La cytométrie en flux en immunohématologie

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1 Transfusion clinique et biologique 9 (2002) MISE AU POINT IMMUNOHÉMATOLOGIE La cytométrie en flux en immunohématologie Flow cytometry in immunohematology P. Gane * Institut national de la transfusion sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, Paris, France Résumé La cytométrie en flux est une technique objective, sensible et quantitative qui permet de mesurer simultanément et très rapidement plusieurs paramètres sur un nombre important de cellules. Ces propriétés font de la cytométrie en flux une technique particulièrement adaptée à l analyse des populations cellulaires complexes, des événements rares et aux études quantitatives. Concernant l immunohématologie, la cytométrie en flux est un outil très utile, voire irremplaçable, pour l étude des doubles populations (transfusions ou chimères hématopoïétiques), la mise en évidence de sous-populations d hématies de faible fréquence (réticulocytes, hématies fœtales dans la circulation sanguine maternelle) et l analyse quantitative de l expression des antigènes de groupes sanguins Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Flow cytometry is an objective, sensitive and quantitative technique which allows rapid and simultaneous analysis of several parameters on a great number of cells. Hence, flow cytometry is particulary suitable for the analysis of complex cell populations, rare events and quantitative studies. In immunohematology, flow cytometry is a very powerfull approach to the study of mixed red cell populations (hematopoietic chimerism, transfusion or bone marrow transplantation), the detection of low frequency cell populations (reticulocytes, fetomaternal hemorrhage) and the quantitative analysis of red blood cell antigens Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Mots clés: Cytomérie en flux; Immunohématologie Keywords: Flow cytometry; Immunohematology 1. INTRODUCTION * Auteur correspondant. Adresse gane@idf.inserm.fr (P. Gane). La cytométrie en flux (CMF) a été mise au point dans les années 60 par les chercheurs de Los Alamos et de Standford aux États-Unis. Elle ne s est cependant réellement développée que depuis les années 80 avec l apparition des anticorps monoclonaux et certaines applications comme le phénotypage des hémopathies malignes et le suivi des populations lymphocytaires dans les pathologies associées au VIH. La CMF est une technique avant tout objective, sensible et quantitative. Les cytomètres en flux, permettent de mesurer simultanément, sur chaque cellule, au moins 6 paramètres (diffusion de la lumière et fluorescences) à une vitesse de plusieurs centaines, voire plusieurs milliers de cellules par seconde Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. PII:S (02)

2 272 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) La fluorescence La CMF est principalement utilisée pour mesurer la fluorescence de cellules qui ont été colorées soit par des techniques d immunofluorescence soit par l utilisation de sondes fluorescentes Les réactions d immunofluorescence On utilise des techniques d immunofluorescence directe (anticorps directement couplé àun fluorochrome) et indirecte (anticorps primaire non couplé, puis dans un second temps, addition d un second anticorps anti-immunoglobuline couplé àun fluorochrome). L utilisation de plusieurs fluorochromes émettant à des longueurs d ondes différentes permet de marquer simultanément les cellules par plusieurs anticorps. Ces réactions sont essentiellement utilisées pour les applications suivantes : Phénotypage des populations cellulaires. Études quantitatives concernant aussi bien l expression des antigènes que la numération des populations cellulaires. Mise en évidence des populations cellulaires rares Les sondes fluorescentes Certains composés fluorescents se fixent plus ou moins spécifiquement sur des structures cellulaires (acides nucléique, protéines, lipides membranaires, mitochondries). Le spectre d émission ou l intensité de fluorescence d autres sondes varie en fonction de la concentration de certains ions, du ph ou du potentiel de membrane. Ces fluorochromes sont donc utilisés pour les applications suivantes : Mise en évidence et quantification de l ADN, de l ARN ou des protéines : analyse du cycle cellulaire, ploïdie, viabilité, apoptose, prolifération et mise en évidence de parasites intracellulaires ou des réticulocytes. Étude des variations de ph, du potentiel de membrane et de la concentration de certains ions (calcium, sodium, zinc). Analyse de différentes activités fonctionnelles : métabolisme oxydatif, activité mitochondriale, phagocytose. Bien entendu, ces techniques et applications ne s excluent pas mutuellement et il est tout à fait possible d utiliser simultanément des sondes fluorescentes et l immunofluorescence pour étudier par exemple le flux calcique dans certaines sous-populations cellulaires. Les seules limitations sont imposées d une part par le nombre de détecteurs de fluorescence de l appareil utilisé et d autre part les caractéristiques des fluorochromes : spectres d excitation et d émission. Une fonction temps peut en outre être utilisée pour mesurer la cinétique de certaines réactions La diffusion de la lumière L intensité de la lumière mesurée dans l axe de la source lumineuse (généralement un laser) est proportionnelle à la taille des cellules alors que la lumière diffusée à 90 varie en fonction de la granularité (contenu cellulaire ou structure). L étude simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer grossièrement des populations cellulaires possédant des caractéristiques très différentes comme les érythrocytes, les lymphocytes, les monocytes et les granuleux du sang périphérique, mais aussi dans certains cas, les cellules mortes et apoptotiques des cellules vivantes. 2. LA CYTOMÉTRIE EN FLUX ET LA LIGNÉE ROUGE L étude des paramètres de diffusion de la lumière ne présente pas beaucoup d intérêt dans la mesure où les érythrocytes matures constituent une population cellulaire relativement homogène. La CMF est donc utilisée essentiellement pour analyser des réactions d immunofluorescence et un grand nombre des applications précédemment citées peut être utilisé en immunohématologie [1-4] Les réactions d immunofluorescence Elles concernent la mise en évidence des antigènes de surface ou intracellulaires. La CMF n offre aucun avantage en terme de sensibilité par rapport aux techniques d agglutination. Les techniques utilisant le test de Coombs et l immunofluorescence indirecte (qui n est rien d autre qu un test de Coombs utilisant une antiglobuline fluorescente) ont des sensibilités tout à fait comparables, de l ordre d une centaine de sites antigéniques (Fig. 1). Par contre, la CMF permet de quantifier d une part l expression des antigènes, la proportion des cellules positives et négatives et de phénotyper chacune des populations d un mélange plus ou moins complexe. Cependant, au moins en ce qui concerne l étude des érythrocytes matures, le phénomène d agglutination induit par les réactions d immunofluorescence, pose un problème spécifique majeur. En effet, la CMF ne permet d étudier que des cellules isolées. Dans la mesure où l appareil n analyse pas des cellules, mais des événements séparés dans le temps, la présence d agglutinats fausse donc les résultats. Ce phénomène est en outre aggravé par le fait que pratiquement tous les anticorps commercialisés sont sélectionnés et conditionnés pour être utilisés dans des réactions d agglutination. De plus, les réactions d immunofluorescence indirecte qui ont l avantage d être nettement plus sensibles que les réactions directes, tendent à intensifier ce phénomène d agglutination.

3 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Fig. 1. Phénotypage des hématies périphériques à l aide d un anticorps monoclonal murin anti-xg. Superposition des histogrammes obtenus avec un anticorps non relevant (pointillés) et l anticorps anti-xg (trait plein gras). Le léger déplacement de la courbe observé avec l anticorps anti-xg témoigne d une faible positivité des cellules qui expriment environ 150 sites antigéniques. Heureusement, la CMF offre plusieurs moyens permettant de sélectionner les cellules isolées. Ils font cependant appel à des notions relativement complexes d analyse des signaux de fluorescence qui dépassent le cadre de cette présentation. L étude de l expression des antigènes de groupes sanguins en CMF se heurte à une seconde difficulté. En effet, toutes les réactions d immunofluorescence ne peuvent être interprétées que par rapport à un témoin de réaction qui permet de définir le «bruit de fond» des cellules analysées, leur fluorescence non spécifique. Idéalement, ce témoin est une immunoglobuline de même classe et sous classe que l anticorps utilisé pour la réaction (pour les anticorps monoclonaux) ou un sérum AB (pour les sérums tests) qui ne reconnaissent aucun déterminant antigénique sur les cellules cible. Les anticorps dirigés contre les antigènes étant majoritairement d origine humaine, il peut être difficile de sélectionner les anticorps témoins adaptés ou des sérums AB en raison de la grande variabilité de leur réactivité Étude et phénotypage des doubles populations et des mélanges complexes Les doubles populations sont observées dans certaines pathologies, les mosaïques, les chimères et les greffes de moelle. Des mélanges parfois très complexes peuvent également être rencontrés lors de transfusions massives et répétées. La CMF est très utile pour phénotyper les différentes populations, particulièrement dans le cas où l une des populations est très minoritaire ou lorsque des doubles populations sont observées avec plusieurs anticorps. Différentes applications utilisant soit uniquement la CMF et des techniques de double ou simple marquages, soit un tri cellulaire puis la CMF seront décrites ci-dessous. a) Les techniques de double marquage paraissent être tout à fait adaptées pour résoudre ces problèmes. L immunofluorescence indirecte n est guère utilisable dans la mesure où la très grande majorité des anticorps sont d origine humaine. Par contre, la conjugaison des anticorps monoclonaux humains ou murins avec la fluorescéine, les cyanines ou les Alexa ne présente pas de difficulté majeure. Dans le cas présenté Fig. 2, nous avons combiné d une part l immunofluorescence indirecte avec des anticorps humains anti-c, -E, -c, -e, et anti-fy a puis un anticorps anti-igg humaines couplé à la fluorescéine et l immunofluorescence directe avec un anticorps monoclonal humain anti-d couplé àla cyanine5. Les hématies RhD positives du receveur qui représentent 5 % des hématies totales ont pu ainsi être facilement phénotypées, ce qui était impossible par les techniques classiques d agglutination. b) La Fig. 3, illustre l utilisation conjointe du phénotypage et d une sonde fluorescente. Le patient de phénotype inconnu, a été typé par immunofluorescence indirecte, grâce à la mise en évidence de ses réticulocytes par un colorant des acides nucléiques (thiazole orange). En effet, dans la très grande majorité des cas, seuls les réticulocytes du receveur peuvent être mis en évidence au-delà d un délai de 24 h après la transfusion [5]. Une technique en tout point comparable a été utilisée pour le suivi des greffes de moelle allogéniques [6]. L étude des réticulocytes présente plusieurs avantages par rapport à celle des hématies matures dont le phénotypage possède un intérêt très relatif à cause de la relativement longue durée de vie des hématies transfusées. Les réticulocytes qui sont facilement mis en évidence sont en outre détectés très rapidement après la greffe. c) Les techniques de simple marquage permettent également de phénotyper des doubles populations, même si celles-ci sont observées avec plusieurs anticorps. La méthode la plus rigoureuse consiste, dans un premier temps à trier les cellules positives et négatives puis, dans un second temps, à phénotyper séparément les cellules ainsi triées. Même si certains les cytomètres en flux sont équipés de modules de tri, le tri de plusieurs millions de cellules par CMF est une opération fastidieuse qui peut prendre plusieurs heures. Par contre, il est tout à fait possible avec un minimum d équipement de trier jusqu à 10 8 cellules, en moins de 2 h, à l aide de billes magnétiques et d un aimant. Les hématies préalablement incubées avec un anticorps ayant induit une image de double population sont mises en présence de billes magnétiques sur lesquelles a été couplé un anticorps anti-immunoglobulines humaines. Après

4 274 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Fig. 2. Phénotypage par double marquage d un sujet polytransfusé dont les hématies de phénotype D+ représentent 5 % des érythrocytes totaux. A, mise en évidence des hématies D+ par simple marquage. B, C, D, E, F doubles marquages avec un anticorps anti-d (ordonnée) et des anticorps anti-c, anti-e, anti-c, anti-e et anti-fya (abscisse). Les cellules doublement négatives sont donc situées dans le quadrant inférieur gauche, les cellules doublement positives dans le quadrant supérieur droit et les cellules marquées par un seul des deux anticorps dans les quadrants supérieurs gauche et inférieurs droit. Les hématies D+ du receveur ont été colorées en noir, les hématies D transfusées en gris. On peut observer très clairement que les hématies du receveur sont de phénotype C, E+, c+, e, Fya. En B on peut remarquer la présence d hématies D, C+etD, C. incubation, le tube de réaction est placé à proximité d un aimant qui va attirer les billes magnétiques et donc les cellules positives vers les parois du tube. Il ne restera alors qu à décanter les cellules négatives restées en suspension puis, après lavage, à récupérer les cellules positives après avoir écarté le tube de réaction de l aimant. Les deux populations cellulaires ainsi isolées peuvent par la suite être phénotypées par simple marquage (Fig. 4). d) Une solution techniquement plus simple permet d exploiter les propriétés quantitatives de la CMF. Elle consiste à comparer les profils de fluorescence obtenus d une part avec un anticorps ayant induit une image de double population et d autre part, avec le mélange de cet anticorps et d un second anticorps reconnaissant un autre déterminant antigénique. Le déplacement vers la droite de l une ou l autre des deux populations (positive ou négative) indique une augmentation de son intensité de fluorescence et donc que le second anticorps s est fixé sur cette population cellulaire. Cette technique a pour principal avantage sa simplicité, mais les résultats peuvent parfois être difficiles à interpréter (Fig. 5). e) Les techniques de CMF peuvent également être appliquées au diagnostic de l Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne (HPN). Cette pathologie qui résulte d une mutation somatique au niveau des cellules souches se traduit par un déficit partiel ou total des protéines de surface liées à la membrane cellulaire par un groupement glycophosphatidylinisitol (CD55, CD58, CD59, en ce concerne la lignée rouge). Sur la population érythrocytaire des patients, on observe le plus souvent deux populations cellulaires : l une exprimant normalement la protéine (type I) l autre étant soit partiellement (type II) soit totalement déficitaire (type III). La CMF est bien sûr plus sensible que le test de Ham classique, particulièrement lorsque la proportion de cellules anormales est faible. Cependant, en raison de la fragilité des hématies pathologiques et des éventuelles transfusions, l étude conjointe des autres lignées cellulaire apparaît le plus souvent nécessaire Mise en évidence des antigènes intracellulaires La CMF permet également de détecter les antigènes intracellulaires. Un grand nombre d anticorps polyclonaux produits par immunisation des animaux par les peptides ou les protéines entières reconnaît le domaine intracellulaire des protéines transmembranaires exprimant des antigènes de groupes sanguins. Afin de rendre accessibles les épitopes reconnus par ces anticorps il est tout d abord nécessaire de fixer les hématies puis de perméabiliser leur membrane. Dans la majorité des cas, les techniques de fixation par la paraformaldéhyde, le formol ou la glutaraldéhyde et de perméabilisation par la saponine ou le SDS induisent une réduction importante de la réactivité antigénique. Il est donc le plus souvent utile de tester plusieurs techniques et de les adapter aux antigènes et aux anticorps testés.

5 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Les études quantitatives Elles concernent d une part la détermination du nombre absolu de cellules d une population cellulaire sélectionnée par un ou de multiples critères (taille, expression d un ou plusieurs déterminants antigéniques) et d autre part la mesure du nombre de sites antigéniques exprimés à la surface des cellules Numération des cellules Les cytomètres ne sont généralement pas conçus pour numérer les cellules. Cependant, ce type de mesure peut être effectué par certains appareils qui prélèvent des volumes fixes et parfaitement déterminés de suspension cellulaire. En outre, plusieurs firmes commercialisent des tubes contenant un nombre précis de microbilles sur lesquelles il suffit d ajouter un volume connu d échantillon. Billes et cellules étant analysées et comptées simultanément, il est alors possible de déduire avec précision la concentration cellulaire de l échantillon. Cette technique est utilisée pour dénombrer les leucocytes résiduels contaminant les préparations plaquettaires et érythrocytaires utilisées en transfusion. Fig. 3. Phénotypage des réticulocytes d un receveur polytransfusé.a,mise en évidence des réticulocytes par une sonde fluorescente, le thiazole orange (Retic Count) qui colore les inclusions d ARN et d ADN des érythrocytes immatures. B, C, D, E, F, G : doubles marquages avec des anticorps anti-b, anti-d, anti-c, anti-e, anti-c et anti-jka (ordonnée) et le thiazole orange (abscisse). Les hématies matures non marquées par la sonde fluorescente ont été colorées en gris, les réticulocytes en noir. Ces derniers sont de phénotype B+, D+, C,E, C+, Jka+. En B et C, on peut remarquer que les hématies (matures et réticulocytes) du receveur qui sont a priori les seules de phénotype B+, D+ sont en fait très minoritaires (environ 8 %) Détermination du nombre de sites antigéniques Les cytomètres en flux sont conçus pour détecter un large spectre d intensités defluorescence. La sensibilité des détecteurs de fluorescence est réglable à volonté et les intensités de fluorescence sont mesurées en unités tout à fait arbitraires. La transformation de ces unités arbitraires en densités antigéniques nécessite donc l utilisation d un étalonnage. L évaluation du nombre de sites antigéniques exprimés par des cellules ne concerne, au moins pour l instant, que les antigènes reconnus par des anticorps monoclonaux murins. Ces déterminations peuvent être effectuées par immunofluorescence directe et indirecte. Les réactions sont basées sur le principe suivant : à saturation des sites antigéniques, l intensité de fluorescence mesurée est directement proportionnelle au nombre de sites antigéniques exprimés. Dans le premier cas, on utilise des microbilles recouvertes d anticorps anti-immunoglobulines de souris lesquelles ont une capacité àfixer un nombre connu d immunoglobulines. L utilisation de billes ayant des capacités différentes permet de tracer une courbe d étalonnage et de faire correspondre un nombre d immunoglobulines à une intensité de fluorescence mesurée. En immunofluorescence indirecte, on utilise des microbilles sur lesquelles a été couplé un nombre connu d immunoglobulines de souris. Dans le second temps de la réaction on ajoute une quantité identique d anticorps antiimmunoglobulines de souris couplé avec un fluorochrome sur les billes et les cellules portant l anticorps. De la même façon que précédemment, il est alors possible de calculer le nombre de sites antigéniques exprimés d après la courbe d étalonnage établi grâce l utilisation d un mélange de billes portant des quantités différentes et parfaitement définies d immunoglobulines (Fig. 6). En toute rigueur, il est difficile d affirmer que les chiffres ainsi calculés correspondent réellement au nombre de sites

6 276 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Fig. 4. Phénotypage d une double population d érythrocytes en simple marquage après séparation des cellules des C+ et C par des billes magnétiques. L analyse de la population cellulaire totale (panel du haut) permet de constater la présence de deux populations d hématies D+ et D et de deux populations C+ et C. Cependant, ces résultats ne nous permettent pas de déterminer quelle population (D+ ou D ) exprime ou non l antigène C. Après avoir été triée avec un anticorps anti-c, la population négative a donc été phénotypée par immunofluorescence indirecte à l aide d anticorps anti-d, anti-c, anti-e, anti-c et anti-e (panel du milieu). Celle-ci apparaît clairement de phénotype D, C, E, c+, e+. Le panel inférieur correspond au phénotypage des cellules positives triées (C+). Bien que celles-ci soient déjà sensibilisées par l anticorps anti-c utilisé pour le tri, on peut remarquer que contrairement à ce qui est observé avec l anticorps anti-e, l addition des anticorps anti-d, anti-c, anti-e et même anti-c induit une augmentation significative de la fluorescence mesurée en présence de sérum AB (SAB). Cette augmentation de fluorescence correspond à la fixation supplémentaire du second anticorps sur cette population cellulaire C+ qui apparaît donc de phénotype D+, C+, E, C+, E+.

7 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Fig. 5. Mise en évidence d une double population avec les anticorps anti-d (A) et anti-c (B). C, D, E, F : superposition des histogrammes obtenus avec l anticorps anti-c (traits pointillés) et les mélanges anti-c+ anti-d, anti-c+anti-e, anti-c+anti-c, anti-c+anti-e (traits pleins). En C, on peut observer que l addition de l anticorps anti-d induit uniquement un déplacement de la population C+, indiquant ainsi que les hématies C+ sont également D+ et que les cellules C n expriment pas l antigène D. En D, l addition d anticorps anti-e ne modifie pas la fluorescence des populations C et C+. En E, l addition de l anticorps anti-c induit manifestement une augmentation de la fluorescence des hématies C. Par contre, aucune conclusion ne peut être déduite de cette expérience, concernant la population C+. En F, nous pouvons observer un déplacement des populations C et C+ qui expriment donc toutes les deux l antigène e. antigéniques, dans la mesure où il faudrait pouvoir vérifier que le second anticorps fluorescent se fixe de façon identique sur les billes et sur les cellules. Cependant, au moins en ce qui concerne notre expérience, les densités antigéniques ainsi calculées sont tout à fait comparables à celles déterminées par d autres techniques beaucoup plus lourdes et complexes utilisant des anticorps radio-marqués (Scatchard). L utilisation d une courbe d étalonnage possède en outre un autre avantage non négligeable dans la mesure où elle permet de comparer des mesures faites à plusieurs jours d intervalle, voire même dans des laboratoires différents. Cette technologie été utilisée, par exemple, pour mettre en évidence, sur les hématies, l augmentation de l expression de molécules d adhésion exprimant des antigènes de groupes sanguins Luthéran et LW dans la drépanocytose (résultats non publiés) mais aussi pour étudier et quantifier l expression des antigènes au cours de la maturation des précurseurs érythroïdes [7] et sur les hématies périphériques [8]. S il n existe pas pour les anticorps humains de système de calibration équivalent à ceux développés pour les anticorps monoclonaux murins, plusieurs auteurs ont mis au point des études quantitatives permettant d utiliser des anticorps d origine humaine afin d étudier par exemple la zygotie (Fig. 7). Ces travaux nécessitent l utilisation d anticorps «dosants» et d un grand nombre de cellules phénotypées en contrôle afin des assurer que les intensités defluorescence mesurées dans les population d hématies homozygotes et hétérozygotes ne se recouvrent pas [9]. Ces techniques sont particulièrement utiles pour mettre en évidence un allèle silencieux. Un troisième type de billes est également utilisable. Leur fluorescence est exprimée en nombre de molécules de fluorochrome (ou équivalent). Leur utilisation ne permet pas de calculer des densités antigéniques mais essentiellement a l étalonner et a régler l appareil de façon à obtenir des résultats aussi reproductibles que possible Étude quantitative des anticorps La CMF est a priori une technique parfaitement adaptée à l étude quantitative des anticorps. En particulier, de nombreuses équipes européennes ont utilisé la CMF pour titrer les anticorps anti-d des femmes enceintes immunisées. Il apparaît cependant qu il est très difficile de standardiser ces

8 278 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) Fig. 7. Intensités de fluorescence observées à l aide d un anticorps polyclonal humain anti-e sur des hématies homozygotes et hétérozygotes. Ce schéma ne montre pas de chevauchement des deux populations. (m = intensité de fluorescence moyenne mesurée en unités arbitraires.) des réticulocytes, mais aussi la mise en évidence des hématies fœtales dans la circulation maternelle à l aide d anticorps anti-cd71, anti-d ou anti-hémoglobine fœtale. Certains auteurs, étudiant les granulocytes, ont réussi à mettre en évidence et à isoler, chez des sujets sains, des cellules ayant un phénotype HPN dont la fréquence moyenne était de 22 pour 1 million de cellules [10]. Fig. 6. Évaluation du nombre de sites antigéniques. A, superposition des histogrammes obtenus avec les cellules marquées par immunofluorescence indirecte avec un anticorps murin (histogramme coloré en noir) et un mélange contenant cinq types de microbilles portant à leur surface un nombre connu et croissant d immunoglobulines de souris (M1, M2, M3, M4, M5). B courbe d étalonnage permettant de faire correspondre un nombre déterminé d immunoglobulines à une intensité de fluorescence mesurée en unités arbitraires. techniques qui se heurtent à nombre de problèmes dont l agglutination, le parallélisme des courbes de titrage et l affinité des anticorps Étude des événements rares La CMF est particulièrement utile pour étudier des populations très minoritaires dans la mesure où il est possible d analyser en quelques minutes plusieurs milliers, voire centaines de milliers de cellules. Les applications de la CMF dans ce domaine concernent, nous l avons évoqué précédemment, la numération des leucocytes résiduels dans les concentrés érythrocytaires et plaquettaires, la numération Études fonctionnelles Un certain nombre de protéines portant des antigènes de groupes sanguins possède une fonction de récepteur. À l aide d anticorps reconnaissant les ligands, il a été possible de caractériser et de quantifier, par CMF, la fixation de l IL-8 et de la laminine respectivement sur les protéines DARC (Duffy) et Luthéran [11,12] exprimées sur les érythrocytes périphériques et sur des cellules eucaryotes transfectées. La grande majorité des antigènes de groupes sanguins sont portés par des protéines transmembranaires. Leurs fonctions de récepteur, de molécule d adhésion et de transporteur étant modulées par leur liaison avec les protéines du cytosquelette, une technique utilisant la CMF a récemment été utilisée pour évaluer cette interaction [13] Les sondes fluorescentes Celle-ci sont relativement peu utilisées pour l étude des cellules de la lignée érythrocytaire. Notons cependant que les techniques permettant la mise en évidence des leucocytes résiduels et des réticulocytes font appel à des sondes fluorescentes des acides nucléiques (iodure de propidium et thiazole orange, respectivement). De la même façon, la

9 P. Gane / Transfusion clinique et biologique 9 (2002) présence de parasites intra-érythrocytaires peut être détectée grâce aux colorants du DNA [14]. Bien que ces techniques ne soient pas d un usage courant, il est tout à fait possible d étudier les variation de ph intracellulaire et du potentiel de membrane des hématies du sang périphérique à l aide de sondes appropriées. Ces techniques peuvent en outre être utilisées avec des lignées de cellules érythroïdes (K562, HEL) exprimant ou non les protéines recombinantes d intérêt, voire des cultures in vitro de précurseurs. 3. CONCLUSION Contrairement à certaines idées reçues, la CMF n offre aucun avantage en terme de sensibilité par rapport aux techniques classiques d agglutination. Cependant, il s agit d une technique irremplaçable pour étudier les populations cellulaires complexes et les événements rares, pour quantifier le nombre et la fréquence des populations d intérêt et pour étudier quantitativement de l expression des antigènes de groupes sanguins. RÉFÉRENCES [1] Freedman C, Lazarus AH. Applications of Flow Cytometry in Transfusion Medicine. Transfusion Medicine Reviews 1995;9: [2] Wagner FF, Flegel WA. Principles and Applications of Red Blood Cell Flow Cytometry. Infusion Therapy and Transfusion Medicine 1998; 25: [3] Garratty G, Arndt PA. Applications of Flow Cytometry to Red Blood Cell Immonology. Cytometry 1999;38: [4] Davies BH. Diagnostic utility of red cell flow cytometric analysis. Clin Lab Med 2001;21: [5] Griffin GD, Lippert LE, Down NS, Berger TA, Hickman MR, Salata KF. A flow cytometric method for phenotyping recipient red cells following transfusion. Transfusion 1994;34: [6] Nelson M, Popp H, Forsyth C, Gibson J. Rapid quantitation of mixed red cell populations using flow cytometry. Clin Lab Hematol 1996; 18: [7] Bony V, Gane P, Bailly P, Cartron JP. Time-course exprression of polypeptides carrying blood group antigens during erythroid differentiation. Br J Haematol 1999;107: [8] Fouchet C, Gane P, Cartron JP, Lopez C. Quantitative analysie of blood XG group and CD99 antigens on human red cells. Immunogenetics 2000;51: [9] Kornprobst M, Rouger PH, Goossens D, Champomier F, Salmon CH. Determination of Rh(D) genotype: use of human monoclonal antibodies in flow cytometry. J Clin Pathol 1986;39: [10] Araten DJ, Nafa K, Pakdeesuwan K, Luzzatto L. Clonal populations of hematopoietic cells with paroxymal nocturne hemoglobinuria genotype and phenotype are present in normal individuals. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96: [11] Tournamille C, Le Van Kim C, Gane P, Blanchard D, Proudfoot AE, Cartron JP, Colin Y. Close association of the first and fourth extracellular domains of the Duffy antigen/receptor for chemokines by a disulfide bond is required for ligand binding. J Biol Chem 1997; 272(26): [12] El-Nemer W, Gane P, Colin Y, Bony V, Rahuel C, Galacteros F, Cartron JP, Le Van Kim C. The Lutheran blood group glycoproteins, the erythroid receptors for laminin, are adhesion molecules. J Biol Chem 1998;273: [13] Gane P, Le Van Kim C, Bony V, El Nemer W, Mouro I, Nicolas V, Colin Y, Cartron JP. Flow cytometric analysis of the association between blood group-related proteins and the detergent-insoluble material of K562 cells and erythroid precursors. Br J Haematol 2001; 113: [14] Saito-Ito A, Akai Y, Kimura M, Kawabata M. A rapid, simple and sensitive flow cytometric system for detection of Plasmodium falciparum. Parasitol Int 2001;50: