REPONDRE DIRECTEMENT SUR LE SUJET. Dessinez un pont disulfure avec les 2 acides aminés correspondants.

Transcription

1 Page 1 sur 6 REPONDRE DIRECTEMENT SUR LE SUJET QUESTIONS DE COURS 1 Les ponts disulfures Dessinez un pont disulfure avec les 2 acides aminés correspondants. Un pont disulfure s établit entre les chaînes latérales de 2 Cystéines. - OOC + 3 CH - - S - S - - CH COO - NH 3 + Si les deux cystéines sont libres (non enchaînées dans les liaisons peptidiques), on obtient la Cystine (dessinée ici) Dans quelles conditions les ponts disulfures se forment ils? La formation du pont disulfure est une réaction d oxydation, il faut donc que les cystéines soient dans un milieu oxydant et non pas réducteur. Comme le cytosol est un milieu réducteur, il n y a pas de pont disulfure dans les protéines cytosoliques. Quel réactif peut-on utiliser pour les rompre? On peut les réduire par le β-mercaptoéthanol ou par le dithiothréitol. On peut également les oxyder par l acide performique. 2 Structure primaire des protéines Comment appelle-t-on le premier résidu d une protéine? Pourquoi? On l appelle résidu N-terminal ou amino-terminal car c est l acide aminé qui garde sa fonction amine en α libre (non engagée dans une liaison peptidique). Mêmes questions avec dernier résidu? On l appelle résidu C-terminal ou carboxy-terminal car c est l acide aminé qui garde sa fonction acide carboxylique libre (non engagée dans une liaison peptidique).

2 Page 2 sur 6 Citez 2 enzymes protéolytiques en précisant leur spécificité d action. Aminopeptidase : hydrolyse sélectivement la première liaison peptidique et détache le premier acide aminé (puis le deuxième, etc) Carboxypeptidase : hydrolyse sélectivement la dernière liaison spécifique et détache le dernier acide aminé (puis l avant-dernier, etc) Trypsine : hydrolyse la liaison peptidique côté C de Lys (K) et Arg (R) Chymotrypsine : hydrolyse la liaison peptidique côté C de Tyr (Y), Phe (F) et Trp (W) La protéase V8 de Streptococcus aureus : hydrolyse la liaison peptidique côté C de Asp (D) et Glu (E) (seulement de Glu dans certaines conditions de tampon) 3 Structure secondaire des protéines : Qu appelle-t-on structure secondaire d une protéine? La structure secondaire est la conformation spatiale répétitive régulière de segments de la chaîne protéique (hélice, feuillet, tour β) Quelle est la principale force qui maintient la structure secondaire des protéines? La liaison hydrogène. EXERCICES I - Après avoir rappelé quelle forme d un acide aminé le ph isoélectrique (phi) caractérise, et donné les domaines de prédominance de chacun des acides aminés suivants, calculez les valeurs des phi de ces acides aminés à partir des valeurs des pk des groupements ionisables à 25 C. pk 1 (COOH) pk 2 (NH 2 ) pk R (chaîne latérale) Asp (D) 2,0 9,9 3,9 His (H) 1,8 9,2 6,0 Tyr (Y) 2,2 9,2 10,1 Le phi caractérise la forme zwitterionique (globalement neutre) d un acide aminé. Il est obtenu en faisant la moyenne arithmétique des 2 pk entourant la zone de prédominance du zwitterion. - HOOC OOC + 3 CH - COOH + CH - COOH 3 Asp - OOC + CH - COO - - OOC 3 2 2,0 3,9 9,9 CH - COO - ph

3 Page 3 sur CH COOH 3 CH COO CH COO - 2 CH COO - NH + NH + N N His 1,8 6 9,2 ph CH COOH 3 CH COO - 2 CH COO - 2 CH COO - Tyr OH OH 2,2 9,2 Ce qui fait pour les phi : OH 10,1 O - ph Pour Asp : (2 + 3,9)/2 = 2,85 Pour His : (6 + 9,2)/2 = 7,5 Pour Tyr : (2,2 + 9,2)/2 = 5,6 II Une protéine P contient 0,905 % en poids de tyrosine? Sachant que la masse molaire de la tyrosine est 181 g.mole -1, calculer la masse molaire minimale de P. Si on considère que l on n a qu une Tyrosine par protéine : La masse molaire de P a été déterminée par chromatographie d exclusion de gel. Il a été trouvé une valeur approximative de g.mole Donner brièvement le principe de cette méthode. Partage qui s'effectue en fonction de la taille des molécules. On utilise des supports sphériques troués de pores dans lesquels les solutés pénétreront ou non, selon leur taille : les molécules sont d'autant plus retenues qu'elles sont petites. (Le support solide est constitué de polymères, dont les chaînes sont plus ou moins pontées pour varier la taille des pores, et qui gonflent en se remplissant d'eau).

4 Page 4 sur 6 - En déduire le nombre de tyrosines contenues dans P. Pour 1 Tyrosine, on avait une protéine de masse moléculaire de g.mole -1 Si la chromatographie par tamis moléculaire donne une masse moléculaire de g.mole -1, c est que la protéine contient 4 Tyrosines. L absorbance à 295 nm d une solution très basique de P donne 0,24. Étant donné que la tyrosine est le seul acide aminé aromatique de P, calculer la concentration de la tyrosine dans la solution, sachant que le coefficient d absorption molaire est : 295 = 1200 L.mol -1.cm -1 (épaisseur de la cuve : 1 cm). - Pourquoi mesure-t-on l absorbance à 295 nm? 295 nm est la longueur d onde maximale d absorption de la tyrosine sous forme déprotonnée (φo -, telle qu on la trouve dans une solution de ph >10,5). - En déduire la concentration de P dans la solution. Utilisation de la loi de Bee-Lambert : A = ε.l.c dans l application numérique, il n est pas nécessaire de faire apparaître la longueur du trajet optique (l) puisque ici la cuve fait 1 cm et que l doit être exprimé en cm. A = 0, 24 U.A. III Détermination de la structure d un hexapeptide P 1 ) L action ménagée sur ce peptide du réactif d Edman permet de mettre en évidence du PTH-Asp. Une hydrolyse totale du peptide restant en milieu HCl 6N à chaud aboutit à l identification des acides aminés suivants : Phénylalanine, Méthionine, Tyrosine, Lysine. Ils sont tous à la même concentration ; un seul acide aminé est à la concentration double des autres. Hexapeptide : 6 résidus P = N C Quelles conclusions peut-on tirer de ces expériences? Pourquoi? 4 acides aminés libérés après hydrolyse acide (dont 1 en concentration double) Puisque après action du réactif d Edman (qui réagit avec l acide aminé en N-terminal) on obtient un PTH-Asp, c est que le peptide commence par Asp P = N Asp C

5 Page 5 sur 6 2 ) Le traitement de P par la chymotrypsine permet d obtenir trois dipeptides B, C et D. Après avoir rappelé le rôle de la chymotrypsine, quelles conclusions-pouvez-vous tirer? La chymotrypsine hydrolyse la liaison peptidique côté C de Tyr (Y), Phe (F) et Trp (W). Il y a 2 aromatiques dans le peptide, une Phe et une Tyr, donc 2 sites de coupure ce qui génère bien 3 peptides. De plus, pour avoir 3 dipeptides, il faut que les acides aminés aromatiques soit en position 2 et 4 : = N Asp C 3 ) L action de la trypsine sur P libère deux peptides E et F. Une action très brève de la carboxypeptidase sur E et F permet d identifier respectivement la Lysine et la Tyrosine. Rappeler le rôle de la trypsine et celui de la carboxypeptidase. Conclusions? La trypsine hydrolyse la liaison peptidique côté C de Lys (K) et Arg (R). Dans le peptide il y a une Lys, 1 site de coupure. C est normal de trouver 2 peptides. La carboxypeptidase hydrolyse la dernière liaison peptidique et libère le dernier acide aminé. On retrouve ici les 2 résidus qui terminent les 2 peptides issus de l hydrolyse par la trypsine. La Lysine termine nécessairement le premier peptide (celui qui contient le résidu N-terminal de P) et la Tyrosine est donc l acide aminé qui est en position C-terminale de P. P = N Asp Lys Tyr C E F Puisqu en position 2 et 4 il y a des aromatiques, c est donc que la Lysine se trouve en position 3 P = N Asp - -Lys - - -Tyr C De plus, puisqu il y a une tyrosine en C-terminal, c est donc que c est un aromatique qu on retrouve 2 fois dans la séquence (sinon il n y aurait pas 2 sites de coupure). L action ménagée du réactif d Edman sur E et F libère respectivement du PTH-Asp et du PTH- Tyr. Conclusions? Les acides aminés libérés par le réactif d Edman sous forme PTH-AA sont les résidus N-terminaux des 2 peptides obtenus après action de la trypsine. Donc on a une Tyrosine qui commence F (puisque Asp commence nécessairement E). Or on a une Tyr qui finit F. C est donc Tyr qui est en double. P = = N Asp - -Lys -Tyr - -Tyr C

6 Page 6 sur 6 4 ) Donner la structure de l hexapeptide P. Pour que la chymotrypsine libère 3 dipeptides, il faut qu en 2, il y ait un aromatique. C est donc la Phe. Il ne reste plus alors qu à placer la Met. P = N Asp Phe Lys Tyr Met Tyr C