Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1

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1 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1

2 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université Epics ALTRA AutoMACS LSRII FACSCAN FACSCALIBUR Epics XL4C Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 2

3 CMF: années 60, laboratoire Pr Herzenberg, Stanford. Technique de routine puissante utilisée en immunologie. Analyse multiparamétrique rapide cellule par cellule Séparation physique des populations cellulaires: tri cellulaire Développement de la CMF: capacité de discriminer des types cellulaires distincts Meilleure compréhension de l immunologie cellulaire et d un ensemble de pathologies Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 3

4 CMF Evaluer et caractériser des cellules en suspension Technique sensible, précision des mesures Information sur une population de cellules Utilise les statistiques pour comparer des données Technique en évolution Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 4

5 Taille relative des cellules Un cytomètre «classique» permet de mesurer des particules allant de 100 nm à 100 µm Il est difficile de mesurer les très petites et les grandes particules: optimisation de l instrument. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 5

6 Principe de la cytométrie en flux Fluidique Des cellules en suspension passent à l intérieur d une veine liquide, Optique sont illuminées par un Laser; elles émettent une fluorescence qui est collectée,filtrée Electronique et convertie par un convertisseur d analyse digital en valeurs qui sont enregistrées puis stockées dans un ordinateur Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 6

7 Echantillon Source de pression régulée Liquide de gaine Détecteur de fluorescence verte Miroirs dichroïques Détecteur de diffraction aux petits angles (FS) Lentille Détecteur de fluorescence rouge Détecteur de diffraction à 90 (SS) Champ électrique Laser - + Photomultiplicateurs Echantillon trié Déchets Echantillon trié Convertisseur d analyse digital Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 7 Ordinateur

8 Fluidique Focalisation hydrodynamique Vitesse d injection de l échantillon La pression du liquide de gaine reste fixe. Une augmentation de la pression d échantillon entraine une augmentation du débit. Plus la pression augmente Plus l échantillon a de liberté de mouvement. Liquide de gaine Echantillon Pression basse (Low) Echantillon Pression haute (High) Liquide de gaine Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 8

9 Fluidique Influence de la concentration cellulaire et de la pression exercée sur l échantillon sur la précision de la mesure Nb d evts Nb d evts Intensité de fluorescence Intensité de fluorescence Echantillon Pression basse (Low) Echantillon Pression haute (High) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 9

10 Optique 1/ Optique d excitation: Un laser Lentilles et prismes pour focaliser le faisceau laser 2/ Optique de réception des signaux: Lentilles pour collecter la lumière émise Miroirs et filtres pour diriger les longueurs d onde spécifiques sur les détecteurs correspondants Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 10

11 Forward Scatter Laser FS Signal FS: Lumière diffractée aux petits angles Proportionnel à la taille de la cellule Détectée dans l axe de la lumière incidente Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 11

12 Side Scatter 90 Laser SS Signal SS: Lumière diffractée aux grands angles Détectée à 90 par rapport à l axe de la lumière incidente Proportionnelle à la granulosité de la cellule Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 12

13 Cellules mononuclées du sang périphérique Seuil ou discriminant(treshold):fs monocytes Fenêtre ou «Gate»: caractérisation d une sous population Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 13

14 Electronique Convertit les signaux optiques en signaux électroniques Analyse la hauteur (H), la surface (A) et la largeur de l impulsion (W) Assure la communication avec l informatique pour le transfert des données Paramètres mesurables d une impulsion Intensité (voltage) Largeur de l impulsion Aire de l impulsion Hauteur de l impulsion Temps Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 14

15 Mesure de la fréquence de distribution des cellules Number of Cells Histogram Event 1 Event 2 Event 3 List-Mode Data FSC SSC FL1 FL Increasing Intensity FL Dot Plot FL Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 15

16 Les fluorochromes Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 16

17 Rendement quantique des fluorochromes Nb photons émis (fluoresence)/nb photons absorbés (excitation) Fluorochromes moins Brillants CD8-PerCP CD8-FITC CD8-ECD CD8-APC CD8-PC7 Fluorochromes très Brillants CD8-PC5 CD8-PE Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 17

18 Fluorochromes les plus utilisés I Petites molécules chimiques: FITC, Cy5, Cy7, Alexa Avantages: Petites (FITC= 389 Da; Cy5= 792 Da) Faciles à coupler à des Ac (par les radicaux amines) Stables Spectre d émission stable Inconvénients: Ecart de Stokes faible ( nm) Rendement quantique faible (peu fluorescents) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 18

19 Fluorochromes les plus utilisés II Protéines: PE, APC, PerCP Avantages: Bonne stabilité Bon rendement quantique (sauf pour le PerCP) Ecart de Stokes moyen ( nm) Spectre d émission constant si la protéine est obtenue chez le même fournisseur Inconvénients: Poids moléculaire élévé (PE= 200 Kda, APC= 120 Kda) Chimie de couplage difficile (Liaison aux Acs par des agents de couplage hétérofonctionnels) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 19

20 Fluorochromes les plus utilisés III Les Tandems: PE-Cy5, PE-Cy5.5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC-Cy7 Association chimique entre un fluorochrome «donneur d énergie» (ex: PE) et un fluorochrome «receveur d énergie»(ex. Texas Red). On mesure l émission de fluorescence du receveur Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 20

21 Fluorochromes en développement IV Les quantum dot Nanocristaux semi-conducteurs de taille inférieure à 10 nm Propriétés biophysiques similaires: même taille, même solubilité, même chimie de conjugaison Photostables: moins sensibles à la dégradation métabolique que les fluorochromes classiques. Spectres d émissions très peu chevauchants : peu de compensation (moins de 6%) Avenir de la CMF polychromatique Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 21

22 Règles pour choisir les fluorochromes Spectre d excitation compatible avec l équipement laser du cytomètre Spectres d émission non chevauchants Associer le fluorochrome le plus fort au marqueur antigénique le plus faiblement exprimé Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 22

23 Les compensations Relative Fluorescence FITC PE ECD PECy 5 APC PECy5. 5 PECy 7 500nm 600nm 700nm Emission Wavelength 800nm Malgré un choix judicieux des fluorochromes qui pourront être utilisés simultanément, l utilisateur ne pourra pas éviter un chevauchement partiel de leurs spectres d émission. On observe alors des fluorescences artéfactuelles du fait de ces fuites de fluorescence lues sur les autres PMT. Il est donc possible, électroniquement de retrancher un certain pourcentage de la fluorescence parasite: c est la compensation. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 23

24 Deux méthodes de calcul des compensations peuvent être utilisées: La méthode des médianes: méthode manuelle La méthode des pentes: compensations automatiques calculées par le logiciel (appareils dernière génération) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 24

25 La méthode des médianes La compensation correcte est obtenue quand la médiane de la population positive à compenser devient la même que celle de la population négative Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 25

26 La méthode des médianes La compensation correcte est obtenue quand la médiane de la population positive à compenser devient la même que celle de la population négative Compensation PE-%FITC= 28.1% Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 26

27 Qu est-ce qu une bonne compensation? Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 27

28 Qu est-ce qu une bonne compensation? Une faible erreur de compensation sur une population de faible fluorescence (A) se traduit par une forte erreur de compensation sur des populations fortement fluorescentes (B et C) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 28

29 Comment fait-on en pratique? 1/ Témoin négatif sert à ajuster les voltages des PMT Cellules non marquées Contrôle avec les isotypes d intérêt (2 couleurs: 2 isotypes; 6 couleurs: 6 isotypes) 2/Les simples marquages servent ensuite à régler les compensations Attention! Si une intensité de fluorescence doit être réajustée il faut modifier le voltage du ou des PMT et recommencer le calcul des compensations. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 29

30 Marquage 6 couleurs CD3 FITC CD38 PE CD45 PerCP-C5.5 CD4 PE-Cy7 CD19 APC CD8 APC-Cy7 Non compensé Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 30

31 Marquage 6 couleurs CD3 FITC CD38 PE CD45 PerCP-C5.5 CD4 PE-Cy7 CD19 APC CD8 APC-Cy7 Compensé Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 31

32 Quels Acs doit on utiliser pour calculer les compensations? Les compensations doivent être calculées avec le même anticorps couplé que celui qui sera utilisé dans le multiple marquage Pour les fluorochromes simples (FITC, APC, PE, Alexa ), le même fournisseur est important Pour les tandems (en particulier Cy7), le même flacon d anticorps doit être utilisé: les tandems sont sensibles à la lumière et à la fixation Les compensations varient avec le lot d Acs fluorescents Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 32

33 Et si les cellules expriment peu l antigène d intérêt? Prendre le même type de cellules positive pour le même marqueur si c est possible Prendre un autre Ac couplé au même fluorochrome si possible du même fournisseur Utiliser des billes spécifiques anti Ig Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 33

34 Les tandems sont sensibles à la lumière CD8-PE-C7 CD3-PE-Cy5 Temps d exposition de l échantillon à la lumière 0 h PE 2 h 4 h Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 34

35 Les cytomètres se valent, ce qui fait la différence: c est la qualité de votre échantillon Cellules en suspension Cellules adhérentes Cultures primaires Lignées Filtration (Tamis 50 à 80 µm) Agrégats Qualité du marquage (concentration en Ac) Fixation ( indice de réfraction des cellules) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 35

36 Les contrôles en cytométrie Contrôles négatifs: Isotype Cellules non marquées Contrôles des compensations de fluorescence: Monomarquages avec chacun des fluorochromes sur les cellules Monomarquages avec chacun des Acs fluorescents sur les cellules Monomarquages avec chacun des Acs fluorescents sur des compbeads Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 36

37 Intérêt des marquages multiples Plus d information pour le phénotypage cellulaire (marqueurs membranaires). 339 CD (homme et souris) caractérisation de populations fonctionnelles (plus de 6 marqueurs) Tests fonctionnels cycle cellulaire (IP, Dapi, BrDU) apoptose flux calcique (indo1, fura, fluo3) Signaux cellulaires Production de cytokines (systèmes multiplex) Transduction du signal Caractérisation molécules phosphorylées Transfection avec protéine de fusion (GFP, BFP, YFP, CFP, DsRed) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 37

38 Applications Analyse Multimarquage membranaire et intracytoplasmique Etude du cycle cellulaire Etude du flux calcique Etude de l apoptose Etude de la prolifération cellulaire Etude de la cytotoxicité cellulaire Tri cellulaire Tri basse vitesse (3000 cellules/sec) Tri haute vitesse (30000 cellules/sec) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 38

39 MARQUAGE 5 COULEURS DE LYMPHOCYTES T HUMAINS Lymphocytes T CD4 Lymphocytes T CD8 Sang total CD45RA ECD Phénotype naïf CD45RO PE Mé moires Taille Structure CD45RO PE Mémoires CD45RA ECD Phénotype naïf CD62L FITC Phénotype activé CD4 PC7 CD62L FITC Phénotype activé CD8 PC5 Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 39

40 APPLICATIONS Analyse du flux calcique Lymphocytes T humains non stimulés Lymphocytes T humains stimulés par l antigène Ratio: indolié/indo libre 3 min 3 min (Equipe Valitutti S.) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 40

41 Flux calcique: Principe de fonctionnement de l indo1 L indo1 est un dérivé acétométhoxyester non chargé et non fluorescent Il est facilement incorporé dans les cellules Des estérases cellulaires le clive en produits tétraanioniques fluorescents qui restent piégés dans les cellules vivantes. L indo1 clivé va se complexer au Ca++ intracellulaire par chélation. L indo émet une fluorescence bleue lorsqu il est libre L indo émet une fluorescence violet lorsqu il est lié au Ca++ On mesure alors le ratio indo lié/indo libre en fonction du temps. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 41

42 APPLICATIONS Analyse du flux calcique Lymphocytes T humains non stimulés Lymphocytes T humains stimulés par l antigène Ratio: indolié/indo libre 3 min 3 min (Equipe Valitutti S.) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 42

43 Prolifération de lymphocytes T après 4 jours de stimulation CD4-PE-Cy5 CFSE CFSE (Equipe Saoudi A.) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 43

44 CFSE: carboxyfluoresceine diacétate succinimidyl Fluorochrome qui se lie de façon covalente à une macromolécule intracellulaire. Peut être détecté par cytométrie en flux jusqu à 8 semaines après injection à des souris par exemple Permet d évaluer la division cellulaire par cytométrie en flux Le marquage est divisé de façon égale entre les cellules filles Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 44

45 Prolifération de lymphocytes T après 4 jours de stimulation CD4-PE-Cy5 CFSE CFSE (Equipe Saoudi A.) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 45

46 Test de cytotoxicité par CMF: Expression de CD107a après activation des NK Exocytose du granule Exposition à la surface de CD107a CD107a activation NK NK Granules lytiques (granzyme, perforine) Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 46

47 Expression de CD107a après activation des NK Contrôle Ac anti-igg1 Activation:Ac anti-cd16 Cellules cibles en apoptose Cellules NK CD56 CD107a (Equipe Le Bouteiller P.) CD107a Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 47

48 Intérêt de la CMF dans les hémopathies malignes 1- Rechercher, confirmer ou infirmer un diagnostic d hémopathie maligne 2- Caractériser la lignée impliquée et son stade de différenciation 3- Définir les sites atteints par les cellules malignes 4- Rechercher des marqueurs pronostiques, thérapeutiques ou de progression tumorale 5- Suivre l efficacité d un traitement et/ou dépister précocément une rechute Différents types de prélèvements: difficultés +/- CMF: technique de référence pour le sang et la moëlle osseuse Liquides biologiques (liq pleuraux, LCR, liq Péritonéaux etc ) Biopsies: bonne mise au point de la préparation de l échantillon en suspension Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 48

49 Bibliographie Baumgarth N., Roederer M., (2000) A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.jim.243, Perfetto SP., Chattopadhyay PK. and Roederer M., (2004), Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol, 4, Chattopadhyay PK. and Al, (2006) Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine, 12, Ouvrages «Practical flow cytometry, fourth edition», Howard Shapiro «La cytométrie en flux», Xavier Ronot, Didier Grunwald, Jean-François Mayol, Jean Boutonnat. Edition Lavoisier Liens utiles Mario Roederer website Cytometry information by Purdue University Association française de cytométrie Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 49