Synthèse. Validation de la méthode d analyse. suivant le protocole de validation PCR Legionella révision 1 ( ) - Laboratoire Central CAE -

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1 De Rapport Synthèse Validation de la méthode d analyse GeneDisc Legionella spp. suivant le protocole de validation PCR Legionella révision 1 ( ) Laboratoire Central CAE Méthode de référence : NF T Centre d Analyses Environnementales GIE des Laboratoires Laboratoire Central Immeuble "Le Dufy" 1 place de Turenne SAINTMAURICE CEDEX Tél : Fax :

2 SOMMAIRE OBJET RAPPELS SUR LA METHODE GENEDISC PRINCIPE PROTOCOLE HISTORIQUE DE LA VALIDATION MODIFICATIONS INTERVENUES DEPUIS LA VALIDATION INITIALE PERFORMANCES RACCORDEMENT DE LA SOLUTION CALIBRANTE ET DU MATERIEL DE REFERENCE A L ETALON PRIMAIRE FONCTION DE CALIBRAGE LIMITE DE DETCTION LIMITE DE QUANTIFICATION DETERMINATION DU RENDEMENT ET DE LA ROBUSTESSE INCLUSIVITE ET EXCLUSIVITE PRATICABILITE ETUDE INTERLABORATOIRES OBJECTIF PLAN D ESSAI ET ANALYSES REALISEES RESULTATS CONCLUSION 2

3 OBJET Etudes réalisées par : Centre d Analyses Environnementales VEOLIA ENVIRONNEMENT Immeuble le Dufy 1, place de Turenne Saint Maurice cedex Pour : Pall GeneDisc Technologies Centre d Affaires CICEA 4, rue du Courtil Bruz Ce rapport de synthèse présente l ensemble des résultats obtenus depuis la validation initiale (2007) jusqu à la reconduction de la validation, demandée avec modification et extension(2012). 3

4 RAPPELS SUR LA METHODE ALTERNATIVE Principe La méthode GeneDisc Legionella spp. est constituée de deux étapes : une première étape de préparation de l ADN microbien à partir de l échantillon d eau réalisée avec les plateformes GeneExtract ou GeneDisc DNA Extractor et nécessitant l utilisation du Extraction Pack Environment 1 pour tous les types d eau ou le Extraction Pack Environment 3 pour les eaux propres,, une deuxième étape de quantification de l ADN de Legionella spp par PCR en temps réel avec l instrument GeneDisc Cycler et les Legionella GeneDisc Packs. Protocole La méthode GeneDisc Legionella spp. est basée sur l utilisation des kits suivants : Extraction de l ADN bactérien : o Extraction Pack Environment 1 (Notices PENVI1096_02.FR et PENVI1096_02.EN) o Extraction Pack environment 03 (Notices PENVI3100_01.FR et PENVI3100_01.EN) Détection et quantification par PCR en temps réel : o Legionella spp. GeneDisc Pack (Notices GLEGSPP_02.FR et GLEGSPP_02.EN) o Duo Legionella pneumophilaspp. GeneDisc Pack (Notices GLEGDUO_02.FR et LEGDUO_02.EN) L Extraction Pack Environment 1 contient tous les consommables et réactifs nécessaires pour la filtration des échantillons d eau, la lyse cellulaire et la purification de l ADN. L extraction de l ADN est basée sur une lyse mécanique des cellules en présence de détergeant, suivie d une purification de l ADN par adsorption sur mini colonne de silice. L ensemble du protocole de préparation d ADN est géré par le GeneExtract ou le GeneDisc DNA Extractor. L Extraction Pack Environment 3 contient tous les consommables et réactifs nécessaires pour la filtration des échantillons d eau, la lyse cellulaire et la concentration de l ADN. L extraction de l ADN est basée sur une lyse mécanique des cellules, suivie d une concentration de l ADN sur une unité de centrifugation. L étape de lyse cellulaire est gérée par le GeneExtract ou le GeneDisc DNA Extractor. L ADN de Legionella est ensuite quantifié par PCR en temps réel grâce aux Legionella GeneDisc Packs. Le test PCR GeneDisc Legionella repose sur l amplification génique par PCR en temps réel d une séquence nucléique spécifique du genre Legionella spp. La détection est possible grâce à l utilisation de sondes TaqMan marquées par un fluorophore (FAM ou ROX). Lors de l élongation de l amplicon, la sonde est clivée et le fluorophore, séparé physiquement du Quencher, émet une fluorescence. Cette fluorescence est mesurée directement par le module optique du GeneDisc Cycler. Page 4 sur 19

5 Pour chaque analyse, le mélange ADN/Master Mix, déposé dans un secteur du GeneDisc Plate, est adressé par dépression dans les chambres réactionnelles préchargées en réactifs (amorces, sondes, ADN). La composition des chambres réactionnelles de chaque secteur des différents types de GeneDisc Plates entrant dans le cadre des méthodes est indiquée dans le tableau suivant : GeneDisc Legionella spp. GLEGSPP N secteur analyse N puits PCR GLEGSPP N secteur analyse N puits PCR GeneDisc Legionella DUO Détection FAM Contrôle interne d inhibition Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Contrôle interne d inhibition Contrôle externe quantitatif Lg Détection FAM Contrôle interne d inhibition Contrôle interne d inhibition Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Contrôle négatif Contrôle négatif Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Contrôle interne d inhibition Contrôle externe quantitatif Lg Contrôle interne d inhibition Détection ROX Contrôle négatif Contrôle négatif Détection ROX GLEGDUO Détection FAM N secteur analyse N puits PCR 1 Contrôle interne d inhibition Lp 2 Analyse L. pneumophila 3 Analyse L. pneumophila Contrôle négatif 1 2 Analyse L. pneumophila 3 Contrôle négatif 6 4 Contrôle interne d inhibition Lp 5 6 Contrôle externe quantitatif Lp Lp : L. pneumophila Lg: Legionella spp. Détection ROX Contrôle négatif Analyse Legionella spp. Analyse Legionella spp. Contrôle interne d inhibition L.g Analyse Legionella spp. Contrôle interne d inhibition Lg Contrôle négatif Contrôle externe quantitatif Lg Page 5 sur 19

6 D un point de vue quantitatif, pour chaque lot de GeneDisc, un GeneDisc de calibration, correspondant à l amplification PCR des ADN génomiques standards de L. pneumophila ATCC33152 (réf. ALEGPNE105), est analysé. Le logiciel du GeneDisc Cycler calcule automatiquement le Ct, les paramètres de l équation de la gamme étalon et le polynôme du second degré représentant la courbe : Amplitude de fluorescence des Témoins d inhibition = f(ct L. pneumophila). Ce polynôme traduit la sensibilité des témoins internes d inhibition à la compétition, en présence d ADN génomique de L. pneumophila (hors inhibition). Les paramètres obtenus avec le GeneDisc de calibration et son Master Mix associé sont sauvegardés et appliqués à tous les GeneDisc Plates d un même lot, sur un GeneDisc Cycler donné, conformément à la définition de la série PCR selon la norme NF T Pour chaque échantillon analysé, dans les mêmes conditions expérimentales que celles du GeneDisc Plate de calibration, le pourcentage d inhibition des témoins internes d inhibition est déterminé par le logiciel de façon à indiquer à l opérateur le facteur de dilution à appliquer si nécessaire (d5 ou d10). Si la réaction PCR n est pas inhibée, le logiciel calcule automatiquement le Ct et le convertit en nombre d UG de Legionella / L en fonction du volume d eau filtré. Historique de la validation La méthode GeneDisc Legionella spp. est validée sous le numéro GEN 25/04 12/07. La première validation a été prononcée en décembre Une première extension portant sur les modifications suivantes a été validée en 2008: Modification du format des colonnes de silice dans le pack d extraction (miniaturisation) pour traiter 48 échantillons simultanément. Modification du design du GeneDisc avec 12 secteurs d analyse, les analyses PCR sont réalisées en duplicate (2 puits PCR par cible) au lieu de triplicate. Une étude d extension de validation a été menée sur les parties suivantes de l étude préliminaire : limite de détection et de quantification, linéarité, rendement optimal. Une deuxième extension portant sur les modifications suivantes a été validée en 2012: Validation selon la norme NF T Modification des automates : la préparation des extraits d ADN est réalisée avec le GeneDisc DNA Extractor et l analyse PCR est réalisée avec le GeneDisc Cycler v3 Une étude d extension de validation a été menée par un laboratoire expert sur les parties suivantes de l étude préliminaire : raccordement à l étalon primaire, linéarité, rendement optimal. Enfin, une troisième extension a été validée, elle aussi, en Elle concerne la mise en place d un protocole simplifié de préparation d ADN pour les eaux sanitaires et les eaux «propres». Une étude Page 6 sur 19

7 d extension a été menée par un laboratoire expert sur le rendement et la robustesse de la méthode ainsi que sur sa praticabilité. Modifications intervenues depuis la validation initiale Modification du référentiel de validation La reconduction a été réalisée en tenant compte des exigences et plans d expérience définis dans la nouvelle version du référentiel de validation «Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella spp. et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR)», révision 1, (version adoptée en janvier 2011 par AFNOR Certification) et sur les modes de calcul décrits dans la norme AFNOR NF T : 2010, pour le dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR) en temps réel. Evolutions de la méthode alternative La méthode GeneDisc Legionella spp. a évolué depuis la validation initiale. Ces évolutions portent sur la modification du format des colonnes de silice dans le pack d extraction (miniaturisation) permettant de traiter 48 échantillons simultanément ainsi que sur la modification du design du GeneDisc avec 12 secteurs d analyse, les analyses PCR sont réalisées en duplicate (2 puits PCR par cible) au lieu de triplicate. Une deuxième évolution a été réalisée sur la méthode lui permettant d être en conformité avec la norme NF T Par ailleurs, les automates ont été modifiés : la préparation des extraits d ADN est réalisée avec le GeneDisc DNA Extractor et l analyse PCR est réalisée avec le GeneDisc Cycler v3. Enfin, un protocole simplifié de préparation d ADN pour les eaux sanitaires et les eaux «propres» a été mis en place. PERFORMANCES Les performances de la méthode (raccordement à l étalon primaire, fonction de calibrage limites de détection et de quantification de l étape PCR, linéarité, rendement et robustesse de l extraction), sa sélectivité, sa praticabilité et la qualité des réactifs ont été évaluées. Les résultats de l étude interlaboratoire ont été obtenus lors de l étude de validation initiale. Page 7 sur 19

8 Raccordement de la solution calibrante et du matériel de référence à l étalon primaire A partir de l étalon primaire, 3 gammes indépendantes de cinq niveaux ont été préparées par dilutions en cascade dans la solution utilisée pour analyser le blanc PCR (diluant fourni par le CNR). Les dilutions couvrent le domaine de quantification linéaire. La même opération a été réalisée à partir de la solution calibrante de travail avec le diluant fourni par Pall GeneDisc même série PCR. Technologies. Les deux lots de 3 gammes ont été analysés dans la Raccordement de l étalon primaire pour la cible Legionella spp. Les résultats obtenus à partir de l étalon primaire sont représentés dans le tableau cidessous. Q (UG/puit) LOG (Q) Ct obtenus Gamme 1 Gamme 2 Gamme 3 Ct moyen 25 1,40 31,334 32,323 31, , ,40 29, , ,586 28, ,40 25,246 25,422 25, , ,40 21, , , , ,40 18,248 18, , ,35 Pente 3,397 4,115<a<2,839 CONFORME Intercept 36,748 La pente est bien comprise entre 4,115<a<2,839, ce qui correspond à une efficacité d amplification comprise entre 75 et 125%. Les résultats obtenus à partir de la solution calibrante de travail sont représentés dans le tableau cidessous. Erreur LOG Ct obtenus LOG (Ct de Q (Q)= Ct moyen)= calibrage CONCLUSION (UG/puit) Valeur Gamme Gamme Gamme moyen Valeur par attendue recalculée niveau 25 1,40 31,55 31,61 31,62 31,59 1,52 0,12 CONFORME 250 2,40 28,61 28,55 28,39 28,52 2,42 0,03 CONFORME ,40 25,47 25,08 24,54 25,03 3,45 0,05 CONFORME ,40 21,73 21,47 21,41 21,53 4,48 0,08 CONFORME ,40 18,23 18,17 18,35 18,25 5,44 0,05 CONFORME erreur de calibrage moyenne 0,06 CONFORME Vérification équivalence des pentes : Val.absolue(Erreur de calibrage log (250000)log(25) ) 0,07 CONFORME Page 8 sur 19

9 Pour chaque niveau, l écart entre le logarithme de la valeur calculée et celui de la valeur attendue est inférieur à 0,15. La valeur absolue de la différence des écarts du point haut et du point bas de la gamme (erreur de calibrage) est inférieure à 0,15 log. Les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus. Raccordement du matériau de référence à l étalon primaire pour la cible Legionella spp. Les résultats obtenus pour le matériau de référence sont représentés dans le tableau cidessous. Ces résultats ont été obtenus par l amplification simultanée du matériau de référence déjà présent dans le GeneDisc et de l étalon primaire. La valeur absolue de l erreur de calibrage est inférieure à 0,15, ce qui est conforme au critère de la norme NF T Fonction de calibrage La fonction de calibrage a été évaluée par l analyse de 5 gammes indépendantes réalisées à partir de 5 tubes d ADN génomique étalon de L.pneumophila ATCC33152 fournis par la société Pall GeneDisc Technologies (Réf. ALEGPNE105). La détection et l amplification ont été réalisées avec le «GeneDisc Legionella DUO 06». Etude de la fonction de calibrage du Legionella spp. avec le «GeneDisc Legionella Duo 06». Equation de la fonction d étalonnage Pente/Efficacité Domaine acceptable Ordonnée à l origine Conclusion ,115 < a < 2,839 75% < e < 125% 36.8 CONFORME Analyse de l'incertitude modèle en cours d évaluation (NF T90471) Cible UG Cible Log 1,40 2,40 3,40 4,40 5,40 biais moyen ecart type Elin* +/ 0.12 Log +/ 0.03 Log +/ 0.10 Log +/ 0.05 Log +/ 0.07 Log Domaine acceptable 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 Conclusion CONFORME CONFORME CONFORME CONFORME CONFORME *Elin = (biais ² + écart type 2 ) Page 9 sur 19

10 En considérant l Elin qui est inférieur à 0,15 sur tous les niveaux de la gamme de calibrage, le domaine linéaire est validé entre 25 et UG d ADN génomique de L.pneumophila ATCC pour la recherche de Legionella spp. Limite de détection 30 solutions indépendantes d ADN de concentration estimée à 5 UG/puits ont été testées. L amplification et la détection ont été faites sur le consommable destiné à la détection de Legionella spp (Legionella spp. GeneDisc pack Premium Réf. GLEGSPP106006). En conclusion, la limite de détection est validée à 5 UG/puits pour la méthode GeneDisc Legionella spp., conformément aux performances annoncées par le fournisseur. Limite de quantification Une solution d ADN de concentration estimée à 25 UG/puits a été analysée 30 fois, en condition de répétabilité. L amplification et la détection ont été faites sur le kit «Legionella spp. GeneDisc pack». Résultats Critères de validation Valeur cible Valeur cible (log) Valeur moyenne mesurée (n = 30) Biais (log) Ecarttype biais du Exactitude E LQ * Incertitude de mesure** <0.30 Résultats obtenus 25 1, , Conclusion conforme **Exactitude E LOQ = (biais² + écart type²) **Incertitude de mesure = 2 x (biais² + écart type²) En conclusion, la limite de quantification est répétable à 25 UG/puits : en termes d incertitude de mesure, elle est conforme au modèle statistique et aux exigences de la norme NF T Page 10 sur 19

11 Détermination du rendement et de la robustesse Le rendement du kit d extraction «Extraction Pack Environment 1» (Réf. PENVI1096) a été évalué. La détection et l amplification ont été réalisées avec le «GeneDisc Legionella pneumophila 12 secteurs» (Réf. GLEGPNE112006). Incertitudes liées à la lyse directe Evian ECS TAR Moyenne (log UG) Moyenne (log UG) Jour 1 8,22 8,45 8,47 Jour 2 8,47 8,49 8,43 Jour 3 8,63 8,64 8,52 Jour 4 8,35 8,61 8,73 Jour 5 8,28 8,55 8,48 Moyenne (log UG) Etude du rendement de la méthode Pall GeneDisc Technologies Type d eau Eau d Evian ECS TAR Niveau de concentration visé Moyenne du rendement obtenu (%)* , Ecarttype* Moyenne du rendement par type d eau (%) Moyenne du biais par type d eau (Log) Ecartype du Biais par type d eau 82 0,15 0.,25 0, ,24 0.,23 0, ,08 0,16 0,18 * Résultats calculés à partir des données obtenues sur les 5 jours d essais. ** U= ((biais moyen) 2 +(ecarttytpe du biais) 2 ) Incertitude (U**) par type d eau Les rendements moyens obtenus sont supérieurs à 25%. Aucune inhibition n a été observée lors de ces essais. Tous les rendements calculés ont des valeurs comprises entre 25% et 199% % et les biais associés sont compris entre 0,6 et 0,3, conformément aux exigences de la norme NF T Les résultats sont donc conformes à ceux attendus. Page 11 sur 19

12 Rendement obtenu avec le protocole simplifié pour les eaux sanitaires et les «eaux propres» Le rendement du kit d extraction «Extraction Pack Environment 3» (Réf. PENVI3100) a été évalué. L évaluation inclut l utilisation de l unité de centrifugation (Nanosep 30K) ou non. La détection et l amplification ont été réalisées avec le «GeneDisc Legionella DUO 06 secteurs» (Réf. GLEGDUO106006). Résultats des lyses directes sur les suspensions mères Evian Moyenne (log UG) ECS Moyenne (log UG) Legionella spp. L.pneumophila Legionella spp. L.pneumophila Jour 1 8,89 9,03 9,03 9,08 Jour 2 8,63 8,69 8,53 8,57 Jour 3 8,59 8,64 8,07 8,09 Jour 4 8,61 8,73 8,61 8,69 Jour 5 8,21 8,33 8,75 8,83 Les rendements par niveaux de concentration et par types d eau sont détaillés dans le tableau cidessous. Type d eau Protocole Niveau de concentration visé rendement moyen (biais) (Log) Variance (Ecarttype du Biais) 2 (log) Incertitude (U élargie**) (log) rendement moyen (biais) (Log) Incertitude U élargie, K = 2 ** Eau d Evian ECS sans Nanosep avec Nanosep sans Nanosep avec Nanosep ,04 0, , ,09 0, , ,32 0, , ,10 0, , ,13 0, , ,05 0, , ,39 0, , ,10 0, ,522 0,098 0,520 Les rendements moyens obtenus pour Legionella spp. sont supérieurs à 25%. Aucune inhibition n a été observée lors de ces essais. Tous les rendements calculés ont des valeurs comprises entre 25% et 199% (ce qui correspond à des valeurs de biais comprises entre 0,6 et + 0,3 log). Page 12 sur 19

13 Les résultats sont donc conformes aux exigences de la norme NF T Inclusivité et exclusivité Les essais d inclusivité ont été effectués sur des extraits d ADN de façon à obtenir environ 100 UG par puits. Au total, 21 souches de Legionella spp. et 15 séropgroupes de L.pneumophila ont été testés. Les essais d exclusivité ont été effectués sur des extraits d ADN de façon à obtenir au minimum UG par puits. Au total, 17 souches bactériennes autres que du genre Legionella ont été testées. En conclusion, les ADN des 36 souches Legionella testées ont tous été détectés et parmi les 17 extraits d ADN testés, appartenant à d autres genres que Legionella, aucune réaction croisée (absence d amplification) n a été détectée. La sélectivité de la méthode GeneDisc Legionella spp. est satisfaisante. Praticabilité MODE DE CONDITIONNEMENT DES REACTIFS Les réactifs sont présentés dans les conditionnements suivants. Extraction Pack Environment 01 Les éléments sont donnés sur l emballage et page 2 de la notice. Les réactifs d extraction sont : «Tampon de lyse». «Tampon de liaison» utilisable après ajout d un «supplément Tampon de liaison». «Tampon de lavage 1». «Tampon de lavage 2». «Tampon d élution». Barrettes de 8 minicolonnes de silice. Extraction Pack Environment 3 Les éléments sont donnés sur l emballage et page 2 de la notice. Les réactifs d extraction sont : 2 flacon de 25 ml «Elution Buffer» 2 sachets de 50 «Lysis tubes» 100 entonnoirs équipés de membranes de polycarbonate 0.45µm 100 NanoSep Centrifugal devices 30K Page 13 sur 19

14 Legionella GeneDisc Pack Les éléments sont donnés sur l emballage et page 2 de la notice. Il existe trois références de GeneDiscs Packs 6 échantillons : Legionella spp GeneDisc Pack (Réf. GLEGSPP106006). Legionella pneumophila GeneDisc Pack (Réf. GLEGPNE106006). Legionella DUO GeneDisc Pack (Réf. GLEGDUO106006) Il existe une référence de GeneDiscs Packs 12 échantillons : Legionella pneumophila GeneDisc Pack (Réf. GLEGPNE112006). Chaque GeneDisc Pack contient : Le mix réactionnel utilisé lors de la réaction PCR (6 tubes : 1 tube / GeneDisc) 6 «GeneDiscs» VOLUME DES REACTIFS Le volume des réactifs à utiliser est indiqué sur la notice du Extraction Pack environment 01 et du Extraction Pack environment 03. CONDITION DE STOCKAGE DES ELEMENTS ET PEREMPTION DES PRODUITS La température de stockage est indiquée sur les packs et à la page 1 des notices des Extraction Packs et des GeneDisc Plates Legionella. Les GeneDisc Packs doivent être conservés au réfrigérateur (5 C ± 3 C). Tous les autres composan ts peuvent être stockés à température ambiante (15 C30 C). La date de péremption est indiquée sur les Packs, ainsi que sur chaque constituant des Packs. MODALITES D UTILISATION APRES PREMIERE UTILISATION Les réactifs sont utilisés jusqu à épuisement dans le respect de la date de péremption. EQUIPEMENTS ET LOCAUX SPECIFIQUES NECESSAIRES Le matériel et les consommables nécessaires sont indiqués sur la page 3 de la notice des Extraction Packs et des GeneDisc Pack. Les mesures de sécurité nécessaires sont indiquées page 1 des notices des Extraction Packs et des GeneDisc Packs.. REACTIFS PRETS A L EMPLOI OU A RECONSTITUER Extraction Packs: Lors de la première utilisation du Extraction Pack Environment 01, les solutions suivantes doivent être préparées : o «Binding buffer» o «Washing buffer 2» La préparation des réactifs est décrite page 3 de la notice du pack. Les autres réactifs sont prêts à l emploi. Page 14 sur 19

15 Lors de la première utilisation du Extraction Pack environment 03, il faut préparer des «Lysis Tubes» : centrifuger les tubes pendant 5 min à 10,000g, retirer le surnageant à l aide d une micropipette de 1mL, puis ajouter dans chaque tube 500 µl de «Dilution Buffer». GeneDisc Packs : Les réactifs sont prêts à l emploi. Cependant, pour chaque numéro de lot de GeneDisc Plates, une droite d étalonnage doit être validée préalablement. Pour cela, il faut reconstituer un tube d ADN calibré à UG/puits PCR (Réf. ALEGPNE1005). DUREE DE FORMATION DE L OPERATEUR NON INITIE A LA METHODE La formation initiale du technicien est de 2 jours. TEMPS REELS DE MANIPULATION Etapes Temps nécessaire pour 8 échantillons Extraction Pack Environment 01 Extraction Pack Environment 03 Filtration En fonction du type d eau ente 5 à 30 minutes Extraction de l ADN 1h15 30 min PCR 15 min de préparation /durée de la PCR : 55min Analyse des résultats 10 minutes 10 minutes En fonction du type d eau ente 5 à 30 minutes 15 min de préparation /durée de la PCR : 55min DELAI D OBTENTION DES RESULTATS Délai minimum : Le délai minimum d obtention des résultats est de 3h05 avec l Extraction pack Environment 01 et de 2h20 avec l Extraction pack Environment 03. En cas de présence d inhibition, la durée est augmentée de 1h30. Le résultat peut être délivré à J0. Réalisation de la PCR après extraction : L analyse peut être interrompue après l extraction. L extrait est ainsi conservé à 20 C ± 3 C si l analyse PCR n est pas faite dans les 6 heures après l extraction. Ceci permet d optimiser l organisation des analyses. TYPE DE QUALIFICATION DE L OPERATEUR Technicien. TRAÇABILITE DES RESULTATS D ANALYSE Les résultats sont conservés sous formes de fichiers informatiques et/ou papier. Les étapes autres que la PCR sont tracées dans des documents prévus par le laboratoire. Le GeneDisc Cycler et le GeneExtract et le GeneDisc DNA Extractor sont équipés de lecteur codebarres permettant la traçabilité de l analyse (lot, date, opérateur, identification des échantillons). Page 15 sur 19

16 MAINTENANCE PAR LE LABORATOIRE Aucune maintenance n est effectuée par le laboratoire. Une maintenance annuelle est réalisée par PallGeneDisc optique et validation biologique. Technologies : métrologie thermique, VOLUME MINIMUM A PIPETER Le volume minimal à pipeter est de 20 µl. STABILITE DES REACTIFS ET DES GAMMES La date de péremption ainsi que la stabilité sont indiquées sur les coffrets des packs. Les conditions de stockage sont décrites sur les Packs. UNG Les conseils de prévention des contaminations sont indiqués à la page 4 de la notice des des Extraction Pack Environment et page 5 de la notice des GeneDisc Plates. En effet, la prévention passe par la décontamination des modules, des accessoires de filtration et le respect des Bonnes Pratiques de Laboratoire. Le «blanc méthode» garantit, entre autres, l absence de contamination d ADN lors de l analyse. PROTECTION DES REACTIFS AUX UV Les réactifs sont conservés dans leur emballage d origine (opaque à la lumière). CONTROLE EXTERNE QUANTITATIF DE LA PCR A chaque disque, l amplification d un matériau de référence, raccordé à l étalon primaire et prédéposé dans les secteur 6 des GeneDisc Plates 6 échantillons et dans les secteurs 12 des GeneDisc Plates 12 échantillons, est réalisée (cf. Page 2 de la notice du GeneDisc Pack). CONTROLE D ABSENCE D INHIBITEURS A chaque analyse, la présence d inhibiteur de la PCR dans l extrait d ADN est contrôlée. Un témoin interne d inhibition est présent dans chaque secteur d analyse. Il s agit d oligonucléotides calibrés comportant les amorces spécifiques de Legionella spp ou L. pneumophila. Ces témoins sont amplifiés en même temps que les échantillons. (Cf. Page 2 de la notice du GeneDisc Pack). Page 16 sur 19

17 3. ETUDE INTERLABORATOIRES Objectif L objectif de cette étude est d évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) des kits commercialisés par la société Pall GeneDisc Technologies pour la détection de Legionella spp. L ensemble des laboratoires participants à cet essai utilise la technologie GeneDisc. Plan d essai et analyses réalisées PLAN D ESSAI Ces essais comportent trois phases qui correspondent à des matrices différentes : Phase I : solution de deux extraits d ADN de L. parisiensis (CIP ) et L.pneumophila (ATCC 33152). Phase II : eau de distribution dopée en L. parisiensis (CIP ), L.pneumophila (ATCC 33152) et E.coli (CIP ). Phase III : eau chaude sanitaire naturellement contaminée. Les souches de légionelles utilisées sont cultivées sur gélose GVPC, la souche de E.coli, quant à elle, est cultivée en bouillon nutritif. Les souches proviennent de pastilles du commerce pour L.pneumophila (ATCC 33152) et E.coli (CIP ) et de la collection du Laboratoire Central pour L. parisiensis (CIP ). La détection de Legionella spp a été réalisée pour les trois phases. Pour la phase I, deux niveaux de dopage ont été réalisés. Le premier niveau de dopage était contenu dans les tubes A et le deuxième niveau de dopage était contenu dans les tubes B. Pour la phase II, deux niveaux de dopage ont également été réalisés. Le premier niveau de dopage était contenu dans les flacons C et le deuxième niveau de dopage était contenu dans les flacons D. Pour la phase III, les échantillons étaient contenus dans les flacons E. Page 17 sur 19

18 CONTROLE DE LA QUALITE DES MATERIAUX Les différents échantillons (A, B, C, D et E).ont fait l objet d un contrôle de lot sur 10 flacons testés sur la période analytique souhaitée. Résultats CONTROLE DE LA QUALITE DES MATERIAUX Le contrôle de lot a montré que l ensemble des flacons testés (A, B, C, D et E) est homogène et stable sur la période analytique souhaitée REPETABILITE ET REPRODUCTIBILITE Le tableau présenté ciaprès reprend les principales informations pour le paramètre Legionella spp. Valeurs de fidélité Legionella spp : Paramètre Legionella spp Legionella spp Legionella spp Legionella spp Legionella spp Echantillon A B C D E Nombre de laboratoires retenus Nombre initial de laboratoires M = Moyenne générale (n/l) Sr (n/l) SR (n/l) CVr (%) 10,8% 8,2% 36,3% 14,2% 24,2% CVR (%) 30,0% 27,1% 92,8% 96,9% 94,5% M = Moyenne générale (en log) 5,253 6,241 4,667 5,666 5,013 Sr (en log) 0,051 0,035 0,113 0,084 0,098 SR (en log) 0,130 0,104 0,445 0,440 0,425 CVr (%) 1,0% 0,6% 2,4% 1,5% 2,0% CVR (%) 2,5% 1,7% 9,5% 7,8% 8,5% Avec : M = moyenne générale : somme de toutes les données non éliminées, divisée par le nombre de données non éliminées s r : écarttype de répétabilité s R : écarttype de reproductibilité CV r : coefficient de variation de répétabilité (=s r /M), s exprime en % CV R : coefficient de variation de reproductibilité (= s R /M), s exprime en % Plusieurs conclusions apparaissent à la suite de cette étude. La première conclusion concerne la moyenne des résultats obtenus par l ensemble des laboratoires comparée à la valeur moyenne estimée par le laboratoire opérateur (test d homogénéité). La différence maximale entre ces deux valeurs est de 0,25 Log. Page 18 sur 19

19 Les écarts types de répétabilité montrent que l ensemble de la méthode est répétable puisque la valeur maximale obtenue est de 0,113 Log. Enfin, les écarts types de reproductibilité traduisent le degré de complexité des échantillons. En effet, l écart type maximal obtenu pour l analyse des solutions d ADN est de 0,130 Log, il peut atteindre 0,445 pour les échantillons prenant en compte l ensemble des étapes de l analyse (préparation de l ADN et amplification). CONCLUSION Ces données sont conformes aux performances annoncées par le fournisseur. 3. CONCLUSION Les résultats de l étude préliminaire ainsi que de l étude interlaboratoire montrent que les performances de la méthode GeneDisc pour la détection de Legionella spp. sont conformes aux exigences de la norme NF T La validation de la méthode GeneDisc a été reconduite le 04 avril 2012 sous le numéro d attestation GEN 25/0312/07 par AFNOR Validation. La méthode GeneDisc Legionella spp. s applique à tout type d eau, sans restriction d emploi. Page 19 sur 19