP-1 se désengage de son récepteur. RIP-1 recrute alors MEKK-3 («MAPK Kinase Kinase») et TAK-1 menant à la dégradation d IκB permettant ainsi la translocation nucléaire de NF-κB. Par ailleurs ce complexe active MEK-4 et MEK-6 participant de ce fait à l activation de p38mapk et de JNK (Bradley, 2008; Kyriakis, 1999 ). Le TNF-R1 active aussi d autres voies de signalisation dont Ras-Raf- MEK1-ERK et PI3K mais les mécanismes impliqués restent actuellement mal connus. La PI3K semble phosphoryler PIP2 en PIP3. Ce dernier active PDK-1, une enzyme induisant la phosphorylation d Akt, et PDK-2 qui va aussi aboutir à la phosphorylation d Akt en passant par l activation du complexe mtor («mammalian Target Of Rapamicin»). La voie ERK et PI3K sont préférentiellement engagées dans la survie et la prolifération cellulaire (Bradley, 2008). 29

31 Membrane plasmique TLR TNFR Endosome MyD88 TRIF TRADD NALP/NOD IRAK TRAF6 TRAF2 RIG-I Caspase 1 MAPK MEKK IL-1β, IL-18 ERK JNK p38 IκB NF-κB IκB NF-κB AP-1 NF-κB IRF NF-κB IRF3 Noyau Cytokines, molécules de costimulation et d adhésion IFN de type I IFN de type I Figure 2 : Différentes voies de signalisation impliquées dans la maturation des cellules dendritiques. Voies de signalisation induites par l interaction CD40/CD40L L engagement de CD40 par son ligand induit le regroupement de CD40 membranaire et le recrutement de protéines adaptatrices appelées TRAF («TNF Receptor Associated Factors»). La liaison de TRAF induit alors la formation d une cascade de signaux impliquant des kinases comme NIK («NF-κB Inducing Kinase»), RIP («Receptor Interacting Protein»), la famille des MAPK et d autres probablement (Quezada et al., 2004). Ces évènements conduisent à l activation de la voie NF-κB et des MAPK et à la production de cytokines inflammatoires, à l allongement de la survie des DC et à l allongement de la survie des complexes MHC peptides à la surface de la DC. Il semble cependant que l activation in vivo de CD40 à elle seule n est pas capable d activer la DC à produire de l IL-12 (Schulz et al., 2000). 30

32 La liaison des ligands de TLR, de TNF-R ou de CD40 induit la maturation des cellules dendritiques par l activation de nombreuses voies de signalisation et plus particulièrement par celle de NF-κB ou des MAPK. Voie NF-kappa B De nombreux stimuli sont capables d induire l activation de la voie NF-κB dans les cellules dendritiques tels que les ligands de TLR (Takeda et al., 2003), les ligands des récepteurs NOD (Inohara et al., 2003), les cytokines dont IL-1 (Vakkila et al., 2008) ou le TNFα (Bradley, 2008) ou encore des molécules de co-stimulation CD40L (Kawai and Akira, 2007; Vakkila et al., 2008 ). Cette activation mène à l expression de nombreux gènes impliqués dans la maturation de la cellule dendritique en induisant l expression des molécules de co-stimulation et les molécules du CMH (Ardeshna et al., 2000; Rescigno et al., 1998 ; Yoshimura et al., 2001 ), la sécrétion de cytokines dont l IL-12 et le TNFα (Jayakumar et al., 2008; Vakkila et al., 2008 ; Yoshimura et al., 2001 ). Voie des MAPKs Les MAPK définissent une famille de protéines impliquée dans la transduction de signaux conduisant à la prolifération, à la différenciation, ou encore à l apoptose de nombreuses cellules. Chez les mammifères, la voie des MAPK joue aussi un rôle important dans la réponse immune en intervenant aussi bien dans l initiation de la réponse immune innée, dans l activation de la réponse immune adaptative, que dans la mort cellulaire lorsque la réponse immune est terminée (Dong et al., 2002). Cette famille de protéines peut être divisée en 3 groupes : ERK, JNK, p38mapk. Ces protéines sont toutes phosphorylées suite à une cascade de phosphorylation d autres protéines kinases situées en amont dont les MAPKKK (ou MEKK) puis les MAPKK (ou MEK). Les MAPK vont alors, à leur tour, phosphoryler différents substrats en aval tels que des protéines kinases, des facteurs de transcription ou des phospholipases. JNK et p38mapk sont fortement activés par l inflammation et les signaux dangers alors qu ERK est principalement activé par des facteurs de croissance (Dong et al., 2002 ; Nakahara et al., 2004). La voie p38mapk joue un rôle crucial lors de la maturation des cellules dendritiques par le LPS ou par le TNFα. Son activation participe à l expression à la surface du CMH de classe II, des molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86) et de maturation : CD83 (Arrighi et al., 2001). Par ailleurs elle est aussi impliquée dans la sécrétion de cytokines inflammatoires telles que l IL-12p40, l IL-12p70 et le TNFα (Agrawal et al., 2003; Arrighi et 31

33 al., 2001 ). Enfin elle contribue à la forte capacité allostimulatrice des cellules dendritiques matures ainsi qu à la perte de l endocytose. (Arrighi et al., 2001 ; Nakahara et al., 2006; Nakahara et al., 2004). Contrairement à la voie p38mapk, la voie ERK semble bloquer certaines fonctions des cellules dendritiques matures (Agrawal et al., 2003 ; Dillon et al., 2004 ; Nakahara et al., 2006). Quelques données ont été obtenues sur la participation de la voie JNK dans la maturation des cellules dendritiques mais son implication n est pas clairement définie (Boisleve et al., 2005). 1d- Modifications d expression des molécules de surface et de la synthèse de cytokines et de chimiokines induites par la maturation Modifications d expression des molécules de surface Nous avons vu que la maturation des cellules dendritiques peut être induite par des agents pathogènes (via les PRR), des cytokines inflammatoires, des agents endogènes (DAMP) ou par l interaction avec des molécules membranaires exprimées par d autres cellules de l organisme. Ces voies d activation entraînent non seulement la synthèse de nouvelles cytokines mais aussi une augmentation d expression de molécules de co-stimulation et d autres molécules de surface comme le CD83 qui vont ensemble participer à l activation du système immunitaire. Les études des modifications du phénotype de surface induites durant le processus de maturation ont beaucoup été réalisées in vitro. La maturation phénotypique des cellules dendritiques s évalue le plus souvent par l analyse de l expression de marqueurs de surface par cytométrie en flux en présence de divers PAMP ou de cytokines ou d activateur de CD40. La maturation des DC s accompagne d une perte de l expression des récepteurs Fc responsables de l endocytose contrôlée par récepteur (Banchereau et al., 2000; Banchereau and Steinman, 1998) et d une augmentation ou apparition de l expression des molécules de co-stimulation lui permettant d interagir efficacement avec les lymphocytes T comme les membres de la famille B7 (CD80, CD86) et les membres de la famille du TNF (CD40, 4-1BBL, OX40L, CD70) (Banchereau and Steinman, 1998) ainsi que des molécules d adhérence comme CD54 (ICAM-1) et CD58 (LFA-1). L augmentation d expression des molécules de CMH de classe II à la surface est aussi généralement observée chez l homme et la souris (Banchereau et al., 2000). En fait, la situation concernant ces molécules est plus complexe qu une simple augmentation du niveau 32

34 d expression. En effet, les molécules du CMH de classe II, ont une demi-vie courte et sont rapidement internalisées dans les cellules dendritiques immatures, après maturation on observe une stabilisation de l expression en surface permettant ainsi une interaction stable avec un lymphocyte effecteur (Banchereau et al., 2000). De plus, une modification du compartiment lysosomal est observée, qui se traduit par une diminution de l expression de CD68 et par une augmentation de l expression de CD208 DC-LAMP (Banchereau et al., 2000 ; de Saint-Vis et al., 1998), une protéine lysosomale qui permet le chargement de l antigène. DC IMMATURE TLR Signal de danger: PAMP, DAMP, cytokines CMH-I DC MATURE Cytokines (ex: IL-12) Récepteur Fc NLR CCR5 CCR1 CMH-II Récepteur au mannose RLH TNF-R TLR DC-SIGN MATURATION CD83 CD40 CCR7 CD80 CD86 Tissu: Capture de l antigène Ganglion: Activation des lymphocytes Figure 3 : Différentes modifications des cellules dendritiques suite à la maturation D autres molécules servant de marqueurs de maturation telle que la molécule CD83 (Zhou and Tedder, 1996) ont été montrées comme étant absentes sur les DC immatures et leur expression apparaît après activation des cellules dendritiques. Récemment, l expression de la chaîne alpha du récepteur à l IL-2 (CD25) a été décrite comme marqueur de maturation des DC. Cette molécule est absente des DC immatures et son expression est induite par une activation in vitro par divers agents comme le LPS, le TNFα ou le CD40L (Mnasria et al., 2008 ; von Bergwelt-Baildon et al., 2006) (Naranjo-Gomez et al., 2007). La maturation modifie aussi l expression des récepteurs impliqués dans la migration comme les récepteurs de chimiokines (Banchereau et al., 2000). Les cellules dendritiques immatures expriment principalement des récepteurs de chimiokines inflammatoires tels que CCR1, CCR2, CCR5, et CXCR4. Elles vont ainsi être attirées par les chimiokines CCL3 (MIP-1b) et CCL5 (RANTES) produites par les macrophages des tissus lors d une 33

35 inflammation (Banchereau et al., 2000). Dans ce contexte inflammatoire, les cellules dendritiques vont capter les antigènes ce qui va induire leur maturation. Ceci se traduit par une diminution de l expression des récepteurs de chimiokines CCR1 et CCR5 notamment et par l expression de novo de CCR7 (Yanagihara et al., 1998). Ce récepteur va permettre la migration des cellules dendritiques vers les organes lymphoïdes secondaires via la lymphe en réponse aux chimiokines CCL19 et CCL21 (Lukacs-Kornek et al., 2008; Sozzani, 2005 ). Modifications de la synthèse de cytokines et chimiokines induite lors de la maturation La modification de la synthèse des cytokines est un autre aspect très important de la maturation des DC. En effet ces cytokines associées à l augmentation des molécules de co-stimulation, présentée ci-dessus, vont permettre l initiation et l orientation de l activation des lymphocytes T. Mentionnons une cytokine clé de la réponse immune l IL-12 synthétisée entre autre par les DC. L IL-12 est une cytokine hétérodimérique composée de deux sousunités p35 et p40 liées par un pont disulfure (Trinchieri and Scott, 1999). La production simultanée de ces sous-unités résulte en la sécrétion d un hétérodimère p70 actif. La sousunité p35 est exprimée de façon ubiquitaire et constitutive à faible niveau. En revanche, la production de p40 est fortement régulée et induite par les produits des bactéries gram positives et négatives, les parasites, les virus et les champignons dans les monocytes, neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques. Une synthèse importante d IL-12 va orienter la réponse immune vers Th1 (voir chapitre sur orientation de la réponse immune) La synthèse d IL-10 par les DC va aussi faire l objet d une régulation complexe lors des signaux de maturation. Certains TLR vont induire une synthèse plus forte que d autres (Reis e Sousa et al., 2001). Il faut aussi rappeler que certaines cellules dendritiques (DC plasmacytoïdes en particulier) vont produire une grande quantité d IFNα qui va jouer un rôle dans l immunité antivirale et dans l activation d autres cellules de l immunité innée (Ito et al., 2004). Les cellules dendritiques sont aussi une source importante de chimiokines. Ainsi les cellules dendritiques immatures sécrètent constitutivement CCL18 et CCL20 alors que les cellules dendritiques thymiques produisent préférentiellement CCL25, une chimiokine activant principalement les thymocytes et les macrophages. Suite au processus de maturation, les cellules dendritiques acquièrent la capacité à sécréter de nouvelles chimiokines comme CCL2, CXCL18, CXCL10 (Sozzani, 2005). 34

36 1e- Maturation des cellules dendritiques porcines La maturation des cellules dendritiques porcines est encore peu étudiée par rapport à celle des cellules dendritiques humaines ou murines. Cependant l activation des DC porcines par différentes molécules telles que des ligands de TLR comme le LPS (TLR4), le poly I: C (TLR 3), le LTA (TLR2) et l utilisation de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNFα ou l INFα a été caractérisée (Bautista et al., 2007 ; Guzylack-Piriou et al., 2006; Paillot et al., 2001 ; Raymond and Wilkie, 2005 ). D autre part, la réponse des cellules dendritiques aux virus a montré que les pdc porcines produisent de l interféron suite à l activation par des virus de façon similaire aux pdc humaines et murines (Guzylack-Piriou et al., 2004 ; Summerfield et al., 2003). L évaluation de l état de maturation des cellules dendritiques porcines s est orientée principalement vers l étude de l augmentation d expression des molécules CD80/86 et CMH-II, de leur capacité d endocytose et de leur aptitude à stimuler des lymphocytes. Pour l instant, aucun marqueur n a été décrit comme totalement absent des DC immatures et dont l expression serait induite par une activation comme par exemple le CD83 chez l homme (Summerfield and McCullough, 2008). 2- Rôle des cellules dendritiques dans l activation des cellules de l immunité innée et adaptative Les cellules dendritiques ont un rôle dans l activation de cellules de l immunité adaptative dont l interaction la plus étudiée est l activation des lymphocytes T. Cependant, les DC jouent également un rôle dans l activation des lymphocytes B. De plus, les DC peuvent également interagir avec les cellules de l immunité innée. Après avoir brièvement décrit le rôle des DC dans l activation des cellules de l immunité innée en prenant comme exemple les cellules NK et décrit le rôle des DC dans l activation des lymphocytes B, l activation des cellules T sera vue en détail car il s agit de l interaction principalement étudiée dans ce travail de thèse. 2a- Activation des cellules NK Les cellules tueuses naturelles ou «Natural Killer» (NK) sont des cellules de l immunité innée qui jouent un rôle important dans la défense de l hôte, tant contre les cellules tumorales que contre les cellules infectées par certains virus ou bactéries. Ces cellules reconnaissent leur cible via des récepteurs qui sont activateurs ou inhibiteurs selon les signaux 35

37 transmis. Les cellules NK lorsqu elles sont activées sécrètent une grande quantité d IFNγ et agissent par leur activité cytotoxique (Colucci et al., 2003). Les DC, lors d infection, peuvent activer les cellules NK de manière accessoire par la synthèse de diverses cytokines dont l IL-12 qui augmente la production d IFNγ (Fernandez et al., 1999 ; Gerosa et al., 2002 Ferlazzo, 2002 #716) favorisant également la réponse Th1. L induction de l activité cytotoxique par les DC nécessiterait un contact physique entre la DC et la cellule NK (Fernandez et al., 1999 ; Gerosa et al., 2002). L interaction entre les DC et les cellules NK est bidirectionnel car les cellules NK par leur production d IFNγ induisent également la maturation des DC (Gerosa et al., 2002). 2b- Activation des lymphocytes B L activation des lymphocytes B est induite par la reconnaissance de l antigène par leur récepteur spécifique le BCR («B cell receptor»), qui induit d une part la capture de l antigène et son apprêtement pour une présentation aux lymphocytes T, et d autre part une cascade de signalisation aboutissant à leur prolifération et leur différenciation en plasmocytes (Lanzavecchia, 1985). Les DC peuvent présenter les antigènes directement aux lymphocytes B (Bergtold et al., 2005 ; Wykes et al., 1998) et ainsi permettre l initiation de la réponse humorale. De plus, les DC produisent des cytokines importantes pour la prolifération des lymphocytes B, leur différenciation ainsi que pour la commutation de classe des immunoglobulines dont BAFF («B-cell Activating Factor») et APRIL («A Proliferation Inducing Ligand») (MacLennan and Vinuesa, 2002). Chez le porc, il a également été montré dans un modèle d infection virale l importance de la synthèse de BAFF dans l activation des lymphocytes B mémoires (Bergamin et al., 2007). 2c- Processus de présentation antigénique aux lymphocytes T Capture de l antigène La capture des antigènes est un évènement clé dans l induction d une réponse immune effectrice. Les cellules dendritiques immatures possèdent une importante capacité de capture des antigènes par différents mécanismes : la macropinocytose, la phagocytose et l endocytose (Banchereau and Steinman, 1998). La macropinocytose est un processus endocytaire dépendant de l actine se produisant par des invaginations de la membrane pour former des vésicules qui captent de façon non sélective des solutés et des antigènes présents dans la phase fluide (Sallusto et al., 1995 ; Watts, 1997). La phagocytose consiste en l ingestion de 36

38 particules, de micro-organismes ou de cellules mortes par internalisation, habituellement grâce à un récepteur membranaire spécifique de la famille des récepteurs Fc (FcγRI ou CD64, FcγRII ou CD32, FcRIII-CD16) et les récepteurs du complément par un processus dépendant de l actine. Les antigènes solubles peuvent être capturés et internalisés par une grande variété de récepteurs spécifiques exprimés à la surface des DC. Les antigènes se lient aux récepteurs et sont internalisés par des vésicules recouvertes de clathrine de façon ATP dépendante. Contrairement à la phagocytose, le mécanisme d endocytose ne nécessite pas de filaments d actine mais dépend des protéines Ras (Barbieri et al., 1998). Les récepteurs permettant aux cellules dendritiques de capturer les antigènes par endocytose sont les récepteurs Fc, les lectines de type C comme DEC-205 (CD205), le récepteur au Mannose (CD206) ou DC- SIGN (CD209) ainsi que les récepteurs «éboueurs» ou «Scavenger» (Banchereau and Steinman, 1998). Apprêtement et présentation des antigènes Pour induire une réponse immune efficace il faut que les cellules dendritiques présentent les antigènes qu elles ont capturés aux lymphocytes effecteurs CD4 + ou CD8 +. Après leur capture, les antigènes subissent un processus intracellulaire d apprêtement par une cascade d évènement. L apprêtement de l antigène consiste en sa dégradation en peptides et au processus qui conduit à leur présentation à la surface de la cellule par les molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH) de classe I ou de classe II aux cellules T adéquates. Le CMH (Complexe Majeur d Histocompatibilité) représente le système de reconnaissance du Soi. Chez l homme, on parle de système HLA pour «Human Leucocyte Antigen» et SLA pour «Swine Leukocyte Antigene» chez le porc. Le polymorphisme des gènes de ce système est tel que les molécules du CMH sont spécifiques d un individu : étant donné le nombre d allèles et de configurations possibles des gènes codant pour ces molécules, seuls les jumeaux homozygotes possèdent les mêmes molécules du CMH. L activation des lymphocytes T résulte de la reconnaissance par le TCR du complexe CMH/peptide présenté par les cellules dendritiques. Les principales molécules de ce complexe sont les molécules de classe I et de classe II qui interagissent avec les molécules CD4 et CD8 respectivement à la surface des lymphocytes. L expression ubiquitaire des molécules de CMH de classe I permet que quelque soit le type cellulaire ou l organe, les complexes «CMH-peptides» soient présentés au lymphocyte CD8 +. Les molécules de classe I présentent des peptides dérivés, par protéolyse, de protéines endogènes synthétisées par la cellule présentatrice. Il s agit d éléments 37

39 intracellulaires tels que des virus, des bactéries intracellulaires ou des éléments issus de la transformation cellulaire. Les molécules de CMH-I sont composées d une chaîne lourde glycosylée associée de manière non covalente à la β2-microglobuline. La chaîne lourde comprend 3 domaines extracellulaires appelés α1, α2, α3, un segment transmembranaire et une queue cytoplasmique. La cavité formée par les domaines α1 et α2 de la chaîne lourde constitue le site d insertion du peptide antigénique. Dans cette zone se situent les résidus polymorphes qui vont interagir avec les peptides de molécules antigéniques du soi ou du non soi. Le domaine α3 contient un site qui interagit avec la molécule CD8 exprimée par les lymphocytes T. Les produits des gènes du CMH-II sont des hétérodimères glycoprotéiques comprenant une chaîne lourde alpha et une chaîne légère beta. Chaque chaîne est composée de deux domaines nommés α1, α2, et β1, β2. Le sillon créé entre les chaînes α1 et β1 constitue le site de fixation du peptide. Le domaine β2 contient un site de liaison à la molécule CD4 exprimé à la surface des lymphocytes T auxiliaires. Le sillon peptidique des molécules du CMH-II est plus large que celui du CMH-I, permettant ainsi la fixation de peptides plus longs entre 13 et 24 acides aminés. Les chaînes α et β du CMH-II sont associées dans le réticulum endoplasmique et stabilisées par un polypeptide appelé chaîne invariante Ii. Des complexes nonamériques comprenant 3 chaînes Ii, 3 chaînes α et β migrent à travers le golgi et sont dirigés vers un compartiment endosomique ou lysosomial acide appelé MIIC. Au cours du trajet, le site de fixation peptidique des dimères de CMH-II est constamment occupé par un fragment de la chaîne Ii, la séquence CLIP («Class II associated Invariant Peptide»), qui sera ensuite remplacé par les peptides destinés à la présentation. Présentation des antigènes intracellulaires par le CMH de classe I La production de peptides endogènes destinés au CMH de classe I utilise le système de dégradation protéique de la voie ubiquitine et protéasome. Le protéasome génère des peptides de 3 à 22 résidus d acides aminés. Sous l effet de l interféron γ, le protéasome constitutif se transforme en immunoprotéasome: les 3 sous-unités catalytiques sont remplacées par LMP2 («Low Molecular mass Polypeptide»)(β1i) et LMP7 (β5i) codées par le CMH et par MECL1 (β2i). Il en résulte une production peptidique plus abondante et plus rapide. La translocation des peptides du cytoplasme vers le réticulum endoplasmique est prise en charge par le transporteur TAP («Transporter Associated with Antigen Processing»). Ce dernier est composé de deux sous-unités, également codées par le CMH, et appartient à la grande famille 38

40 des protéines ABC qui utilisent l énergie fournie par l hydrolyse de l ATP pour transporter les peptides entre 7 et 20 résidus aminoacyles.la formation d un complexe entre un peptide et une molécule CMH-I implique l action de quatre protéines chaperonnes différentes, dont trois appartiennent au système de contrôle de qualité du RE, qui empêche les protéines dont la conformation n est pas adéquate de sortir de ce compartiment. Du fait de leur faible stabilité en l absence de peptide fixé, les molécules CMH-I restent en permanence associées à ces protéines, jusqu à ce qu elles acquièrent un peptide de haute affinité. Les chaînes lourdes nouvellement synthétisées sont d abord associées à la calnexine qui aide au repliement correct de glycoprotéines. L association des chaînes lourdes avec la β2-microglobuline est accompagnée par le remplacement de la calnexine par une deuxième lectine, la calréticuline, ainsi que par l entrée en jeu de l ERp57, une oxydoréductase catalysant probablement la formation des ponts disulfures au sein des chaînes lourdes. Les complexes ainsi formés se lient enfin directement aux pompes TAP, par l intermédiaire d une protéine chaperonne spécialisée, la tapasine, constituant ainsi les «complexes de chargement» des molécules CMH-I. Arrivant dans le RE, les peptides sont pris en charge par des molécules de classe I organisées en un grand complexe tétramérique. Les molécules de classe I, l assemblage terminé, sont transférées à la surface de la cellule pour une présentation aux cellules T CD8 + (Cresswell et al., 1994 ; Hart, 1997). Présentation des antigènes extracellulaires par le CMH de classe II Les antigènes exogènes sont internalisés par endocytose ou après fixation à un récepteur de surface par les cellules présentatrices d antigène, et placés dans un compartiment intracellulaire, le phagosome. Ce phagosome subit une série de modifications et fusionne avec un lysosome pour former le phagolysosome dans lequel le contenu peut interagir avec les molécules du CMH de classe II. Dans ce compartiment acide, la chaîne invariante Ii est dégradée et CLIP («CLass II Invariant chain Peptide») est libéré avec l aide de la molécule HLA-DM. L association du complexe CLIP-CMH à la molécule HLA-DM permet la fixation des peptides présents dans le compartiment et la libération de la molécule CLIP. Le CMH de classe II présentant l antigène est alors transporté jusqu à la membrane plasmique où il sera reconnu par les lymphocytes T CD4 + (Cresswell, 1994 ; Cresswell, 1996 ; Thery and Amigorena, 2001). Présentation antigénique croisée Des modifications intracellulaires importantes dans les cellules non immunes, qui peuvent être induites par des évènements comme une infection virale ou une transformation maligne, doivent être reportées au système immunitaire pour assurer l induction de la réponse 39

41 T CD8 +. Les cellules dendritiques peuvent de façon efficace capturer et dégrader les cellules non immunes infectées ou des fragments de cellules et ensuite délivrer les fragments peptidiques à la voie d apprêtement de la classe I pour une présentation aux cellules T CD8 +. Ceci entraîne leur activaction et l acquisition de leur fonction cytotoxique contre les cellules malignes ou infectées (Albert et al., 1998). Cette propriété est atypique car comme nous l avons vu précédemment la plupart des cellules présentent les peptides dérivés de protéines endogènes par des molécules de CMH de classe I. Ce procédé de présentation de peptides exogènes par les molécules de classe I connu comme la «cross-présentation» ou présentation croisée, a été décrit initialement par Bevan en 1976 (Bevan, 1976). Complexe majeur d histocompatibilité porcin : SLA Chez le porc, les molécules du complexe majeur d histocompatibilité sont nommées SLA pour «Swine Leukocyte Antigene». Le locus classe I traditionnel est désigné par SLA- A, B, C et code une glycoprotéine qui s associe de façon non covalente à la β2- microglobuline. Le locus de la classe II code pour une variété de gènes de classe II pour lesquels seulement SLA-DR et SLA-DQ semblent exprimés au niveau protéique (Lunney et al., 2009). Ces gènes codent pour une chaîne α associée à une chaîne β. Les cellules présentatrices d antigènes porcines comme les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques expriment les molécules de classe II (DR et DQ) (Chamorro et al., 2000 ; Summerfield et al., 2003). De façon inattendue, plusieurs lymphocytes T circulants expriment les antigènes de classe II, préférentiellement les CD8 + (Gerner et al., 2008; Saalmuller and Maurer, 1994 ; Saalmuller et al., 1991 ). 3- Différentes sous-populations de cellules dendritiques: origine et différenciation 3a- Différentes sous-populations On distingue habituellement deux grandes familles de cellules dendritiques : les DC conventionnelles (cdc) et les précurseurs immédiats des DC appelés «pré-dc». Les cdc sont des cellules qui au repos à l état stable dans les tissus ont déjà les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles de DC. Les pré-dc ont besoin de signaux complémentaires (par exemple infectieux ou inflammatoires) pour acquérir les caractéristiques de DC. Dans ce 40

42 dernier groupe on trouve notamment les DC plasmacytoïdes, les pré-dc spléniques et enfin les monocytes. Cellules dendritiques conventionnelles Parmi les cellules dendritiques conventionnelles 2 grands catégories sont distinguées : les DC des tissus périphériques (DC migratoires) et les DC résidentes des OLS (non migratoires). Notons que la peau a des caractéristiques particulières concernant la distribution des DC résidentes. En effet, 2 grands types de DC cohabitent : les cellules de Langerhans de l épiderme et les DC interstitielles dermiques. DC des tissus périphériques (DC migratoires) Ce sont des DC qui lors de la maturation acquièrent une capacité migratoire. Elles capturent les informations antigéniques dans les tissus périphériques puis migrent vers les ganglions permettant de délivrer l information nécessaire à l activation des lymphocytes. On distingue des sous-groupes au sein de cette famille en fonction du lieu d origine de ces cellules. Nous allons détailler les mieux caractérisées. Cellules de Langerhans Les cellules de Langerhans sont situées dans l épiderme, les muqueuses et l épithélium pulmonaire où elles forment un réseau dense grâce à leurs longs prolongements cytoplasmiques (Rossi and Young, 2005). Elles expriment des molécules qui leur sont spécifiques : la Langerine, une lectine de type C qui jouerait un rôle dans la présentation des antigènes glycopeptidiques (Mizumoto and Takashima, 2004) et la E-cadherine, une molécule d adhésion permettant leur rétention dans l épiderme (Tang et al., 1993). Les cellules de Langerhans sont les seules cellules dendritiques possédant des structures cytoplasmiques appelées granules de Birbeck. Il s agit d endosomes lamellaires organisés en strates ayant la forme de raquette de tennis et qui participeraient au processus de chargement de l antigène (Mizumoto and Takashima, 2004). Les cellules de Langerhans expriment également d autres molécules caractéristiques de cellules dendritiques comme le CD1a qui leur permettrait de présenter les antigènes lipidiques (Hunger et al., 2004; Mizumoto and Takashima, 2004 ). Bien que particulières, les cellules de Langerhans, comme les autres cellules dendritiques, après capture d un antigène, migrent vers les organes lymphoïdes secondaires tout en effectuant leur maturation afin de présenter les antigènes aux lymphocytes T (Hemmi et al., 2001). 41

43 Les cellules dendritiques dermiques et interstitielles Les cellules dendritiques dermiques et interstitielles complètent la fonction «sentinelle» exercée par les cellules de Langerhans au niveau de l épiderme. Elles ne possèdent pas de granules de Birbeck et n expriment pas la Langerine. On distingue les cellules dendritiques dermiques des autres cellules interstitielles par leur expression du facteur de coagulation XIIIa (Hart, 1997). Des cellules dendritiques interstitielles ont été isosées dans les plaques de Peyer de l intestin et des poumons, le cœur (associées à de petits capillaires), le foie et les reins (Hart and McKenzie, 1988 ; Prickett et al., 1988). Les cellules dendritiques associées aux muqueuses Elles résident dans les plaques de Peyer, dans les muqueuses du tractus respiratoires et de l intestin, la cavité orale, l appareil uro-génital et dans le mucus de membrane (Hart, 1997; Iwasaki, 2007 ; Johansson and Kelsall, 2005 ). Ces cellules participent principalement au maintien de la tolérance orale mais aussi à la lutte contre les pathogènes (Iwasaki, 2007 ; Johansson and Kelsall, 2005). Ces cellules jouent un rôle important dans la réponse immune et forment un réseau complexe et encore mal caractérisé chez l homme. Plusieurs sous-populations de cellules dendritiques situées dans les muqueuses ont été identifiées chez la souris. Elles sont beaucoup moins bien caractérisées chez l homme du fait de leur faible accessibilité. Néanmoins, quelques études ont mis en évidence la présence de cellules présentatrices d antigène exprimant le CMH II et présentant une morphologie similaire à celle des cellules dendritiques dans l intestin au niveau des plaques de Peyer et de la lamina propria (Iwasaki, 2007 ; Johansson and Kelsall, 2005). Les cellules dendritiques résidentes des organes lymphoïdes Les cellules dendritiques résidentes des organes lymphoïdes secondaires Ces cellules ne migrent pas via la lymphe. Elles exercent leur fonction dans un organe lymphoïde secondaire où elles capturent et présentent les antigènes du Soi et du non-soi en fonction des signaux locaux. En cas de stimulation par un PRR (en cas d infection par exemple) ces cellules stimulent la prolifération des cellules T spécifiques des antigènes présentés localement, alors qu à l état de repos ces DC présentent essentiellement les antigènes du Soi et participent ainsi à la tolérance. Ces DC résidentes ont plutôt un phénotype immature (faible expression des molécules CMH de classe II et des molécules de costimulation comme CD80/86) ce qui les distingue des DC migratoires des ganglions lymphatiques (McIlroy et al., 2001; Wilson et al., 2003 ). Les cdc des ganglions peuvent être 42

44 à leur tour divisées en sous familles. Par exemple chez la souris on peut distinguer au sein des ganglions les cdc exprimant un fort niveau de CD8α de celles dépourvues de ce marqueur (Shortman and Liu, 2002). Ces populations ont des productions distinctes de cytokines et une aptitude pour la présentation antigénique différente (Shortman and Liu, 2002). Cellules dendritiques thymiques Les cellules dendritiques thymiques sont divisées en deux sous-groupes : les conventionnelles et les plasmacytoïdes. Les cellules dendritiques thymiques conventionnelles sont CMH-II +, CD11c +, CD4 + et sont retrouvées dans la médulla ainsi qu au niveau de la jonction cortico-médullaire (Wu and Shortman, 2005). Ces cellules semblent participer à la sélection négative en éliminant les lymphocytes T auto-réactifs par présentation des antigènes du Soi (Sprent and Webb, 1995). Les cellules dendritiques thymiques plasmacytoïdes sont CMH-II low, CD45RA +, CD11c - et CD Elles sont présentes dans la médulla et dans la jonction cortico-médullaire mais aussi dans le cortex contrairement aux cellules thymiques conventionnelles (Sprent and Webb, 1995 ; Wu and Shortman, 2005). Leur rôle n est actuellement pas clairement défini. Précurseurs immédiats de cellules dendritiques : pré-dc Ce sont des cellules que l on trouve dans un organisme à l état de repos en équilibre (c est à dire en dehors d un contexte infectieux ou inflammatoire). Cette famille est constituée de précurseurs immédiats de DC hétérogènes qui vont acquérir, après une stimulation spécifique, des caractéristiques de DC (inflammatoires et plasmacytoïdes). L acquisition de ces caractéristiques ne nécessite aucune division cellulaire. Les pré-dc «inflammatoires» Les DC dites «inflammatoires» sont recrutées à partir de précurseurs sanguins vers les tissus inflammés. Elles constituent un autre type de DC dont une partie au moins, dérive de monocytes in vivo (Shortman and Naik, 2007). Elles ont été clairement isolées des autres DC grâce à des études murines récentes in vivo. On ne les trouve pas dans les organismes au repos en équilibre (non inflammatoire et en l absence d infection). Leur rôle in vivo été longtemps controversé mais des travaux récents ont montré la contribution de ces DC dans la réponse immune devient très importante lors du processus inflammatoire ou infectieux (Ginhoux et al., 2006 ; Leon et al., 2007; Randolph et al., 1999 ). Par exemple, l infection par leishmania major chez l homme et la souris induit l accumulation de DC dérivées de monocytes recrutés au niveau de la peau (Leon et al., 2007). Si les DC dérivées de monocytes 43

45 constituent une partie des DC migratoires conventionnelles, leur accumulation lors de cette infection de la peau pourrait être considérée comme le résultat d une augmentation de leur recrutement. D un autre coté, une infection par Listeria monocytogenes ou bien une inflammation systémique induit l accumulation de DC dérivées de monocytes dans la rate, un organe dépourvu de DC migratoire à l état stable (Naik et al., 2006 ; Serbina et al., 2003). Dans cette situation, les monocytes semblent représenter une source de sous-population de DC «d urgence» qui émerge seulement au site d inflammation. Bien évidemment ces deux possibilités ne sont pas mutuellement exclusives et des populations distinctes de monocytes pourraient être des précurseurs de DC migratoires à l état stable et une source de nouvelle DC dans les tissus inflammés (Shortman and Naik, 2007 ; Tacke and Randolph, 2006). Les messages importants à retenir à partir de ces études sont que les DC dérivées de monocytes ne représentent que l'une des différentes sous-populations de DC qui constituent le réseau de DC in vivo, et que les conclusions des études fonctionnelles basées sur ce type de DC pourrait ne pas être applicable à d autres DC. Dans ce travail, nous avons choisi d utiliser les DC dérivées de monocytes porcins car elles correspondent probablement à une partie des cellules présentatrices d antigènes impliquées dans le phénomène de rejet aïgu de greffe. Cellules dendritiques plasmacytoïdes (pdc) Les cellules dendritiques plasmacytoïdes ont été découvertes en 1958 par Lennert et Remmele, dans les zones T des ganglions lymphatiques (Lennert and Remmele, 1958). Elles ont initialement été considérées comme des cellules plasmatiques puis plus tard comme des cellules T plasmacytoïdes. Leur nom a été associé à leur morphologie proche de celle des plasmocytes ; cependant ces cellules n expriment pas de marqueurs spécifiques des lymphocytes B ni des plasmocytes. Elles sont identifiées comme non T, non B, non NK, non monocyte, exprimant des récepteurs FcRγ de faible affinité et des molécules CMH de classe II (Trinchieri et al., 1978). Contrairement aux cellules dendritiques conventionnelles, elles n expriment pas CD11c mais sont CD123 high. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes humaines sont également caractérisées par le phénotype suivant : CD4 +, ILT3 +, BDCA-2 +, HLA-DR ++ (Colonna et al., 2004 ; Rossi and Young, 2005) (figure 4). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les cellules les plus productrices d IFNα de l organisme, ce qui leur confère un rôle majeur dans la réponse anti-virale. Elles reconnaissent les ADN et ARN viraux grâce aux TLR7 et 9. Elles pourraient également intervenir dans les réponses anti-tumorales (McKenna et al., 2005). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont capables 44

46 d orienter la réponse immunitaire vers Th1 ou Th2 (Ito et al., 2004) ; certaines études montrent qu elles peuvent également induire de la tolérance in vivo (Ito et al., 2007). Marqueurs Pré-DC (monocyte) Pré-DC (plasmacytoïde) PRR Fonction Figure 4 : Précurseurs des cellules dendritiques humaines. (Adapté de Shortman, et al, Nat. rev. Immunol., 2002) 3b- Sous-populations de cellules dendritiques porcines La plupart des différentes DC décrites ci-dessus ont également été identifiées chez le porc mais sont peu caractérisées. Une population de cellules SWC3 + CD4 - CD14 - avec les caractéristiques de DC (forte expression de CD80/86 et de CMH-II, forte stimulatrice de lymphocytes T) a été isolées à partir du sang de porc (Summerfield et al., 2003). A l opposé, une population cellulaire exprimant la molécule CD4 dans le sang périphérique porcin a été décrites comme étant des DC plasmacytoides pour sa forte production d IFNα (Summerfield et al., 2003). Des cellules ayant des caractéristiques de cellules dendritiques ont été isolées à partir de différents tissus lymphoïdes comme la rate et les ganglions lymphatiques (Jamin et al., 2006) ainsi que dans des tissus non lymphoïdes comme la peau (Bautista et al., 2002) et les muqueuses (Bimczok et al., 2005). De plus, les cellules de langerhans viennent d être isolées et caractérisées à partir de peau de porc (Nfon et al., 2008). Les monocytes, les DC dérivées de monocytes ainsi que les DC plasmacytoïdes porcines sont les plus étudiées et caractérisées pour leur implication dans la réponse anti-virales notamment (Chamorro et al., 2004 ; Guzylack-Piriou et al., 2004 ; Summerfield and McCullough, 2008). 45

47 3c- Ontogénie et différenciation des cellules dendritiques Si différentes sous-populations de DC ont été caractérisées, leur différenciation ainsi que leurs précurseurs ne sont pas clairement définis. Les raisons sont multiples : le milieu dans lequel va se différencier la DC jouant un rôle capital, les modèles in vitro sur lesquels reposent une bonne partie des connaissances sur la différenciation des DC humaines ne permettent pas de récapituler exactement l environnement réel in vivo. Par ailleurs des données obtenues sur des modèles in vivo murins ne garantissent pas que leur transposition à l homme soit correcte. De plus, les expériences in vivo de transferts cellulaires de précurseurs se font souvent après irradiation ce qui peut modifier considérablement la différenciation des cellules notamment vers des DC inflammatoires. Les études sur la différenciation des cellules B, NK, T, des monocytes, avait conduit à une vision du processus de différenciation hématopoïétique comme strictement ordonné et assez tôt irréversible. Les études de la différenciation des DC ont conduit à élaborer de nouveaux modèles de différenciation plus graduelle fonctionnant par étapes successives où l irréversibilité du processus n est atteinte que très tard au cours de la différenciation. Il est maintenant établi que les cellules dendritiques sont toutes des leucocytes issues de la moelle osseuse, à l exception toutefois des cellules dendritiques folliculaires qui ont une origine stromale (Rossi and Young, 2005). Le concept initial de différenciation faisait état d une origine surtout myéloïde. Ce modèle était fondé sur la génération de cellules dendritiques in vitro à partir de monocytes et de cellules souches CD34 + (Caux et al., 1996a ; Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Toutefois des études effectuées chez la souris ont montré que les cellules dendritiques pouvaient se différencier à partir de cellules exprimant des marqueurs lymphoïdes (Wu et al., 1998; Wu et al., 1996 ). Un modèle de développement avec deux voies de différenciation indépendantes des cellules dendritiques a alors été proposé. Cette classification soutenait que la voie myéloïde générait la majorité des DC CD11c + regroupant la plupart des sous-types dont les cellules de Langerhans, ou des cellules dendritiques interstitielles plus proches des monocytes/macrophages qui sont trouvées dans tous les autres tissus (Caux et al., 1996a). Au contraire, selon cette classification, la voie lymphoïde générait principalement les DC plasmacytoïdes CD11c - qui sécrètent une grande quantité d interféron de type I après une infection virale (Cella et al., 1999; Siegal et al., 1999 ). En fait, il est apparu que les voies de différenciation des cellules dendritiques étaient plus complexes et interconnectées. Ainsi des études plus récentes montrent que des cellules 46

48 dendritiques myéloïdes et plasmacytoïdes peuvent être obtenues indifféremment à partir de précurseurs de type myéloïdes et lymphoïdes exprimant le Flt3 («FMS-like tyrosine kinase- 3») (D'Amico and Wu, 2003; Karsunky et al., 2003 ). De plus, il semble que des cellules dendritiques plasmacytoïdes pourraient se différencier elles mêmes en cellules dendritiques myéloïdes suite à une infection virale (Zuniga et al., 2004). Ceci rend le schéma de différenciation encore plus complexe. Ces observations ont conduit au concept de plasticité fonctionnelle des précurseurs avec une rétention prolongée du potentiel myéloïde. Ce modèle suggère que toutes les DC peuvent se différencier à divers stades, les sous-populations de DC étant générées par l influence de l environnement local sur les précurseurs relativement plastiques (Shortman and Naik, 2007). Cette plasticité des précurseurs permettrait la présence de cellules dendritiques dans l organisme dans toutes les situations. 4- Modèles de différenciation de cellules dendritiques in vitro Les cellules dendritiques sont présentes en faible proportion dans l organisme : elles représentent environ 1 à 2% des leucocytes. Il est donc difficile de les isoler en quantité suffisante pour pouvoir les étudier. Des méthodes de différenciation de cellules dendritiques in vitro ont été développées : soit à partir de cellules souches CD34 + issues de la moelle osseuse ou de sang de cordon ombilical soit à partir de monocytes du sang périphérique. A partir de cellules souches CD34 + Les cellules souches CD34 + peuvent être isolées de la moelle osseuse ou de sang de cordon ombilical du nouveau-né pour obtenir des cellules dendritiques in vitro. La culture de ces cellules avec du GM-CSF («Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor») et du TNFα entraîne leur différenciation en deux sous-populations de cellules dendritiques (Caux et al., 1996a). La première population ressemble aux cellules de Langerhans : elles expriment CD1a, E-Cadhérine, et contiennent des granules de Birbeck. Cette voie est dépendante de la présence de TGFβ («Transforming Growth Factor β») confirmant les données sur les souris déficientes en TGFβ qui ne possèdent pas de cellules de Langerhans (Borkowski et al., 1996). La seconde population ressemblant aux cellules dendritiques interstitielles ou dermiques (Caux et al., 1996a ; Shortman and Liu, 2002). Les cellules de Langerhans peuvent également être obtenues à partir de cellules CD34 + traitées avec de l IL-3 et du TNF-α (Caux et al., 1996b). 47

49 Les cellules souches CD34 + sont capables de se différencier en cellules dendritiques interstielles CD11c + /CD1a - /CD1c -, en présence de Flt3L, d IL-6, d IL-3 et de SCF (facteur de croissance de cellules souches, «stem cell factor») (Fadilah et al., 2007). L utilisation d IL-4, de Flt3L, de GM-CSF et de SCF favorise aussi l émergence de cellules dendritiques interstitielles (Ward et al., 2006). A partir de monocytes Les monocytes sont les précurseurs les plus fréquemment utilisés pour obtenir des cellules dendritiques in vitro. Lorsqu ils sont cultivés pendant plusieurs jours en présence de GM-CSF et d IL-4, ils se différencient en cellules dendritiques myéloïdes immatures (Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Notons que l IL-4 peut être remplacée par l IL-13 (Alters et al., 1999). L addition de TGF-β lors de la différenciation de monocytes cultivées avec du GM- CSF et de l IL-4 induit des cellules ressemblant aux cellules de Langerhans (Geissmann et al., 1998). La culture de monocytes en présence de GM-CSF, d IL-4 et d IFNβ ou de GM-CSF, de TNFα et de flt3 ou de GM-CSF, d IL-3 et de flt3 favorise l émergence de cellules dendritiques plasmacytoïdes (Brawand et al., 2002; Gilliet et al., 2002 ; Huang et al., 2001 ). Différenciation de cellules dendritiques porcines in vitro De façon similaire aux autres espèces, les cellules dendritiques de porc peuvent être générées in vitro à partir de monocytes (Carrasco et al., 2001 ; Paillot et al., 2001) ainsi que de précurseurs hématopoïétiques. Les monocytes sont différenciées en DC en présence principalement de GM-CSF et d IL-4 bien que d autres cytokines comme l IFNα aient été utilisées lors de l étape de différenciation (Balmelli et al., 2005). Les cellules dentritiques issues de monocytes porcins (GM-CSF+IL-4) expriment à l état immature SWC3 (marqueur de la lignée monocytaire), le CD1, le CD11b/c, le CMH-I et II et le CD14 (Carrasco et al., 2001 ; Foss et al., 2003; Paillot et al., 2001 ). Cependant, pour le moment aucun marqueur de surface ne permet de distinguer les DC des autres cellules de la lignée comme les macrophages et les monocytes. L ajout de TGFβ à l IL-4 et au GM-CSF permet la génération de cellules avec des caractéristiques de cellules de langerhans (Paillot et al., 2001). Des DC porcines peuvent également être différenciées à partir de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse par la culture en présence de GM-CSF et du TNFα (Summerfield and McCullough, 1997) 48

50 III- Les lymphocytes T Les lymphocytes proviennent également de précurseurs de la moelle osseuse qui migrent vers le thymus pour effectuer leur differenciation. La maturation du lymphocyte T dans le thymus entraîne son développement et l expression à la surface de la membrane d une molécule de liaison à l antigène spécifique, appelé récepteur des cellules T (TCR «T-Cell Receptor»). Cette molécule est un hétérodimère composé d une chaîne α et β ou bien γ et δ. Les cellules T αβ sont normalement prédominantes mais la proportion exacte entre les cellules exprimant un TCR αβ et γδ diffère entre les espèces. Cette distinction d expression de chaîne du TCR entraîne une première classification des lymphocytes T. Les lymphocytes sont aussi classifiés en fonction de l expression des molécules telles que CD4 et CD8. 1- Les différentes sous-populations de lymphocytes T Chez l homme, dans la circulation sanguine, les lymphocytes possédant un TCR αβ se distinguent en deux sous-populations principales, les lymphocytes T CD4 + et les lymphocytes T CD8 +. Il existe en très faible proportion une sous population double-négative CD4 - CD8 -. Les lymphocytes T CD4 + reconnaissant les molécules du CMH de classe II sont des cellules dites auxiliaires ou Th (T «helper») permettant le développement de la réponse immunitaire à la fois cytotoxique T et humorale B et modulent aussi l activité des phagocytes par leur production de cytokines. La deuxième sous-population, les lymphocytes T CD8 +, sont des cellules qui possèdent essentiellement une activité cytotoxique. Les lymphocytes porcins possèdent également un TCR formé d hétérodimère soit αβ ou γδ. La proportion de cellules γδ chez le porc est plus importante que chez l homme (Charerntantanakul and Roth, 2006 ; Gerner et al., 2008). Les lymphocytes T porcins αβ peuvent être séparés en 4 sous-populations selon leur expression des molécules CD4 et CD8 : CD4 + CD8 -, CD4 + CD8 +, CD4 - CD8 - et CD4 - CD8 +. L existence de la population de cellules double-positives CD4 + CD8 + dans le sang périphérique est une particularité du système immunitaire porcin. Cette sous populations semble contenir surtout des lymphocytes T mémoires car suite à un tri cellulaire elles sont les seules pouvant proliférer en réponse secondaire d une stimulation virale (Summerfield et al., 1996 ; Zuckermann and Husmann, 1996). Cette hypothèse est également soutenue par le fait que les porcelets nouveaux-nés ont 49

51 une faible proportion de ces cellules qui augmentent avec l âge dans la circulation sanguine (Pescovitz et al., 1994 ; Yang and Parkhouse, 1996 ; Zuckermann, 1999). La notion actuelle est que la population CD4 + CD8 + double-positive contient les cellules mémoires et les cellules activées. Pour ce qui est des cellules simple positives pour le marqueur CD8, la population de cellules CD8α high semble correspondre aux lymphocytes CD8 cytotoxiques et peuvent être identifié par un anticorps anti-cd8β (Piriou-Guzylack and Salmon, 2008; Zuckermann et al., 1998 ). Une des particularités des cellules porcines par rapport aux lymphocytes T humains, est l expression des molécules de CMH de classe II au repos sur un pourcentage significatif de cellules (Gerner, dev, compl immu, 2008 voir pour une ref plus vieille). Lors de l activation des lymphocytes T, l expression de CD25, de CD8α (et non CD8β) ainsi que le CMH-II augmente (Saalmuller et al., 2002). Cependant, la fonctionnalité de l expression de la molécule de CMH de classe II à la surface des lymphocytes T n est pas définie. Une seconde particularité du porc par rapport à l homme est que la fraction de lymphocytes CD8 + porcins prédomine en nombre sur les lymphocytes CD4 + (Charerntantanakul and Roth, 2006; Gerner et al., 2008 ). 2- L activation du lymphocyte T Le processus d activation des cellules T a lieu en général dans le ganglion lymphatique le plus proche du foyer infectieux. La première rencontre des cellules T avec les CPA est une liaison non spécifique assurée par des molécules d adhérence. Cette interaction transitoire permet à la cellule T d entrer en contact avec un grand nombre de combinaisons CMH/peptides différentes sur diverses CPA. En l absence d interaction spécifique, la cellule T et l CPA se dissocient rapidement. Cependant lorsque l interaction est spécifique, une réponse immune est déclenchée par l intégration de 3 signaux d activation lymphocytaire. L élément clé de l initiation de l activation lymphocytaire est le signal 1 qui est délivré par l engagement du TCR par un complexe CMH-peptide approprié. Le signal 2 est une costimulation à partir de la cellule présentatrice d antigène souvent mesurée par une expansion clonale, la différenciation en cellules effectrices et à long terme, une augmentation en fréquence des précurseurs (mémoires). Le signal 3 est récent dans la terminologie et réfère au signal délivré par la CPA à la cellule T qui détermine sa différenciation en cellules effectrices. (Ex : IL-12 dans les Th1). Le signal 3 est caractérisé par la libération de cytokines (par le lymphocyte) comme l IL-2. Celle-ci au contact de son récepteur, active les lymphocytes T et entraîne leur prolifération. 50

52 Le signal 1, s il est seul activé, aboutit à l apoptose ou mort cellulaire programmée des lymphocytes T, mécanisme susceptible d induire l anergie. Par contre, le signal 1 en présence du signal 2 entraîne l activation de 3 voies : la voie des canaux calciques (voie Ca ++ calcineurine), la voie des protéines kinases (MAPK) et la voie du facteur nucléaire NF-κB résultant en la transcription des gènes codant pour des cytokines et à la production de cellesci. Ces cytokines libérées rejoignent leurs récepteurs pour promouvoir le signal 3 qui est nécessaire à la prolifération lymphocytaire. 2a- Récepteur des cellules T TCR La reconnaissance d un antigène spécifique par le lymphocyte T est assurée par le récepteur des cellules T ou TCR (T-Cell Receptor) qui est un hétérodimère formé par l association de deux chaînes transmembranaires polypeptidiques α et β ou γ et δ. Ces glycoprotéines de type I appartiennent à la superfamille des immunoglobulines. Chaque chaîne est composée d un domaine extracellulaire amino-terminal contenant une région variable (V), une région constante (C) ainsi qu une région charnière. De proximal en distal font suite, un domaine transmembranaire hydrophobe composé de 5 à 12 acides aminés (favorisant la stabilité du complexe TCR/CD3) ainsi que d un court domaine cytoplasmique. L association des deux chaînes α et β se fait par l intermédiaire d un pont di-sulfure (Meuer et al., 1984). L ensemble des régions variables (Vα et Vβ) ainsi réunies forme le site de reconnaissance à l antigène. Chaque région variable possède trois régions hypervariables appelées CDR («Complementary Determining Region») (Chothia et al., 1988) par homologie aux CDR identifiés sur les régions variables des immunoglobulines. Les régions CDR1 et CDR2 permettent la liaison aux molécules de CMH, le CDR3 se liant préférentiellement au peptide antigénique (Jorgensen et al., 1992 ; Sant'Angelo et al., 1996). Les chaînes αβ sont polymorphes, elles constituent les unités de reconnaissance d un antigène, elles sont associées à un complexe polypeptidique non polymorphique, le complexe CD3 (fait d assemblage de chaînes γ, ε, δ, et ζ) qui permet la transduction du signal. A l exception du domaine CD3ζ, toutes les sous-unités CD3 possèdent une portion transmembranaire qui va permettre l association avec le TCR et surtout favoriser la stabilité du complexe CD3/TCR (Koning et al., 1990 ; Manolios et al., 1991). En réponse à l engagement du TCR par le complexe CMH/peptide, les portions cytoplasmiques des molécules CD3 permettent l initiation de la signalisation grâce à leurs motifs ITAM («Immunoreceptor tyrosines-based activation motifs»). 51

53 La diversité du répertoire TCR exprimé sur les lymphocytes T est considérable par association des séquences VDJ (en effet il y a de très nombreuses séquences V, D et J et les associations sont aléatoires ce qui permet d obtenir une grande possibilité de combinaisons différentes). Les associations des chaînes α et β se font aussi de manière aléatoire ce qui fait que le potentiel de reconnaissance est de l ordre de spécificités différentes. Cependant la diversité existante en périphérie est très inférieure. Le complexe TCR/CD3 est également associé, pour la majorité des lymphocytes αβ, à des molécules invariantes CD4 ou CD8 qui interagissent avec les molécules CMH de classe II ou de classe I respectivement, et participent à la transduction du signal activateur par CD3. PHA Anti-CD3 PMA Anti-CD28 Ionomycine Figure 5 : Voies de signalisation impliquées dans l activation du lymphocyte T 52

54 Le signal 1 d'engagement du récepteur T permet l'activation et l'association, par l'intermédiaire de protéines adaptatrices, de tyrosine-kinases intracellulaires telles que p59 fyn et p56 lck et la phosphorylation de ZAP 70 («Zeta chain Associated Protein Kinase») via les domaines ITAM («Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) (figure 5). La conséquence en est, par l'intermédiaire d'une phopholipase Cγ 1 (PLCγ1), une hydrolyse des phospho-inositides membranaires (PIP-2) et la libération d'inositol triphosphate (IP3) et de diacylglycerol (DAG). La fixation d'ip3 sur son récepteur permet de réguler le taux de calcium intracellulaire et d'activer des enzymes dépendants du calcium, comme la calcineurine. La calcineurine activée permet la déphosphorylation d'un facteur de transcription : le NF-AT («Nuclear Factor of Activated T cells»). Le NF-AT déphosphorylé peut, en association avec la calcineurine, migrer du cytoplasme vers le noyau pour se fixer sur des séquences régulatrices de gènes et induire la synthèse de cytokines comme l'il-2.par ailleurs le DAG formé lors de l'activation du récepteur T active une protéine kinase C (PKC) qui dissocie le complexe cytoplasmique formé de NF-κB et de son inhibiteur IκB en phosphorylant et dégradant IκB. NF-κB peut alors migrer dans le noyau pour se fixer sur les séquences activant les promoteurs de gènes. 2b- Les molécules de co-stimulation dans l activation T Les cellules T reçoivent des signaux d activation ou de survie à chaque stade de la réponse, incluant le stade naïf, effecteur et mémoire. Le signal 2, de co-stimulation, est induit au niveau de la synapse immunologique, par la liaison de molécules complémentaires, dites de co-stimulation regroupées en deux grandes familles : la famille des molécules B7 et la famille du TNF/TNF récepteur. Les molécules d adhérence importantes dans l initiation et le maintien de l interaction entre les DC et les lymphocytes T semblent pouvoir également induire un signal lors de l activation lymphocytaire. Les molécules d adhérence les mieux caractérisées sont d une part l interaction LFA-1(«Lymphocyte Function associated Antigen- 1») /ICAM-1 («Intercellular Adhasion Molecule») et d autre part l interaction CD2/LFA-2. La molécule LFA-1 (CD11a/CD18) appartient à la famille des intégrines dans laquelle la sous-unité β2 (CD18) est associée à différentes sous-unités α (CD11a, b, c, d) (Springer, 1990). LFA-1 est exprimé par les cellules T et peut se lier à ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) et ICAM-3 (CD50) présent sur les CPA. La molécule CD58 (LFA-3) est connue pour être le ligand principal de CD2 (Selvaraj et al., 1987). La molécule CD2 appartient à la superfamille des Ig et est exprimée sur les lymphocytes T (Bierer et al., 1988). 53

55 Cellules dendritiques Lymphocytes T ICOSL PD-L1 PD-L2 CD80 CD86 CD80 CD86 ICOS PD-1 CTLA-4 CD28 Famille CD28 CD40 CD40L 4-1BBL OX40L CD70 4-1BB OX40 CD27 Famille des récepteurs du TNF (TNFR) Figure 6 : Molécules de co-stimulations de la famille B7-CD28 et TNF-TNFR Co-stimulation de la famille B7-CD28 La famille des molécules B7 contient plusieurs membres (figure 6). L interaction la mieux caractérisée et l une des plus importantes pour l activation T est celle de CD28 exprimés à la surface des lymphocytes au repos qui est engagé par les ligands B7.1 (CD80) et B7.2 (CD86). Les molécules B7.1 et B7.2 sont des hétérodimères de la superfamille des immunoglobulines qui sont retrouvés principalement à la surface des cellules présentatrices d antigènes. Ces ligands sont exprimés différemment selon l état d activation de la cellule dendritique. En effet, une cellule dendritique immature exprime le B7.2 dont l expression est rapidement augmentée avec la maturation de ces cellules, alors que l expression de B7.1 est inductible et plus tardive (McAdam et al., 1998). 54

56 L'activation du CD28 permet une association des domaines cytoplasmiques SH2 dont les résidus tyrosines sont phosphorylés. L'activation d'une phospho-inositol-3 kinase (PI3K) génère des signaux qui agissent en synergie avec l'activation de p21 ras pour augmenter l'activité des jun kinases (JNK) et d'autres MAP kinases, telles que ERK1 et ERK2 par l'intermédiaire d'une cascade de kinases. Les kinases ERK et JNK régulent l'expression nucléaire de, respectivement, c fos et c jun qui sont les composants du facteur de transcription AP-1 et qui activent les facteurs NF-AT («Nuclear Factor of Activated T-cells») et OCT-1. L'action coordonnée du signal 1 d'activation du récepteur T et du signal 2 de co-stimulation permet la synthèse de protéines d'activation lymphocytaire, comme l'il-2 et la chaîne α du récepteur de l'interleukine 2 (CD25). D'autres cytokines sont induites par l'action répétée de ces 2 signaux (ex : IFN). Un autre récepteur des molécules B7 a été identifié il s agit de la molécule CTLA-4 («Cytotoxique T-lymphocyte Antigen-4»). Ce récepteur, contrairement à son homologue le CD28, n est pas exprimé de façon constitutive mais son expression est plutôt induite par l activation. Ce qui est contrastant entre ces deux molécules, CD28 et CTLA-4, bien qu elles aient les mêmes ligands, est qu elles ont une action opposée sur la réponse immune. En effet, le CD28 délivre un signal important pour l activation et la survie des lymphocytes T alors que CTLA-4 induit plutôt un signal inhibiteur et serait impliqué dans l induction de la tolérance. De plus, l affinité de CTLA-4 pour ses ligands est dix à vingt fois supérieure que celle de la molécule CD28 (Greenwald et al., 2005). Les effets de cette molécule seront décrits ultérieurement pour son implication dans la physiologie des lymphocytes T régulateurs. ICOS («Inducible T-cell Costimultor») est un autre membre de la famille du CD28. Contrairement à celui-ci, il n est pas exprimé de façon constitutive sur les lymphocytes T mais est rapidement induit après engagement du TCR (Coyle et al., 2000; Yoshinaga et al., 1999 ). Le ligand d ICOS, ICOSL (B7.H) est exprimé sur les cellules B, les macrophages, les cellules dendritiques et les tissus non lymphoïdes (Greenwald, ann rev imm, 2005). Comme le CD28, ICOS augmente l activation et la production de cytokines par les cellules T mais pas la production d IL-2 (Riley et al., 2002). Par contre, cette voie ne permet pas d induire la survie des cellules T, les lymphocytes co-stimulés par l intermédiaire d ICOS sont incapables de s expandre à long terme et meurent par apoptose en quelques jours (Riley et al., 2001). Cependant ICOS permet d augmenter les fonctions effectrices des cellules T. Cette voie permettrait d activer rapidement les réponses effectrices mémoires sans induire une expansion clonale (Riley and June, 2005). 55

57 Une autre interaction de cette famille est celle des ligands PDL-1 («Programmed Death 1 ligand») et PDL-2 à leur récepteur PD-1. PDL-1 et PDL-2 peuvent être exprimés par les DC alors que PD-1 est exprimé par les lymphocytes B et T activés (Ishida et al., 1992). PD1 est avant tout décrite comme une molécule inhibitrice, comme le montre le phénotype des souris PD1-/- qui développent une auto-immunité (Freeman et al., 2000 ; Latchman et al., 2001). D autre part, le blocage de PDL1 accélère le rejet de greffe augmente l activation des cellules T et leur prolifération. PD1 diminue la synthèse de l IL-2, provoque un arrêt du cycle en phase G0/G1 et inhibe la prolifération (Latchman et al., 2001). Mais plusieurs travaux ont montré que dans certains cas PDL-1 et PDL-2 pourraient délivrer des signaux de costimulation positifs aux cellules T (Nguyen et al., 2002; Tseng et al., 2001 ). Une possible explication pour ces résultats apparemment contradictoires pourrait être l existence d un autre récepteur capable de se lier à PDL-1 et/ou PDL-2 et qui lui aurait une activité stimulatrice (Riley and June, 2005). D autres molécules de cette famille ont été récemment décrites ; B7H3, B7H4 et BTLA («B and T Lymphocyte Attenuator») mais leur implication dans l activation des cellules T par les cellules dendritiques est peu caractérisée (Greenwald et al., 2005). Co-stimulation de la famille TNF/TNFR L interaction des molécules de la famille du TNF/TNFR peut avoir différents effets sur la réponse T (figure 6). Ces molécules peuvent influencer l inflammation et l immunité innée, l organisation du tissu lymphoïde ou l activation des cellules présentatrices d antigènes, ou encore fournir directement un signal aux cellules T (Watts, 2005). Une des interactions importante de cette famille est celle entre le CD40 exprimé sur de nombreuses CPA tels que les lymphocytes B, les monocytes, les DC et les cellules endothéliales de façon constitutive (Quezada et al., 2004) et son ligand le CD40L exprimé sur les lymphocytes T activés. Ces molécules interagissent sous forme de trimère. Le CD40 joue un rôle majeur dans l activation / maturation de la DC, et augmente l activation des lymphocytes T (par une boucle de rétro-contrôle positive) en rendant les CPA meilleures stimulatrices par l induction de l augmentation : des molécules de co-stimulations B7.1, B7.2, OX40 et de la synthèse d IL-12 (Quezada et al., 2004). La superfamille du TNF-TNFR, contient également les voies de signalisation positives pour les lymphocytes T OX40(CD134)-OX40L, 4-1BB(CD137)-4-1BBL, CD27-CD70 et GITR/GITRL («Glucocorticoïd Induced Tumor Necrosis factor Receptor»). OX40 est induit par l'activation des lymphocytes T (Durkop et al., 1995) et son ligand OX40L est exprimé sur 56

58 les CPA activées (Ohshima et al., 1997). Il a été démontré une induction d OX40L, après engagement de CD40, au niveau de la membrane des cellules dendritiques immatures. L engagement d OX40 permet une expansion clonale T avec une augmentation des fonctions effectrices des cellules mémoires surtout au niveau des sites inflammatoires. Le système interviendrait donc aussi bien au niveau de la réponse primaire que de la réponse secondaire (Gramaglia et al., 2000 ; Murata et al., 2000). 4-1BB est exprimé sur les cellules T activées et les cellules NK (Pollok et al., 1993). Il se lie à 4-1BBL, qui est exprimé sur les CPA (DeBenedette et al., 1997). L interaction de GITR et GITR-L sera décrite dans le paragraphe sur les lymphocytes T régulateurs dans le chapitre sur la tolérance. Le système complexe des voies de co-stimulation positives et négatives possède un certain niveau de redondance. Toutefois, chaque voie est dédiée à une fonction spécifique. Certaines interactions sont impliquées dans la signalisation de cellules T naïves, tandis que d'autres sont plus impliqués dans la signalisation des cellules T mémoires, comme indiqué cidessus. Le signal désigné comme le signal 3 consiste en l action de différentes cytokines dans l activation des lymphocytes T. En effet, l IL-2 par exemple est une cytokine importante pour l activation et la prolifération des lymphocytes T. Sur les cellules T au repos, l IL-2R est exprimé sous sa forme de faible affinité comportant deux chaînes polypeptidiques, une chaîne β (CD122) et une chaîne γ (CD132) commune à plusieurs récepteurs de cytokines servant à la transmission du signal. Lors de l activation lymphocytaire, l expression de la chaîne α (CD25) est induite formant le récepteur de haute affinité avec les chaînes β et γ et favorisant l interaction avec l IL-2. De même, la signalisation induite par la fixation des cytokines polarisantes, telles que l IL-4 et l IFNγ, à leurs récepteurs est importante pour l activation complète et dans la différenciation en sous population effectrice ou régulatrice. Ce phénomène de différenciation et de polarisation de la réponse immune T sera traité dans le prochain paragraphe. 2c- Synapse immunologique Après la migration des DC présentant le peptide antigénique via leur CMH dans les zones T des tissus lymphoïdes, la transmission d informations avec les lymphocytes T s effectue au sein d une zone d interaction stable nommée synapse immunologique. Un complexe supramoléculaire d activation SMAC («SupraMolecular Activation Cluster») se forme alors au niveau de radeaux lipidiques (micro-domaine lipidique riche en cholestérol et glycosphingolipides) formés dans la membrane plasmique favorisant l échange de signaux. Le 57

59 premier contact non spécifique entre un lymphocyte T et une CPA s effectue de par l intermédiaire des molécules d adhérences comme les interactions entre ICAM-1 et LFA-3 à la surface des CPA et leur ligands LFA-1 et CD2 respectivement (figure 7). Initialement, les molécules CMH et TCR sont plutôt externes et accompagnées de plusieurs protéines (CD43, CD45, ICAM-1). L engagment du TCR provoque de petits agrégats et une redistribution des protéines membranaires : TCR et CMH étant alors entourés d un anneau riche en intégrines et ICAM-1, CD43, CD45 se trouvant en périphérie (Johnson et al., 2000; Sperling et al., 1998 ). LFA-1 joue un rôle très important dans le rassemblement des TCR au SMAC ainsi que dans la réorganisation du cytosquelette lymphocytaire et l exclusion de la molécule CD45 de la synapse centrale (Graf et al., 2007). La synapse immunologique n est pas nécessaire à la transduction de signaux car la phosphorylation de lck et de ZAP70 précède la formation d une synapse mature mais la polymérisation de l actine dans le lymphocyte T (par activation de ZAP-70) est nécessaire pour former la synapse. CELLULE DENDRITIQUE + Membrane plasmique ICAM-1 LFA-3 (CD48) CD80 CD86 CMH-II CD40 ICAM-1 CD45 CD43 CD43 CD45 LFA-1 CD2 CD28 TCR CD40L LFA-1 LYMPHOCYTE T Signal 2 Signal 1 Membrane plasmique Figure 7 : Molécules impliquées dans la synapse immunologique entre la cellule dendritique et un lymphocyte T. 2d- Activation polyclonale des lymphocytes T Les cellules T peuvent également être activées par d autres molécules de façon polyclonale. Le traitement des cellules T au repos par le PMA («Phorbol Myristic Acetate»), qui est un ester de phorbol, et l ionophore calcique inomycine fait entrer ces dernières en cycle cellulaire, déclenche la sécrétion de cytokines telles que l IL-2, et peut provoquer la 58

60 mort cellulaire induite par activation (AICD «Activation Induced Cell Death») (Anel et al., 1994). Une autre alternative pour une activation T non spécifique est l utilisation de superantigène. En effet, ces superantigènes sont des molécules d origine principalement bactérienne qui activent un grand nombre de clones T dont les TCR possèdent les séquences Vβ permettant leur interaction avec un superantigène donné, indépendamment du complexe CMH-peptide. Ces molécules, dont les plus étudiées sont les entérotoxines de staphylocoques (Newman and Wilkinson, 1996), se lient à la chaîne β des molécules de CMH de classe II sur la face externe et s attachent à la région Vβ du TCR par un autre site, en dehors de la zone de contact peptide-cmh. La plupart des cellules T sont stimulées par la phytohémagglutinine (PHA), une lectine isolée des haricots rouges, ou la concanavaline-a extraite des graines de ricin. Ces molécules sont capables de se lier aux molécules de surface, y compris le complexe du TCR et CD2, déclenchant ainsi le regroupement de ces molécules comme celui mimant le contact antigénique (Chilson et al., 1984; Licastro et al., 1993 ). De tels mitogènes activent l ensemble des cellules T sans tenir compte de leur spécificité antigénique. D autre part, il est possible d activer des lymphocytes T avec des anticorps monoclonaux spécifique. En effet, l utilisation combinée d un anti-corps anti-cd3 et d un anticorps anti-cd28 (soit solubles ou fixé sur un support) mime les deux signaux d activation : TCR et co-stimulation (Landegren et al., 1984). 3- Orientation de la réponse immune Le système immunitaire est constamment sollicité par des pathogènes allant du virus au parasite multicellulaire et a mis en place un éventail de mécanismes de réponses immunes correspondant, contrôlé par différentes cellules effectrices. Pour éliminer l infection, le système immunitaire doit d abord reconnaître le type de pathogène impliqué et ensuite déclencher une réponse appropriée. Les lymphocytes T CD4 + jouent un rôle central dans la nature de la réponse immune qui sera mobilisée. Ceux-ci peuvent être différenciés en au moins 4 sous-types distincts, caractérisés chacun par un profil de sécrétion particulier responsable de leurs fonctions spécifiques (figure 8). Les deux types de cellules effectrices les plus anciennement décrits sont: Th1 et Th2. Plus récemment un troisième type de lymphocytes CD4 + effecteurs a été décrit et nommé Th17 à cause de sa forte production d IL-17. Enfin, le phénomène de cellules régulatrices a émergé avec la description des cellules T CD4 + régulatrices considéré comme une quatrième 59

61 voie de différenciation. Nous avons vu précédemment que ce sont les cellules dendritiques qui sont principalement à l origine de la présentation des antigènes aux lymphocytes jouant ainsi un rôle important tant dans l orientation de la réponse effectrice (avec les trois types cités), que dans l induction de cellules régulatrices. Pathogènes intracellulaires Autoimmunité IFNγ LTα Th1 T-bet STAT 4 Tolérance immune Homéostasie lymphocytaire Régulation de la réponse immune TGFβ IL-10 Treg Foxp3 TGFβ+IL-2 CD4 naïf IL-12 + IFNγ TGFβ + IL-6 (IL-23) Th17 RORγt Stat 3 Bactéries extra-cellulaires Champignon Autoimmunité IL-17A IL-21 IL-17F IL-22 IL-4 Parasites extra-cellulaires Allergie et asthme Th2 GATA-3 Stat 6 IL-4 IL-5 IL-13 Figure 8 : Différentes orientations de la réponse immune T CD4 + Nombreux sont les facteurs cellulaires et moléculaires qui interviennent dans le processus qui guide la différenciation d un lymphocyte auxiliaire précurseur vers une cellule Th1, Th2 ou Th17 pleinement différenciée. Parmi ceux-ci on distingue : la nature de l antigène et sa dose, le niveau d activation de la CPA, et surtout les cytokines qui se trouvent dans l environnement local. Suite à la reconnaissance de l antigène et la perception des signaux provenant des différents récepteurs membranaires (dont les récepteurs de cytokines), les lymphocytes subissent 4 stades différents de développement : l activation de gènes de cytokines particulières, l engagement vers une certaine sous population (Th1, Th2, Th17), la suppression des gènes des cytokines du type opposé et la stabilisation du phénotype. 60

62 3a- Orientation de la réponse Th1 Les cellules Th1 contrôlent la réponse immune contre les infections virales ou les pathogènes intracellulaires (Mosmann and Coffman, 1989 ; Paul and Seder, 1994), contre les micro-organismes qui se développent dans les macrophages et participent à l élimination des cellules cancéreuses. Ces cellules jouent un rôle central dans le rejet de greffe. De plus, le profil de cytokines Th1 est observé cliniquement dans certains cas d inflammation chronique et certaines maladies auto-immunes comme la maladie de Crohn (Strober et al., 1998). Les principales cytokines produites sont l IFNγ qui active les macrophages, augmente leur capacité de phagocytose et permet la destruction des micro-organismes mais aussi la lymphotoxine α (LTα) (aussi nommé TNFβ) identifiée comme marqueur de la progression de la maladie chez les patients atteints de scléroses en plaque (Selmaj et al., 1991). IL-12R IL-12 IFNγ IFNγ R STAT4 STAT1 T-bet IFNγ Figure 9 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th1 La différenciation Th1 est favorisée par la production d IL-12 par les cellules présentatrices d antigènes en réponse à divers stimuli (figure 9). La signalisation via l IL-12 s effectue par son récepteur composé de deux sous-unités l IL-12Rβ1 et l IL-12Rβ2 (Chua et al., 1994 ; Presky et al., 1996). La sous-unité β2 est la chaîne majeure de transduction du signal du récepteur et contient le résidu tyrosine intracellulaire qui lie le facteur de transcription STAT4 (Nishikomori et al., 2002 ; Presky et al., 1996). L IL-12 entraîne la production d IFNγ par différents types cellules comme des cellules NK, des macrophages et des cellules dendritiques. La fixation de l IFNγ sur son récepteur active STAT1 qui augmente 61

63 l expression du facteur de transcription T-bet, entraînant le remodelage de la chromatine du locus de l IFNγ et la transactivation du gène de l IFNγ (ref 152 Szabo, 2003). Ceci résulte en une augmentation locale d IFNγ et crée une boucle de contrôle positive orientant la différenciation Th1. T-bet induit également l expression de la chaîne IL-12Rβ2 (Afkarian et al., 2002; Mullen et al., 2001 ) permettant la signalisation via IL-12/STAT4 optimisant la production d IFNγ, renforçant ainsi l engagement Th1. A un stade plus tardif de la différenciation Th1, l expression de l IL-18R est aussi augmentée. Cette dernière nécessite la signalisation via IL-12/STAT4 et est encore plus fortement augmentée par l IFNγ. L IL-18 sert de co-facteur à l induction de la différenciation Th1. L IL-18 et l IL-12, utilisées ensemble, peuvent induire la production d IFNγ par les Th1 en absence de stimulation TCR (Stober et al., 2001). Cette production de cytokine indépendante de l antigène est probablement importante dans l amplification de la réponse Th1 par le recrutement de cellules Th1 pré-existantes (Yoshimoto et al., 1998). Un des rôles essentiels de l IFNγ produit par les cellules Th1 est d activer les macrophages, ce qui entraîne l augmentation de la phagocytose, de l expression des molécules du CMH-I et II et l induction la production d IL-12, des NO et superoxyde. Tous ces éléments sont importants pour l élimination des pathogènes intracellulaires (Boehm et al., 1997). Par ailleurs les lymphocytes Th1 favorisent la fonction effectrice cytotoxique des NK, des lymphocytes CD8 + et des macrophages et soutiennent également la production IgG2a et IgG1 chez l homme. Facteurs de transcription impliqués dans la réponse Th1 Un déterminant important du développement de la réponse des cellules CD4 + Th1 est l activation de STAT4 par l IL-12. Les souris déficientes en STAT4 ont un défaut de dévelopement Th1 (Kaplan et al., 1996b ; Thierfelder et al., 1996) et les souris déficientes en IL-12R ont un défaut de production d IFNγ induite par l IL-12 (Wu et al., 1997). De plus, la fixation de l IFNγ sur les cellules T naïves entraîne une activation du facteur de transcription STAT1 ce qui induit l expression de T-bet (Afkarian et al., 2002; Lighvani et al., 2001 ). T-bet (Szabo et al., 2000) aussi connu sous le nom de Tbx21 (Zhang and Yang, 2000) appartient à la famille des facteurs de transcription T-box. La production de T-bet initie le remodelage du locus du gène de l IFNγ, la production d IFNγ, l expression de la chaîne β2 du récepteur de l IL-12 ainsi que la stabilisation de sa propre expression via l activité autocrine de l IFNγ (Mullen et al., 2001). D autres facteurs de transcription ont été décrits comme intervenant potentiellement dans la réponse Th1 comme Hlx, qui est plus exprimé dans les cellules Th1 que Th2 et semble interagir avec T-bet pour une expression optimale d IFNγ 62

64 (Mullen et al., 2002). De même, l expression de Runx3, un autre facteur de transcription, est augmentée dans les conditions polarisantes pour Th1 (Djuretic et al., 2007). De plus, Runx3 interagit avec T-bet pour activer le gène codant pour l IFNγ et éteindre celui codant pour l IL-4. 3b- Orientation de la réponse Th2 Les cellules Th2 contrôlent les défenses de l hôte contre les parasites extracellulaires incluant les helminthes. Elles sont aussi impliquées dans l induction et la persistance de l asthme et d autres maladies allergiques. Les cytokines suivantes sont produites lors d une réponse Th2 : l IL-4, IL-5, IL-10, et l IL-13. L IL-4 semble être la cytokine de la boucle de rétro-contrôle positif de la différenciation Th2 (Le Gros et al., 1990 ; Swain et al., 1990) et est un médiateur majeur de la commutation de classe des IgE dans les cellules B (Kopf et al., 1993). Jagged IL-4 IL-4R Notch Notch ICD STAT6 GATA-3 IL-4 / IL-5 / IL-13 Figure 10 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th2 L interaction de l IL-4 avec son récepteur IL-4R (augmenté lors de la différenciation Th2) induit l activation de STAT6 dans les cellules T naïves, qui active à son tour l expression du facteur de transcription GATA-3 (Kaplan et al., 1996a) (Ouyang et al., 1998) (figure 10). L origine de l IL-4 n a pas clairement été établie sachant que les DC sont incapables de produire cette cytokine en quantité significative, elle pourrait provenir d autres cellules comme les cellules NK, les éosinophiles, les mastocytes ou les lymphocytes T CD4 + eux-mêmes (Solymar et al., 2002; Wang et al., 2006 ; Woerly et al., 1999 ). L activation du TCR et de STAT5 via l IL-2 peut induire une faible production d IL-4 (Yamane et al., 2005) 63

65 par les lymphocytes T CD4 +. Cette production endogène d IL-4 ne se produit que lorsque les cellules reçoivent un signal de faible amplitude. Le signal de polarisation vers Th2 par les cellules dendritiques n est pas clairement identifié mais les récepteurs Notch pourrait être impliqués (voir chapitre IV-1). Facteurs de transcription impliqués dans la différenciation Th2 L action de l IL-4 sur le développement de la réponse Th2 semble s opérer via l action de STAT6. Ceci a en autre été montré par le fait que des souris déficientes en STAT6 ont un défaut de développement de réponse Th2 (Kaplan et al., 1996a ; Shimoda et al., 1996 ; Takeda et al., 1996). L activation de STAT6 par l IL-4 induit l expression de GATA-3, autre facteur de transcription impliqué dans la réponse Th2 (Ouyang et al., 2000). In vitro, l activation de STAT6 est nécessaire et suffisante pour induire la forte expression de GATA-3 (Kurata et al., 1999). GATA-3 peut transactiver le promoteur du gène de l IL-5, de l IL-4 et de l IL-13 pour réguler positivement la synthèse de ces cytokines (Lee et al., 2000; Zhang et al., 1997 ; Zheng and Flavell, 1997 ). Un autre facteur de transcription identifié comme jouant un rôle dans la réponse Th2 est la protéine cmaf qui est aussi impliquée dans la régulation de la synthèse d IL-4 via l activation du promoteur du gène de l IL-4 (Ho et al., 1996). Les cellules Th2 favorisent la production d anticorps d isotype IgG1 et IgGE (Stevens et al., 1988) et participent à la stimulation des mastocytes et des éosinophiles (Kadowaki, 2007). 3c- Orientation de la réponse Th17 Initialement, l IL-17 a été associée aux maladies auto-immunes et à la défense de l hôte contre différents pathogènes. Cependant la régulation de la production d IL-17 n était pas clairement définie. En 2000, l IL-23 a été décrite comme étant l association de la sousunité p19 avec la sous-unité p40 (partagée aussi avec l IL-12) initiant ainsi l étude de la contribution de l IL-12 et de l IL-23 dans les maladies inflammatoires chroniques (Oppmann et al., 2000). Peu de temps après la découverte que les souris déficientes en p19 étaient résistantes à l encéphalite allergique expérimentale EAE (Cua et al., 2003), l IL-23 a été montrée comme pouvant induire la production d IL-17 par les cellules T activées et que les souris déficientes en p19 et résistantes à l EAE possédaient très peu de cellules capable de sécréter de l IL-17 (Aggarwal et al., 2003 ; Langrish et al., 2005). Ensuite deux groupes ont montré que des cellules T naïves peuvent être différenciées en cellules T productrices d IL-17 in vitro et in vivo indépendamment du développement Th1 et Th2 (Harrington et al., 2005 ; 64

66 Park et al., 2005). Les cellules Th17 sont alors proposées comme une sous-population distincte de cellules T helper. Bien que l IL-23 ait été montrée comme étant importante pour la prolifération des cellules Th17 et dans le développement des maladies auto-immunes controlées par l IL-17, cette cytokine ne semble pas nécessaire à la différenciation en cellules Th17, contrairement au TGFβ qui est critique pour cette différenciation (Bettelli et al., 2006 ; Veldhoen et al., 2006; Volpe et al., 2008 ; Yang et al., 2008a ) (figure 11). En effet, des souris déficientes en TGFβ1 sont dépourvues de cellules Th17 et la délétion spécifique du TGFβ1 dans les cellules T bloque la différenciation Th17 pendant l induction de l EAE et ces souris sont résistantes à l EAE (Li et al., 2007). En présence d IL-6, le TGFβ1 induit la différenciation Th17 ; la production d IL-21, l expression du récepteur à l IL-23 et celle de RORγt. L IL-21 peut remplacer l IL-6 dans l induction de RORγt et l expression d IL-17 (Korn et al., 2007 ; Nurieva et al., 2007 ; Zhou et al., 2007). Ainsi, l IL-21 pourrait servir de cytokine d amplification de la différenciation Th17. L IL-23 quant à elle ne permet pas d induire la différenciation Th17 à partir de lymphocytes T CD4 + naïfs mais joue un rôle important pour la survie et le maintient de la fonction des cellules Th17. Ainsi, la différenciation en cellules Th17 consiste en 3 stades ; un stade de différenciation basé sur le TGFβ et l IL-6, un stade d amplification médié par l IL-21 et une phase de stabilisation due à l IL-23. La différenciation en Th17 semble différente chez l homme et chez la souris. Chez la souris, plusieurs études ont confirmé que le TGFβ et l IL-6 sont les facteurs nécessaires et suffisants à la différenciation Th17 à partir de lymphocytes T CD4 + naïfs (Veldhoen et al., 2006). Chez l homme, le TGFβ semblait avoir un effet plutôt inhibiteur initialement mais des études récentes ont montré que le TGFβ était bien impliqué dans la différenciation des lymphocytes en Th17 et que l environnement et le contexte inflammatoire (IL-1β, IL-6, IL-23) dans lequel se trouvent les cellules jouent un rôle dans cette différenciation (Manel et al., 2008 ; Yang et al., 2008a). Les cellules Th17 sont impliquées entre autres dans l immunité contre les infections par des bactéries extra-cellulaires et certains champignons (Bettelli et al., 2008; Ouyang et al., 2008 ). Ces cellules jouent un rôle majeur dans les maladies inflammatoires telles que la sclérose en plaque et les colites inflammatoires, en répondant à l activation par l IL-23 (McGeachy and Cua, 2008). Ces cellules produisent la cytokine proinflammatoire IL-17 activant le recrutement des polynucléaires neutrophiles et l IL-22 agissant sur les cellules épithéliales (Bettelli et al., 2008). Les cellules produisant de l IL-17A produisent également de l IL-17F, de l IL-21, de l IL-22, de l IL-6 et du TNFα (Langrish et al., 2005 ; Weaver et al., 2007). La production d IL-17 n est pas restreinte aux cellules T 65

67 CD4 + car les CD8 +, les cellules NK invariantes, les γδ, les neutrophiles, monocytes et éosinophiles en produisent aussi (Dong, 2008). IL-6 IL-23 IL-6R IL-23R TGFβ STAT3 IL-21R IL-21 TGFβR RORγt IL-17, IL-21, IL-22 Figure 11 : Facteurs impliqués dans la différenciation Th17 Facteurs de transcription impliqués dans la différenciation des Th17. Le facteur de transcription RORγt est important pour la différenciation en cellules Th17 (Ivanov et al., 2006). La surexpression de RORγt induit la production d IL-17 alors que les cellules déficientes en RORγt produisent peu d IL-17. En effet, les souris déficientes en RORγt sont partiellement résistantes à l EAE. Un autre récepteur nucléaire relié, le RORα, est aussi augmenté dans les cellules Th17 (Sundrud and Rao, 2008; Yang et al., 2008b ). Bien que la délétion de RORα ait un effet minimal sur la production d IL-17, la déficience en RORγt et RORα abolit complètement la production d IL-17. STAT3, le transducteur de signal principal pour l IL-6, l IL-21 et l IL-23, est indispensable pour la production d IL-17 et la délétion en STAT3 résulte en la perte de cellules productrices d IL-17 (Harris et al., 2007; Mathur et al., 2007 ). STAT3 est aussi responsable de l induction de l IL-23R (Harris et al., 2007). «L interferon regulatory factor 4» (IRF4) a récemment été montré comme étant important pour la différenciation Th17 (Brustle et al., 2007 ; Huber et al., 2008). Les cellules T IRF4-/- échouent dans la production d IL-17. De ce fait, l EAE ne peut pas être induite chez des souris IRF4-/-. 66

68 3d- Lymphocytes T régulateurs Enfin, une autre orientation de différenciation des lymphocytes T CD4 + est la voie des lymphocytes T régulateurs. Vu l importance de ces cellules T dans la tolérance immunitaire notamment aux allogreffes, nous avons développé un chapitre dans lequel nous détaillons leurs caractéristiques (chapitre V-4) 3e- Interconnexion des différentes orientations et notion d équilibre La différenciation en l un des sous types de cellules Th implique des rétro-contrôles négatifs provenant des autres polarisations. La suppression mutuelle de l IFNγ et de l IL-4 a été à l origine des études sur la régulation croisée des différents Th (Mosmann and Coffman, 1989 ; Paul and Seder, 1994). L absence d IFNγ dans la culture de cellules Th2 semble jouer un rôle important dans l orientation Th2. Pendant le procédé de différenciation Th2, les cellules en développement perdent leur habilité à répondre à l IL-12 par la diminution d expression de la chaîne IL-12Rβ2 (Szabo et al., 1997). De la même façon, le TGFβ suppriment la différenciation Th1 et Th2 (Gorelik et al., 2000 ; Lin et al., 2005) et l IL-4 et l IFNγ inhibent la différenciation Th17 (Cua et al., 2003 ; Harrington et al., 2005; Park et al., 2005 ). L inhibition des autres types de Th par les cytokines peut partiellement être expliquée par l activation de facteurs de transcription comme GATA-3 et T-bet qui sont mutuellement antagonistes : lorsque les niveaux d IFNγ, d IL-12 et de T-bet sont élevés, la production de GATA-3 est inhibée et lorsque les niveaux d IL-4 et de GATA-3 augmentent T-bet est réprimé (Mullen et al., 2001 ; Ouyang et al., 1998). T-bet en se liant à GATA-3 inhibe sa fonction (Hwang et al., 2005) empêchant ainsi la différenciation Th2. La signalisation de l IL- 12 et GATA-3 est également opposée : la surexpression de GATA-3 dans des cellules Th1 entraîne la diminution de l expression de l IL-12Rβ2 et ainsi la diminution de la réponse Th1 (Ouyang et al., 1998). Le TGFβ semble inhiber la différenciation Th1 et Th2 en inhibant l expression de T-bet et GATA-3 respectivement par le TGFβ (Gorelik et al., 2002 ; Gorelik et al., 2000). De même, l'induction de foxp3 par le TGFβ chez la souris avec une stimulation dépendante du TCR est inhibée par les cytokines orientant vers les profils Th1 et Th2. C'est-àdire que l ajout d IL-4 et la surexpression de GATA-3 ou de T-bet inhibe l induction de foxp3 alors que l utilisation d un anticorps anti-il-4 augmente l induction de foxp3 (Wei et al., 2007). Ainsi, le contexte environnemental dans lequel se trouvent les cellules effectrices guide leur différenciation. Le succès d une réponse immune, adaptée aux pathogènes dépend de l équilibre entre les différentes sous-populations de cellules T. 67

69 IV- Vision intégrée de l organisation de la réponse immune adaptative : plasticité de la cellule dendritique, rôle de l environnement et trafic cellulaire dans l organisme 1- Rôle des cellules dendritiques dans l orientation de la réponse immune Les cellules dendritiques, avec leurs différentes fonctions, sont impliquées dans l orientation de la réponse immune. Nous avons vu précédemment que leur activation entraîne des modifications majeures de leur phénotype et de leur fonctionnalité. Elles expriment un arsenal de molécules polarisantes, solubles ou membranaires, qui déterminent l orientation de la réponse immune appropriée selon le signal détecté. Initialement, il avait été rapporté que les DC «myéloïdes» entraînaient une réponse plutôt Th1 alors que les pdc entraîneraient une réponse Th2 (Banchereau et al., 2000). Ce concept initial a été depuis remis en cause et il semblerait que la plasticité des cellules dendritiques permette d orienter différemment la réponse immune selon leur mode d activation et leur environnement. Les molécules identifiées comme ayant des propriétés polarisantes sont de nature très variées, solubles ou liées à la membrane. Les premières caractérisées comme telles furent des cytokines mais des chimiokines, des molécules de co-stimulation et d autres encore peuvent avoir des capacités à polariser la différenciation des cellules T. Cytokines de la famille de l IL-12 L IL-12 fut la première cytokine décrite pour avoir un rôle de polarisation des lymphocytes T vers Th1 (de Jong et al., 2005). Plusieurs signaux sont nécessaires à la production d IL-12 par les cellules dendritiques incluant des produits microbiens, la stimulation par des cellules T activées (CD40L) et l environnement cytokinique du milieu. L IL-12 est une cytokine hétérodimérique composée de deux sous-unités p35 et p40 liées par un pont disulfure (Trinchieri and Scott, 1999)(figure 12). La production simultanée de ces sous-unités résulte en la sécrétion d un hétérodimère p70 actif. La sous-unité p35 est 68

70 exprimée de façon ubiquitaire et constitutive à faible niveau et inductible. En revanche, la production de p40 est fortement régulée et induite par les produits des bactéries gram positives et négatives, les parasites, virus et champignons dans les monocytes, neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques. IL-12 IL-23 IL-27 p40 p35 p40 p19 EBI3 p28 IL-12Rβ1 IL-12Rβ2 IL-12Rβ1 IL-23R gp130 IL-27Rα Domaine d homologie des récepteurs de cytokines Domaine de type-fibronectine Domaine de type-immunoglobuline Figure 12 : Cytokines de la famille de l IL-12 et leurs récepteurs Les DC peuvent produire une grande quantité d IL-12 lors de leur activation, favorisant la différenciation des cellules Th1 en agissant à la fois sur des cellules NK et T. Nous avons vu précédemment que l activation par les pathogènes via les TLR induit la production d IL-12 favorisant ainsi la polarisation Th1. Deux autres membres de la famille de l IL-12, l IL-23 et IL-27, ont été identifiés comme étant également produites par les cellules dendritiques. Les membres de cette famille étaient tous initialement considérés comme polarisant la réponse vers Th1 en agissant à différent stade du développement. Il est maintenant clair que malgré leurs similarités structurelles et fonctionnelles ces cytokines ont des fonctions distinctes sur la polarisation de la réponse immune (Goriely et al., 2008). L IL- 27 est un hétérodimère composé de la protéine EBI3 («Epstein-Barr virus-induced gene 3»), qui partage une homologie avec l IL-12p40 et une nouvelle sous-unité, p28 (Pflanz et al., 2002). L IL-27 peut induire une synthèse rapide d IFN-γ chez les cellules naïves et ainsi favoriser la polarisation Th1. Elle intervient également dans le maintien de la réponse Th1 69

71 (Lucas et al., 2003; Owaki et al., 2005 ; Pflanz et al., 2002 ). L IL-23 était initialement associée à la différenciation Th1 mais les résultats récents montrent l implication de cette cytokines dans la polarisation Th17 (Harrington et al., 2005 ; Langrish et al., 2005). La présence simultanée d IL-23 et d IL-12 oriente plutôt vers Th1 et il a été montré que l IL-12 avait un effet négatif sur la différentiation Th17. Cependant, lorsque l IL-23 est produite seule l orientation Th17 domine. La nature du pathogène à l origine de la maturation de la cellule dendritique pourrait être à l origine de la production différentielle de cytokines de la famille de l IL-12. L engagement de certains TLR par les différentes voies que nous avons vu précédemment induit la production des différentes sous-unités de la famille de l IL-12 favorisant ainsi plus une cytokine que l autre (Goriely et al., 2008). Implication de la voie Notch Le signal de polarisation vers Th2 par les cellules dendritiques n est pas encore clairement défini. L IL-4 malgré son rôle dans l orientation de la réponse Th2 ne semble pas un bon candidat car les DC n en produisent qu une très faible quantité. L ignorance au niveau du signal provenant des DC associé à l orientation Th2, peut laisser penser que la simple absence d un signal polarisant vers Th1 ou Th17 (IL-12 ou IL23 par exemple) conduirait à une orientation Th2. Mais dans une situation où la réponse Th2 est critique pour l élimination de pathogènes ou dans la prévention de l immunopathologie, la dépendance à un phénomène par défaut semble peu probable. Par ailleurs une forte synthèse d IL-10 par les DC en inhibant la production d IL-12 pourrait orienter plutôt vers Th2 (Reis e Sousa et al., 2001). D autres candidats ont été récemment suggérés pour être impliqué dans le signal émis par les DC polarisant la réponse Th2. Par exemple, la voie des récepteurs Notch pourrait être le maillon manquant de la chaîne de la différenciation Th2. Les récepteurs Notch sont des protéines transmembranaires hétérodimériques très conservées impliquées dans le développement d une variété de cellules dont les lymphocytes T (Tanigaki et al., 2004). Lorsqu un ligand fixe un récepteur Notch, le domaine intracellulaire est clivé pour générer la forme active du récepteur qui migre dans le noyau où il induit l expression de gènes par l activation du facteur de transcription RBPJκ (Maillard et al., 2005). Les ligands de Notch contiennent deux classes distinctes : Jagged et delta. En 2004, Amsen et son équipe suggéraient que les ligands de Notch orientent différemment la réponse : alors que Delta-4 induit plutôt une réponse Th1, l expression de Jagged-1 oriente plutôt vers Th2 (Amsen et al., 2004). L interaction de jagged-1 sur les cellules dendritiques avec Notch durant la phase initiale de l activation T contrôle la différenciation Th2 par un mécanisme indépendant de la signalisation via l IL-4 et STAT-6 (Amsen et al., 2004 ; Krawczyk et al., 2008). La régulation du facteur de 70

72 transcription GATA-3 serait responsable de l orientation Th2 suite à la fixation de Jagged au récepteur Notch (Amsen et al., 2004; Fang et al., 2007 ). Rôle des molécules membranaires Les molécules de co-stimulation ou d adhésion exprimées par les cellules dendritiques peuvent jouer un rôle dans l induction de réponses vers Th1 ou Th2. ICAM-1 est une molécule d adhésion membranaire exprimée par les DC qui se lie à LFA-1 sur les cellules T. Outre son rôle dans la stabilisation des contacts entre la DC et la cellule T, l interaction ICAM-1/LFA-1 pourrait orienter la réponse vers Th1 via une signalisation impliquant les MAPK (Salomon and Bluestone, 1998; Smits et al., 2002 ). A l opposé, la molécule OX40L que les DC expriment suite à une activation par certains antigènes serait plutôt inductrice de la réponse Th2. L expression de la molécule OX40L par les DC après stimulation par le SEA («Schistosomal Egg Antigene») par exemple, est impliquée dans la polarisation Th2 car la neutralisation d OX40L bloque l induction de production d IL-4 et augmente la synthèse d IFNγ (de Jong et al., 2002). Polarisation vers la réponse Th17 La mise en évidence de la sous population Th17 étant très récente le rôle joué par les DC dans cette polarisation reste peu décrit. Les récepteurs NOD ont récemment été identifiés comme pouvant être impliqués dans la polarisation Th17 par les DC (Van Beelen, Immunity, 2007). L activation des DC par le ligand de NOD2, le muramyldipeptide (MBP) un composant du peptidoglycane bactérien, induirait la production d IL-17 par les cellules T. Le MBP augmenterait la capacité des ligands de TLR à induire la production d IL-23 et d IL-1 par les DC favorisant l expression d IL-17 par les cellules T (Van Beelen, Immunity 2007). D autres travaux récents indiquent que la signalisation par les CLR pourrait également favoriser la production d IL-23. En effet, le curdlan, un β-glucane agoniste de Dectine-1 (CLR) induit la synthèse d IL-23, sans production d IL-12p70 par les DC dérivées de moelle osseuse de souris. Cette production d IL-23 induit la synthèse d IL-17 par les lymphocytes T CD4 + (LeibundGut-Landmann et al., 2007). Ainsi il apparaît clairement que le mode d activation de la DC et l environnement dans lequel elle se trouve va diriger la polarisation de la réponse T. 71

73 2- Le concept de cellules dendritiques tolérogènes Il y a maintenant de nombreuses preuves du rôle des DC dans l induction de la tolérance. Pendant longtemps, on a considéré que ce rôle était dévolu aux cellules dendritiques immatures alors que les cellules dendritiques matures généreraient une réponse immune effectrice. Ce concept n est plus valable actuellement. Nous avons vu précédemment que les DC, après activation par différents signaux de «danger» inhérents à une infection ou une inflammation, vont migrer vers les organes lymphoïdes secondaires pour induire une réponse immune effectrice. En condition normale sans pathogène ni inflammation une migration spontanée des DC vers les organes lymphoïdes secondaires se produit également. Par exemple, les cellules de Langerhans quittent la peau après la perte de molécules d ancrage comme la E-cadhérine et induisent l expression de CCR7 permettant le guidage de ces cellules vers les ganglions en l absence de toute infection (Jiang et al., 2007; Randolph, 2001 ). De même, des DC semblent capables de transporter, à l état stable, des cellules apoptotiques épithéliales vers la zone T des ganglions mésentériques suggérant ainsi un rôle dans l induction et le maintien de la tolérance périphérique intestinale (Huang et al., 2000). Ces cellules ne sont pas des DC immatures et ont atteint un certain degré d activation car elles expriment les molécules de co-stimulation CD80/CD86, le CMH-II et le CCR7 (Ip and Lau, 2004 ; Jiang et al., 2007; Stoitzner et al., 2003 ). Ces cellules migratoires sont chargées avec des antigènes tissulaires probablement internalisés par phagocytose. Par ce biais, des antigènes du Soi sont donc transportés jusqu aux organes lymphoïdes secondaires pour une induction de tolérance. En effet, ces DC ont migré et ont maturé en absence de danger et ne semblent pas synthétiser de cytokines inflammatoires nécessaires à l induction d une immunité (Jiang et al., 2007). Par ailleurs la manipulation des DC in vitro par des agents anti-inflammatoires ou immunosuppresseurs peut générer des DC dans un état appelé parfois «semi mature» qui ont des propriétés dites «protolérogènes». Ces agents ciblent la différenciation et la fonction des DC par différents mécanismes (Hackstein and Thomson, 2004) et incluent notamment l IL-10 (Nolan et al., 2004; Steinbrink et al., 1997), le TGFβ (Geissmann et al., 1999; Strobl and Knapp, 1999 ) ainsi que la vitamine D 3 et ses analogues (Pedersen et al., 2004; Piemonti et al., 2000 ). De plus, les immunossuppresseurs tels que les corticostéroïdes comme la dexamethasone (Rea et al., 2000), la rapamycine (Turnquist et al., 2007) et l acide mycophénolique (Lagaraine et al., 2005) ont aussi été utilisés pour cibler la différenciation et la fonction des DC. 72

74 Les DC dites «tolérogènes» peuvent produire des cytokines connues pour être antiinflammatoires et pro-tolérogènes comme l IL-10 et le TGFβ (Coombes et al., 2007), et ainsi favoriser l activation et / ou l émergence de lymphocytes T régulateurs. Bien qu aucun marqueur spécifique des DC tolérogènes ne soit décrit, l expression des molécules ILT3 et ILT4, exprimées essentiellement sur les monocytes, macrophages et cellules dendritiques, a été associée à des DC tolérogènes. Les cellules dendritiques exprimant fortement les molécules ILT3 et ILT4 induisent une anergie des cellules T (Chang et al., 2002 ; Manavalan et al., 2003). L expression de la molécule IDO a également été associée à certaines DC dites «tolérogènes». Il s agit d une enzyme clé du catabolisme du tryptophane qui entraîne une déplétion du milieu en tryptophane ainsi que l arrêt de la prolifération des cellules T car le tryptophane est un acide aminé essentiel à leur prolifération (Mellor and Munn, 2004 ; Munn et al., 2002). Ces lymphocytes T activés dont leur prolifération est inhibée par IDO sont bloqués en phase G1 du cycle cellulaire et sont plus sensibles à l apoptose (Lee et al., 2002). L expression de cette molécule est induite dans les DC par la PGE 2, l IFNγ et CTLA-4 (Braun et al., 2005 ; Mellor and Munn, 2004 Grohmann, 2002 #747). Ceci implique que des cellules exprimant CTLA-4 (comme les Treg) peuvent induire l expression d IDO sur les DC, qui à leur tour deviennent tolérogènes et peuvent potentialiser l action des Treg en limitant la prolifération des lymphocytes T effecteurs. Les DC tolérogènes présentent les antigènes aux cellules T spécifiques d antigènes mais échouent dans la délivrance d un signal complet de co-stimulation ou éventuellement procurent un signal inhibiteur pour l activation et la prolifération des cellules T. Cette absence d activation efficace peut se manifester par la mort de la cellule T, l anergie ou la génération de cellules T régulatrices (Morelli and Thomson, 2007). Ces différentes observations laissent penser que le micro-environnement dans lequel la DC a internalisé et présenté l antigène influence grandement sur la capacité immunogène ou tolérogène de ces cellules. 3- Migration des cellules dendritiques La fonctionnalité des DC est fortement influencée par leur localisation ainsi que par leur capacité migratoire. Les DC tissulaires, comme celles de la peau, doivent d abord se détacher de la matrice extracellulaire avant de migrer vers les organes lymphoïdes secondaires. Ce processus est régulé par l expression par les DC de la peau de métalloprotéases matricielles, MMP-9 et MMP-2 entre autres (Ratzinger et al., 2002). La migration des DC en général est dictée en majorité par les chimiokines. Il s agit de molécules 73

75 de petite taille impliquées dans le chimiotactisme des leucocytes. Elles déterminent le type de cellules devant traverser l endothélium et l endroit où elles doivent se situer dans le tissu. Les chimiokines agissent par l intermédiaire de récepteurs qui sont des protéines à sept domaines transmembranaires et associés aux petites protéines G qui mènent à la signalisation intracellulaire (McColl, 2002). Différents récepteurs de chimiokines sont impliqués dans les stades de la vie d une cellule dendritique et les changements d expression de ces récepteurs gouvernent la capacité migratoire des DC. Par exemple, le CCR5 semble permettre le recrutement des cellules dendritiques sur le site d inflammation via les chimiokines CCL3 ou MIP-1α (Aliberti et al., 2000; Sallusto et al., 1998 ) et le CCR6 apparaît comme important dans le positionnement des DC à la surface des épithélia (Cook et al., 2000 ; Vanbervliet et al., 2002). Pendant la maturation des cellules dendritiques, l expression des récepteurs de chimiokines est modifiée avec la diminution d expression de CCR5 et l acquisition de l expression de CCR7, molécule clé de la migration des DC matures. Cette modification entraîne une attraction de ces cellules vers les organes lymphoïdes secondaires où les ligands CCL21 et CCL19 sont exprimés (Dieu et al., 1998 ; Lukacs-Kornek et al., 2008; Sozzani, 2005 ). 74

76 V-Immunologie de la greffe La transplantation d organe allogénique est trop récente (une soixantaine d années) pour que le système immunitaire ait développé un autre système de défense que celui présent pour lutter contre les infections déjà présentes. Nous avons vu précédemment que la réponse immune adaptative implique que les cellules présentatrices d antigènes, en particulier les cellules dendritiques, signalent la présence d invasion par des pathogènes aux lymphocytes T capables de recevoir ce signal, engendrant ainsi une réponse immune efficace. Au centre de ce dialogue entre la CPA et la cellule T il y a les molécules codées par le complexe majeur d histocompatibilité que nous avons vues dans le chapitre II-2b. Le degré élevé de polymorphisme de ces molécules au sein d une espèce et le nombre conséquent de gènes exprimés (au moins 12 par cellule) entraîne un nombre très élevé de combinaisons. Ceci explique le fait que l identité du MHC entre deux individus soit un phénomène très rare dans l espèce humaine. L alloreconnaissance, base de l alloréactivité réfère au phénomène par lequel le système immunitaire reconnaît les antigènes du donneur d organe. La réponse immune du receveur contre l allogreffe a pour cible principale les antigènes du CMH du donneur. L alloréactivité présente 3 caractéristiques par rapport à la réponse immune induite par des antigènes conventionnels : aucune présensibilisation n est nécessaire pour observer la réponse, la réponse est puissante in vivo et in vitro en raison d une grande fréquence des précurseurs et enfin la reconnaissance peut se faire sans restriction au CMH du soi. La reconnaissance de ces antigènes est l événement primaire qui conduit au rejet de l allogreffe. Le rejet de greffe peut être classé cliniquement en distinguant le rejet hyperaigu, le rejet aigu et le rejet chronique. Encore aujourd hui, malgré les progrès dans le domaine de l immunosuppression de nombreux organes sont perdus par rejet chronique. Les cellules T constituent l arme effectrice principale de l alloreconnaissance. Les alloantigènes du CMH peuvent être présentés au système immunitaire du receveur principalement par deux voies : la voie directe et la voie indirecte. La voie directe de présentation implique la présentation d antigène intact du donneur par les CPA du donneur aux cellules T du receveur. La voie de reconnaissance indirecte est plus représentative de la réponse à l antigène classique. Dans cette voie, les cellules T reconnaissent les antigènes du 75

77 donneur qui ont été apprêtés et présentés dans le contexte du CMH du Soi sur les CPA du receveur. De même que pour la présentation directe, les lymphocytes T CD4 + et CD8 + peuvent médier la présentation indirecte. Suite à l alloreconnaissance par l hôte, la réaction contre le greffon qui en résulte mène, en absence de traitement, à la destruction du tissu du donneur. Une troisième voie récemment décrite vient compléter la classification initiale et consiste en la présentation par des molécules de CMH du donneur exprimées à la surface des CPA du receveur. PRESENTATION DIRECTE APC du donneur PRESENTATION INDIRECTE APC du receveur PRESENTATION SEMI-DIRECTE APC du receveur CMH du donneur TCR Peptide dérivé du donneur Peptide dérivé du CMH du donneur TCR CMH du receveur Peptide TCR CMH du donneur Lymphocytes T du receveur Lymphocytes T du receveur Figure 13 : Différentes voies d alloreconnaissance Lymphocytes T du receveur 1- Différents types de rejets Rejet hyperaigu Le rejet hyperaigu est très rapide et survient immédiatement après la greffe (en moins de 24h). Il est principalement dû à des anticorps présents dans le sérum de l hôte, spécifiques des antigènes du greffon. En particulier les IgM qui vont reconnaître des antigènes portés par les cellules endothéliales. La destruction de celles-ci compromet la vascularisation du greffon. Les complexes antigènes-anticorps entraînent également un phénomène de coagulation à l intérieur des vaisseaux. La cascade du complément peut aboutir à la destruction de l endothélium ou, lorsque la lésion est grave sans être fatale, à l activation des cellules endothéliales. La prévention du rejet hyperaigu s effectue par l assurance de la compatibilité du système ABO ainsi que par un test de compatibilité («cross-match») entre le donneur et le receveur. Ce test consiste en l incubation des lymphocytes du donneur avec le sérum du 76

78 receveur en présence de complément. Une mort cellulaire indique la présence d anticorps contre le donneur et est une contre indication à la transplantation. Rejet aigu Le rejet aigu est constaté le plus souvent dans les jours ou les semaines qui suivent la transplantation et est causé par l alloreconnaissance des antigènes du donneur par les lymphocytes T auxiliaires du receveur. Les cellules dendritiques présentes dans le greffon migrent vers les ganglions lymphatiques et stimulent une réponse immunitaire allogénique primaire. Une fois activées, les cellules T migrent vers le greffon et endommagent le tissu par des mécanismes effecteurs ; génération de cellules T cytotoxiques et induction de réactions d hypersensibilité de type retardé, infiltration massive du greffon par des cellules mononucléées (lymphocytes T activés et macrophages), phénomène de type IV (hypersensibilité cutanée retardée). Rejet chronique La séquence d évènements de rejet de greffe peut être scindée en deux étapes distinctes : tout d abord la sensibilisation durant laquelle les lymphocytes alloréactifs prolifèrent après reconnaissance des alloantigènes et une phase effectrice durant laquelle la destruction du greffon par la réponse immune est opérée. Les cellules CD4 + alloréactives stimulées par les molécules de classe II portées par les cellules endothéliales du greffon et les cellules dendritiques activées produisent un ensemble de cytokines (IL-2, IFNγ, TNFα) qui stimulent la production d IL-1, de TNF d IL-6 et d IL-8 par les cellules CPA, les CD4 + Th1 et CD8 + qui vont à leur tour stimuler le recrutement des cellules de la lignée monocyto/macrophagique et des lymphocytes T auxiliaires CD4 + qui vont participer à l activation des cellules cytotoxiques CD8 +. Par ailleurs, les cellules Th2 et les DC activées vont stimuler la synthèse d alloanticorps dirigés essentiellement contre des antigènes du CMH et d autres (les antigènes MICA, apparentés aux antigènes du CMH). Les cellules T cytotoxiques détruisent les cellules du greffon par reconnaissance des antigènes de classe I, adhérence, synthèse de perforine et lyse de la membrane de la cellule cible, ou bien par induction d apoptose. En plus de cette réaction spécifique, des cellules tueuses non spécifiques (NK, monocytes, polynucléaires neutrophiles et éosinophiles) pourraient participer à la lyse des cellules du greffon. Les alloanticorps se fixent sur les antigènes du greffon portés par l endothélium vasculaire et les cellules éptithéliales. Ces anticorps 77

79 contribuent, avec les lymphocytes T, à la formation des lésions vasculaires du greffon observées au cours du rejet chronique. 2- Différentes voies d alloreconnaissance La voie de présentation directe Suite à la tranplantation, les cellules dendritiques du donneur migrent du greffon jusqu aux organes lymphoïdes secondaires du receveur (Larsen et al., 1990) suggérant que l alloreconnaissance directe peut être initiée dans le tissu lymphoïde comme les réponses envers les pathogènes. L observation que le greffon peut être immunologiquement ignoré dans les animaux déficients en organes lymphoïdes soutient également cette idée (Lakkis et al., 2000). A ce niveau, les cellules dendritiques du donneur présentent les antigènes du donneur aux cellules T du receveur via des molécules du complexe CMH (figure 13). La forte réponse déclenchée par la présentation directe est due à une fréquence élevée de cellules T avec une allospécificité directe (Lindahl and Wilson, 1977). L alloréactivité représente la reconnaissance du polymorphisme alléllique des molécules allogéniques du CMH. L alloréactivité est due à une réactivité croisée ; un TCR spécifique d un complexe CMH-peptide du Soi peut également reconnaitre une molécule du complexe CMH-peptide allogénique. Bien que la rencontre d un CMH allogénique apparaisse très peu probable au cours de la vie normale d un individu, la réponse immune envers les molécules du CMH allogéniques est très forte. De plus, cette reconnaissance directe n obéit pas aux lois conventionnelles de restriction au CMH. Bien que le répertoire lymphocytaire T soit sélectionné dans le thymus sur la base d une affinité du TCR suffisante pour les complexes CMH autologue/peptide du Soi, la fréquence des lymphocytes T capables de reconnaître par la voie directe des molécules du CMH vis-à-vis desquelles elles n ont pas été «éduquées» est paradoxalement très élevée. Il est en effet estimé que 0,1 à 10 % du répertoire T d un individu est capable de reconnaître des alloantigènes (Wang et al., 1998) (Benichou et al., 1998), tandis que la fréquence des cellules T spécifiques d un peptide antigénique conventionnel donné, d origine infectieuse par exemple, est de moins de 1 sur (Karulin et al., 2000). Cette fréquence élevée des lymphocytes T alloréactifs explique en partie l intensité particulière de la réponse allogénique directe in vivo en dehors de toute sensibilisation préalable. Cette reconnaissance directe intervient puissamment dans les jours ou semaines qui suivent la greffe et est responsable des rejets aigus précoces (Benichou, 1999). Les cellules 78

80 dendritiques du donneur ayant une durée de vie limitée, leur part dans l activation directe diminue petit à petit. Cependant des données récentes suggèrent que cette voie directe pourrait être active tout au long de la vie des greffons via la présentation par d autres cellules (endothélium, épithélium) (Bestard et al., 2008). La voie de présentation indirecte Lechler et Batchelor (Lechler and Batchelor, 1982) ont initialement émis l'hypothèse que les cellules T alloréactives peuvent également être stimulées par la voie indirecte, dans laquelle les antigènes dérivés du donneur sont apprêtés et présentés aux lymphocytes T du receveur par les CPA du donneur (Benichou et al., 1994 ; Benichou et al., 1992) (figure 13). Ces dernières infiltrent le greffon tout spécialement lors du processus inflammatoire local initié par la transplantation. Elles vont localement phagocyter, apprêter puis migrer et présenter les alloantigènes (la possibilité d une présentation efficace dans le greffon n est pas encore totalement exclue dans la mesure où les reins en rejet chronique ont certains aspects qui les rapprochent des organes lymphoïdes secondaires). Ainsi, les CPA du receveur vont présenter des peptides dérivés essentiellement du CMH du donneur via leur propre CMH aux cellules T du receveur. De plus, il a été rapporté que les molécules du système HLA solubles et intactes sont présentes dans la circulation chez l homme après transplantation (Suciu-Foca et al., 1991), par conséquent, des fragments de molécules du CMH du donneur peuvent être clivés et pris en charge par les DC de l hôte et présentés par le CMH du Soi comme peptides allogéniques aux lymphocytes T. La plupart des peptides antigéniques présentés par la voie indirecte proviennent de la région polymorphe des molécules du CMH du donneur (Benichou et al., 1994 ; Benichou et al., 1992 ; Gould and Auchincloss, 1999). Cependant, la présentation indirecte peut également se produire en réponse à des peptides dérivés d'autres protéines du donneur incluant les antigènes mineurs de transplantation (Richards et al., 2004). Les lymphocytes T CD4 + sont «classiquement» activés par une voie indirecte puisque les antigènes exogènes rejoignent le circuit de présentation antigénique des molécules HLA de classe II. Le phénomène de présentation croisée est une propriété particulière des cellules dendritiques qui permet aux alloantigènes internalisés de rejoindre la voie d apprêtement des molécules HLA de classe I, et donc l activation de lymphocytes T CD8 + par la voie indirecte (Popov et al., 1995; Shen and Rock, 2006 ). De tels lymphocytes CD8 + ont pu être isolés dans des modèles expérimentaux et aussi chez des patients transplantés. 79

81 Alors que la voie directe est plus importante dans le processus de rejet aigu d allogreffe, la voie de présentation indirecte pourrait jouer un rôle dominant dans le rejet chronique mais ceci reste à prouver. Des analyses des ganglions lymphatiques ont démontré que plus de 90% des cellules T allospécifiques étaient sensibilisés par la voie directe alors que seulement 1-5% représentent des cellules T allospécifiques de la voie indirecte (Benichou et al., 1999 ; Lindahl and Wilson, 1977; Suchin et al., 2001 ). Cependant, un aflux continu d antigènes du donneur apprêtés par les CPA du receveur augmente le nombre de lymphocytes T alloréactifs de la voie indirecte. Ces lymphocytes T semblent aussi plus résistants à l immunosuppression conventionnelle (Sawyer et al., 1993). La voie semi-directe Ce modèle de reconnaissance, propose que des molécules intactes du CMH allogénique soient capturées par les CPA du receveur à partir du greffon et a été démontré par Lechler et collaborateurs, tout d abord dans des travaux in vitro (figure 13). Des phénomènes de transfert de molécules du CMH par acquisition de fragments de membrane cellulaire ont été observés entre des cellules endothéliales et des DC (Jiang et al., 2004a), et également entre DC par l intermédiaire des exosomes (Thery et al., 2002). Par ailleurs, les DC du donneur semblent sécréter des exosomes contenant les molécules du CMH qui pourraient fusionner au contact de la membrane des cellules dendritiques du receveur (Jiang et al., 2004a). L acquisition de molécules du CMH allogénique pourrait survenir lors de la circulation des DC du receveur à travers le greffon et à partir de l endothélium vasculaire. Les DC du receveur exprimeraient donc les molécules à la fois du CMH autologue et du CMH allogénique, et seraient capables d activer simultanément la réponse CD4 et CD8 par les voies directes et indirectes. 3- Les immunosuppresseurs Le succès d une transplantation d organe dépend principalement des immunosuppresseurs qui contrôlent la réponse immunitaire allogénique. La découverte du premier immunosuppresseur, la 6-mercaptopurine, en 1959, par Schwartz et Dameshek (Schwartz and Dameshek, 1959) a été une étape déterminante pour le développement de la transplantation d organe. Cette molécule a la propriété d inhiber la prolifération des lymphocytes T et de prolonger le temps de survie du greffon. Les recherches se sont donc intensifiées sur des molécules capables de bloquer l activation des lymphocytes T en agissant 80

82 au niveau des 3 signaux d activation aboutissant soit à la destruction des lymphocytes soit à la suspension de leur fonction. Plusieurs types d agents immunosuppresseurs ont été développés : des inhibiteurs de la calcineurine (la cyclosporine et le tacrolimus), des inhibiteurs du métabolisme des purines et des pyrimidines (azathioprine et l acide mycophénolique), des inhibiteurs de mtor (rapamycine et éverolimus), des antiinflammatoires de la famille des glucocorticoïdes utilisés en tant qu immunosuppresseur (dexamethazone) ainsi que des anticorps, monoclonaux (anti-cd3 et anti-cd25) et polyclonaux (ATG-anti-thymoglobulines). D autres molécules sont en cours d évaluation dans des essais thérapeutiques en transplantation comme la molécule CTLA-4-Ig (Belatacept ). Il existe également d autres agents comme des dérivées de la vitamine D 3 qui ont des propriétés immunomodulatrices in vitro en cours de dévelopement pour la thérapeutique chez l homme. Néanmoins, les immunosuppresseurs n induisent pas de tolérance immune et dépriment le système immunitaire de façon importante et de manière non spécifique. En conséquence, ils engendrent de nombreux effets secondaires tels que le développement de cancers viro-induits ou d infections à germes opportunistes d origine bactérienne, virale et fongique. Parce qu ils ont fait l objet d une partie de ce travail, seules les propriétés de l acide mycophénolique et de la rapamycine seront détaillées. Effet de l acide mycophénolique L acide mycophénolique (MPA pour «Mycophenolate Acid») est le principe actif du «Mycophenolate Mofetil» utilisé en clinique. Le MPA est un inhibiteur non compétitif de l inosine monophosphate déshydrogénase (IMPDH) enzyme-clé dans la synthèse de novo des nucléotides à guanine, nécessaire à la synthèse de l ADN et à la prolifération cellulaire (Allison and Eugui, 2000 à voir). Comme les lymphocytes sont incapables d utiliser la voie de récupération des nucléotides, leur prolifération est particulièrement sensible à l inhibition de la synthèse de novo par le MPA. L inhibition préférentielle de leur division cellulaire constitue la base des propriétés immunosuppressives de l acide mycophénolique. Outre son activité immunosuppresseur sur les lymphocytes, le MPA modifie également la fonctionnalité des cellules dendritiques. En 2000, Mehling et collaborateurs ont été les premiers à décrire l action du MPA sur des DC (Mehling et al., 2000). Dans cette étude, le MPA inhibe la maturation des DC de souris induite par le LPS, les DC traitées ayant une faible expression du CD40, CD80, CD86 et CD54, une diminution de la sécrétion d IL-12 ainsi qu une faible capacité à stimuler des lymphocytes T allogéniques (Mehling et al., 2000). 81

83 L effet du MPA sur les cellules dendritiques a aussi été étudié chez l homme. Le MPA inhibe l augmentation de l expression des marqueurs de maturation tels que le CD83 et CD80/CD86 induite par l activation par le TNFα. L effet sur le phénotype de surface des DC humaines semble différent lorsque la stimulation des DC s effectue avec du LPS. Par ailleurs, le MPA ne modifie pas la capacité d endocytose des DC mais bloque la sécrétion de cytokines comme l IL-12 et le TNFα (Colic et al., 2003 ; Lagaraine et al., 2005). De plus, les DC traitées avec le MPA lors de la maturation possèdent une faible capacité allo-stimulatrice (Lagaraine et al., 2005 ; Lagaraine et al., 2008). Ces cellules ayant un profil plutôt semi-mature suggèrent une population de cellules dendritiques tolérogènes. De plus, Lagaraine et collaborateurs ont récemment mis en évidence que les DC traitées avec du MPA lors de la maturation par du TNFα sont capables d induire des lymphocytes T régulateurs in vitro, caractérisés par l expression des marqueurs CD25, GITR, CTLA-4, CD95 et du facteur de transcription Foxp3 ainsi que par une sécrétion importante d IL-10 et de TGF-β(Lagaraine et al., 2008). La rapamycine La rapamycine, initialement développée comme antibiotique, est un métabolite fongique, produit par Streptomyces hydroscopicus (Sehgal et al., 1975) décourvert sur l Ile de Pâque (Rapa Nui). Durant le développement clinique de cette molécule, la mise en évidence d effets anti-prolifératifs a orienté son utilisation comme agent immunosuppresseur dans la préventation des rejets de greffes. La rapamycine exerce sa fonction en se liant au complexe mtor-fkbp12 («FK506-binding protein») entraînant l inhibition de l activité kinase de mtor (Sabers et al., 1995). La protéine mtor est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire au travers de : l initiation, la traduction, la synthèse de protéines impliquées dans la progression du cycle cellulaire et la synthèse d ADN. Son action passe par le blocage de signaux intracellulaires induits par la liaison de l IL-2 à son récepteur mais la rapamycine n inhibe pas l expression du gène de l IL-2 ni celle de son récepteur (Dumont et al., 1990). Ainsi, la rapamycine intervient à une étape un peu plus tardive de l activation des lymphocytes T. En effet, elle bloque leur prolifération et leur survie cellulaire induite par l IL-2 (Morelon et al., 2001 ; Terada et al., 1993). L effet de la rapamycine a d abord été décrit principalement sur les lymphocytes ; il faut attendre les années 2000 pour voir apparaître des études portant sur l influence de cet agent sur la fonctionnalité de la cellule dendritique. 82

84 L action de la rapamycine sur la maturation des cellules dendritiques n est pas encore clairement définie. Des études indiquent que la rapamycine n interfère pas dans le processus de maturation (Chiang et al., 2004; Woltman et al., 2001 ). Cependant, d autres travaux soulignent une inhibition de l expression des molécules de co-stimulation CD40, CD80, CD86, CD83 et/ou des molécules du CMH de classe II par la rapamycine (Hackstein et al., 2003 ; Monti et al., 2003 ; Taner et al., 2005). Curieusement, la rapamycine augmente l expression de CCR7 et favorise la migration des cellules dendritiques en réponse à CCL19 in vitro, et vers les ganglions lymphatiques in vivo (Sordi et al., 2006). Une inhibition de la synthèse d IL-12 et d IL-10 est observée après une stimulation par le CD40L en présence de rapamycine (Monti et al., 2003) mais cette inhibition de la sécrétion d IL-12 n est pas retrouvée suite à une activation par le LPS (Chiang et al., 2004). Par ailleurs, les cellules dendritiques traitées par la rapamycine sont incapables d activer efficacement les lymphocytes T allogéniques in vitro et in vivo (Hackstein et al., 2003 ; Monti et al., 2003; Taner et al., 2005 ). Seuls les travaux de Taner et collaborateurs indiquent une prolifération normale des lymphocytes T allogéniques mais une inhibition de l expansion de lymphocytes T syngéniques (Taner et al., 2005). Néanmoins, après plusieurs re-stimulations par voie directe ou indirecte, les lymphocytes T deviennent hyporépondeurs. Cette hyporéponse est spécifique de l antigène et peut être levée par l addition d IL-2 exogène (Taner et al., 2005). Enfin, cellules dendritiques traitées par la rapamycine pulsées avec des allo-antigènes ou de cellules dendritiques allogéniques traitées à la rapamycine induisent des lymphocytes T régulateurs (Turnquist et al., 2007). 4- Tolérance immune 4a- Mécanismes généraux La tolérance immunitaire est l incapacité à élaborer une réponse effectrice vis-à-vis d antigènes spécifiques. Le plus souvent il s agit d un phénomène actif qui nécessite un contact préalable avec l antigène. Les mécanismes de la tolérance active sont nécessaires à la prévention des réactions inflammatoires vis-à-vis des nombreux antigènes inoffensifs de l air ou provenant de l alimentation, entrant en contact avec les muqueuses de l intestin et des poumons ainsi que pour prévenir les réactions autoimmunes. Il existe une tolérance centrale dans le thymus où la majorité des lymphocytes T autoréactifs sont détruits par un mécanisme de sélection négative et une tolérance périphérique, où les lymphocytes T autoréactifs ayant échappé à la sélection négative, ou qui 83

85 reconnaissent des antigènes du Soi non présents dans le thymus, sont inactivés. La tolérance centrale implique la délétion clonale lors du développement des thymocytes tandis que la tolérance périphérique est accomplie par divers mécanismes comme l anergie, l induction d apoptose, l ignorance et l action de cellules régulatrices. Tolérance centrale Pour assurer une réponse immune efficace, le système immunitaire doit contenir des cellules T capables de reconnaître et de répondre à un nombre important d antigènes étrangers (Blackman et al., 1990). Pour une large part ceci est accompli par les multiples réarrangements des gènes du TCR au cours de l ontogénie qui aboutit à la production d une grande variété de spécificités antigéniques. Durant ce processus stochastique des clones ayant des spécificités pour des antigènes du Soi sont produits. Ces clones vont être éliminés par la sélection négative par interaction avec les CPA thymiques. Les progéniteurs des lymphocytes T, provenant de la moelle osseuse, migrent dans le thymus pour y subir une maturation. Au cours de leur développement dans le thymus, les lymphocytes T subissent deux sélections : positive et négative. La sélection positive s effectue dans la zone corticale du thymus où les lymphocytes T doubles positifs CD4 + CD8 + porteurs de TCR reconnaissant les molécules de CMH du Soi exprimées à la surface des cellules épithéliales thymiques, reçoivent un signal de survie et pourront poursuivre leur développement. Le second phénomène de tri, la sélection négative, aussi connu sous le nom de délétion clonale, s effectue dans la zone médullaire du thymus (Sprent and Kishimoto, 2002). Les lymphocytes T autoréactifs, possédant une forte avidité pour les peptides du Soi présentés par le CMH des cellules présentatrices d antigènes thymiques (dont les cellules dendritiques), vont mourir par l induction d apoptose via l activation de leur TCR (Anderton and Wraith, 2002). Environ 3% seulement des précurseurs de cellules T qui entrent dans le thymus survivent à la sélection positive et négative. Ces lymphocytes quittent le thymus pour se diriger vers les organes lymphoïdes secondaires. La tolérance périphérique Certains lymphocytes T autoréactifs échappent à la sélection négative, en particulier les lymphocytes T spécifiques des déterminants du Soi absents du thymus mais présents en périphérie. L existence d une tolérance périphérique est donc nécessaire pour inactiver les cellules T autoréactives. Cette tolérance périphérique repose sur plusieurs mécanismes : 84

86 l inactivation fonctionnelle des cellules auto-réactives par des cellules régulatrices, l induction d apoptose, l ignorance et enfin l anergie. La délétion clonale La délétion des cellules T peut également avoir lieu en périphérie, lorsque celles-ci rencontrent l antigène dans des conditions particulières (Kabelitz et al., 1993). Par exemple, la mort par apoptose après activation appelée AICD («Activation-induced Cell Death») est déclenchée suite à une activation trop importante. Il s agit d un mécanisme de contrôle de l expansion des lymphocytes T lorsqu ils ont été préalablement stimulés. La stimulation répétée de lymphocytes T par des antigènes spécifiques présents à forte concentration ou des activateurs polyclonaux va entraîner une mort des cellules activées par un phénomène d apoptose dépendant d une interaction Fas/FasL (Brunner et al., 1995; Marth et al., 1999 ). Son rôle est avant tout de prévenir une activation incontrôlée des cellules T. Mais ce processus est également important pour le maintien d une tolérance périphérique à certains antigènes du Soi comme le suggèrent des mutations touchant Fas ou FasL et qui conduisent à des syndromes auto-immuns (Holzelova et al., 2004 ; Singer et al., 1994). Il semble donc que des lymphocytes T puissent également subir une délétion clonale en périphérie; c est notamment le cas des lymphocytes T CD4 + reconnaissant les antigènes administrés par voie orale (Bu et al., 2001). L anergie L anergie constitue un état particulier de la cellule T qui est fonctionnellement inactivée c est à dire qu elle ne répond plus par une prolifération après stimulation du TCR. La cellule reste vivante mais est incapable synthétiser de l IL-2 (Schwartz, 1990). Elle est dans un état d hypo-réponse, c'est-à-dire qu elle ne peut plus répondre à une nouvelle stimulation. Il existe deux sortes d anergies : l anergie clonale et «l anergie in vivo». L anergie clonale résulte d une activation du TCR sans signal de co-stimulation par le CD28 (signal 1 sans signal 2) ; elle est réversible en présence de grandes quantités d IL-2 ou par un signal via OX40 (Schwartz, 2003). «L anergie in vivo» dépend majoritairement des molécules de «co-inhibition» comme CTLA-4 ou PD-1. Cette forme d anergie nécessite une certaine activation préalable du lymphocyte dans la mesure où CTLA-4 est une molécule inductible. Contrairement à l anergie clonale, elle n est pas levée par l IL-2. Par ailleurs, la présence de l antigène est nécessaire au maintien de «l anergie in vivo» (Schwartz, 2003). Les signaux induits par l engagement de ces récepteurs ne sont pas clairement connus. Ces 85

87 récepteurs transduisent des signaux inhibiteurs qui confèrent un état de non réponse à long terme ou bien simplement un changement dans le seuil d activation. L ignorance L ignorance est une absence d activation de la cellule T qui conduit à une relation d acceptation mutuelle de l antigène et de la cellule effectrice (Melero et al., 1997). Des études anciennes avaient montré que des antigènes viraux exprimés sur les cellules des ilôts β dans le pancréas étaient incapables d anergiser ou de déleter les lymphocytes effecteurs périphériques, ce qui avait pour résultat une coexistence pacifique entre les antigènes et les cellules effectrices qui demeuraient pourtant parfaitement compétentes et étaient capables de réagir in vitro à l antigène (Ohashi et al., 1991). L ignorance n induit pas une tolérance active, les cellules T ne sont ni anergiques. Les cellules demeurent inductibles mais elles n initient pas de réponses immunes (Miller and Heath, 1993). Les antigènes séquestrés dans des zones immunologiquement protégées sont également ignorés par le système immunitaire (Barker and Billingham, 1977). 4b- Les lymphocytes T régulateurs Des expériences de maladies autoimmunes déclenchées par des lymphopénies induites néonatales chez la souris ont conduit à suspecter l existence d une population cellulaire lymphocytaire capable de contrôler les phénomènes autoimmuns. Au milieu des années 90 des travaux de Sakaguchi et de ses collaborateurs ont mis en évidence le rôle de lymphocytes T CD4 + CD25 + dans le contrôle de ces phénomènes autoimmuns (Sakaguchi et al., 1995). Ces lymphocytes ont alors été dénommés lymphocytes T régulateurs (Treg) afin de les distinguer des lymphocytes T suppresseurs qui étaient moins bien caractérisés quant à leur marqueurs. Il a par la suite été montré que ces lymphocytes T régulateurs CD4 + CD25 + jouaient un rôle crucial non seulement dans la prévention de l autoimmunité (Sakaguchi et al., 2006; Shevach et al., 2006 ) et des maladies inflammatoires (Izcue et al., 2006), mais aussi dans la régulation de l immunité anti-virale et anti-parasitaire (Belkaid et al., 2006 ; Rouse et al., 2006), dans le maintien de la tolérance maternelle du fœtus (Aluvihare et al., 2004), et dans l inhibition de l immunité anti tumorale (Beyer and Schultze, 2006) et enfin dans la tolérance aux allogreffes (Graca et al., 2002 ; Qin et al., 1993). Notons que divers types de cellules avec des fonctions suppressives ont été rapportés appartenant notamment aux groupes des lymphocytes NK, des lymphocytes T CD8 des lymphocytes γδ (Shevach, 2006). Dans ce paragraphe, nous parlerons essentiellement des 86

88 lymphocytes T CD4 + CD25 + car ce sont les mieux caractérisés chez l homme et la souris et les plus universellement considérés comme impliqués dans les phénomènes immunitaires. Dans ce groupe, on distingue classiquement 2 grands types de lymphocytes T régulateurs CD4 + appelés naturels ou induits. Quelques rappels historiques sur la découverte des lymphocytes T régulateurs naturels Une des premières et plus convaincantes séries d études démontrant l importance des lymphocytes T suppresseurs dans la prévention de l autoimmunité spécifique d organe a été réalisée dans le début des années 1970 (Gershon and Kondo, 1970). A cette époque, ils découvrirent que les cellules T pouvaient également réguler le système immunitaire et que cette régulation n était pas effectuée par des cellules effectrices. Le problème majeur de cette époque était le manque de marqueur de la population cellulaire qui supprimait les lymphocytes auto-réactifs et l ignorance des mécanismes d action (Sakaguchi et al., 2007). Les observations de l équipe de Sakaguchi en 1995, constituèrent une avancée majeure dans la compréhension de la fonction des cellules suppressives. Ils ont montré que l injection d une population de cellules T CD4 + murines dépourvues de la fraction de cellules exprimant le marqueur CD25 dans une souris athymique nude entraînait le développement spontané de maladies autoimmunes multiples chez les receveurs (Sakaguchi et al., 1995). De plus, la reconstitution avec des cellules CD4 + CD25 + prévenait l effet délétère engendré par les cellules CD4 + CD25 -. La démonstration qui suivit montrant que les cellules T CD4 + CD25 + manifestaient également une activité régulatrice in vitro (Thornton and Shevach, 1998), a initié le regain d intérêt pour l immunorégulation régie par les cellules T. Par la suite, il a été démontré que des souris présentant des syndromes autoimmuns graves étaient associé à un déficit en cellules CD4 + CD25 + et que ceci était dû à une mutation du gène foxp3 exprimé de façon sélective sur les cellules CD4 + CD25 +, qui est nécessaire pour leur développement (Hori et al., 2003). Des cellules T CD4 + CD25 + humaines avec des propriétés fonctionnelles très similaires à celle des cellules T CD4 + CD25 + murines ont ensuite été identifiées par plusieurs groupes (Baecher-Allan et al., 2001; Ng et al., 2001 ; Stephens et al., 2001 ). Les doutes sur l importance de cette population de cellules T régulatrices chez l homme ont été totalement levés par l observation que des patients atteints de syndromes autoimmuns graves appelés syndrome IPEX («Immunodysregulation, Polyendocrinopathy and Enteropathy, X-linked») 87

89 présentaient une déficience en cellules T reg lui aussi associé à une mutation dans le gène foxp3 (Gambineri et al., 2003). Les lymphocytes T régulateurs naturels Les expériences de thymectomie néonatale ont montré l apparition de manifestations auto-immunes si la thymectomie était effectuée avant l âge de 3 jours chez la souris. Ainsi, l existence d une population régulatrice issue du thymus et capable de contrôler une réponse effectrice auto-immune a été mise en évidence. Les premiers travaux de Sakaguchi ont montré qu il s agissait d une population de cellules CD4 + exprimant de façon constitutive le CD25. La proportion de cellules CD4 + CD25 + issues du thymus au repos représente environ 3-5% des cellules du sang périphérique soit environ 15-30% des cellules CD4 + au repos chez l homme (Baecher-Allan et al., 2001), chez la souris (Sakaguchi et al., 1995) ainsi que chez le porc (Kaser et al., 2008). Les thymocytes CD4 + CD8 - CD25 + ainsi que les cellules du sang périphérique CD4 + CD25 + expriment spécifiquement la molécule Foxp3 qui est cruciale pour le développement et la fonction des Treg naturels (Fontenot et al., 2003 ; Hori et al., 2003 ; Roncador et al., 2005) L absence de marqueur spécifique de la population régulatrice a été un obstacle majeur à la caractérisation et à l isolement des cellules T régulatrices naturelles et notamment pour les différencier des cellules T activées conventionnelles. En plus de CD25 et de foxp3, d autres molécules ont été associées à la population de ntreg dont des molécules de costimulation telles que CTLA-4 (expression constitutive) (Read et al., 2000), GITR (Shimizu et al., 2002), OX40 (McHugh et al., 2002) et d autres molécules comme la molécule de CMH-II (Baecher-Allan et al., 2006). Le rôle de ces molécules dans la physiologie des T reg est encore mal compris. Cependant, l implication des molécules CTLA-4 et GITR dans la suppression semble mieux démontrée. Les lymphocytes T CD4 + CD25 high humain sont par ailleurs homogènes dans leur expression de CD45RO, CD62L et CD122 et la majorité expriment HLA-DR et le CD71 (Baecher-Allan et al., 2001 ; Cao et al., 2003; Lepault and Gagnerault, 2000 ). Deux groupes ont mis en évidence que les Treg naturelles CD4 + CD25 + Foxp3 + étaient CD127 low (chaîne α du récepteur à l IL-7) alors que les lymphocytes T effecteurs étaient CD127 high (Liu et al., 2006 ; Seddiki et al., 2006) ce qui pourrait représenter un critère sélectif supplémentaire pour un tri efficace des Treg naturels (Peters et al., 2008). De plus, l engagement du TCR est nécessaire pour une activité suppressive et il a été montré que des Treg CD4 + CD25 + circulants sont activés par la reconnaissance d antigène du soi in vivo (Cozzo et al., 2003 ; Romagnoli et al., 2002). Les Treg sont préférentiellement 88

90 spécifiques des antigènes du Soi. Suite à une activation via leur TCR, les ntreg exercent une activité suppressive non spécifiques et inhibent à la fois la prolifération des cellules CD4 + (Thornton and Shevach, 1998) et CD8 + (Piccirillo and Shevach, 2001). Prolifération des lymphocytes T régulateurs naturels La question de la capacité proliférative des lymphocytes Treg naturels est importante spécialement dans une optique d utilisation thérapeutique. Les cellules T CD4 + CD25 + sont considérées comme anergiques in vitro, c'est-à-dire qu elles ne répondent pas à une stimulation conventionnelle du TCR mais l ajout d IL-2 lève cette hypo-réponse (Dieckmann et al., 2001; Thornton and Shevach, 1998 ). A l inverse, in vivo les Treg ont une très forte capacité proliférative homéostatique dans un environnement lymphopénique, et répondent à une stimulation par le TCR par une prolifération similaire à celle des lymphocytes T conventionnels (Fisson et al., 2003; Walker et al., 2003 ). Les lymphocytes T régulateurs adaptatifs ou induits Ces lymphocytes T acquièrent un phénotype régulateur après contact avec un antigène spécifique. A la différence des lymphocytes Treg naturels, ils nécessitent donc une étape de différenciation par contact avec un antigène pour devenir régulateurs. La diversité des conditions expérimentales conduisant à leur mise en évidence peut expliquer l hétérogénéité de ces populations et les controverses sur leur caractérisation. Plusieurs populations de cellules régulatrices CD4 + ont été décrites, citons les plus fréquemment analysées les CD4 + CD25 +, les lymphocytes Tr1 et Th3. La génération de cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + en périphérie peut être induit par exemple grâce à l action du TGFβ, cependant des modifications soit de l environnement dans lequel se déroule la présentation antigénique soit de la cellule présentatrice elle même jouent également un rôle capital. Le rôle du TGFβ dans l induction de Treg a tout d abord été décrit par le groupe de Horwitz qui démontrèrent que le TGFβ pouvait induire le développement de CD4 + naïfs possédant une activité suppressive (Yamagiwa et al., 2001). D autres travaux suivirent, démontrant la conversion de cellules T CD4 + CD25 - murines ou humaines en cellules régulatrice CD4 + CD25 + Foxp3 + suite à une activation par le TCR en présence de TGFβ (Chen et al., 2003 ; Fantini et al., 2004). Des études récentes, après la mise en place de l analyse par cytométrie en flux de l expression de Foxp3, confirmèrent que 50 à 100% des cellules CD25 - Foxp3 - peuvent être induite pour exprimer Foxp3 en présence de TGFβ (Bettelli et al., 89

91 2006). De plus, chez la souris une déficience pour le gène de TGFβ1 conduit à une réaction auto-immune multi organes avec une lymphoprolifération similaire à celle induite dans les souris Foxp3 -/- (Kulkarni et al., 1993). L environnement et les conditions de la présentation de l antigène influent également sur l induction de Treg. Par exemple, in vivo une stimulation continue et prolongée à petite dose induit l expression de Foxp3 et ainsi qu une régulation de la réponse contre l antigène injecté (Apostolou and von Boehmer, 2004). Un autre exemple du rôle de l environnement est donné par la mise en évidence du rôle de l IL-10 dans la différenciation de Tr1. Dans certaines conditions la présence d IL-10 induit la différenciation de cellules de type Tr1 décrites pour la première fois en 1997 (Groux et al., 1997), qui acquièrent la capacité de produire une grande quantité d IL-10 et ont la capacité de prévenir des colites autoimmunes (Roncarolo et al., 2001). Les cellules Tr1 sont produites in vitro par une stimulation antigénique de cellules T naïves en présence d IL-10 et sécrètent de l IL-10 et du TGFβ (Levings and Roncarolo, 2000). Ces cellules semblent exprimer la molécule Foxp3 mais à un niveau très faible (Levings et al., 2005 ; Roncarolo and Gregori, 2008). Une autre sous-population appelée Th3 a été identifiée comme cellules régulatrices in vivo et in vitro par leur rôle, via la production de TGFβ dans le développement de la tolérance immune suivant l ingestion d antigènes (nommée tolérance orale) (Chen et al., 1994). Dans cette observation, nous voyons ici mis en évidence le rôle de la voie d injection de l antigène et de l environnement intestinal où certaines substances pourraient faciliter la différenciation de cellules régulatrices. Par exemple, l acide rétinoïque, un dérivé de la vitamine A, en présence de TGFβ facilite la différenciation de cellules T naïves en Treg Foxp3 + chez l homme et la souris (Benson et al., 2007 ; Coombes et al., 2007; Mucida et al., 2007 ). Il a été montré que l acide rétinoïque peut être sécrété par certaines DC notamment dans les tissus lymphoïdes associés à l intestin (Sun et al., 2007). Ainsi, les antigènes protéiques administrés par voie orale et présentés par les DC productrices d acide rétinoïque pourraient induire des Treg Foxp3 +. Ceci pourrait être un mécanisme plausible de la tolérance orale. La diversité des conditions expérimentales de différenciation des cellules régulatrices fait qu il reste difficile d établir une classification pertinente des cellules T régulatrices induites. Par ailleurs, une classification insiste plus sur les différences entre les populations cellulaires que sur leurs traits communs. Ainsi, dans le reste du chapitre nous allons nous attacher à décrire des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques obtenues sur des 90

92 populations cellulaires bien caractérisées en insistant spécialement sur les cellules exprimant Foxp3. Quelques molécules importantes dans la différenciation et les modes d action des lymphocytes Treg Les molécules importantes dans la différenciation des Treg sont nombreuses et encore incomplètement connues. Par ailleurs, certaines d entre elles sont aussi déterminantes pour la fonction effectrice des Treg. Il est donc difficile de séparer complètement différenciation et phase effectrice de la régulation. De plus, les mécanismes effecteurs qui ont été décrits pour les Treg sont très divers et ce champ est encore rapidement évolutif. Ainsi, résumer et exposer ces mécanismes d action est donc une tâche très difficile. Cependant appréhender ces mécanismes est important tant pour la compréhension du contrôle du processus de tolérance que pour l identification de cibles thérapeutiques. Nous ne décrirons donc ici que les molécules qui nous ont semblé les plus importantes pour la différenciation ou pour la phase effectrice de la régulation. Nous parlerons de la molécule Foxp3, du rôle de l IL-2 et de certaines molécules de co-stimulation ainsi que de cytokines inhibitrices. Nous montrerons l acquisition de fonctions cytolytiques par les Treg et enfin nous décrirons brièvement l action des Treg sur les cellules dendritiques et les altérations métaboliques de l environnement qu elles sont susceptibles d engendrer. D un point de vue fonctionnel, les nombreux mécanismes utilisés par les Treg peuvent être regroupés en 4 grands groupes modes d action : suppression par des cytokines inhibitrices, suppression par contact cellulaire direct avec la cible (cytolyse ou molécules membranaires ayant une action inhibitrice sur la cible), suppression par altérations métaboliques et suppression via une action sur les cellules dendritiques (figure 14). Foxp3 (Forkhead box protein 3) L expression du gène Foxp3 semble capitale dans l activation du programme génétique conférant des propriétés régulatrices aux cellules. Chez la souris, la mutation spontanée scurfy dans le gène Foxp3 a été montrée comme une mutation perte de fonction qui résulte en une absence complète de Treg et en la mort de la souris à l âge de 3-4 semaines (Brunkow et al., 2001; Godfrey et al., 1991 ). De façon similaire, les hommes souffrant du syndrome IPEX possèdent aussi une mutation dans ce gène et ont un ensemble de symptômes autoimmuns et lymphoprolifératifs similaires à la souris (Bennett et al., 2001 ; Gambineri et 91

93 al., 2003). Chez la souris le transfert de Foxp3 dans des cellules naïves les convertit en cellules CD25 + Treg. (Hori et al., 2003). Ainsi l expression de foxp3 semble suffisante pour exprimer le phénotype Treg chez la souris. Foxp3 est un facteur de transcription qui se lie à l ADN en coopération avec différents facteurs de transcription tels que NF-AT et AML/Runx1 pour réguler la transcription de nombreux gènes cibles (Marson et al., 2007 ; Ono et al., 2007; Wu et al., 2006 ). En l absence de Foxp3, le complexe NF-AT/AP1 facilite l activation des cellules non régulatrices, induit la synthèse d IL-2 et la différenciation en cellules effectrices. La fixation de Foxp3 au facteur de transcription NF-AT inhibe l activité de ce dernier et bloque ainsi la transcription du gène de l IL-2. Les gènes activés ou réprimés par la molécule Foxp3 sont en cours d identification en utilisant des techniques permettant d étudiant les interactions entre protéines et l ADN, afin d élargir le champ d investigation. Quelques gènes cibles sont cependant clairement établis comme les gènes de l IL-2, de l IL-2Rα, de CTLA-4 et de GITR (Chen et al., 2006). Notons que les cellules régulatrices ont une particularité puisqu elles expriment fortement le CD25 et ont une répression du gène de l IL-2. A l opposé, dans les cellules non régulatrices, le signal de l IL-2 via l activation de CD25, induit le gène CD25 (John et al., 1996). Le facteur de transcription Foxp3 reste probablement encore le meilleur marqueur des Treg, mais son rôle dans les cellules T reg humaines paraît plus complexe que chez la souris. Il semble requis pour le développement et la fonction de cellules Treg humaines naturelles mais son expression n est peut être pas suffisante pour développer la fonction régulatrice. Ceci est suggéré par des travaux récents montrant qu un pourcentage significatif de cellules T humaines activées expriment Foxp3 mais n exercent aucune activité suppressive (Allan et al., 2007 ; Gavin et al., 2006 ; Tran et al., 2007).Ceci pourrait être lié à une expression transitoire de ce gène (Gavin et al., 2006 ; Wang et al., 2007a). Cependant il faut garder en mémoire qu il est difficile d étudier chez l homme la fonction des cellules foxp3 + car il s agit d un marqueur intracellulaire qui nécessite donc une perméabilisation de la cellule pour être mis en évidence. Chez la souris, les travaux ont été facilité par l obtention d animaux knock-in pour foxp3 couplé à la GFP permettant in vivo de suivre les cellules foxp3 par leur fluorescence verte (Fontenot et al., 2003). Enfin la régulation du gène foxp3 lui même est encore incomplètement connue, cependant le TGFβ a été démontré comme un puissant inducteur de la transcription du gène foxp3 (Marie et al., 2005). 92

94 Rôle de l IL-2 Une des caractéristiques fondamentales des Treg est leur impossibilité à produire de l IL-2 contrairement à la majorité des lymphocytes T. Contrairement aux cellules T naïves, la région proximale promotrice du gène de l IL-2 dans les Treg ne semble pas subir de remodelage de la chromatine après activation par le TCR (Su et al., 2004). L IL-2 est considérée comme une cytokine majeure pour la prolifération et la différenciation des cellules T. C est d ailleurs cette caractéristique qui a conduit à sa découverte et à sa dénomination initiale (facteur de croissance des cellules T-«TCGF-T-Cell Growth Factor») avant le clonage du gène. Cependant, l étude des souris déficientes en IL-2 a remis en question la vision du rôle de l IL-2. En effet, ces souris n ont pas de trouble de différenciation des cellules T. Au contraire, ces souris développent spontanément des maladies inflammatoires dues à une lymphoprolifération fatale avec des composantes auto-immunes (Malek and Bayer, 2004). Par ailleurs, les souris déficientes en récepteur à l IL-2, CD25 ou CD122 développent également de sévères syndromes lymphoprolifératifs (Almeida et al., 2002; Malek et al., 2002 ). Ainsi, ces résultats ont montré que l IL-2 jouait un rôle non redondant dans la régulation de la réponse immune alors que son rôle dans la différenciation et la prolifération lymphocytaire T in vivo pouvait être suppléée par d autres cytokines. Par la suite, il a été montré que le nombre de Treg Foxp3 + était fortement diminué chez les souris déficientes en IL-2 (Antony et al., 2006) et le développement des syndromes auto-immuns pouvait être prévenu par l inoculation de cellules CD4 + CD25 + provenant de souris sauvages. De plus, la déficience en STAT5 α et β, molécules impliquées dans la signalisation de la chaîne β de l IL-2R au noyau, inhibe le développement de Treg Foxp3 +, induisant le développement de maladies auto-immunes et inflammatoires (Burchill et al., 2007 ; Yao et al., 2007). Enfin, l IL-2 est requise pour la stabilité de l expression de Foxp3 et CD25 dans les Treg naturels et augmente leur fonction suppressive, du moins in vitro (Fontenot et al., 2005). Rôle des molécules de co-stimulation La signalisation via le CD28 est critique pour la génération thymique des Treg naturels, ainsi que pour leur renouvellement et leur survie en périphérie. Le nombre de cellules CD4 + CD25 + est considérablement réduit dans le thymus et en périphérie chez les souris déficientes pour le CD28 ou B7 (Salomon et al., 2000 ; Takahashi et al., 2000 ; Tang et al., 2003) ou encore chez des souris traitées par un anticorps dirigé contre les molécules B7 ou par la molécule CTLA-4-Ig (Salomon et al., 2000). La déficience en CD28 ou B7 ou le blocage de B7 peut également affecter l activation des lymphocytes Foxp3 -, donc leur 93

95 production d IL-2 et ainsi réduire le développement de Treg par insuffisance en IL-2 (Tai et al., 2005) (Tang et al., 2003). Un aspect intéressant des ntreg est qu ils expriment de façon constitutive la molécule CTLA-4 alors que les cellules T naïves l expriment uniquement après activation (Read et al., 2000 ; Salomon et al., 2000 ; Takahashi et al., 2000). Ceci soulève la question du rôle de cette molécule dans la fonction régulatrice ntreg. L administration d anticorps monoclonaux contre CTLA-4 à des jeunes souris naïves pendant une période limitée entraîne des maladies auto-immunes similaires à celles produites lors de la déplétion en cellules CD4 + CD25 + sans diminuer le nombre de Treg (Takahashi et al., 2000). Cependant dans ce cas il est difficile de conclure s il s agit d un effet sur les lymphocytes T effecteurs ou sur les Treg eux-mêmes. Par la suite des travaux de Manzotti ont rapporté que le blocage de CTLA-4 inhibait l activité suppressive des Treg humains in vitro (Manzotti et al., 2002) suggérant clairement l implication de CTLA-4 dans la fonction des Treg naturels. Des travaux récents ont confirmé ce rôle clef de CTLA-4. En effet, l inhibition de CTLA-4 spécifiquement dans les cellules Foxp3 chez la souris, conduit à des syndromes lymphoprolifératifs importants et à une diminution de la survie de ces souris (Wing et al., 2008). Ces cellules Foxp3 + CTLA-4 - ont une activité suppressive diminuée. De plus, ces cellules n altèrent pas l expression des molécules de co-stimulation B7 sur les DC comparativement aux cellules Foxp3 + CTLA-4 +. Il semblerait que la molécule CTLA-4 joue un rôle également dans l induction de cellules régulatrices Foxp3 + à partir de cellules CD4 + CD25 -. En effet, l induction de Foxp3 et de l activité suppressive est plus difficile dans des souris déficientes en CTLA-4 suite à une stimulation polyclonale en présence de TGFβ (Zheng et al., 2006). De plus, la surexpression de CTLA-4 dans des lymphocytes T au repos engendre une population avec des propriétés régulatrices semblable à celle des lymphocytes Treg naturels (Zheng et al., 2008). Ces résultats suggèrent que la molécule CTLA-4 sur les Treg pourrait transduire un co-signal qui, en complément de l activation via le TCR, entraînerait l activation d un programme effecteur Treg ou tout simplement que CTLA-4, en liant des ligands sur la cellule cible (soit CPA soit lymphocytes), exercerait une activité inhibitrice sur cette cible. Quoiqu il en soit ces travaux assignent un nouveau rôle à cette molécule qui était considérée jusque récemment comme induisant un signal négatif dans la cellule qui exprimaient CTLA-4. La molécule GITR semble également jouer un rôle dans l activité suppressive des Treg naturels. En effet, l utilisation d un anticorps anti-gitr in vitro inhibe l activité suppressive de ces cellules et le traitement avec ce même anticorps in vivo induit une gastrite auto-immune (Shimizu et al., 2002). Cependant, la fixation sur le GITR exprimé sur les Treg 94

96 CD4 + CD25 + murins préalablement activés par de l anti-cd3 et de l IL-2 n inhibe pas les propriétés suppressives de ces cellules et active les cellules T CD4 + conventionnelles, qui expriment également le GITR et n ont pas d activité suppressive, ce qui suggère que GITR n est pas directement impliqué dans la fonction suppressive (McHugh et al., 2002). Cytokines inhibitrices IL-10 Plusieurs expériences in vivo soutiennent le rôle de l IL-10 dans la suppression par les Treg. Par exemple, l IL-10 est requise pour le contrôle des colites et le maintien de l homéostasie du nombre de cellules T par les Treg. En effet, les cellules CD4 + CD25 + isolée de souris KO pour l IL-10 ne régulent ni les colites ni la prolifération des cellules CD4 + dans les souris RAG-/- (Annacker et al., 2001). De façon similaire, le transfert adoptif de cellules CD4 + CD25 + en parallèle d une greffe de peau allogénique induit la tolérance mais l injection d anticorps anti-il-10 bloquant accélère le rejet du greffon (Kingsley et al., 2002). TGFβ Le TGFβ est une molécule jouant un rôle essentiel dans la tolérance immunitaire. Chez les mammifères, trois isoformes de TGFβ sont dénombrés (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3), le TGF β1 étant le plus exprimé dans le système immunitaire (Govinden and Bhoola, 2003). Le récepteur du TGFβ consiste en un tétramère transmembranaire formé par deux chaînes TGFβRI et deux chaînes TGFβRII (massague, 1998, revue, ann rev biochem, voir pour la ref). L engagement du récepteur par le TGFβ active l activité kinase du récepteur qui va phosphoryler les cibles en aval dont les facteurs de transcription smad, ce qui engendrera leur translocation dans le noyau (Derynck and Zhang, 2003 ; Shi and Massague, 2003). IL-35 L IL-35 est une nouvelle cytokine de la famille des cytokines hétérodimériques de l IL-12. Collison et collaborateurs ont récemment montré que la sous-unité EBI3 était préférentiellement exprimée dans les Treg avec p35 (chaîne α de l IL-12) pour former l hétérodimère IL-35 (Collison, Nature 2007). Le récepteur n est pour l instant pas décrit. Cytolyse La cytolyse par la sécrétion des molécules granzymes a longtemps été associée aux lymphocytes T CD8 + cytotoxiques et aux cellules NK. Cependant, plusieurs lymphocytes T CD4 + possèdent une activité cytolytique. De plus, l activité «tueuse» de cellules Treg a été 95

97 rapportée par le granzyme A et la perforine (Puccetti and Grohmann, 2007). Dans le même sens, la molécule granzyme B serait impliquée et probablement nécessaire in vivo pour la cytolyse réalisée par les Treg de souris (Gondek et al., 2005 ; Zhao et al., 2006) Figure 14 : Différents mécanismes d action des Treg. (Adapté de Vignali, et al, Nat. rev. Immunol., 2008) Action sur les cellules dendritiques Les cellules dendritiques interagissent avec les Treg in vivo (Tang et al., 2006). En effet, après avoir formé des aggrégats autour de la DC, via un mécanisme dépendant de LFA-1 (Onishi et al., 2008), les Treg entraînent de façon spécifique la diminution d expression des molécules CD80 et CD86 mais pas CD40 ou CMH-II dans un phénomène dépendant de CTLA-4 et LFA-1 (Onishi et al., 2008). L interaction des Treg avec les DC altère leur capacité à maintenir une interaction de longue durée avec les cellules T effectrices (Tadokoro et al., 2006): la molécule CTLA-4 semble jouer un rôle dans ce processus (Oderup et al., 2006). Par ailleurs, nous avons vu (paragraphe sur les DC «tolérogène») que les Treg 96

98 peuvent induire l expression d IDO de façon CTLA-4 dépendante dans les DC (Puccetti and Grohmann, 2007). Altération du métabolisme La consommation de l IL-2 locale par les Treg, due entre autres à leur forte expression de CD25, peut induire l apoptose des cellules effectrices. Ce mécanisme anciennement supposé a trouvé des confirmations expérimentales récentes (Pandiyan et al., 2007). D autres mécanismes ont également été décrits récemment comme le relarguage d adénosine (via l expression de CD39 et CD70 par les Treg) (Borsellino et al., 2007; Deaglio et al., 2007 ) et le transfert d AMPc (Adénosine MonoPhosphate cyclique) par les jonctions gap (Bopp et al., 2007). Les lymphocytes T régulateurs chez les mammifères L existence de lymphocytes T régulateurs naturels a été démontrée chez quelques espèces de mammifères principalement dans des modèles d études de transplantation. Ainsi, l existence de lymphocytes Treg naturels a été mis en évidence chez le singe rhésus (Haanstra et al., 2008), chez le babouin (Porter et al., 2007), chez le porc (Kaser et al., 2008) ainsi que chez le chien (Biller et al., 2007). Cependant la caractérisation de ces cellules est pour la plupart à l étape initiale. 5-Le porc comme modèle animal d étude de l allogreffe Le système immunitaire humain est complexe et est exposé à une diversité de conditions environnementales supérieures par rapport à celle des petits animaux de laboratoire car ils vivent dans des conditions exemptes de pathogène. De ce fait, l expérimentation sur les animaux de grande taille a été et reste la meilleure façon d obtenir suffisamment de données avant d initier des essais cliniques humains de conception éthique (Kirk, 2003). L immunologie du porc est de plus en plus connue avec la séquence des gènes impliqués et le dévelopement d outils spécifiques. De plus, la taille de l animal permet d effectuer des prélèvements important sans avoir à sacrifier l animal. Ainsi, il est possible de réaliser des prélèvements consécutifs sur le même animal. Le porc comme modèle préclinique en transplantation Depuis les années 1980, les porcs ont été utilisés comme modèle de greffe allogénique. Les souches de porcs miniatures homozygotes au locus CMH ont été 97

99 développées et croisées pour obtenir une lignée partiellement homogène. Les porcs miniatures SLA d/d, a/a, c/c sont des lignées homozygotes pour le CMH discordant pour les loci de la classe I et II (Gianello et al., 1993). Ces animaux sont le seul modèle de grands animaux dans lequel les effets d'appariement sélectif pour les antigènes CMH reproductible peuvent être étudiés (Gianello et al., 1993). Une greffe de rein de donneur c/c à un receveur d/d traitées par de la Ciclosporine A pendant 12 jours est prolongée dans sa survie mais est généralement rejetée 30 jours après l arrêt du traitement à comparer à 12 jours sans traitement (Rosengard et al., 1992; Sonntag et al., 2001). Cette combinaison d'espèce porcine a été bien étudiée et a fourni des résultats reproductibles. Objectifs de l étude Les cellules dendritiques jouent un rôle central dans le processus de rejet de greffe tout comme dans celui de la tolérance aux allotransplantations. La grande plasticité des DC ouvre un champ d investigation pour une thérapie cellulaire potentielle par des DC protolérogènes afin de moduler la réponse immune. Notre premier objectif a été, dans un premier temps d étudier la réponse proliférative des lymphocytes T, et dans un deuxième temps d explorer l orientation de la réponse allogénique induite par des DC porcines prises à un stade immature ou après activation par différents agents. Dans la mesure où les lymphocytes T régulateurs apparaissent actuellement comme un outil prometteur pour l induction d une tolérance immune spécifique en transplantation, notre deuxième objectif a consisté à : - caractériser la sous population cellulaire T régulatrice naturelle du porc - définir des conditions d induction de cellules régulatrices in vitro. 98

100 MATERIELS ET METHODES DE L ETUDE 99

101 Animaux Les prélèvements sanguins sont réalisés à l INRA de Tours à Nouzilly. Le sang de porc Large White provient d animaux prélevés dans l unité mixte de recherche Physiologie de la Reproduction et des Comportements (Dr. B. Malpaux, Mr. G. Gomot). Par ailleurs, des miniporcs histocompatibles consanguins et homozygotes pour le CMH (miniporc SLA d/d, lignée du «Massachusetts General Hospital») élevés en zone confinée sur la Plateforme d Infectiologie Expérimentale de l INRA (Dr. H. Salmon) sont également utilisés. Les expériences de culture lymphocytaire mixte ont été réalisées entre des cellules dendritiques provenant d un de ces deux groupes et des lymphocytes dérivés de l autre pour s assurer que la réponse soit allogénique. Les stimulations de cellules CD4 + ont été réalisées à partir du sang de porc Large White. Réactifs Les cellules dendritiques ainsi que les lymphocytes ont été cultivées dans du RPMI 1640 (Gibco, Cergy-Pontoise, France) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 50µM de β-mercaptoéthanol ainsi que 50U/mL de pénicilline, 50µg/mL de streptomycine et 2mM de L-glutamine (milieu complet). Le RPMI 1640, la L-glutamine, le β-mercaptoéthanol, le cocktail d antibiotiques pénicilline / streptomycine, le PBS (Phosphate-Buffered Saline), l inhibiteur de p38mapk (SB203580) et le SVF proviennent de chez Gibco (Invitrogen, France). Les cytokines recombinantes porcines utilisées pour la différenciation des monocytes en cellules dendritiques, l IL-4 et le GM-CSF nous ont été gracieusement fournies par Mérial S.AS. (Lyon, France). Les protéines recombinantes porcines IL-2, TNFα, IFNα et le TGFβ recombinant humain proviennent de chez R&D System (Lille, France). Le lipopolysaccharide (LPS; Escherichia coli), la phytohémagglutinine (PHA), le phorbol myristate acétate (PMA), la ionomycine, le CFSE («5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester») et l acide mycophénolique (MPA) ont été obtenus chez Sigma Aldrich Chemical (St Quentin Fallavier, France). La protéine recombinante porcine, l IL-6 provient de chez AbD Serotec (Düsseldorf, Allemagne). La rapamycine a été gracieusement fournie par les laboratoires pharmaceutiques Wyeth. Les cellules L fibroblastiques murines transfectées avec l ADN codant pour le CD40L (L-CD40L) humain ainsi que les cellules L transfectées avec un ADN contrôle (L-orient) ont été gracieusement fournies par le Dr. Julie Déchanet-Merville. 100

102 Isolement des PMBC («Peripheral Blood Mononuclear cells») Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont isolées par séparation sur gradient de densité. Le sang de porc est déposé sur une solution de séparation lymphocytaire (Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norvège) de densité d=1,077 à raison d un volume de sang pour un volume de milieu de séparation. Après une centrifugation de 30 minutes à 1000g l anneau de cellules mononucléées est prélevé et subit 3 lavages successifs avec du RPMI. Les PBMC ainsi isolées sont reprises dans du milieu complet contenant 2,5% SVF pour permettre l adhésion des monocytes. Cellules dendritiques porcines Différenciation des monocytes en cellules dendritiques L isolement des monocytes porcins est réalisé par adhésion sur support plastique. Les PBMC fraîchement isolées sont ensemencées à raison de 150x10 6 / flasque dans des flasques de 150cm 2 dans un volume de 20mL de milieu complet 2,5% SVF. Après une incubation de 30 minutes à 37 C les cellules non adhérentes sont éliminées par tapotements et lavages de la flasque. Les cellules adhérentes sont cultivées dans du milieu complet contenant en présence de 1% d IL-4 et de GM-CSF porcins pendant 6 jours afin de permettre leur différenciation en cellules dendritiques. Maturation des cellules dendritiques Afin d induire la maturation des cellules dendritiques, les DC immatures récupérées après 6 jours de culture sont cultivées pour 48 heures supplémentaires en présence de LPS à 1µg/mL, seul ou en combinaison avec des cytokines inflammatoires : l IFNα (500 U/mL) et le TNFα (20ng/mL). Alternativement, les cellules dendritiques sont stimulées par des cellules fibroblastiques murines (L-CD40L) exprimant la molécule CD40L humaine à raison de 1 cellule L-CD40L pour 3 cellules dendritiques. Pour l analyse de l effet des immunosuppresseurs, les DC immatures sont cultivées avec du CD40L en présence ou non de MPA (100 µm) ou de rapamycine (100 nm) pendant 48h. Microscopie électronique Cette partie du travail a été effectuée en collaboration étroite avec Mme Lebos dans le laboratoire de microscopie du Dr. B. Arbeille de l université de Tours. Les DC, après avoir été cultivées avec ou sans le CD40L pendant 48h, sont récupérées et préparées pour 101

103 l observation par microscopie à balayage. Les conditions physiques de la lecture des images par microscopie électronique à balayage impliquent une préparation préalable des échantillons qui consiste en une fixation pour préserver les structures, une déshydratation suivie d un séchage complet. Enfin l échantillon est couvert d une très fine couche métallique conductrice qui favorise l émission d électrons secondaires et évite les phénomènes de charges susceptibles d altérer l image. La fixation est réalisée par immersion de l échantillon d une durée minimale de deux heures dans une solution de paraformaldéhyde à 4% associé au glutaraldéhyde à 1% en tampon phosphate de sodium 0.1 M ph 7,4. L échantillon est ensuite rincé avec un tampon phosphate 0.15 M ph 7,4 contenant du NaCl 34 mm, puis post-fixé avec une solution de tétroxyde d osmium (OsO 4 ) à 2% dans le tampon phosphate de sodium 0,15M ph 7,4 pendant une heure à l obscurité sous la hotte. Au terme de cette post-fixation, l échantillon est lavé 3 fois en eau PPI (pour préparation injectable), puis déshydraté en bains d acétone de force croissante : 50,70,90 puis 3 bains d acétone absolu. Ensuite, l échantillon est dessiqué par la méthode du point critique utilisant le CO 2. L échantillon est rendu conducteur par métallisation avec du platine par pulvérisation cathodique (la couche déposée est de 5 nm environ). L échantillon ainsi métallisé est observé avec un microscope à balayage doté d un canon à émission de champ (Zeiss Gemini 982). Les images sont numérisées en ligne avec une résolution de 1024x1024 pixels. Analyse de la phosphorylation de p38mapk Les cellules dendritiques immatures (1x10 6 /tube) sont placées au bain-marie à 37 C puis activées par du LPS (1µg/mL) seul ou en combinaison avec du TNFα (20ng/mL) et de l IFNα (500 U/mL) pendant 5, 10, 15, 30 minutes. Les cellules sont ensuite fixées par l ajout de 65µL de formaldehyde à 10% (Polysciences, Eppelheim, Allemagne) pendant 10 minutes puis perméabilisées par une solution de triton X-100 à 0,1% (Pierce distributed by Perbio Science, Brebières, France) pendant 30 minutes. Après centrifugation, les cellules sont resuspendues dans une solution de méthanol à 50% (Prolabo, West Chester, PA, USA) supplémenté en NaCl à 0,9% (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) pendant 10 minutes sur de la glace puis filtrées sur des filtres de nylon de 100µm (SAATI, Sailly- Saillisel, France). Enfin, les cellules sont marquées avec un anticorps anti-phospho-p38mapk couplé au fluorochrome Alexa-647 (clone 36, pt180/y182, IgG1; Becton Dickinson, Grenoble, France) pendant 20 minutes puis analysées par cytométrie en flux (FACSCanto TM ; Becton Dickinson, Grenoble, France). La phosphorylation de p38mapk est représentée par le ratio des intensités moyennes de fluorescences (IMF). Afin 102

104 de déterminer la phosphorylation induite par le stimulus, nous avons calculé la différence (δ) entre le niveau basal d activation de p38mapk et la réponse après stimulation soit δ = (IMF de phospho-p38mapk des cellules dendritiques stimulées / IMF du contrôle isotypique des cellules dendritiques stimulées) - (IMF phospho-p38mapk des cellules dendritiques non stimulées / IMF du contrôle isotypique des cellules dendritiques non stimulées). Pour l inhibition de la protéine p38mapk un inhibiteur spécifique le SB a été ajouté (20µM) lors de la maturation en présence de CD40L. Isolement des lymphocytes Isolement des lymphocytes CD4 + par billes magnétiques Pour l orientation de la réponse immune vers le profil régulateur et Th17 après activation par la PHA, les cellules CD4 + ont été purifiées par sélection positive en utilisant le système d isolement par billes magnétiques commercialisé par Miltenyi (MACS Miltenyi Biotec, France). Suite à leur isolement du sang périphérique, les PBMC sont lavées en PBS et incubées pendant 20 minutes à 4 C sous agitation orbitale en présence d un anticorps anti-cd4 (clone MIL17, AbD Serotec, Allemagne). Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et incubées avec les billes anti-ig de souris (Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads) pendant 15 minutes à 4 C. Après un lavage, le mélange cellules + billes est déposée sur une colonne LS fixée sur un support magnétique. Après plusieurs lavages de la colonne, l élution des cellules positives est réalisée après le retrait de la colonne du support magnétique et éjection mécanique des cellules positives pour le CD4 encore présentes dans la colonne. La vérification de l expression de CD4 après l isolement montre un taux de cellules CD4 + supérieur à 97%. Tri cellulaire par cytométrie en flux Les cellules CD4 + CD25 +, les cellules CD4 + CD25 - ainsi que les lymphocytes T CD4 + (pour l analyse de l orientation de la réponse immune par les cellules dendritiques) ont été triées par cytométrie en flux. Les cellules sont marquées avec des anticorps spécifiques (voir tableau) et sont ensuite triées à l aide d un cytomètre trieur MoFlo haute vitesse (Beckmann Coulter, Fort Collins, CO, USA) équipé d un laser en phase solide opérant à 488nm et 100mW. Les critères morphologiques ont été utilisés pour l élimination des débris et des grandes cellules. La vitesse de tri avoisine cellules par secondes. Ce tri a été réalisé à l INRA de Nouzilly sur le trieur du service commun de cytométrie dirigé par le Dr. D. Kerboeuf. 103

105 Activation lymphocytaire Culture mixte lymphocytaire allogénique (MLR) Suite aux 48h de maturation, les cellules dendritiques sont lavées et distribuées en plaque 96 puits à raison de 2x10 4 cellules par puits. Des PBMC ou des lymphocytes purifiés CD4 + ou encore des PBMC dépourvues de lymphocytes CD4 + d un animal allogénique sont ajoutés aux cellules dendritiques à une concentration de 1x10 5 cellules/puits pour obtenir un ratio d une cellule présentatrice pour 5 cellules répondeuses. La prolifération lymphocytaire est mesurée par incorporation de 1µCi de thymidine tritiée (Amersham Life Science, Angleterre) qui est ajoutée durant les 18 dernières heures de la co-culture. Au bout de 5 jours, les plaques sont filtrées et 25µL de liquide de scintillation (Microscint 0) sont ajoutés dans chaque puits pour permettre la lecture de l incorporation de thymidine tritiée avec un compteur à scintillation (tri-carb 2550 TR/LL, Packard). Les résultats sont exprimés en coups par minute, ce qui permet de quantifier la prolifération en fonction de l intensité des radiations. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± l écart type des valeurs de 3 puits pour les réponses prolifératives des CD4 + purifiées et celle des PBMC dépourvues de cellules CD4 +. La capacité des différentes cellules dendritiques à stimuler la prolifération des PBMC est exprimée à l aide d un index de prolifération calculé de la façon suivante : prolifération des PBMC stimulées par les DC moins la prolifération spontanée des DC divisé par la prolifération spontanée (moyenne cpm) des PBMC. Parallèlement, les cellules dendritiques, activées ou non, sont cultivées avec les lymphocytes allogéniques dans une plaque 24 puits avec un ratio de 1 DC pour 5 lymphocytes pendant 5 jours. Ces cellules serviront pour l analyse du phénotype de surface et pour l extraction d ARNm pour l analyse de l orientation de la réponse. Stimulation polyclonale des lymphocytes CD4 + par la PHA et l IL-2 Les lymphocytes CD4 + totaux purifiés par billes magnétiques ou des cellules CD4 + CD25 - issus du tri cellulaire par cytométrie en flux ont été stimulées à la PHA (10µg/mL) en présence d IL-2 (50U/mL) pendant 5 à 7 jours. Cette stimulation a été réalisée avec de la PHA seule (T-PHA) ou en présence de TGFβ (10ng/mL) (T-TGFβ), de rapamycine (100 nm) (T-Rapa) ou encore d un mélange des deux agents (T-TGFβ+Rapa). Pour certaines expériences l IL-6 recombinante porcine (AbD Serotec, Allemagne) a été ajoutée (20ng/mL) La prolifération est mesurée à l aide d un colorant intra-cellulaire fluorescent : le CFSE. Cette technique a nécessité un certain nombre de mises au point avant d être fonctionnelle. En effet, à partir d une certaine concentration, ce produit devenait cytotoxique pour les cellules en 104

106 division. Les cellules sont d abord lavées en PBS et reprises dans du PBS à raison d 1x10 7 cellules / ml. Le CFSE est ajouté à une concentration finale de 5µM et les cellules sont immédiatement incubées dans un bain-marie à 37 C pendant 10 minutes à l abri de la lumière. La réaction est arrêtée par l ajout de SVF à volume équivalent. Les cellules subissent ensuite 2 lavages en PBS avant d être reprises en milieu de culture complet. Après 5 jours de culture, la prolifération est mesurée par cytométrie en flux. L intensité du marquage cellulaire est divisée par deux à chaque cycle parcouru. Le pourcentage de cellules en cycles ainsi que le nombre de cycles effectués par les cellules peuvent ainsi être analysés. Test de la fonction suppressive L activité suppressive des lymphocytes CD4 + CD25 + circulants a été analysée avec le marquage CFSE. Des PBMC, préalablement marquées au CFSE (voir paragraphe précédent), sont stimulées avec de la PHA (10µg/mL) ou avec une combinaison de PMA (25ng/mL) / ionomycine (250ng/mL) dans une plaque 96 puits à fond rond. Les cellules CD4 + CD25 +, ou CD4 + CD25 - sont ajoutées selon différents ratios en gardant le nombre de cellules répondeuses constant à 7,5x10 4 /puits et en diminuant le nombre de cellules ajoutées. L analyse de la prolifération, par mesure de la décroissance de la fluorescence par cytométrie en flux, est effectuée après 72h de culture. L analyse de la suppression par les cellules CD4 + stimulées à la PHA en présence d IL-2 a été effectuée par la technique d incorporation de la thymidine tritiée (voir ci-haut) ou par la méthode utilisant le CFSE (voir ci-haut). Des PBMC stimulées à la PHA (10µg/mL) servent de population répondeuse indexe. Ces cellules sont incubées en plaque 96 puits à raison de 7,5x10 4 cellules par puits et les lymphocytes T CD4 + dont l activité suppressive est testée sont ajoutés à différents ratios. La mesure de la suppression s effectue après 72h de co-culture. Pour certaines expériences, les cellules T-PHA, T-Rapa, T-TGF ou T-TGF+Rapa ont été irradiées à 16 Gray. Culture à long terme Les cultures à long terme consiste en la culture de 5x10 6 PBMC avec 1x10 6 DC-CD40L (Ly-CD40L) ou DC-MPA (Ly-MPA) allogéniques pendant 4 semaines avec 3 stimulations intermédiaires (à raison d une par semaine) avec le même type de DC. Toutes les DC sont obtenues à partir du même animal donneur. A la fin de la culture, les PBMC issues de la culture à long terme sont ajoutées à une culture mixte lymphocytaire composée de DC- CD40L comme cellules présentatrices stimulantes et de PBMC autologues à celles utilisées pour la culture longue comme cellules répondeuses. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine tritiée après 5 jours de co-culture. 105

107 Cytométrie en flux L analyse des marqueurs de surface est effectuée à partir de 1x10 5 cellules auxquelles les anticorps monoclonaux primaires sont ajoutés (voir tableau I). Ce mélange est incubé dans du PBS pendant 30 min à 4 C. Après un premier lavage dans du PBS, les anticorps secondaires couplés à des fluorochromes, dirigés contre les anticorps primaires, sont ajoutés. Les cellules sont incubées pendant 30 min à 4 C. Après un deuxième lavage en PBS l expression des marqueurs de surface est analysée à l aide d un FACSCanto TM (Becton Dickinson) et les données sont traitées avec le logiciel FACSDiva TM (Becton Dickinson). L expression des molécules CD80/CD86 est étudiée grâce à la protéine de fusion CTLA-4-Ig : un anticorps secondaire anti-ig humaine couplé à la PE est ajouté lors du marquage secondaire. L expression de Foxp3 est mesurée avec une IgG de rat anti-foxp3 de souris (clone FJK16s) ; le marquage est effectué grâce au kit «Foxp3 staining set» (ebioscience, Montrouge, France) selon les recommandations du fournisseur. Tableau I : anticorps utilisés pour l analyse des cellules dendritiques et des lymphocytes porcins par cytométrie en flux Molécule cible Isotype Couplage Clone Fournisseur CD3 IgG2a FITC BB23-8E6-8C8 BD Biosciences CD4a IgG2b - MIL17 AbD Serotec CD4a IgG2b PE BD Biosciences CD8α IgG2a - MIL12 AbD Serotec CD14 IgG2b - MIL2 AbD Serotec CD21 (humain) IgG1 - B-Ly4 BD Biosciences CD25 IgG1 - K231.3B2 AbD Serotec SLA-DR IgG2a h2-18-1, 1F12 BD Biosciences Γδ IgG2a - MAC320 BD Biosciences Foxp3 (souris) IgG2a APC FJK16s ebioscience phospho-p38mapk (humain) IgG1 Alexa /p38, pt180/py182 BD Biosciences Mesure de la sécrétion de cytokines par ELISA La production de cytokines est analysée par ELISA dans le surnageant de culture des cellules dendritiques après 48h de maturation et/ou des lymphocytes activés par stimulation polyclonale. Les surnageants de culture sont prélevés et conservés à -20 C jusqu à leur utilisation pour dosage par ELISA. La concentration de l IL-10 et l IL-12/IL-23p40 porcines est mesurée grâce au système DuoSet commercialisé par R & D Systems (Lille, France) et celle de l IFNγ porcin par l IFNγ module set (Bender MedSystems, Tebu-Bio SA, France) selon les instructions du fournisseur. Les mesures sont effectuées en duplicata pour chaque 106

108 échantillon et révélées par le système avidine-peroxydase. La densité optique est mesurée par un lecteur de plaque ELISA à une longueur d onde de 450nm et la quantification de la concentration de cytokines est réalisée à l aide d une courbe étalon. PCR quantitative Préparation des ARN messagers et des ADN complémentaires Les ARN totaux sont isolés des cellules issues des co-cultures de cellules dendritiques et de lymphocytes CD4 + ainsi que des cultures de stimulation polyclonale de lymphocytes T CD4 +. L extraction d ARN (1x10 6 cellules/extraction) s effectue par l utilisation d une solution de Trizol (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et du RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Les échantillons d ARN sont ensuite traités avec la DNAse I Amp Grade (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) (1 U/µg d ARN). L ARN est quantifié par la détermination de la densité optique à 260nm (DO 260 ) et l analyse de la pureté est calculée par le ratio DO 260 /DO 280. La qualité de l ARN est évaluée plus précisément par électrophorèse capillaire (Agilent 2100 Bioanalyzer). La génération de l ADNc (ADN complémentaire) est réalisée par l incubation de chaque échantillon d ARN (2µg) dans un volume final de 20µL avec 2µL dntp (0,25mM final) (Eurogentec, Liège, Belgium), 1,3 µl oligo dt (133 pmoles/µl) (Eurogentec, Liège, Belgium), 0,8 µl MuMLV reverse transcriptase (25 U/µl) (Eurogentec, Liège, Belgium), 4 µl 5X buffer MuMLV (Eurogentec, Liège, Belgium) et 1,9 µl d eau ultra-pure (Gibco, Paisley, Scotland). La réaction est réalisée pendant 90 min à 37 C puis l enzyme est inactivée par la chaleur à 95 C pendant 5 min. Analyse de l expression de l ARN messager par PCR quantitative (qpcr) Les PCR quantitatives sont réalisées en utilisant les ADNc dilués combinés avec les paires d amorces diluées dans de l eau et le «IQ SYBR Green Supermix» (Bio-Rad, Hercules, CA) selon les recommandations du fournisseur. Les conditions de qpcr sont : 3 min à 95 C, puis 45 cycles comportant 3 étapes : dénaturation 15 secondes à 96 C, hybridation des amorces 30 s à la température d hybridation (tableau II) et une élongation de 30 s à 72 C. Les mesures en temps réel sont effectuées sur un appareil Bio-Rad icycler iq (Bio-Rad, Hercules, CA). La spécificité de la réaction de PCR quantitative est déterminée par l analyse de la courbe de fusion des produits de PCR et la vérification de la taille des amplicons. Les quantités d ARN sont normalisées en utilisant simultanément la moyenne des (Ct) des gènes de ménage Hypoxanthine PhosphoRiblosyl-Transferase 1 (HPRT-1), Ribosomal Protein L 19 (RPL-19), Tata Box Binding Protein (TBP-1). Ils ont été sélectionnés 107

109 comme gènes de référence par leur faible niveau de variation entre les échantillons. Les résultats sont exprimés en valeur relative après analyse avec le logiciel Genex macro (Bio- Rad, Hercules, CA) (Vandesompele et al., 2002). Tableau II : Séquences des amorces, température d hybridation des paires d amorces ( C), tailles des fragments attendus (bp) et numéros d accession. Gènes étudiés Gata-3 HPRT-1 IFNγ IL-2 IL-6 IL-10 IL-13 IL-17A IL-27p28 RORγt RPL19 T-bet TBP-1 TGFβ Séquence des amorces S : CCCGTCCTACTACGGAAAC AS : GTGGTGGATGGACGTCTTG S : GGACTTGAATCATGTTTGTG AS : CAGATGTTTCCAAACTCAAC S : GCTCTGGGAAACTGAATGAC AS : TCTCTGGCCTTGGAACATAG S : GCCATTGCTGCTGGATTTAC AS : CCCTCCAGAGCTTTGAGTTC S : ATCAGGAGACCTGCTTGATG AS : TGGTGGCTTTGTCTGGATTC S : ACCAGATGGGCGACTTGTTG AS : TCTCTGCCTTCGGCATTACG S : GGTGCAGTCTCTGGAACAAC AS : CCATGCTGCCGTTGCATAGG S : CCAGACGGCCCTCAGATTAC AS : CACTTGGCCTCCCAGATCAC S : GCCCGCCACTTTGCTGAATC AS : GGGCGAAGTGTCATGGAGAG S : TTCAGTACGTGGTGGAGTTC AS : TGTGGTTGTCAGCGTTGTAG S : AACTCCCGTCAGCAGATCC AS : AGTACCCTTCCGCTTACCG S : TCAATCCTACTGCCCACTAC AS : TTAGGAGACTCTGGGTGAAC S : AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA AS: AGATGTTCTCAAACGCTTCG S : GAAGCGCATCGAGGCCATTC AS: GGCTCCGGTTCGACACTTTC Température d hybridation ( C) Produit PCR cdna (bp) Numéros d accession BW (Nygard et al., 2007) NM_ NM_ NM_ NM_ NM_ AB BP BP EST AF CJ (Nygard et al., 2007) NM_ Analyse Statistique Les comparaisons statistiques entre les groupes ont été réalisées en utilisant le test Mann-Whitney ou le test- t de student selon les échantillons (ulisation du logiciel GraphPad Prism version 4.03, GraphPad Software Inc., California, USA). Les différences entre les groupes ont été considérées significatives lorsque p<

110 RESULTATS 109

111 A- Caractéristiques des cellules dendritiques porcines avant et après activation par divers agents en présence ou non d immunosuppresseurs. Nous avons vu précédemment (chapitre II) que le rôle des cellules dendritiques est de filtrer les informations provenant de leur environnement pour en extraire les antigènes vis-àvis desquels elles initieront, une fois activées, la réponse immune visant à éliminer le danger ou au contraire participer activement au maintien de la tolérance. Au stade immature de leur développement, les DC agissent comme sentinelles au niveau des tissus périphériques, sondant continuellement l environnement antigénique. Toute rencontre avec certains produits provenant soit de micro-organismes soit de tissus endommagés initie la migration et la maturation des DC vers les organes lymphoïdes secondaire. Lors de ce processus, l antigène capturé dans un contexte identifié par la DC comme «danger» est apprêté pour être présenté par les molécules du CMH s à la surface de la cellule, aux cellules T effectrices. La maturation des DC porcines a été antérieurement rapportée avec le LPS ou une combinaison de LPS avec de l IFNα et du TNFα (Guzylack-Piriou et al., 2006). Cependant à ce jour la maturation par le CD40L n a pas été rapportée chez le porc. Par ailleurs, il a été montré chez l homme et la souris que différents stimuli peuvent influencer non seulement le phénotype des DC mais aussi leur capacité à orienter la réponse des cellules T (Reis e Sousa et al., 2001 ; Vieira et al., 2000). Chez le porc, la capacité des DC à orienter la réponse immune en fonction des agents de maturation a très peu été étudiée. En effet, les études n ont porté principalement que sur la polarisation Th1/Th2 après une exposition à des agents infectieux (Johansson et al., 2003; Raymond and Wilkie, 2004 ). De même, l orientation Th17 n a jamais été rapportée. Dans la première partie de ce travail, nous avons effectué une analyse comparative du phénotype, du profil de sécrétion de cytokines, de la capacité allostimulatrice ainsi que de l orientation de la réponse immune induite par des DC immatures porcines ou des DC stimulées par différents agents. Un spectre couvrant plusieurs voies d induction de la maturation des DC a été utilisé : un produit bactérien (LPS) seul ou en combinaison avec des cytokines pro-inflammatoires (TNFα et IFNα) et soit du CD40L humain. 110

112 I- Etude de la morphologie, du phénotype de surface et des cytokines Changements morphologiques des cellules dendritiques porcines induits par le CD40L Il a déjà été rapporté que le CD40L humain interagissait avec le CD40 de porc (Rushworth et al., 2000). Néanmoins, sa capacité à induire la maturation des DC porcines n a jamais été rapportée. Ainsi nous avons testé la capacité d une lignée de cellules fibroblastiques murines transfectées avec le CD40L humain à activer des DC porcines. (Cellules L-CD40L, procurées par le Dr Déchanet-Merville à Bordeaux). Nous avons dans un premier temps caractérisé par microscopie électronique à balayage les changements morphologiques des DC immatures après 48h de stimulation en présence de cellules L-CD40L (fig. 15). Au grossissement x2000, nous observons que les cellules dendritiques immatures sont isolées les unes des autres tandis que les cellules dendritiques stimulées avec du CD40L sont regroupées en petits amas. De plus, à plus fort grossissement, (x5000), nous voyons que le CD40L induit une augmentation de la taille de la cellule ainsi que la formation d extensions cellulaires. Cette morphologie est proche de celle des DC matures humaines isolées dans notre laboratoire (Lagaraine et al., 2005). Ces résultats suggèrent donc que le CD40L humain induit la maturation des DC porcines. Nous avons ensuite étudié les caractéristiques de cette maturation tant sur le plan phénotypique que fonctionnel. Modification phénotypique des DC porcines après activation par différents agents: expression de novo du CD25. Il a été montré chez l homme que différentes conditions de stimulation des cellules dendritiques influencent leur phénotype (de Jong et al., 2002). Nous avons donc décidé d analyser et de comparer les modifications du phénotype des DC porcines après activation par du CD40L-humain, du LPS seul ou en combinaison avec de l IFNα et du TNFα. Les DC immatures ont été récupérées après 5 jours de différenciation et ensuite cultivées pendant 48h avec les différents agents précédemment cités ou avec les cellules L-orient contrôles (cellules transfectées par un ADN contrôle). L expression des marqueurs de surface CD14, CD80/86, SLA-DR et CD25 a ensuite été analysée par cytométrie en flux. La figure 16 montre que le CD14 est exprimé de façon constitutive sur les DC immatures et que son expression augmente après stimulation quelque soit l agent de maturation utilisé contrairement à ce qui est observé chez l homme. Il est à noter que le petit nombre de cellules CD14 négatives dans la condition 111

113 de maturation avec le CD40L correspond aux cellules L murines résiduelles (résultats non montrés). Le CD40L et l association TNF-LPS-IFN augmentent fortement l expression des molécules de co-stimulation CD80/86 alors que le LPS n a aucun effet sur l expression de ces marqueurs (figure 16A). Par contre, aucun agent utilisé pour la maturation ne modifie l expression de la molécule de classe II SLA-DR. Par ailleurs, notons de façon intéressante que la stimulation avec du LPS ou avec l association TNF-LPS-IFN ou avec du CD40L humain induit l expression du CD25 alors qu il est complètement absent sur les cellules dendritiques immatures. Notons que le CD40L induit le plus fort niveau d expression de CD25 alors que ce niveau est faible en présence de LPS et que la combinaison TNF-LPS-IFN a un effet intermédiaire (fig. 16A). Les cellules contrôles L-orient quant à elles n entraînent l augmentation d aucuns des marqueurs de surface testés (fig. 16B). Enfin, l effet de l addition d IL-2 exogène entraîne une augmentation du pourcentage de cellules CD25 + (50% versus 39%) en présence de CD40L (fig. 16C) suggérant que ce récepteur est fonctionnel sur la DC porcine comme ceci a été rapporté chez l homme (Mnasria et al., 2008). Analyse des cytokines produites : le CD40L et le mélange TNF-LPS-IFN induisent la production d IL-12p40 par les cellules dendritiques Il a été précédemment montré que la synthèse d IL-12 et d IL-10 par les DC est importante pour le devenir de la réponse immune (Kapsenberg, 2003). Nous avons donc analysé et comparé le niveau de synthèse de ces deux cytokines dans les cultures de DC porcines après activation par le CD40L, le LPS seul ou en combinaison avec l IFNα et le TNFα. Le dosage de la production d IL-10 et d IL-12p40 dans les surnageants de culture des DC a été réalisé par ELISA. La figure 17 montre que les DC immatures ne produisent pas de niveau détectable d IL-12p40. A l inverse, le mélange TNF-LPS-IFN et le CD40L induisent tous deux fortement la production d IL-12p40 par les DC alors que de façon surprenante le LPS n induit pas de niveau détectable (fig. 17A). La production d IL-10 est fortement induite par le CD40L tandis que le LPS augmente faiblement cette synthèse et que la combinaison de TNF-LPS-IFN induit un niveau intermédiaire (fig. 17B). Notons que les DC immatures porcines ne produisent pas de niveau détectable d IL-10. Nous avons comparé la production d IL-10 entre les DC humaines et les DC porcines, toutes deux cultivées de façon similaire dans notre laboratoire et nous avons montré que contrairement aux DC porcines, les DC immatures humaines produisent de façon constante de l IL-10 (fig.17c). 112

114 Etude de la phosphorylation de p38mapk par le LPS et le mélange TNF-LPS-IFN Nous venons de montrer que le LPS n induisait ni la synthèse d IL-12p40 ni l augmentation des marqueurs de surface CD80/86 et n augmente que faiblement l expression de CD25 sur les DC à l opposé de ce qu on observe chez l homme (Mnasria et al., 2008). Chez ce dernier, il a été montré que ces paramètres sont sous la dépendance, entre autre, de la phosphorylation de p38mapk (Arrighi et al., 2001). Nous avons donc fait l hypothèse que l absence de modification de ces paramètres en présence de LPS pouvait être liée à l absence de phosphorylation de p38mapk chez le porc. Nous avons ainsi analysé la phosphorylation de p38mapk par cytométrie en flux à l aide d un anticorps monoclonal anti-phosphop38mapk humain. La figure 18A montre que le LPS est capable d induire efficacement la phosphorylation de p38mapk à un niveau et suivant une cinétique similaires à ceux observés chez l homme, (résultats du laboratoire) alors que le mélange TNF-IFN sans LPS n induit qu une faible phosphorylation. Notons également que le LPS induit un niveau similaire de phosphorylation par rapport au mélange TNF-LPS-IFN alors qu il n induit qu une faible expression de CD25 et aucune production d IL-12p40 contrairement à l association TNF-LPS-IFN. De plus, en utilisant un inhibiteur chimique spécifique de p38mapk (SB203580), nous montrons une inhibition de la synthèse d IL-12p40 induite par l association TNF-LPS-IFN (fig. 18B). Ces observations suggèrent que la phosphorylation de p38mapk est impliquée dans la synthèse d IL-12p40 mais qu elle est insuffisante à elle seule. Ces résultats sont en cours d approfondissement notamment afin de déterminer si l inhibiteur chimique de p38mapk que nous avons utilisé inhibe réellement de façon spécifique la phosphorylation de p38mapk chez le porc par la réalisation d une courbe effet dose de cet inhibiteur chez le porc. 113

115 DC-Immature DC-CD40L X 2000 X 5000 Figure 15 : L activation des cellules dendritiques porcines par du CD40L entraîne des modifications morphologiques. Des cellules dendritiques immatures après 5 jours de différenciation ont été cultivées en présence ou non de cellules L exprimant le CD40L humain pour 48h supplémentaires. Les échantillons de cellules dendritiques sont ensuite récupérés et préparés pour l observation au microscope électronique à balayage. 114

116 A CD14 CD80/86 SLA-DR CD25 Immature CD40L LPS TNFα-LPS- IFNα B C 39% CD40L CD40L L-orient CD40L+IL-2 50% CD25 Figure 16 : Caractéristiques phénotypiques des cellules dendritiques stimulées par différents agents maturants. CD25 Les DC-immatures ont été cultivées lors des dernières 48h avec du CD40L, du LPS ou le mélange TNF-IFN-LPS et l expression des marqueurs de surface CD14, CD80/86, SLA-DR et CD25 a été analysé par cytométrie en flux (A). Les histogrammes pleins représentent l expression du marqueur indiqué et les histogrammes vides représentent le marquage avec le contrôle isotypique approprié. B) Comparaison de l expression de CD25 lors de la maturation en présence de cellules L-CD40L ou L-orient (contrôle). C) Expression de CD25 sur des DC traitées pendant 48h avec du CD40L en présence ou non d IL-2 recombinante porcine (200 U/mL). Résulats réprésentatifs de 5 (A), 2 (B et C) expériences. 115

117 A IL-12p40 Concentration concentration d IL-12p40 (pg/ml) Immature CD40L ns LPS TNF+LPS+IFN B Concentration concentration d IL-10 (pg/ml) Immature CD40L IL-10 * LPS * TNF+LPS+IFN C C Concentration d IL-10 (pg/ml) IL-10 DC-immature DC-porcine DC-humaine Figure 17 : Synthèse d IL-12p40 et d IL-10 par les DC porcines activées. Les DC immatures ont été stimulées avec les agents indiqués pendant les dernières 48h de culture. Les surnageants de culture ont été récupérés et les quantités d IL-12p40 (A) et d IL- 10 (B) ont été quantifiées par ELISA. (C) Comparaison de la production d IL-10 par les DC immatures humaines et porcines. Les données sont exprimées en valeur moyenne ± S.E.M. (n = 10 pour l IL-12p40 et n = 6 pour l IL-10). *p = ns : non significatif. 116

118 A Phosphorylation de p38mapk (unité arbitraire) Phosphorylation de p38mapk (unité arbitraire) Temps (minute) TNF+LPS+IFN LPS TNF+IFN+LPS TNF+INF B Concentration d IL-12p40 (pg/ml) DC-TNF+IFN+LPS IL-12p40 DC-TNF+IFN+LPS + SB Temps (minute) Figure 18 : Détection de la phosphorylation de p38mapk dans les cellules dendritiques porcines. A) Les cellules dendritiques immatures sont stimulées par du LPS seul, par la combinaison de TNF+IFN ou encore le mélange TNF+IFN+LPS à différents temps, puis la phosphorylation de p38mapk est déterminée par cytométrie en flux avec un anticorps anti-phosphop38mapk humain. La phosphorylation de p38mapk est exprimée par le rapport δ = (IMF de phospho-p38mapk des cellules dendritiques stimulées / IMF de l isotype contrôle des cellules dendritiques stimulées) - (IMF de phospho-p38mapk des cellules dendritiques non stimulées / IMF de l isotype contrôle des cellules dendritiques non stimulées). B) Effet d un inhibiteur de p38mapk (SB203580) sur la synthèse d IL-12p40 par les DC-TNF+IFN+LPS. Ces résultats sont représentatifs de 3 (A) ou 2 (B) expériences. 117

119 II- Influence des différentes conditions d activation sur la capacité allostimulatrice des cellules dendritiques porcines. Etude quantitative de la capacité allo-stimulatrice des cellules dendritiques porcines L entrée en cycle cellulaire des cellules lymphocytaires allogéniques après stimulation par des DC est une composante importante dans la détermination de la capacité stimulatrice des DC. La capacité à activer les cellules T est une fonction essentielle des DC qui est augmentée par le processus de maturation. Nous avons comparé la capacité des DC porcines à induire la prolifération de lymphocytes porcins allogéniques en fonction des agents de maturation utilisés. La figure 19 montre que tous les agents de maturation utilisés induisent une augmentation significative de la capacité des DC à stimuler la prolifération de PBMC ou de cellules CD4 + purifiées allogéniques comparativement aux DC immatures. Cependant, le traitement des DC par l association TNF-LPS-IFN induit la plus forte augmentation de la capacité stimulatrice (fig. 19 A et B), alors que de façon intéressante seule les DC stimulées par CD40L sont capables d induire la prolifération des PBMC dépourvues de cellules CD4 + (fig. 19C). Notons également que les cellules CD4 - obtenues après un tri par cytométrie en flux contiennent des lymphocytes B, des lymphocytes γδ, des cellules NK et des lymphocytes CD8 simple-positifs. Analyse phénotypique des lymphocytes porcins après stimulation par des DC allogéniques Outre l entrée en cycle cellulaire des cellules lymphocytaires allogéniques après stimulation par des DC, nous nous sommes intéressés à l analyse de certains marqueurs de surface afin de mieux caractériser les cellules qui ont été activées par les différentes populations de DC. Chez le porc, peu d anticorps sont disponibles pour l analyse de l expression des marqueurs d activation lymphocytaire, nous avons donc essentiellement analysé l expression de CD25. De plus, nous avons aussi analysé les marqueurs CD4, CD8, γδ et CD21. Ces marqueurs ont été analysés à J0, puis après 5 jours de co-culture entre des PBMC totaux ou des cellules CD4 + triées par cytométrie en flux ou les cellules de la fraction négative (PBMC dépourvues de CD4 + ) activées soit par des DC immatures soit par des DC pré-activées avec le CD40L, le LPS ou la combinaison TNF-LPS-IFN. Au repos (J0), 118

120 l analyse de l expression des molécules CD4 et CD8 (fig. 20A) montre qu il existe dans le sang périphérique chez le porc 4 populations lymphocytaires différentes selon l expression de ces molécules : CD4 - CD8 -, CD4 + CD8 -, CD4 - CD8 + et une population CD4 + CD8 +. La fraction de cellules exprimant la molécule CD8, plus importante que celle exprimant le CD4 (34% vs 12%), contient une population avec une forte expression de CD8 high et une autre avec une expression intermédiaire CD8 int. Ce niveau d expression de CD8 est équivalent à celui des cellules double-positives CD4/CD8. Les cellules du sang périphérique contiennent également environ 20% de lymphocytes γδ et 5% de cellules positives pour le CD21 (lymphocytes B) (fig. 20B). Environ 5% des PBMC expriment la molécule CD25 (fig. 20A). Par ailleurs, la figure 19A montre que le pourcentage de cellules CD25 + après activation des PBMC s échelonne entre 27% et 37% après 5 jours de culture comparativement aux 5% à J0. Il est a noté que les DC traitées par le mélange TNF-LPS-IFN induisent constamment le plus fort pourcentage de cellules CD25 + en accord avec les résultats de l étude de la prolifération rapportés plus haut. L analyse de l activation des PBMC non fractionnées (fig. 20A) montre des caractéristiques phénotypiques manifestement différentes en fonction du type d activation des DC. Les DC-CD40L activent de façon préférentielle les cellules CD4 négatives (parmi les cellules activées 80% n expriment pas le CD4 et 66% sont CD8 + ). Environ 40% des cellules activées par les DC-CD40L sont CD8 simple-positives et 40% sont double-négatives (ni CD4 ni CD8) incluant probablement des lymphocytes T (CD8 et γδ), des cellules NK et des lymphocytes B. En effet, nous voyons que le pourcentage de lymphocytes B (CD21 + ) et de lymphocytes γδ après 5 jours de culture augmente en présence de DC-CD40L (fig. 20B). A l opposé, les DC-LPS et les DC-TNF-LPS-IFN activent préférentiellement les cellules CD4 + (60 à 70% des cellules activées expriment le CD4) et la quasi-totalité de ces cellules expriment également le CD8 (90%) (fig. 20A). Par conséquent, peu de cellules activées par les DC-TNF-LPS-IFN ne sont double-négatives CD4/CD8 (fig. 20A). Notons également que parmi les cellules activées presque toutes les CD4 + sont aussi CD8 (fig. 20A). Par ailleurs, bien qu elles soient de faibles inductrices de la prolifération, les DC immatures ont entraîné l apparition du CD25 sur une fraction significative des PBMC (27 %) (fig. 20A). En utilisant des cellules CD4 + sélectionnées positivement comme cellules répondeuses (fig. 21A), nous avons constaté que les DC-TNF-LPS-IFN étaient aussi les meilleures inductrices de l expression de CD25 (56% des cellules CD4 + dans cette condition), tandis qu'ils représentent seulement 30%, 43% et 41% lorsque les DC immatures, CD40L ou LPS ont été utilisées comme stimulatrices respectivement. Par ailleurs, nous observons parmi les 119

121 cellules CD25 + que le niveau d expression est nettement plus élevé après activation par des DC-TNF-LPS-IFN (fig. 21A). De plus, la majorité des cellules T activées (CD25 + ) expriment la molécule CD8 après 5 jours de culture (fig. 21A), suggérant que les cellules CD4 + ont acquis le marqueur CD8 pendant l'activation allogénique. Nous nous sommes également intéressés à l analyse de la capacité des différents types de DC à activer des cellules lymphocytaires en absence de cellules CD4 + auxiliaires dans des MLR de 5 jours (fig. 21B). Nous montrons que l expression de CD25 est beaucoup plus faible (8 à 20% des cellules expriment le CD25) et que seules les DC-CD40L sont capable d activer de façon significative les cellules CD8 + en absence de cellules CD4 + (14% de cellules CD8 + CD25 + versus 5% dans les autres conditions). En résumé, les DC-TNF-LPS-IFN stimulent essentiellement des lymphocytes T CD4 + (qui vont acquérir le CD8 pendant l activation) mais n activent pas les cellules CD8 + simple positives alors que les DC-CD40L sont capables d activer à la fois les cellules CD4 et CD8 simple-positives. 120

122 MLR allogénique avec des PBMC ** ** A 12 ns * Index de prolifération B Incorporation de [3H] T- cpm DC-Immature DC-Immature MLR allogénique avec des cellules CD4 + purifiées DC-CD40L DC-LPS DC-CD40L Figure 19 : Comparaison de la prolifération de lymphocytes porcins par des DC allogéniques maturées par différents agents. 0 DC-TNF+LPS+IFN Incorporation de [3H] T - cpm MLR allogénique avec des PBMC dépourvues de cellules CD PBMC ou cellules CD4 + purifiées ou PBMC dépourvus de CD4 + sont cultivés pendant 5 jours avec 2x10 4 DC indiquées (axe des x). La prolifération a été mesurée par l incorporation de thymidine tritiée. La prolifération des PBMC est exprimée par un index de prolifération calculé ainsi: prolifération des PBMC stimulées par les DC - la prolifération des DC seules divisé par la prolifération spontanée des PBMC (A). La prolifération des CD4 + (B) et des PBMC dépourvues de cellules CD4 + (C) est exprimée en cpm (moyenne ± SEM de culture en triplicat). Les résultats sont représentatifs de 3 expériences. L analyse statistique de la prolifération des PBMC en réponse aux DC a été réalisée avec un test t de student. (* p=0.03, ** p<0.003). C DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN DC-Immature DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN 121

123 A J0 PBMC Non stimulés J5 de la co-culture des DC avec des PBMC allogéniques DC-Immature DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN 2,3% 3,5% 13% 14% 27% 8% 9% 19% 11% 26% CD8 CD25 CD25 CD4 14% 3,5% 2,1% 37% CD8 34% 6% 16% 7% 22% 27% 23% 17% 14% 21% CD4 11% 23% 7% 22% 25% 27% CD8 36% 9% 23% 23% 6% 23% 18% 32% 21% 28% 48% 12% 14% 13% 17% 16% CD4 Répartition des cellules CD25 + CD4 31% 38% 47% 13% 21% 50% 22% 61% CD8 12% 7% 16% 11% CD4 B γδ 20 % DC-Immature DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN 10% 25% 12% 17% CD21 5 % 9% 19% 11% 11% Figure 20 : Analyse phénotypique des PBMC après leur activation par des DC allogéniques. Des PBMC ont été cultivées avec des DC activées de façon différente et une analyse en immunofluorescence utilisant 3 couleurs a été réalisée avec les anticorps anti-cd4, CD8 et CD25 à J0 et à J5 de la co-culture (A). Les marqueurs γδ et CD21 ont aussi été analysées par cytométrie en flux (B). Les résulats sont représentatifs de 3 expériences. 122

124 A Cellules répondeuses: CD4 + isolées positivement DC-Immature DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN 30% 43% 41% 56% CD25 CD25 CD4 60% 66% 63% 72% CD8 CD4 4% 30% 4% 38% 4% 36% 4% 50% 28% 26% 25% 20% CD8 B Cellules répondeuses= PBMC dépourvues de cellules CD4 + DC-Immature DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+IFN 3% 5% 6% 14% 3% 5% 2% 6% CD25 61% 64% 63% 61% CD8 Figure 21 : Analyse phénotypique des lymphocytes CD4 + ou de PBMC dépourvues de cellules CD4 + après leur activation par des DC allogéniques. Des cellules CD4 + (A) ou des PBMC dépourvues de cellules CD4 + (B) ont été cultivés avec des DC activées de façon différente et une analyse en immunofluorescence utilisant 3 couleurs a été réalisée avec les anticorps anti-cd4, CD8 et CD25 à J5 de la co-culture. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences. 123

125 III-Effet des immunosuppresseurs sur les cellules dendritiques porcines Les effets sur le système immunitaire des immunosuppresseurs utilisés en transplantation ont été initialement étudiés sur les lymphocytes. Cependant, ces dernières années, l influence de certains immunosuppresseurs sur les cellules dendritiques a été décrite chez l homme et la souris (Hackstein and Thomson, 2004). Toutefois, aucune étude n a mis en évidence l effet des immunosuppresseurs sur les DC porcines. Effet de l acide mycophénolique sur les capacités allostimulatrices des cellules dendritiques Nous avons fait une étude préliminaire sur l effet de l acide mycophénolique (MPA) sur les propriétés allo-stimulatrices des DC. Pour étudier l influence du MPA sur les DC porcines, les DC immatures ont été activées avec du CD40L (DC-CD40L) seul ou en présence de MPA (100µM) (DC-MPA). Les cellules dendritiques maturées en présence de MPA montrent une plus faible expression de CD80/86 et de CD25 (fig. 22A), ainsi qu une diminution de la production d IL-12p40 en comparaison avec les DC-CD40L (fig. 22B). De plus, la figure 22C, montre que les DC-MPA ont une faible activité allostimulatrice comparées aux DC-CD40L. Un protocole de culture à long terme avec stimulations intermédiaires répétées a été mis au point au laboratoire chez l homme pour l étude de l induction de lymphocytes T régulateurs par des DC-MPA (Lagaraine et al., 2008). Ce protocole a été transposé aux cellules porcines en utilisant des DC-CD40L ou DC-MPA comme stimulatrices de PBMC. Les premiers résultats nous indiquent que les PBMC cultivées pendant 4 semaines avec des DC-MPA avec 3 stimulations intermédiaires, suppriment une MLR allogénique de PBMC stimulées par des DC matures. A l opposé, les PBMC stimulées avec des DC-CD40L pendant 4 semaines selon le même protocole n ont pas d activité suppressive (fig. 22D). Effet de la rapamycine sur la maturation et l activation des cellules dendritiques Nous avons réalisé une autre étude préliminaire sur l effet de la rapamycine sur la maturation des DC porcines. Pour évaluer cet effet, des DC immatures ont été cultivées avec du CD40L (DC-CD40L) seul ou en présence de rapamycine (100nM) (DC-Rapa) pendant 48h. D après la figure 23A, la rapamycine ne modifie pas l expression du marqueur de 124

126 maturation CD25 mais diminue légèrement l expression de CD80/86. De façon inattendue, la rapamycine entraîne une augmentation de la synthèse d IL-12p40 par les DC stimulées par le CD40L (1526 versus 3774 pg/ml) (fig. 23B) ainsi qu une diminution de la synthèse d IL-10 (578 versus 354 pg/ml). Ces résultats préliminaires doivent être complétés par l analyse de la capacité allostimulatrice de ces DC-Rapa et du rôle joué par la modulation de la synthèse de cytokines dans l orientation de la réponse immune. IV-Orientation de la réponse immune par les cellules dendritiques Le processus de maturation des DC implique non seulement l augmentation de molécules de co-stimulation ainsi que l optimisation de la capacité de présentation de l antigène mais également la production de cytokines et de chimiokines influençant fortement le devenir de la réponse T par la polarisation de la réponse immune T vers les profils effecteurs Th1, Th2, Th17. De plus, il a été montré chez l homme et les rongeurs que différents types d activation des DC peuvent orienter la réponse vers Th1, Th2, Th17 ou même Treg (Khayrullina et al., 2008; Langenkamp et al., 2000; Macatonia et al., 1995; Moser and Murphy, 2000; Whelan et al., 2000; Yamazaki et al., 2006) et que cette orientation est cruciale pour obtenir une réponse immune adaptée contre différents antigènes (pathogènes, auto-antigènes, allo-antigènes, antigènes alimentaires) (Pulendran et al., 2001). Nous avons ainsi décidé d analyser comment divers agents activateurs des cellules dendritiques influençaient l orientation de cette réponse chez le porc. Pour ce faire, des échantillons d ARNm ont été extraits à partir de 1x10 6 cellules issues de 5 jours de co-culture entre des DC et des cellules CD4 + allogéniques purifiées par tri cellulaire. L expression des ARNm pour l IFNγ, T-bet (facteur de transcription associé à Th1), l IL-13, GATA-3 (facteur de transcription associé à Th2) et l IL-17 (associé à Th17) a été quantifiée par PCR quantitative afin de comparer l orientation donnée par des DC immatures ou activées par le LPS, le CD40L ou la combinaison TNF-LPS-IFN. La quantité d ARNm pour chaque gène a été normalisée avec le gène de référence RPL19. Pour un ARNm déterminé, la valeur 1 pour chaque gène est donnée arbitrairement à la plus faible expression au sein d une même expérience. Ainsi, nous montrons que dans les MLR allogéniques les DC immatures induisent l expression la plus importante de GATA-3 et le plus faible niveau de transcrits de T-bet (fig 24), suggérant une réponse de type Th2. L inverse est observé avec des DC-CD40L suggérant dans ce cas une réponse de type Th1 qui est confirmée par la forte expression des transcrits d IFNγ et la faible synthèse de ceux de 125

127 l IL-13 et de GATA-3. Ces résultats par ailleurs confirment l existence d une balance entre Th1 et Th2 chez le porc. De façon étonnante, les DC activées par le mélange TNF-LPS-IFN augmentent l expression des ARNm de l IFNγ et de T-bet mais à un niveau inférieur à celui induit par le CD40L (fig 24). En revanche, ni les DC-TNF-LPS-IFN ni les DC-CD40L n activent la transcription de l ARNm de l IL-13 (fig 24). Notons que le transcrit de l IL-17 est surexprimé en présence des DC-LPS et DC-TNF-LPS-IFN alors que le niveau est le plus bas pour les DC-CD40L (fig 24). Ce résultat suggère donc que le LPS ainsi que l association TNF-LPS-IFN confèrent aux DC la capacité d orienter la réponse T vers Th17. L ensemble de ces résultats indique que différentes conditions d activation affectent la capacité des DC à orienter la réponse 126

128 A DC-CD40L DC-MPA CD80-86 CD25 B Concentration d IL-12p40 (pg/ml) DC-CD40L IL-12p40 DC-MPA C Incorporation de [ 3 H]T (cpm) Prolifération des PBMC DC-CD40L DC-MPA D Incorporation de [ 3 H]T (cpm) DC+R DC+R+ Ly-CD40L Test de suppression DC+R+ Ly-MPA Figure 22 : Effet de l acide mycophénolique sur la fonctionnalité des cellules dendriques porcines. A) analyse en cytométrie en flux de l expression de CD80/86 et de CD25 par les cellules dendritiques maturées avec du CD40L en présence ou non de MPA (100µM). Les histogrammes pleins représentent l expression du marqueur indiqué et les histogrammes vides représentent le marquage avec le contrôle isotypique approprié. B) Sécrétion d IL-12p40 mesurée par ELISA dans le surnageant de culture des DC stimulées pendant 48h par du CD40L avec ou sans MPA. C) 2x10 4 DC-CD40L ou DC-MPA ont été cultivées avec 1x10 5 PBMC allogéniques en plaque 96 puits. La prolifération des PBMC est mesurée par incorporation de thymidine après 5 jours de culture. Les résultats exprimés en cpm représentent la moyenne ±/- écart type des triplicatas. D) Des PBMC ont été stimulées pendant 4 semaines avec des DC-CD40L (Ly-CD40L) ou des DC-MPA (Ly-MPA) et ont ensuite été ajoutés sur une MLR constituté de PBMC répondeurs (R) stimulé par des DC matures. La prolifération des PBMC est mesurée par incorporation de thymidine après 5 jours de culture. Les résultats exprimés en cpm représentent la moyenne ±/- écart type des triplicatas. 127

129 A DC-CD40L CD25 35% CD80/86 DC-Rapa 36% B Concentration d IL-12p40 (pg/ml) DC-CD40L IL-12p40 DC-Rapa Concentration d IL-12p40 (pg/ml) DC-CD40L IL-10 DC-Rapa Figure 23 : Effet de la rapamycine sur le phénotype et la production de cytokines des cellules dendritiques porcines. Des DC immatures porcines ont été stimulées avec du CD40L en présence ou non de rapamycine (100 nm) pendant les dernières 48h. A) L expression du CD25 et des molécules CD80/86 a été analysée par cytométrie en flux. Les histogrammes pleins représentent l expression du marqueur indiqué et les histogrammes vides représentent le marquage avec le contrôle isotypique approprié. B) Les surnageants de culture ont été récupérés et les quantités d IL-10 et d IL-12p40 produites ont été mesurées par ELISA. Ces résultats sont représentatifs de 4 expériences. 128

130 Expression relative d'arnm DC-immature DC-CD40L IFNγ DC-LPS DC-TNF+LPS+INF Expression relative d'arnm DC-immature DC-CD40L T-bet DC-LPS DC-TNF+LPS+INF Expression relative d'arnm DC-immature IL-13 IL-13 DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+INF Expression relative d'arnm DC-immature GATA-3 DC-CD40L DC-LPS DC-TNF+LPS+INF Expression relative d'arnm DC-immature DC-CD40L IL-17A DC-LPS DC-TNF+LPS+INF Figure 24 : Analyse de l orientation des cellules T auxiliaires par les DC porcines. Les différentes cellules dendritiques ont été cultivées avec des lymphocytes T CD4 + allogéniques purifiés par tri cellulaire et l ARNm a été extrait après 5 jours de co-culture. L expression des gènes de cytokines (IFN, IL-13 et IL-17) ainsi que de facteurs de transcriptions (T-bet et GATA-3) a été analysée par PCR quantitative. La quantité d ARNm pour chaque gène a été normalisée avec le gène de référence RPL19. Pour un ARNm déterminé, la valeur 1 pour chaque gène est donnée arbitrairement à la plus faible expression au sein d une même expérience. Ces résultats sont représentatifs de 2 expériences. 129

131 B- Exploration de la réponse immune T régulatrice et Th17 chez le porc. Comme nous l avons souligné précédemment au moins 4 voies de différenciation des lymphocytes T CD4 + ont été identifiées chez l homme et les rongeurs : Th1, Th2, Th17 et Treg avec des propriétés immunologiques très différentes. Notre projet à moyen terme étant de favoriser la voie de différenciation vers Treg, nous nous sommes particulièrement intéressés aux 2 dernières voies dans la mesure où les différenciations Th17 et Treg entretiennent des liens étroits (Awasthi et al., 2008; Bettelli et al., 2006 ). Les Treg sont d importantes cellules connues pour réguler l'auto-immunité (Sakaguchi et al., 1995) et l'immunité contre les allogreffes (Graca et al., 2002 ; Qin et al., 1993). Ces cellules ont d'abord été isolées et caractérisées chez les rongeurs (Sakaguchi et al., 1995), puis chez l'homme (Thornton and Shevach, 1998). Deux types de Treg ont été identifiés : les Treg naturels (Ng et al., 2001) et les Treg induits (également appelée adaptatif) (von Herrath and Harrison, 2003). Chez le porc, Kaser et collaborateurs ont mis en évidence une population de lymphocytes CD4 + CD25 + naturels (Kaser et al., 2008). Cependant, la caractérisation de ces cellules est encore restreinte et aucune n étude n a mis en évidence l induction de Treg. La voie de différenciation Th17 a récemment été proposée comme sous-population distincte (Harrington et al., 2005; Park et al., 2005 ) et caractérise des cellules T CD4 + produisant beaucoup d IL-17 et pouvant être impliquées dans la protection contre les infections par des certains pathogènes et dans l inflammation ainsi que dans des maladies autoimmunes (Bettelli et al., 2008). A ce jour, aucune étude n a été rapportée caractérisant la population Th17 chez le porc. Dans cette deuxième partie du travail, nous avons mis en évidence et caractérisé la population de cellules T régulatrices naturelles porcines après avoir isolée la population de cellules CD4 + CD25 + du sang périphérique. D autre part, nous avons étudié l orientation de la réponse immune après activation polyclonale en présence d un agent immunosuppresseur et de cytokines connus chez l homme et la souris pour influencer la différenciation lymphocytaire. 130

132 I- Caractérisation des lymphocytes T régulateurs naturels porcins Répartition des cellules CD25 + et Foxp3 dans les lymphocytes circulants Les cellules du sang périphérique exprimant les molécules CD4 et CD25 constituent environ 5 à 10% des cellules CD4 + chez l homme et la souris (Sakaguchi et al., 1995 ; Stephens et al., 2001). Afin d évaluer la proportion de ces cellules dans le sang périphérique du porc un double marquage CD4/CD25 a été effectué. La figure 25A montre la répartition des cellules CD25 + dans les PBMC porcins. Toutes les cellules CD25 + dans les PBMC expriment la molécule CD3 et une majorité des cellules CD25 + expriment la molécule CD4 (60%) dont les 2/3 sont également CD8 +. Notons qu environ 30% des cellules CD25 + n expriment ni le CD4 ni le CD8 (fig. 25A). Par ailleurs, environ 50% des cellules CD25 + expriment également la molécule SLA-DR. La proportion de cellules CD4 + CD25 + représentent environ 3 et 5% des PBMC soit environ 10-15% des CD4 +. Le facteur de transcription Foxp3 est exprimé par les lymphocytes Treg naturels chez l homme et la souris (Fontenot et al., 2003 ; Roncador et al., 2005). Chez le porc, actuellement aucun anticorps spécifique de l espèce porcine n est commercialisé. Nous avons donc testé un anticorps dirigé contre la molécule Foxp3 murine. Environ 2-3% des PBMC expriment Foxp3 et toutes celles-ci expriment aussi le CD25 (fig. 25B). De plus, la majorité des cellules Foxp3 + expriment le CD4 ou le CD8 ou les deux : 1/4 sont CD8 + CD4 -, 1/3 sont CD4 + CD8 + et 40% sont CD4 + CD8 -. Par ailleurs, environ 40% des cellules Foxp3 + expriment SLA-DR (fig. 25B). Afin de mieux caractériser les cellules CD4 + CD25 +, un tri cellulaire à partir de ces deux marqueurs a été réalisé par cytométrie en flux. Les cellules CD4 + CD25 + expriment Foxp3 alors que les CD4 + CD25 - ne l expriment pas confirmant les résultats obtenus chez l homme et la souris (fig. 25C). Mise en évidence de la fonction régulatrice des lymphocytes T CD4 + CD25 + circulants Avec l expression de Foxp3, l activité suppressive est une autre caractéristique majeure décrite pour les cellules régulatrices naturelles CD4 + CD25 +. Pour évaluer cette fonctionnalité chez le porc, nous avons ajouté ces cellules triées à une culture de PBMC stimulées de manière polyclonale. Les PBMC (servant de cellules répondeuses indexes) ont été marquées au CFSE et stimulées par des agents mitogènes (PHA ou combinaison 131

133 PMA/ionomycine) en présence des cellules CD4 + CD25 + ou de CD4 + CD25 - issues du tri (ratio 1:1) puis la prolifération a été mesurée par cytométrie en flux après 72h de culture. Les résultats de la figure 26A montrent que les cellules CD4 + CD25 + diminuent le pourcentage de cellules en cycle en présence de PHA contrairement au CD4 + CD25 - (47% versus 66%). Cependant, notons que les cellules CD25 + n empêchent pas l entrée en cycle des cellules répondeuses (fig. 26A). Toutefois, le pourcentage de cellules répondeuses ayant parcouru au moins deux cycles est nettement diminué par l ajout de cellules CD25 + comparé à l effet des CD25 - (40% versus 75% dans l expérience de la figure 26B). Nous avons donc choisi cet index pour mesurer l activité suppressive des cellules dans la suite de notre travail. De plus, la suppression est dépendante de la quantité de cellules CD4 + CD25 + ajoutées : à partir d un ratio d une cellule régulatrice pour dix cellules répondeuses nous n observons plus l inhibition de la prolifération induite par la PHA ou la PMA/ionomycine (fig. 26B). L ensemble de ces résultats indique l existence d une population de cellules régulatrices naturelles (ntreg) chez le porc capable d empêcher la pleine expansion des cellules répondeuses sans toutefois bloquer en les cellules en phase Go/G1 du cycle. Capacité proliférative des Treg naturels du porc après stimulation par des agents mitogènes Après avoir mis en évidence la population de lymphocytes ntreg, nous nous sommes intéressés à leur capacité proliférative. Suite au tri cellulaire, les cellules CD4 + CD25 + ou CD25 - sont stimulées pendant 72h en présence d agents mitogènes. La prolifération est évaluée par incorporation de thymidine tritiée ainsi que par le marquage CFSE analysé par cytométrie en flux. Les cellules CD4 + CD25 + prolifèrent suite à la stimulation par la PHA avec 50% de cellules en cycles ce qui est légèrement moins important que les 65% pour les CD4 + CD25 - (fig. 27A). Lors de la stimulation par PMA-ionomycine, les cellules CD4 + CD25 + ont également une capacité proliférative plus faible (49% versus 75% de cellules en cycle) (fig. 27A). Les résultats de prolifération mesurée par l incorporation de thymidine tritiée sont corrélés avec ceux obtenus par cytométrie en flux (fig. 27B). Par ailleurs, l ajout d IL-2 augmente la prolifération des lymphocytes Treg naturels (9000 à cpm) (fig. 27B). De façon intéressante, des résultats préliminaires nous indiquent que l expression de Foxp3 par les cellules Treg naturelles est maintenue voire même augmentée en présence de PMAionomycine (fig. 27C). 132

134 A Expression de CD25 dans les PBMC 0,4 5,9 2,2 4,5 2,3 3,7 2,7 3,3 9, ,4 48,5 CD4 CD8 SLA-DR Répartition des cellules CD CD Expression de Foxp3 dans les PBMC CD4 0,5 2,2 0,8 1,5 1,3 1,4 1,4 0,9 Foxp3 94,3 3 53,7 43, ,7 CD25 CD4 Répartition des cellules Foxp3+ CD8 SLA-DR CD CD4 Marquage Foxp3 après tri cellulaire des cellules CD4 + CD25 high et des CD4 + CD25 - CD25 CD25 CD3 B 7 21 C CD4 + CD25 + CD4 + CD25 - CD4 Foxp3 Figure 25 : Répartition des marqueurs CD25 et Foxp3 dans les PBMC porcins. Les PBMC ont été isolées du sang de porc et le phénotype des cellules CD25 + (A) et Foxp3 + (B) a été analysée par cytométrie de flux. Les PBMC ont été marquées avec des anticorps spécifiques des molécules membranaires CD3, CD4, CD8, SLA-DR, CD25 et de la molécule Foxp3 par marquage intracellulaire. C) Analyse de l expression de Foxp3 dans les cellules CD4 + CD25 + (histogramme rouge) et CD4 + CD25 - (histogramme gris) après tri cellulaire. 133

135 A 80% 47% PBMC PHA PBMC PHA +CD4 + CD25 + Ajout de CD4 + CD % 66% PBMC PHA PBMC PHA +CD4 + CD25 - Ajout de CD4 + CD25 - CFSE % de prolifération par rapport aux PBMC PHA B PBMC PHA Stimulation PHA 1:1 2:1 10:1 1:1 CD4 + CD25 + CD4 + CD25 - % de prolifération par rapport aux PBMC PMA/iono PBMC PMA/iono Stimulation PMA/ionomycine 1:1 2:1 10:1 1:1 CD4 + CD25 + CD4 + CD25 - Figure 26 : Mise en évidence du phénomène de lymphocytes T régulateurs naturels chez le porc. Les cellules CD4 + CD25 + ainsi que les cellules CD4 + CD25 - ont été triées par cytométrie en flux et ajoutées à une stimulation de PBMC (préalablement marquées au CFSE) avec de la PHA pendant 72h. A) Analyse de la prolifération par cytométrie en flux. Les histogrammes vides représentent la prolifération indexe des PBMC stimulées à la PHA (PBMC PHA ) et les histogrammes pleins représentent la prolifération des PBMC PHA en présence de cellules CD4 + CD25 + (rouge) ou de CD4 + CD25 - (gris). B) Les cellules CD4 + CD25 + ont été ajoutées à différents ratios sur une stimulation de PBMC à la PHA ou PMA+ionomycine. La prolifération en présence des populations triées est normalisée sur la prolifération de la population répondeuse PBMC PHA (=100%) sur le critère du pourcentage de cellules ayant fait 2 cycles et plus. Les résultats sont représentatifs de 2 expériences 134

136 A PHA PMA/iono Prolifération CD4 + CD25 + CD4 + CD25-50% 64% 49% 75% CFSE CFSE B Incorporation de [3H] T- cpm Non stimulé Prolifération des cellules CD4 + CD25 + PHA PHA +IL-2 PMA /iono PMA /iono +IL-2 C Expression de Foxp3 avant et après stimulation par PMA/ionomycine J0 J3 Foxp3 Figure 27 : Capacité proliférative des T régulateurs naturels après stimulation par des agents mitogènes. A) Les cellules CD4 + CD25 + et CD4 + CD25 - ont été triées par cytométrie en flux, marqué au CFSE avant d être cultivées pendant 72h en présence de PHA ou de PMA/ionomycine. La prolifération est analysée par cytométrie en flux. B A) Les cellules CD4 + CD25 + ont été triées par cytométrie en flux avant d être cultivées pendant 72h en présence de PHA ou de PMA/ionomycine avec ou sans IL-2. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine. C) Analyse de l expression de Foxp3 en cytométrie en flux sur les cellules CD4 + CD25 + avant (histograme rouge) et après (histogramme plein) stimulation par la PMA/ionomycine. 135

137 II- Orientation de la réponse immune vers la régulation par activation polyclonale de lymphocytes CD4 + en présence de TGFβ et de rapamycine La proportion de lymphocytes T régulateurs naturels est très faible et malgré les tentatives d expansion in vitro, le nombre reste encore insuffisant pour une injection dans un gros animal tel que le porc. Ainsi explorer les possibilités de différencier des lymphocytes Treg induits à partir de cellules CD4 +, semble plus adéquat pour une thérapie cellulaire et de plus cette voie permettrait de générer des lymphocytes Treg spécifiques des antigènes allogéniques exprimés par un greffon. Il a été montré que le TGFβ associé avec une stimulation du TCR peut induire des lymphocytes T régulateurs exprimant Foxp3 chez l homme et la souris (Chen et al., 2003 ; Yamagiwa et al., 2001). La stimulation du TCR du lymphocyte T peut être engendrée par une stimulation antigénique spécifique ou par une stimulation polyclonale. La non disponibilité des anticorps anti-cd28 et les difficultés d obtention d un anticorps anti-cd3 activateur pouvant mimer les deux signaux d activation T, a orienté notre choix pour une stimulation par des agents mitogènes. Nous avons observé que l association de PMA couplé à un ionophore de calcium (ionomycine) entrâine une forte activation induisant une mort cellulaire trop importante. Ainsi afin de mimer une activation polyclonale dépendante du TCR sans recourir à des anticorps monoclonaux, nous avons choisi d utiliser la PHA couplé à l IL-2 sur des cellules CD4 + purifiées. Durant cette stimulation, les effets du TGFβ et de la rapamycine ont été analysés. Effet du TGFβ et de la rapamycine sur la prolifération induite par la PHA Des cellules CD4 + ont été purifiées par billes magnétiques avec un taux de pureté supérieur à 97%. L activation de ces cellules a été réalisée de façon polyclonale par la PHA (10µg/mL) en combinaison avec de l IL-2 recombinante porcine (50U/mL) en présence ou non de rapamycine (100 nm), de TGFβ (20ng/mL) ou la combinaison des deux. Dans un premier temps, pour étudier la prolifération induite par cette stimulation, les cellules CD4 + ont été préalablement marquées au CFSE avant la stimulation et la prolifération a été analysée après 5 jours de culture par cytométrie en flux. Les cellules CD4 + stimulées de façon polyclonale prolifèrent et les cellules en cycle expriment le marqueur d activation CD25 (fig. 28). La rapamycine inhibe la prolifération induite par la PHA (50% de cellules en cycle par rapport à 82%) sans modifier l expression du CD25 (fig. 28). Le TGFβ diminue aussi la 136

138 prolifération qui se traduit surtout par un plus petit nombre de cycles effectués (les T-TGFβ ne parcourent pas plus de 3 cycles comparativement à 5 pour les T-PHA) (fig. 28), alors que la combinaison de ces deux agents entraîne une très forte inhibition de la prolifération (fig. 28). Enfin, notons que l inhibition de la prolifération ne coïncide pas avec une diminution de l expression du CD25 dans aucune condition. Induction de l expression de Foxp3 par le TGFβ Après avoir observé que le TGFβ et la rapamycine influaient sur la prolifération des cellules stimulées par la PHA, nous avons voulu savoir si cette modulation de l activation polyclonale pouvait induire des cellules T régulatrices. Les cellules CD4 + ont été stimulées pendant 7 jours par la PHA et de l IL-2 en présence de rapamycine, de TGFβ ou de la combinaison des deux. La stimulation PHA n induit pas l expression de Foxp3, 15% des cellules expriment la molécule Foxp3 après PHA (fig. 29A), ce qui est très similaire au pourcentage initial dans la population CD4 +. De même, la rapamycine en présence de PHA n a pas d effet direct sur l expression de Foxp3 (fig. 29A). Lorsque le TGFβ est ajouté à la stimulation polyclonale nous obtenons 55% de cellules double-positives CD25 + et Foxp3 + (fig. 29A). La rapamycine n empêche pas l induction de l expression de Foxp3 par le TGFβ avec 59% de cellules Foxp3 + (fig. 29A). Il est également à noter que toutes les cellules Foxp3 + sont positives pour le CD25 dans les 4 conditions. Afin de déterminer comment évolue l expression de Foxp3 lors du cycle cellulaire, nous avons analysé ce marqueur dans des cultures de cellules CD4 + préalablement marquées par le CFSE et activées pendant 5 jours avec la PHA et de l IL-2 en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou encore d un mélange des deux. Lors de la stimulation PHA avec l IL-2, environ 10% des cellules en cycle expriment Foxp3 et cette proportion n est pas affectée par l ajout de rapamycine (fig. 29B). A l opposé, l ajout de TGFβ en présence ou non de rapamycine augmente fortement cette fraction (environ 50%) (fig. 29B). L ajout de la rapamycine au TGFβ diminue fortement le pourcentage de cellules Foxp3 + en cycle par rapport au TGFβ seul (22% versus 36%). Nous pouvons voir que toutes les cellules qui expriment Foxp3 expriment également le CD25 à un haut niveau (fig. 29). A l inverse, une partie importante des cellules CD25 + n exprime pas Foxp3. Ces dernières pourraient correspondre aux cellules T activées conventionnelles dont le pourcentage varie en fonction des conditions d activation : après PHA (avec ou sans rapamycine) environ 80% de cellules CD25 + contre 40% en cas d activation en présence TGFβ (fig. 29). De plus, bien que la stimulation par la PHA seule ou 137

139 en présence de TGFβ induise un nombre similaire de cellules en cycle (environ 75%), ces cellules prolifératives possèdent des caractéristiques très différentes comme en témoigne le niveau variable d expression de Foxp3 (seulement 12% pour l activation PHA seule contre 50% en présence de TGFβ) (fig. 29). Afin d évaluer précisément le nombre de cellules Foxp3 + induit par les différentes conditions d activation cellulaire, nous avons rapporté le pourcentage de cellules Foxp3 + au nombre absolu de cellules obtenues par millions de cellules mises en culture (fig. 30). A partir de 1x10 6 de cellules CD4 + au départ nous obtenons avec le TGFβ environ 0,35x10 6 de cellules exprimant Foxp3 comparativement à 0,12x10 6 avec la PHA seule (fig. 30). La rapamycine avec le TGFβ diminue légèrement (0,29x10 6 ) le nombre de cellules Foxp3 + obtenues. L ensemble de ses résultats suggère donc que l activation par la PHA seule induit la croissance préférentielle de lymphocytes T non régulateurs, alors que l association de TGFβ et de PHA induit l apparition d un nombre important de cellules Foxp3 + en cycle cellulaire, évoquant un phénotype régulateur qui doit cependant être contrôlé par des études d inhibition de la prolifération. Augmentation de CD25 et de SLA-DR par la PHA : effet de la rapamycine et du TGFβ Pour mieux caractériser les cellules après stimulation par la PHA en présence d IL-2, nous avons étudié l expression des marqueurs de surface CD25 et SLA-DR après 7 jours de culture. Nous avons vu précédemment que l activation polyclonale entraînait l expression du CD25 sur les cellules en cycle et nous montrons que l ajout de rapamycine ou de TGFβ engendre une augmentation de l intensité d expression du CD25 (fig. 31A). La molécule de CMH de classe II, SLA-DR, a été montrée comme étant exprimée sur certains lymphocytes T porcins après activation mais le rôle de cette expression sur des lymphocytes T n est pas défini. Nous avons ainsi voulu étudier l expression de cette molécule de classe II dans notre modèle d activation. La stimulation par la PHA/IL-2 entraîne une expression de SLA-DR sur environ 50% des cellules et l ajout de rapamycine ou de TGFβ porte cette expression à 74% et 87% respectivement (fig. 31A). L ajout de la combinaison de ces deux agents agit en synergie avec une expression de 92% et une intensité moyenne de fluorescence (IMF) par cellule positive nettement plus élevée que sur les cellules SLA-DR + induite par la PHA (IMF= pour T-TGFβ+Rapa versus pour T-PHA. Par ailleurs, 138

140 un double marquage Foxp3/SLA-DR montre que toutes les cellules Foxp3 + sont SLA-DR + (fig. 31B). Activité suppressive des lymphocytes T CD4 + en présence de TGFβ et de rapamycine La méthode depuis longtemps utilisée pour les mesures de prolifération cellulaire est la technique utilisant l incorporation de thymidine tritiée. Dans un premier temps, nous avons étudié l activité suppressive des cellules CD4 + activées par la PHA après 7 jours de culture avec cette méthode. Des PBMC stimulées de façon polyclonale servent de population cible de la suppression à laquelle sont ajoutées les cellules CD4 + pendant 72h. La thymidine tritiée est ajoutée pour les dernières 18h de culture. La figure 32A montre qu aucune suppression de la prolifération n est visible malgré la forte expression de Foxp3 dans les conditions avec du TGFβ. De plus, les cellules T CD4 + qu elles soient pré-stimulées par de la PHA avec ou sans TGFβ incorporent la thymidine tritiée à un haut niveau ( et cpm, respectivement) après une re-stimulation par la PHA (fig. 32B). Cette prolifération perturbe ainsi les possibilités d observer la réponse des PBMC servant d index pour évaluer la suppression (PBMC répondeurs). Par cette technique, il est par ailleurs impossible de savoir la distribution de l expression de Foxp3 parmi les cellules qui ont incorporé la thymidine. Toutefois, en se reportant à la figure 29 présentée précédement, concernant une activation primaire par la PHA et le TGFβ, nous pouvons estimer qu une fraction importante (environ 50%) des cellules ayant incorporé la thymidine tritiée expriment Foxp3 dans la condition T-TGFβ bien qu il s agisse ici d une réactivation secondaire. Ainsi, ces résultats nous indiquent que la méthodologie par l incorporation de thymidine ne permet pas de répondre à nos questions. Pour palier ce problème d évaluation de la suppression, nous nous sommes tournés à nouveau vers le colorant intracellulaire fluorescent, le CFSE permettant de suivre la prolifération d une population préalablement marquée. Ainsi, les PBMC servant d index pour la lecture de la suppression (PBMC répondeurs) ont été marqués au CFSE et cultivés en présence des lymphocytes T CD4 issus des cultures de 7 jours en présence de PHA (T-PHA) associée ou non au TGFβ (T-TGFβ) plus ou moins la rapamycine (T-Rapa). Au bout de 72h de culture, la dilution du marqueur CFSE est étudiée par cytométrie en flux. De façon surprenante, nous pouvons voir que les cellules CD4 +, quelque soit les conditions de préactivation entraînent une forte suppression de la prolifération de la population indexe de PBMC (seulement 15% des cellules ont parcouru au moins un cycle contre plus de 75% dans 139

141 la population indexe sans ajout de cellules) (fig. 33A). Nous avons testé l hypothèse de la présence de facteurs suppresseurs solubles induits par l activation. Cependant, rappelons que nous avons lavé plusieurs fois les cellules avant de les mettre en culture avec les PBMC indexes. Nous avons donc testé les surnageants dilués provenant des cultures après la première stimulation et nous avons vérifié que leur ajout sur des PBMC indexes avec de la PHA n induisait aucune inhibition de la prolifération (fig. 33B). Ceci suggère que l implication d un facteur soluble est peu probable. Nous avons aussi émis l hypothèse d une suppression non spécifique indirecte liée à la compétition pour l entrée en cycle cellulaire. En effet, nous avons vu que les cellules pré-stimulées que ce soit les T-PHA, les T-Rapa ou les T-TGFβ sont capables de proliférer assez fortement après une re-stimulation (fig. 32B), ces cellules pourraient donc entrer en compétition pour la progression dans le cycle cellulaire avec les PBMC indexes. Pour empêcher les cellules T CD4 + de proliférer après la re-stimulation lors du test de suppression, nous avons irradié (16 gy) ces cellules avant de les ajouter aux PBMC répondeurs. La figure 33C montre qu il n y a plus de suppression dans la condition T-PHA lorsque ceux-ci sont irradiés alors que les T-Rapa et les T-TGFβ restent suppresseurs. La plus forte inhibition de la prolifération étant obtenue par l ajout de T-TGFβ+Rapa (fig. 33C). Afin de comparer l activité suppressive des différentes populations de cellules nous avons effectué des expériences avec différents ratios. En gardant le nombre de répondeurs constant à 7,5x10 4 cellules nous avons ajouté 7,5x10 4 (ratio 1:1), 1,5x10 4 (ratio 1:5) ou 7,5x10 3 (ratio 1:10) de cellules T. La figure 34 montre que la suppression est dépendante du nombre de cellules ajoutées. Au ratio 1:10, seules les cellules T-TGFβ+Rapa ont encore un effet suppresseur détectable qui est à peu près équivalent aux cellules T-TGFβ au ratio 1:1. Ceci suggère que l activation en présence de TGFβ et de rapamycine induit une population cellulaire dont le potentiel suppresseur est 10 fois plus élevé que celui des T-TGFβ. Effet de la rapamycine et du TGFβ sur la stimulation de lymphocytes CD4 + CD25- par de la PHA et de l IL-2. Nous avons vu que le TGFβ pouvait induire l expression de Foxp3 et en présence de rapamycine induire une population régulatrice à partir de lymphocytes CD4 + totaux. Nous avons étudié les mêmes paramètres à partir d une population dépourvue de cellules Treg naturelles (CD4 + CD25 - triées par cytométrie en flux). Nous présentons dans ce travail des résultats préliminaires concernant cette étude. Les résultats de la figure 35, représentant une expérience montre que les cellules CD4 + CD25 - prolifèrent suite à une stimulation polyclonale 140

142 PHA/IL-2. L étude de l expression de Foxp3 lors de l analyse de la prolifération montre que tout comme pour les CD4 + totaux, le TGFβ induit l expression de Foxp3 dans une proportion similaire (entre 35 et 45%) (fig. 35A). Cependant, nous observons sur cette expérience que l induction de Foxp3 est moins importante dans la condition TGF+Rapa à partir de CD4 + CD25 -. L analyse du phénotype des cellules CD4 + CD25 - stimulées par la PHA avec le TGFβ et la rapamycine montre que l expression de CD25 est aussi augmentée par le TGFβ et la rapamycine (fig. 35B) de même que l expression de SLA-DR. La molécule CD8 est exprimée sur les cellules CD4 + suite à l activation par la PHA (fig. 35B) mais cette expression varie peu en fonction des conditions. Ces résultats préliminaires semblent indiquer qu une population régulatrice induite puisse émerger à partir d une population CD4 + CD25 - foxp3 - Cette étude doit être complétée par l étude de l activité suppressive de ces cellules. III- Modulation de l orientation Th17 par l IL-6 et la rapamycine Nous venons de montrer que l activation en présence de TGFβ+rapamycine induit une population cellulaire dont le potentiel suppresseur est 10 fois plus élevé que celui de la population induite en présence de TGFβ. Or, chez l homme et la souris, il a été montré que le TGFβ, dans certaines conditions pouvait orienter vers la voie effectrice Th17 (Bettelli et al., 2006 ; Manel et al., 2008). Nous avons donc émis l hypothèse qu un niveau différent d activité Th17 induit au sein des populations cellulaires générées pouvait être un facteur expliquant le différentiel de capacité suppressive. Ainsi, nous avons analysé l effet de chacun de ces 2 agents sur la polarisation de la réponse immune chez le porc par une activation polyclonale PHA et IL2. De plus, afin d analyser comment un environnement inflammatoire influençait l effet du TGFβ et de la rapamycine, nous avons ajouté de l IL6 et analyser son effet sur la polarisation. L offre d anticorps monoclonaux chez le porc restant encore peu diversifiée nous avons donc choisi d étudier essentiellement l expression des ARN messagers pour certains facteurs de transcription et cytokines. Les cellules CD4 + ont été activées avec de la PHA et de l IL-2 pendant 7 jours avec et sans TGFβ et/ou rapamycine et/ou IL-6 et l analyse de l expression des ARNm de plusieurs cytokines (IL-17, TGFβ, IL-10, IL-13, IL-6, IL-2, IL-27) et de facteur de transcription (RORγt, GATA-3, T-bet) a été effectuée par RT-PCR quantitative. Les quantités d ARNm pour chaque gène ont été normalisées avec 3 gènes de référence (HPRT-1, RPL19, TBP-1) selon la méthode décrite dans la section matériels et méthodes. L expression des résultats pour les ARNm est présentée de façon relative à la 141

143 condition T-PHA (fig 36 et37). La synthèse d IFNγ a également été mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (fig. 37). Le TGFβ semble avoir peu d effet sur l expression des messagers pour les facteurs de transcription T-bet et Gata-3 (fig. 36). Nous pouvons, en revanche, observer que le TGFβ en présence de PHA stimule l expression des ARNm de l IL-17, IL-10, IL-6 et du facteur de transcription RORγt (fig. 36). L expression de l ARNm de l IL-13 est fortement diminuée et la production d IFNγ est très faible (fig. 36 et 37), supportant une inhibition de l orientation Th2 et Th1 alors que l augmentation de l IL-17 et de RORγt laisse supposer une orientation vers le profil Th17. D autre part, la forte stimulation de l expression de foxp3 induit par le TGFβ démontré précédemment (fig. 29) suggère l existence de liens unissant la différenciation Th17 et Treg chez le porc. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que l ajout d IL-6 au TGFβ induit une augmentation de l expression des ARNm d IL-17 et de RORγt par rapport au TGFβ seul (fig. 37). Ceci suggère que l IL-6 porcine renforce l action du TGFβ vers l orientation Th17. D autre part, cette augmentation de l expression de RORγt suggère que ce facteur, à l instar de la souris, est impliqué dans la différenciation Th17 chez le porc. Nous avons vu que l activation par PHA en présence de TGFβ induisait simultanément la synthèse de l ARNm de l IL-17 et l expression de Foxp3 et que cette population cellulaire avait une capacité suppressive. Néanmoins, l ajout de rapamycine au TGFβ génère des populations cellulaires dont le potentiel suppresseur est environ 10 fois supérieur (fig. 34). Pour expliquer cette observation, nous avons émis l hypothèse que la rapamycine pourrait inhiber l orientation vers Th17 sans altérer l induction de Foxp3 par le TGFβ. La figure 37 montre que l ajout de la rapamycine au TGFβ lors de la stimulation PHA des cellules CD4 + entraîne une nette inhibition de l expression de l ARNm de l IL-17 même en présence d IL-6. Ce qui suggère que la rapamycine garde son effet inhibiteur sur la synthèse d IL-17 dans un environnement riche en substances pro-inflammatoires comme l IL-6. Notons par ailleurs, que la rapamycine est sans effet sur l expression de l ARNm de RORγt (fig. 37) suggérant que l inhibition passe par un effet sur une autre cible moléculaire. Par ailleurs, nous avons montré précédemment que la rapamycine n avait aucune action antagoniste sur l induction de Foxp3 par le TGFβ (fig. 29) et que l activation des T par la PHA en présence de rapamycine n induit pas d expression significative de Foxp3 (fig. 29). Ainsi, l induction de cellules régulatrices ne paraît donc pas être due à l action directe de la rapamycine sur Foxp3. Son action favorable semble donc être indirecte. Son antagonisme au développement Th17 pourrait, en partie, expliquer la plus forte capacité suppressive des T induits en présence de 142

144 rapamycine. Il faut observer que les effets de la rapamycine semblent complexes puisque dans un environnement dénué de TGFβ la rapamycine augmente la synthèse d IFNγ (fig. 37) induite par la PHA et est sans effet sur celle d IL-2 ce qui suggère que la rapamycine dans ce contexte renforcerait la réponse Th1. 143

145 T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-Rapa+TGFβ CFSE CD25 CFSE Figure 28 : Activation et prolifération induite par la stimulation PHA en présence d IL- 2 et d agents immunomodulants. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été préalablement marquées au CFSE ont été stimulées avec de la PHA et de l IL-2 (50U/mL) soit seul (T-PHA) soit en présence de TGFβ (20ng/mL) (T-TGFβ), de rapamycine (100nM) (T-Rapa) ou de la combinaison des deux (T-TGFβ+Rapa). Après 5 jours de culture, les cellules sont récupérées et la prolifération est analysée par cytométrie en flux. L expression de CD25 a aussi été analysée avec le marquage CFSE. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences. 144

146 A T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-Rapa+TGFβ Foxp CD25 B T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-Rapa+TGFβ Foxp CFSE Figure 29 : Induction de l expression de Foxp3 par le TGFβ Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par de la PHA et de l IL-2 (50 U/mL) en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou de la combinaison des deux. (A) Analyse de l expression de Foxp3 et de CD25 après 7 jours de culture. (B) Analyse de la prolifération avec marquage CFSE préalable des cellules CD4 + et analyse de l expression de Foxp3. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences. 145

147 A % de cellules Foxp % de cellules Foxp3 après 7 jours de culture des CD4 + B Nombre de cellules Foxp3+/millions de CD4initial Nombre de cellules Foxp3 + / million de CD4 initial 0 T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ +Rapa 0 T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ +Rapa Figure 30 : Pourcentage et nombre de cellules exprimant Foxp3. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par de la PHA et de l IL-2 (50 U/mL) en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou la combinaison des deux. A) Pourcentage de cellules Foxp3 + exprimé selon les différentes conditions (moyenne et écart type de 4 expériences). B) Nombre absolu de cellules Foxp3 + par million de cellules CD4 + mis en culture au départ. Le calcul du nombre de cellules Foxp3 + a été effectué à partir du nombre total de cellules à la fin de la culture (J7) et rapporté par million de cellules mises au départ (moyenne et écart type de 4 expériences). 146

148 A CD25 T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa 86% 95% 95% 97% SLA-DR 50% 74% 87% 92% B T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa Foxp SLA-DR Figure 31 : Le TGFβ et la rapamycine augmentent l expression de CD25 et de SLA-DR. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par la PHA et de l IL-2 en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou de la combinaison des deux. L expression de CD25 et de SLA-DR (A) et le double marquage Foxp3/SLA-DR (B) ont été ensuite analysés sur ces cellules après 7 jours de culture. Les histogrammes pleins représentent l expression du marqueur indiqué et les histogrammes vides représentent le marquage avec le contrôle isotypique approprié. Ces résultats sont représentatifs de 4 expériences. 147

149 A Incorporation de [3H] T- cpm Test de la fonction suppressive par incorporation de thymidine tritiée PBMC PHA B Incorporation de [3H] T- cpm Prolifération après re-stimulation par PHA Non stimulés PHA T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-PHA T-Rapa T-TGFβ Figure 32 : Analyse de la fonction suppressive et de la prolifération des cellules T CD4 + après culture en présence de TGFβ et de rapamycine. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par de la PHA et de l IL- 2 pendant 7 jours en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou un mélange des deux. A) Les cellules CD4 + ont été ajoutées à la fin de la culture à une stimulation de PBMC préalablement stimulés par de la PHA pendant 72h. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine tritiée. B) Les cellules CD4 + après 7 jours de culture ont été récupérées et re-stimulées par de la PHA pendant 72h. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine pendant les dernières 18h de la co-culture. La prolifération des PBMC (A) et des cellules CD4 + (B) est exprimée en cpm (moyenne ± SEM de culture en triplicat). 148

150 A PBMC PHA B PBMC PHA 83% Cellules ajoutées (non irradiées): CFSE T-PHA T-Rapa T-TGFβ PBMC PHA + CFSE 81% CFSE CFSE CFSE Surnageant T-PHA CFSE C PBMC PHA Cellules ajoutées (irradiées): CFSE T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa CFSE CFSE CFSE CFSE % de cellules 2 cycles et Sans irradiation 0 PBMC PHA T-PHA T-Rapa T-TGF T-TGFβ +Rapa % de cellules 2 cycles et Avec irradiation 0 PBMC PHA T-PHA T-Rapa T-TGF T-TGFβ +Rapa Figure 33 : Analyse de la fonction suppressive des cellules T CD4 + après culture en présence de TGFβ et de rapamycine. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par de la PHA et de l IL- 2 pendant 7 jours en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou un mélange des deux. (A) Les cellules CD4 + ont été ajoutées à la fin de la culture à une stimulation de PBMC préalablement marqués au CFSE et stimulés par de la PHA pendant 72h. La prolifération est analysée par cytométrie en flux. B) Le surnageant de culture des cellules T-PHA a été ajouté à la stimulation de PBMC à la PHA (dilution au ½). C) Les CD4 + ont été irradiés avant d être ajoutés au PBMC CFSE +. Analyse comparative du pourcentage de cellules répondeuses ayant fait 2 cycles et plus en présence de cellules CD4 + irradiées ou non (C). Le pourcentage est normalisé sur la prolifération de la population indexe. 149

151 100 % de cellules 2 cycles et PBMC PHA T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa 1 T : 1 PBMC 1 T : 5 PBMC 1 T : 10 PBMC Figure 34 : L activité suppressive est dépendante du nombre du ratio T : PBMC. Des cellules CD4 + ont été stimulées par de la PHA et de l IL-2 pendant 7 jours. Les cellules CD4 + à la fin de la culture ont été irradiées et ajoutées à une stimulation de PBMC préalablement marquées au CFSE et stimulés par de la PHA pendant 72h selon différents ratio CD4 + /répondeurs en gardant le nombre de cellules répondeuses constant. Les résultats sont exprimés en % de cellules ayant fait 2 cycles et plus normalisés sur la prolifération de la population index-pbmc PHA. 150

152 A T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-Rapa+TGFβ Foxp CFSE B T-PHA T-Rapa T-TGFβ 87% 84% 95% T-Rapa+TGFβ 88% SLA-DR CD25 54% 60% 82% 70% CD8 69% 55% 62% 62% Figure 35 : Effet du TGFβ et la rapamycine sur l activation de cellules CD4 + CD25 - par la PHA. Des cellules CD4 + CD25 - issues du tri cellulaire ont été stimulées par de la PHA et de l IL-2 (50U/mL) en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou de la combinaison des deux. A) l analyse combinée de la prolifération et de l expression de Foxp3 est réalisée par cytométrie en flux après 5 jours de culture. B) L expression de CD25 et de SLA-DR est analysée après 7 jours de culture. Les histogrammes pleins représentent l expression du marqueur indiqué et les histogrammes vides représentent le marquage avec le contrôle isotypique approprié. 151

153 16.0 Expression relative d ARNm IL-17 TGFβ IL-10 IL-13 IL-6 IL-2 IL-27 RORγt Gata-3 T-bet Figure 36 : Modulation par le TGFβ de l orientation de la réponse immune induite par la PHA et l IL-2. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par de la PHA (10µg/mL) et de l IL-2 (50U/mL) en présence ou non de TGFβ. L ARNm des cellules T-PHA et T-TGFβ a été extrait à la fin de 7 jours de culture et l expression des différents gènes a été analysée par PCR quantitative. La quantité d ARNm pour chaque gène a été normalisée avec 3 gènes de références (HPRT-1, RPL19, TBP-1). L histogramme représente l expression relative d ARNm extrait des cellules T-TGFβ par rapport aux cellules T-PHA. (Moyenne de 3 expériences +/- écart type). 152

154 12 IL-17A (ARNm) 25 RORγt (ARNm) Expression relative d ARNm T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa T-TGFβ+IL-6 T-TGFβ+IL-6+Rapa Expression relative d ARNm T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa T-TGFβ+IL-6 T-TGFβ+IL-6+Rapa 20 IL-10 (ARNm) 1000 IFNγ (ELISA) Expression relative d ARNm T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa T-TGFβ+IL-6 T-TGFβ+IL-6+Rapa Concentration d IFNγ (pg/ml) T-PHA T-Rapa T-TGFβ T-TGFβ+Rapa T-TGFβ+IL-6 T-TGFβ+IL-6+Rapa Figure 37 : Modulation de l orientation de la réponse immune par le TGFβ et la rapamycine. Des cellules CD4 + purifiées par billes magnétiques ont été stimulées par la PHA (10µg/mL) et de l IL-2 (50U/mL) en présence ou non de TGFβ, de rapamycine ou de la combinaison des deux, en présence ou non d IL-6 recombinante porcine (20ng/mL). L ARNm a été extrait pour chaque condition après 7 jours de culture et l expression des différents gènes a été analysée par PCR quantitative. Pour chaque échantillon, la quantité d ARNm a été normalisée avec 3 gènes de références (HPRT-1, RPL19, TBP-1). Les histogrammes représentent l expression relative d ARNm extrait des cellules des différentes conditions par rapport aux cellules T-PHA (Moyenne de 3 expériences +/- écart type). La production d IFNγ a été mesurée par dosage ELISA dans les surnageants de culture des cellules CD4 + (Moyenne de 3 expériences +/- écart type). 153

155 DISCUSSION 154

156 Ce travail s intègre dans un projet de recherche plus vaste qui vise à explorer les possibilités de modulation de la réponse allogénique telles que les thérapies cellulaires en transplantation. En effet, étant donné les difficultés de transposition des résultats obtenus sur les souris vers la transplantation clinique, la possibilité de valider ces hypothèses dans un modèle préclinique de transplantation rénale chez le gros animal et plus particulièrement chez le porc, pourrait s avérer à l avenir dès plus pertinent. Il a été suggéré dans le passé que la réponse immune de type Th1 et Th2 était initiée par différentes sous populations de cellules dendritiques avec des capacités intrinsèques différentes (Moser and Murphy, 2000; Rissoan et al., 1999). Cette hypothèse a récemment été remise en cause par des études montrant qu une population de cellules dendritiques donnée est capable d orienter différentes réponses T effectrices en fonction des stimuli de maturation (de Jong et al., 2002; Manickasingham et al., 2003; Vieira et al., 2000) soutenant l idée que la polarisation de la réponse T effectrice par les DC repose plutôt sur le type d activation des DC. Cependant l influence des conditions de maturation des cellules dendritiques sur leur capacité orienter les cellules T allogéniques a été rarement étudiée chez le porc, de plus la maturation des cellules dendritiques induite par le CD40L n a jamais été analysée. Nous avons caractérisé l effet de l interaction CD40-CD40L sur l activation des DC porcines ainsi que sur leurs fonctions en comparaison avec une activation par le LPS (TLR4- ligand) seul ou en combinaison avec des cytokines inflammatoires, l IFNα et le TNFα. En utilisant la microscopie électronique, nous avons d abord montré que la molécule CD40L humaine induit de profonds changements dans la morphologie des DC porcines se traduisant par l augmentation de leur taille et l apparition de longues dendrites caractéristiques des DC matures. Ces observations sont en accord et prolongent des résultats obtenus dans d autres modèles expérimentaux montrant que le CD40L humain peut interagir avec le CD40 sur l endothélium vasculaire porcin (Choi et al., 2008). Les agents maturants utilisés entraînent une augmentation de l expression des molécules de co-stimulation CD80/86 ce qui a également été rapporté dans d autres études (Bimczok et al., 2007; Flores-Mendoza et al., 2008). Par contre, les variations d expression de SLA-DR après activation chez le porc reste controversée, certains auteurs ont rapporté une augmentation de son expression en réponse au LPS (Carrasco et al., 2004; Flores-Mendoza et al., 2008) alors que d autres n ont vu aucune augmentation (Guzylack-Piriou et al., 2006). L ensemble de ces résultats suggèrent que l augmentation de SLA-DR n est peut être pas un marqueur de maturation pertinent. 155

157 En revanche, nos résultats sur l expression de CD25 sont intéressants au moins à deux titres. Tout d abord comme marqueur, l absence totale d expression du CD25 sur les DC immatures fait de lui un excellent candidat pour discriminer les DC immatures et matures. D autre part, sur le plan physiologique, cette stricte induction observée en réponse à un signal de maturation nous amène à nous poser la question du rôle de la voie IL-2/IL-2R dans la fonction des cellules dendritiques porcines. Il est intéressant de noter que dans notre étude la force de l orientation Th1 est corrélée avec un plus fort niveau d expression du CD25 à la surface de la DC. Ces résultats suggèrent que la voie IL-2/ IL-2R pourrait jouer un rôle dans l habilité des DC à orienter la réponse vers Th1 chez le porc comme cela a été précédemment rapporté chez l homme grâce à l utilisation d un anticorps anti CD25 qui diminue la synthèse d IL-12p70 par la DC (Mnasria et al., 2008). Cette hypothèse est aussi soutenue par notre observation que l IL-2 augmente l expression de son récepteur sur les DC porcines. Ces résultats sont intéressants et nécessitent une étude plus approfondie sachant que le rôle de la voie de signalisation de l IL-2 dans les DC porcines n a jamais été rapporté et la fonction de ce récepteur sur les DC reste encore incomplètement explorée. Nous avons montré que les DC-CD40L produisent de fortes quantités d IL-12p40 en accord avec les études publiées chez l homme et la souris (Cella et al., 1996 ; Valenzuela et al., 2002) et que ces DC semblent capables de stimuler une réponse immune effectrice comme en témoigne la forte synthèse d ARNm pour l IFNγ. Notons cependant que des auteurs ont rapporté que l engagement du CD40 ne semblait pas suffisant in vivo pour induire une synthèse efficace d IL-12p70 et donc pour induire une réponse immune effectrice. En effet, l injection d un anticorps agoniste de CD40 n induit pas la synthèse de p40 par les DC spléniques murines mais, in vitro dans ce même article les auteurs observent que l anticorps anti CD40 induit une augmentation modérée de la production d IL-12p40 et de l IL-12p70 (Schulz et al., 2000). En revanche, l adjonction d un signal TLR avec l engagement de CD40 in vivo ou in vitro induit une très forte synthèse d IL-12p70 active (même ref). Ces observations suggèrent que les modes de stimulations de CD40 utilisés in vitro pourraient entrainer un niveau de stimulation supra-physiologique, ou encore que le signal via CD40 dans les DC in vivo serait sous un contrôle inhibiteur par des mécanismes non reproduits in vitro. Notons que ces travaux ont été faits sur des DC spléniques de souris et que les résultats pourraient être différents sur des DC dérivées des monocytes. Quoiqu il en soit ces travaux suggèrent que l engagement du CD40 in vivo ne serait pas suffisant pour donner licence à la DC d induire une réponse immune effectrice, dans ce cas le CD40 fonctionnerait comme un adjuvant aux autres signaux bactériens par exemple. 156

158 Nous montrons par ailleurs, que l engagement de CD40 par rapport aux autres stimuli utilisés est celui qui induit la plus forte polarisation vers Th1 caractérisée par un fort niveau d expression des transcrits de T-bet et d IFNγ associé à un faible niveau d expression de GATA-3, d IL-13 et d IL-17 mesurés par PCR quantitative. Ces résultats sont en accord avec d autres travaux publiés chez l homme et les rongeurs (Cella et al., 1996; Dohnal et al., 2008; Valenzuela et al., 2002 ). Ces observations nous indiquent que la liaison de CD40 porcin induit la production de la forme active de l IL-12 (IL-12p70) et pas seulement de l IL-12p40 par les cellules dendritiques. Par ailleurs, les résultats de PCR montrant qu une forte induction d ARNm de l IFNγ est associée à une faible production de l ARNm de l IL-17 porcine suggèrent chez le porc l existence d une balance entre Th1/Th17. Ceci a été rapporté par une publication récente chez l homme montrant que les DC fortes productrices d IL-12 inhibent la polarisation vers Th17 (Roses et al., 2008). Curieusement, la stimulation par le CD40L induit simultanément la synthèse d IL-12p40, et la plus forte production d IL-10 dans les DC porcines comparativement aux autres stimuli. Ces résultats rassemblés avec l induction de l expression de l ARNm de l IFNγ suggèrent que l IL-10 par elle même n antagonise pas la différenciation Th1 s il y a assez d IL-12. Certains auteurs ont aussi rapporté que des DC issues de monocytes humains cosécrètent des quantités équivalentes d IL-10 et d IL-12 (Rivas-Carvalho et al., 2004; Tajima et al., 2003). D autre part, les cellules dendritiques traitées avec la combinaison de TNF-IFN-LPS sont les plus fortes activatrices des cellules T CD4 + allogéniques (montré par l expression du CD25 et l index de prolifération) et induisent une forte production d IL-12p40. Cependant, de façon surprenante, cette combinaison ne polarise pas la réponse T effectrice vers Th1 (indiqué par un faible niveau de transcription de T-bet et d IFNγ) mais plutôt vers Th17. La chaîne IL-12p40 est également une composante de la cytokine IL-23 connue chez l homme et les rongeurs pour favoriser la voie Th17 (Aggarwal et al., 2003; Wilson et al., 2007) de ce fait, il est possible que la combinaison TNF-LPS-IFN induise plus fortement la synthèse d IL-23 que d IL-12p70. Cette hypothèse est supportée par le fait que les DC traitées par le mélange TNF-IFN-LPS induisent l expression d une quantité significative d ARNm de l IL-17A dans les lymphocytes allogéniques (3 fois supérieur que dans les MLR avec les DC-CD40L). La probabilité de ce scénario est aussi renforcée par un article récent rapportant que l orientation Th17 induite par des DC humaines traitées par le LPS est liée à l induction d IL-23 par le LPS (Roses et al., 2008). Notons qu avec les DC traitées par le mélange TNF-IFN-LPS la 157

159 forte transcription d IL-17 est corrélée avec un niveau de transcription bas d IFNγ et intermédiaire de T-bet et suggérant là aussi l antagonisme entre Th1 et Th17. Ces résultats sont intéressants dans la mesure où la polarisation Th17 n a jamais été décrite chez le porc. De plus, nous montrons que les DC dérivées de monocytes porcins sont capables de polariser la réponse vers Th17. Par ailleurs, la polarisation vers Th17 par des agents de maturation des DC est encore très peu étudiée. Notons que le LPS seul n induit pas de synthèse détectable d IL-12p40 ce qui est en accord avec d autres résultats sur les DC porcines (Guzylack-Piriou et al., 2006). Ce résultat cependant est paradoxal par rapport aux données de la littérature chez l homme qui ont rapporté une induction d IL-12 par le LPS (Hoarau et al., 2006; Tajima et al., 2003). La phosphorylation de p38mapk est considérée comme importante dans l induction de cette synthèse en réponse au LPS, nous avons donc analysé ce phénomène chez le porc. Nous avons montré que le LPS entraînait une phosphorylation efficace de p38mapk ce qui suggère que le défaut d induction de p40 n est donc pas du à une mauvaise induction de la phosphorylation des MAPK. Cependant, la présence d IL-4 dans le milieu de culture pourrait être un facteur expliquant la mauvaise induction de p40 puisque certains auteurs ont rapporté un effet antagoniste de l IL-4 à la fois sur la synthèse d IL-12 et d IL-23 par les DC en réponse au LPS suggérant donc un effet négatif sur l induction de p40 (Roses et al., 2008). Nous avons par ailleurs analysé les caractéristiques des DC porcines immatures et avons tout d abord montré que, contrairement à l homme (Sallusto and Lanzavecchia, 1994), la molécule CD14 est exprimée de façon constitutive sur les DC qu elles soient immatures ou matures. Ce résultat est en accord avec d autres études chez le porc (Loving et al., 2007; Wang et al., 2007b). Nous avons ensuite montré que les DC immatures porcines orientent clairement la réponse vers Th2, démontré par une forte expression d ARNm de GATA-3 et d IL-13 et une absence de transcription de T-bet et d IFNγ et pas de sécrétion d IL-12. De plus, les DC porcines immature sont de faibles activatrices de la prolifération de lymphocytes CD4 + allogéniques et produisent très peu de cytokines bien qu elles induisent l expression de CD25 sur une fraction substantielle des CD4 + (30%). Ces données suggèrent que les cellules dendritiques porcines délivrent un signal d activation incomplet aux cellules T comme rapporté par d autres chez l homme (Mahnke et al., 2002) et chez le porc (Bimczok et al., 2007). De façon intéressante, contrairement aux DC humaines immatures qui produisent constamment de l IL-10, aucune production n a été détectée dans les cultures de DC porcines immatures. 158

160 Après avoir analysé certaines caractéristiques des cellules dendritiques, nous avons étudié leur capacité à induire une prolifération lymphocytaire. La prolifération des PBMC et des cellules CD4 + purifiées induite par des DC porcines à déjà été rapportée par plusieurs auteurs (Bimczok et al., 2007; Carrasco et al., 2001; Carrasco et al., 2004). Cependant peu d études ont révélé le phénotype des lymphocytes activés par des DC maturées par différents agents. Dans le sang périphérique porcin, quatre sous populations de lymphocytes T peuvent être définies sur la base de l expression des antigènes CD4 et CD8 : CD4 - CD8α +, CD4 + CD8α -, CD4 + CD8α + et une petite fraction de cellules CD4 - CD8α -. Nous avons étudié le marqueur CD25 et avons observé que la maturation des cellules dendritiques s accompagne constamment d une augmentation de leur capacité à induire ce marqueur sur les lymphocytes allogéniques. De plus, les CD4 + purifiés ont acquis la molécule CD8α après activation comme ceci a été décrit précédemment par d autres auteurs (Revilla et al., 2005). Lorsque les PBMC totaux ont été utilisées comme répondeurs, les DC-CD40L ont la particularité d induire préférentiellement l activation des cellules CD4 - CD8 low allogéniques (80% des cellules activées n expriment pas le CD4) contrairement aux DC-LPS ou aux DC-TNF-LPS-IFN qui induisent préférentiellement l activation des cellules T CD4 + (67% des cellules activées expriment le CD4). Nous avons aussi étudié le marquage γδ, ces dernières représentent environ 20% des cellules en fin de culture. Cependant, seule une très faible fraction de γδ exprime le CD8 (Takamatsu et al., 2006). Il serait intéressant d étudier plus en détail l activation de la population CD4 - CD8 low activées par les DC-CD40L qui pourrait également correspondre à des cellules NK (une partie de ces cellules expriment CD8, (Denyer et al., 2006)). Nous avons aussi analysé l activation des PBMC en absence de cellules CD4 + puisque cet aspect n a jamais été analysé chez le porc. Nous montrons que les DC-CD40L sont capables d induire la prolifération des cellules dépourvues de cellules CD4 donc majoritairement CD8 + porcines alors que ni les DC-immature, ni les DC-LPS, ni les DC-TNF-LPS-IFN n ont cette habilité. Il a été précédemment rapporté que la réponse primaire CD8 chez les rongeurs en absence de cellules CD4 + joue un rôle dans la défense contre différents pathogènes incluant le virus de la méningite choriolymphocytaire, le virus de la stomatite vésiculaire et la bactérie listeria monocytogenes (Andreasen et al., 2000; Clarke, 2000; Hamilton et al., 2001; Shedlock et al., 2003). De façon similaire, en transplantation d organe l activation de lymphocytes cytotoxiques indépendamment des cellules CD4 + à un rôle important dans le rejet (Jones et al., 2006). La propriété du CD40L à conférer aux DC porcines la capacité de stimuler les lymphocytes T cytotoxique pourraient être expliquée par 159

161 la forte production d IL-12 considéré par certains auteurs comme un facteur déterminant de l activation des lymphocytes T CD8 + (Valenzuela et al., 2002). Néanmoins, il a également été rapporté que le CD40 pourraient fournir un signal unique et non redondant activant les DC qui leur apporterait la capacité spécifique d activation des CTL indépendamment de la synthèse d IL-12 (Hernandez et al., 2007). Après avoir caractérisé la fonctionnalité des DC porcines matures et immatures nous nous sommes intéressés aux possibilités de moduler les fonctions activatrices des DC porcines en utilisant divers immunosuppresseurs. Nous avons étudié les effets de l acide mycophénolique (MPA) et de la rapamycine tous deux largement utilisés en transplantation humaine et sont considérés comme n étant pas antagonistes de la production de lymphocytes Treg in vivo ou in vitro (Coenen et al., 2006; Zeiser et al., 2006 ) et constituent, à ce titre, des agents qui pourraient être utilisés de préférence dans un modèle préclinique d immunomodulation en adjonction d une thérapie cellulaire. Le MPA diminue la production d IL-12p40 et l expression des marqueurs CD80/86 et CD25 sur les DC activées par le CD40L. De plus, ces DC-MPA ont une faible activité allostimulatrice comparé au DC-CD40L. Ces résultats sont similaires à ceux rapportés chez l homme (Lagaraine et al., 2005). Cependant, la diminution de l expression du CD25 induit par le MPA n a jamais été rapportée antérieurement. Cette propriété pourrait avoir des conséquences sur la sensibilité de la DC à l IL-2, comme le suggèrent des résultats de notre laboratoire rapportant que le blocage du CD25 à la surface de la DC diminue la synthèse d IL-12. Cet effet pourrait participer à la diminution de l activité allostimulatrice des DC induite par le MPA. Nous avons aussi étudié les effets de la rapamycine sur les DC porcines. Cet immunosuppresseur, contrairement au MPA, n a aucun effet sur l expression de CD25, et n induit qu une très faible diminution de celle des molécules CD80/86. En revanche, nous observons une augmentation de la synthèse d IL-12 et une baisse de la synthèse d IL-10. Ces effets sur les cytokines pourraient paraître paradoxaux par rapport à certains travaux antérieurs obtenus chez l homme ou la souris. Citons par exemple, Monti et collaborateurs en 2003 qui observent une baisse de la synthèse d IL-12 induites par des DC pré-traitées par de la rapamycine dans des cultures mixtes lymphocytaires allogéniques humaines (Monti et al., 2003). Cependant, cet article mentionne que la rapamycine induit une apoptose jusqu à 38% des cellules et l IL-12 est dosée dans des MLR environ 10 jours après la mise en contact de la DC avec la rapamycine. Il est donc probable que le nombre de cellules dendritiques dans les conditions de MLR en présence de DC-Rapa soit très inférieur au nombre contenu dans les 160

162 MLR avec des DC contrôles. Ceci pourrait amplement expliquer la diminution de la synthèse d IL-12 que l auteur rapporte. Ce mode expérimental ne permet donc pas à l auteur de conclure sur l effet direct de la rapamycine sur la synthèse d IL-12 par la DC. En outre, les auteurs utilisent des DC irradiées ce qui pourrait altérer de façon très importante le profil de synthèse de cytokines des DC. Par ailleurs, certains articles du groupe de Thomson ont aussi rapporté un effet plutôt négatif de la rapamycine sur la synthèse d IL-12 chez la souris. Mais la rapamycine était délivrée in vivo chez la souris et les DC spléniques étaient extraites de ces animaux puis testées in vitro (Hackstein et al., 2003). Dans ce cas, on ne peut exclure un effet de la rapamycine sur d autres cellules in vivo notamment sur les lymphocytes qui en retour, influenceraient la réponse des DC extraites de ces animaux. D autres travaux ont rapporté tout d abord chez la souris que la rapamycine n avait pas d effet inhibiteur directe de la synthèse d IL-12 par la DC (Chiang et al., 2004) et plus récemment chez l homme et la souris des publications ont montré une augmentation de la synthèse d IL-12 par les CPA traitées par la rapamycine (Cao et al., 2008 ; Ohtani et al., 2008 ; Weichhart et al., 2008). Notons que dans notre travail la synthèse d IL-10 est diminuée par le traitement à la rapamycine ce qui pourrait participer à l augmentation de la synthèse d IL-12 par une levée du rétro contrôle négatif de l IL-10 comme le suggère Ohtani (Ohtani et al., 2008). Il serait interessant d étudier les conséquences de cette modulation des sécrétions de cytokines sur l orientation de la réponse immune. Notre travail s intégrant dans un projet plus vaste d induction de tolérance aux allogreffes, nous avons exploré les possibilités de réguler la réponse immune allogénique chez le porc. Dans ce travail, nous avons d abord mis en évidence la population de lymphocytes T régulateurs naturels CD4 + CD25 + porcins. Ces cellules expriment le facteur de transcription spécifique Foxp3 et suppriment une stimulation polyclonale. La fraction de cellules CD4 + CD25 + dans la circulation sanguine de porc est dans une proportion similaire à ce qui a été montré chez les rongeurs (Sakaguchi et al., 1995) et chez l homme (Ng et al., 2001; Stephens et al., 2001 ). L expression de Foxp3 dans cette population est plus importante parmi les cellules exprimant fortement le CD25 (CD25 high ) comme chez l homme (Baecher- Allan et al., 2004). Les cellules exprimant le CD25 se trouvent principalement dans la population de lymphocytes doubles positifs pour CD4 et CD8. Notons que parmi les cellules Foxp3 du porc, environ un tiers expriment à la fois CD4 et CD8 et un quart sont CD8 high simples positives. Cette distribution est différente de celle de l homme où on ne note que très peu de CD8 simples positives (et aucune double positives CD4/CD8 parmi les cellules Foxp3 161

163 positives. Cette population double positive pourrait correspondre à des cellules «mémoires». Notons qu environ 35 à 40 % des cellules Foxp3 + expriment SLA-DR, une proportion qui est similaire à ce qui a été rapportée pour l homme (Baecher-Allan et al., 2001). Il reste à déterminer si ces populations SLA-DR + correspondent aux cellules doubles positives CD4/CD8. Récemment une étude a rapporté que les cellules HLA-DR + Foxp3 + ont des propriétés différentes des cellules HLA-DR - foxp3 + chez l homme (Baecher-Allan et al., 2006). Nous avons confirmé qu il s agissait de lymphocytes Treg naturels en démontrant leur activité suppressive sur une prolifération polyclonale après tri par cytométrie en flux des cellules CD25 high (nous avons montré qu elles expriment toutes Foxp3). Nous montrons qu il s agit bien de cellules T régulatrices naturelles puisque les cellules CD25 - traitées de la même façon n ont aucun effet suppresseur. Ainsi, cette population contient bien des cellules T régulatrices naturelles, nos observations sont donc similaires à ce qu il a été initialement montré pour l homme et la souris (Fontenot et al., 2003 ; Hori et al., 2003; Stephens et al., 2001 ). Notons que les cellules régulatrices naturelles n empêchent pas totalement l entrée en cycle des cellules répondeuses mais diminuent leur nombre total de cycles parcourus. Ceci pourrait signifier soit qu elles sont entrées en cycle plus tardivement soit qu elles sont mortes plus précocement pendant les cycles cellulaires Ainsi, afin de mieux cerner l effet des Treg naturels sur l expansion clonale des populations répondeuses, il faudrait évaluer aussi l induction d apoptose parmi les cellules répondeuses dans la culture. L utilisation de cellules T régulatrices en thérapie cellulaire nécessitant un grand nombre de cellules, nous avons donc stimulation polyclonale en présence ou non d IL-2 pour évaluer la capacité proliférative des lymphocytes Treg naturels de porc. Classiquement les lymphocytes T régulateurs sont considérés comme étant hypo-répondeurs à une stimulation par le seul TCR en présence de l antigène présenté par sur une CPA in vitro mais l ajout d IL-2 restore leur capacité proliférative (Dieckmann et al., 2001; Thornton and Shevach, 1998 ). Nous avons montré que les cellules T CD4 + CD25 + peuvent proliférer suite à une stimulation polyclonale par la PHA et que cette prolifération augmente en présence d IL-2. Notons cependant que leur capacité proliférative est inférieure à celle des CD25 -. Ce résultat constitue la première étude de la capacité proliférative des lymphocytes T régulateurs naturels porcins. Notons qu il peut paraître surprenant d observer une prolifération de cellules CD4 + purifiées suite à l activation par la PHA dans la mesure où il a été rapporté que ce type de stimulation sur des lymphocytes dépourvus de CPA conduit à leur anergie (Mueller et al., 1989 ; Schwartz, 1990). Le CD4 est un marqueur de populations cellulaire complexe, il ne 162

164 marque pas seulement des lymphocytes T puisque des cellules de la lignée monocytes et des DC circulantes peuvent aussi l exprimer. Le tri cellulaire en cytométrie en flux a porté sur des cellules CD4 + de petite taille et de faible granulosité, cette fenêtre de tri devrait donc avoir éliminé les quelques cellules CD4 + CD14 + circulantes qui ont une grande taille et une granulosité élevée (Summerfield et al., 2003). Cependant, les cellules CD4 + SWC3 int CD14 - (qui représentent environ 1 à 2 % des cellules CD4 circulantes) sont probablement encore présentes, ces cellules correspondent essentiellement aux pdc du porc. Dans la mesure où il a été montré que l ajout de simplement 1% de monocytes suffit à rétablir la réponse des lymphocytes T à la PHA (Ceuppens et al., 1988) ces cellules pdc pourraient donc jouer le rôle de cellules présentatrices donnant le co-signal en association à la PHA. Quoiqu il en soit les lymphocytes Treg naturels du porc ne paraissent pas totalement anergiques et l ajout d IL-2 permet d obtenir une prolifération assez importante. Par ailleurs elles prolifèrent de façon importante en réponse à l association PMA/ionomycine même sans l ajout d IL-2 exogène. Il est important d observer que les cellules qui ont proliféré ont aussi augmenté leur expression de Foxp3. L expansion des Treg naturels est un champ d investigation important sur lequel plusieurs équipes travaillent actuellement pour obtenir un nombre important de Treg dans l optique de thérapie cellulaire. Récemment, des lymphocytes Treg naturels qualifiées pour une utilisation en clinique ont été obtenus (Peters et al., 2008). Cependant, dans cette étude nous n avons obtenu qu une expansion faible et la fraction des cellules Treg naturelles circulantes dans le sang est très limitée. Ainsi dans une logique de thérapie cellulaire nous nous sommes intéressés aux possibilités d induire des Treg à partir de lymphocytes T circulants CD4 +. Nous nous sommes alors tournés vers l autre alternative d obtention de Treg : générer in vitro T régulateurs induits (encore appelés adaptatifs). Le TGFβ ainsi que la rapamycine ont été montré comme inducteur de lymphocytes Treg in vitro par son utilisation lors d une stimulation de lymphocytes T CD4 + chez l homme et chez la souris (Chen et al., 2003; Fantini et al., 2004 ; Yamagiwa et al., 2001 ). La possibilité d induction in vitro de lymphocytes T régulateurs ainsi que l effet de ces deux molécules sur les lymphocytes T porcins n ont jamais été explorée chez le porc. Nous montrons que la rapamycine, le TGFβ et surtout l alliance de ces deux agents ont un effet anti-prolifératif sur une stimulation polyclonale de lymphocytes T CD4 + à la PHA en présence d IL-2. Cet effet anti-prolifératif est corrélé à une augmentation de l expression de CD25 induite par la PHA en présence de rapamycine et de façon plus importante encore en présence de TGFβ. Une étude réalisée sur la stimulation de lymphocytes murins par un anti- CD3 et anti-cd28 a également montré que l ajout de TGFβ à cette stimulation entraînait une 163

165 augmentation de l expression de CD25 (Kim et al., 2005). L activation via le TCR entraîne initialement l expression de la chaine α du récepteur à l IL-2. L augmentation de cette induction en présence de TGFβ serait du à l implication des protéines Smad (impliquées dans la signalisation via le TGFβR) dans l augmentation d expression de l IL-2Rα. Nous avons vu précédemment que le marqueur caractéristique des lymphocytes T régulateurs (naturels) est le facteur de transcription Foxp3. Nous montrons tout d abord que l expression de Foxp3 reste très faible après la stimulation PHA en présence d IL-2, proche de celle des lymphocytes initiaux. La PHA ne semble donc pas induire fortement l expression de Foxp3. Notons que l ajout de rapamycine à la PHA n a aucun effet sur l expression de Foxp3. Ces résultats sont, là aussi en accord avec les résultats chez l homme montrant que la rapamycine n induit pas l expression de la molécule Foxp3 dans les lymphocytes T activés de façon polyclonale (Valmori et al., 2006). En revanche nous montrons que le TGFβ induit fortement l expression de Foxp3 (entre 30 et 50%) suite à l activation polyclonale de lymphocytes T CD4 +. Ce qui est en accord avec les données humaines et murines montrant que le TGFβ induit le gène Foxp3 (Chen et al., 2003 ; Fantini et al., 2004; Marie et al., 2005 ). De façon intéressante, l ajout de rapamycine augmente légèrement ce pourcentage d expression. Cette observation nous indique que la rapamycine n antagonise pas l induction du gène Foxp3 par le TGFβ. Notons que chez l homme il a été montré que la rapamycine bloquait la prolifération des T non-régulateurs sans empêcher celle des lymphocytes Treg naturels CD25 +, lors d une stimulation polyclonale de lymphocytes CD4 + en présence d IL-2 (Battaglia et al., 2006). Cet effet semble lié à l induction du gène pim2 par Foxp3 qui confère à la cellule une résistance à la rapamycine (Basu et al., 2008). Cependant, il faut observer que cet effet sur pim2 n a pas été encore rapporté pour des Treg induites in vitro à partir de cellules Foxp3 négatives. Cependant, nos résultats montrant que la rapamycine n empêche pas l induction de Foxp3 sur des CD4 totaux suggèrent que l effet bénéfique de la rapamycine pourrait se confirmer pour des Treg générées de novo. Il faut observer que la rapamycine n induit pas d anergie des lymphocytes puisque ceux ci sont tout à fait capables de répondre à une re-stimulation à la PHA après les avoir mis en culture dans un milieu sans rapamycine. Ainsi, la rapamycine est par elle même incapable d induire des cellules Foxp3 + mais sa présence est favorable à l expansion clonale de cellules Foxp3 + contenues dans le milieu. En conséquence, l effet bénéfique de la rapamycine nécessite au préalable de créer les meilleures conditions favorables à l induction de Foxp3. Nous avons ensuite analysé la capacité suppressive des différentes populations cellulaires sur des PBMC activées de façon polyclonale par la PHA. Lorsque nous avons 164

166 analysé les fonctions suppressives des cellules générées in vitro nous avons du faire face à un certains nombre de problèmes assez peu discutés dans la littérature scientifique. Il nous paraît intéressant d en discuter ici. Dans cette étude, nous avons choisi de tester l activité suppressive par deux techniques différentes de mesure de la prolifération lymphocytaire. Tout d abord, la technique d incorporation de thymidine tritiée qui est plutôt la méthodologie traditionnelle et permet d évaluer les cellules en phase S du cycle à l instant où on ajoute la thymidine et la technique utilisant la décroissance de la fluorescence d un colorant cellulaire par cytométrie en flux. Cette seconde technique, plus récemment mise au point, donne des informations différentes dans la mesure où le marquage se fait au départ de la culture et la lecture se fait à la fin reflétant ainsi la prolifération pendant toute la durée de la culture. Nous n avons pas pu observer de suppression avec aucune de nos populations cellulaires qu elles soient Foxp3 positives ou négatives en utilisant l incorporation de thymidine comme technique de lecture de la prolifération. Nous avons par ailleurs montré que les lymphocytes T pré-activés à la PHA en présence ou non de TGFβ ou de rapamycine répondent fortement à une re-stimulation par la PHA. Cette prolifération des populations dont on veut tester les propriétés suppressives est donc un sérieux obstacle lorsqu on doit analyser la prolifération du mélange cellulaire avec les populations cibles répondeuses (PBMC activées par PHA). Pour cette raison nous avons opté pour une technique permettant de marquer des cellules de façon irréversible et permettant simultanément d analyser les divisions cellulaires. Le CFSE est un agent qui répond à ces critères. Cependant en utilisant cette technique nous avons observé une inhibition de la prolifération des populations répondeuses dans toutes les conditions. Cette suppression non spécifique, ne semble pas venir d un facteur soluble apporté par l ajout des lymphocytes T activés car les surnageants de culture de pré-activation n ont pas engendré de suppression de la prolifération des PBMC. Il s agit donc d un phénomène lié à la présence de cellules. Dans la mesure où les cellules dont nous voulons tester la capacité suppressive répondent fortement à la PHA, nous avons émis l hypothèse que cette prolifération pourrait induire une suppression par des phénomènes complexes d homéostasie anciennement décrits. Nous avons donc décidé d irradier à 16 gy les populations dont nous voulons tester les capacités suppressives avant de les mettre en contact avec les populations cibles. Cette approche nous a permis de mettre en évidence une suppression spécifique. En effet la population pré-stimulée par la PHA a perdu sa capacité suppressive après irradiation, alors que la population traitée par l association TGFβ+Rapamycine a conservé sa forte capacité suppressive. Des hypothèses sur la compétition pour les nutriments liée à une 165

167 consommation par les cellules prolifératives ne semblent pas expliquer ce phénomène comme le suggère une étude antérieure (Winger et al., 1977). L explication biologique de ce phénomène reste incertaine mais pourrait être lié au passage du statut de cellule répondeuse à celui de cellule suppressive transitoire après quelques cycles cellulaires. Ainsi l irradiation en bloquant le cycle cellulaire empêcherait cette transformation. Il ne s agirait alors pas d un phénomène lié à la présence de Treg spécifique. Notons par ailleurs que d autres auteurs ont montré que l irradiation faible n empêchait pas la fonctionnalité des Treg (Hamdi et al., 2007). Ainsi nos résultats rappellent que tester la fonction suppressive de cellules provenant de cultures pose de nombreux problèmes comme il a été récemment discuté (Venken et al., 2007). Notons que le phénomène suppresseur est corrélé à une forte expression de SLA-DR et de CD25 sur les cellules. Ceci pourrait suggérer un rôle pour ces molécules dans la différenciation ou la fonction des cellules régulatrices. Notons que chez l homme, la différenciation et la fonction des cellules T régulatrices nécessitent l expression de CD25. Cependant, ces résultats sur la fonction suppressive des cellules obtenues à partir de lymphocytes CD4 + non fractionnés activés en présence de TGF+rapamycine ne nous permet pas d affirmer définitivement une induction de novo de cellules Foxp3 + L analyse simultanée du marquage Foxp3 et CFSE nous montre que de nombreuses cellules Foxp3 + sont restées en phase Go/G1 nous indiquant que l expression de foxp3 ne résulte pas simplement d une expansion clonale des Treg naturels initiaux mais bien de l expression de novo de ce marqueur. De plus, des résultats préliminaires sur deux expériences utilisant des CD4 + dépourvus de CD25 + suggèrent que nous pouvons induire l émergence de novo de cellules Foxp3 + avec le TGFβ. Mais dans ce cas nous observons que l induction en présence de rapamycine et de TGFβ est plus faible qu en présence de TGFβ seul et que la rapamycine semble avoir bloqué fortement la prolifération des cellules Foxp3 + induites par le TGFβ comme le montre les expériences de dilution du CFSE de la figure 35. Nous voyons qu en présence de TGFβ 75% des cellules foxp3 sont en cycle contre seulement 30 % en présence TGFβ+rapamycine. Pour le moment nous n avons étudié la prolifération des cellules Foxp3 induites à partir de cellules dépourvues en CD25 que sur une seule expérience. Ces résultats doivent donc être considérés comme préliminaires. Cependant, s ils étaient confirmés cela signifierait que la présence de rapamycine pourrait être moins favorable à l émergence de Treg induits sur des populations dépourvues de CD25 +. Dans ce cas cela suggère qu il faudrait d abord induire les Treg avec le TGFβ puis au cours de stimulations répétées rajouter 166

168 la rapamycine pour antagoniser la croissance des cellules n exprimant pas Foxp3 qui devraient être sensibles à cet agent. Pour résumer, nous avons montré que l activation par la PHA/IL-2 en présence de rapamycine et de TGFβ induit des populations cellulaires qui ont la plus forte activité suppressive avec l induction de Foxp3. Pour tenter de mieux appréhender la nature des phénomènes à l origine de l orientation de la réponse immune vers les Treg nous avons étudié l action directe de ces 2 agents immunomodulateurs sur la polarisation de la réponse lymphocytaire Th1/Th17 en présence de PHA/IL-2 chez le porc. Nous avons montré que l activation PHA/IL-2 induisait une balance orientant plutôt vers Th1 (synthèse d IFNγ et faible production d ARNm pour IL-17 et RORγt). L ajout de rapamycine à la PHA augmente la production d IFNγ sans modifier celle de l IL-17 ce qui suggère que la rapamycine renforce l orientation Th1 en présence d agents polarisant Th1. Si nous tenons compte du fait que la rapamycine bloque la prolifération lymphocytaire, l augmentation de la concentration d IFNγ traduit donc une forte augmentation de la production par cellule. L ajout de TGFβ à la PHA induit l expression des ARNm pour l IL-17 et RORγt et diminue la production d IFNγ suggérant une orientation Th17 qui bloquerait la différenciation Th1. Cependant nous avons montré aussi que le TGFβ semblait induire aussi l expression de Foxp3 et donc orienter potentiellement vers Treg. Ce résultat nous suggère un tronc commun dans la différenciation Th17/Treg chez le porc comme cela est rapporté par des études chez la souris (Awasthi et al., 2008; Lochner et al., 2008 ). Ainsi, le TGFβ pourrait être un agent orientant vers la voie de ce tronc commun et d autres agents interviendraient dans la décision d orientation préférentielle Th17 ou Treg. Ainsi, dans notre étude l ajout d IL-6 au TGFβ renforce l orientation Th17 comme décrit chez la souris (Bettelli et al., 2006; Kimura et al., 2007 ). De façon intéressante, nous observons que l association rapamycine et TGFβ bloque fortement la production d IFNγ et de l ARNm pour l IL-17 en présence ou non d IL-6, créant ainsi des conditions favorables à la différenciation vers le phénotype Treg même dans un contexte inflammatoire. Ce résultat pourrait donc expliquer que les lymphocytes stimulés en présence de l association rapamycine-tgfβ soient les plus suppresseurs. En revanche, nous montrons que la rapamycine ne bloque pas la production de l ARNm du RORγt qui est un facteur de transcription de l IL-17 (Ivanov et al., 2006), ceci suggère qu elle agirait sur une autre cible que RORγt pour inhiber l expression d ARNm de l IL-17. Cette cible pourrait être 167

169 le facteur de transcription STAT3. En effet STAT3 est un facteur de transcription important pour la différenciation Th17 (Harris et al., 2007; Mathur et al., 2007 ) et la phosphorylation de ce facteur est activée par mtor (Weichhart et al., 2008) qui est lui même inhibé par la rapamycine. La résistance des Treg à l action antiproliférative de la rapamycine permet d expliquer certains effets favorables de la rapamycine sur l expansion d une population Treg (Battaglia et al., 2005 ; Coenen et al., 2006 ; Strauss et al., 2007). Nos résultats suggèrent que le blocage de la voie Th17 par la rapamycine pourrait être un autre mécanisme expliquant son action positive sur l orientation Treg. Cependant cet effet pour se manifester nécessiterait la présence de conditions locales polarisantes vers le tronc commun Th17/Treg. De plus gardons en mémoire que l effet de la rapamycine dans des conditions polarisantes Th1 semble plutôt renforcer la production d IFNγ une cytokine globalement favorable à l orientation Th1. Ces résultats pourraient aussi rendre compte d un certain nombre d observations cliniques chez les patients recevant de la rapamycine pour lesquels des syndromes inflammatoires inexpliqués ont été rapportés (Dittrich et al., 2004; Thaunat et al., 2005 ). Cependant pour mieux analyser l action de la rapamycine dans des conditions polarisantes Th1, il faudrait aussi étudier l effet net sur la production d une réponse immune effectrice, en effet un accroissement de la production d une cytokine n indique pas nécessairement une augmentation de son activité car il pourrait y avoir simultanément une résistance à la signalisation via son récepteur. De plus, il faut garder en mémoire que des résultats in vitro ne présagent pas nécessairement des effets cliniques. Ainsi, de façon intéressante, nos données suggèrent que les effets de la rapamycine sur la réponse immune pourraient être assez différents en fonction de l environnement dans lequel se trouvent les lymphocytes et les cellules dendritiques. PHA / IL-2 IL-6 + TGFβ Rapamycine Th1 Th17 Treg Rapamycine Figure 38 : Schéma hypothétique sur les effets de la rapamycine et du TGFβ sur l orientation de la réponse immune chez le porc. 168

170 CONCLUSION 169

171 Certains de nos objectifs initiaux ont été atteints : - Nous avons caractérisé l orientation de la réponse immune effectrice par des cellules dendritiques porcines et notamment le rôle du CD40L et la combinaison TNF+LPS+IFN pour induire des cellules dendritiques capables de polariser vers Th1 ou Th17 respectivement. - Nous avons mieux caractérisé l orientation effectrice vers la voie Th17 ainsi que sa modulation par la rapamycine qui favorise ainsi l orientation vers l induction de Treg après un signal TCR d activation polyclonale. - Enfin, nous avons caractérisé des cellules T régulatrices naturelles et induites chez le porc. Cependant, ce travail nécessite encore d améliorer la différenciation et la prolifération de ces cellules. En effet le nombre de cellules Treg générées reste encore faible puisque à partir de 5x10 6 PBMC nous sommes en mesure de générer in vitro 0,4x10 6 cellules Foxp3 +. Ce chiffre permet cependant d envisager à relativement court terme, après quelques mises au point, une thérapie cellulaire chez le gros animal. Ces mises au point devront avoir comme priorité d améliorer les conditions propices à la prolifération préférentielle des Treg et de différencier en présence des antigènes allogéniques afin d enrichir en Treg allospécifiques. Des cellules dendritiques modifiées pourraient servir de source d alloantigènes. Sur ce point nos travaux sur la caractérisation de la réponse immune induite par des cellules dendritiques et les résultats préliminaires sur l effet de l acide mycophénolique (MPA) devraient aider à obtenir des DC protolérogènes avec un phénotype stable. Au total, cette étude a fait faire des progrès significatifs dans la réalisation du projet plus global dans lequel s incorporent ce travail. 170

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