Technologie Luminex : principe, applications, et perspectives

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1 Technologie Luminex : principe, applications, et perspectives Moalic Virginie, Mercier Bernard, Ferec Claude Laboratoire de Génétique Moléculaire et d Histocompatibilité, Centre Hospitalier Universitaire Augustin Morvan, 5 Avenue Foch, BREST RÉSUMÉ La Technologie Luminex est une technologie récente [11] qui, basée sur le principe de la cytométrie en flux, allie l utilisation de microsphères fluorescentes et une double lecture après excitation par 2 lasers. Actuellement, un panel de 100 billes renfermant un ratio différent de fluorescence rouge et orange est utilisable. Ces différentes billes peuvent être couplées à leur surface avec des sondes oligonucléotidiques, des peptides ou des anticorps, permettant ainsi la détection d allèles, d anticorps, ou de peptides. Cet article présente cette nouvelle technologie et fait une revue des applications qui en découlent à l heure actuelle, dans les domaines de l histocompatibilité, de l immunologie, de l infectiologie, de la génétique, de la cancérologie ou de la biochimie. Mots clés: Luminex, Microsphère, Fluorescence. RIASSUNTO Tecnologia Luminex TM : principio, applicazioni, prospettive La tecnologia Luminex TM è una nuova tecnologia basata sulla citometria a flusso che utilizza microsfere fluorescenti e una doppia lettura dopo stimolazione mediante due laser. Attualmente è disponibile un pannello di 100 microsfere definito da differenti rapporti di fluorescenza rossa e arancione. Tali microsfere diversamente colorate possono essere individualmente accoppiate in superficie con sonde oligonucleotidiche, peptidi o anticorpi, consentendo in tal modo la rivelazione di alleli, di anticorpi o di peptidi. Qusta tecnologia viene presentata nell articolo, che passa in rassegna le attuali pllicazioni nei settori dell istocompatibilità, dell immunologia, della genetica, dell oncologia e della biochimica. Parole chiave: Luminex TM, microsfere, fluorescenza. ABSTRACT Luminex Technology: technical approach, applications and future prospects Luminex technology is a new technology, based on fluorescent detection using a flow cytometer, microbeads dyed with multiple fluorescent colours and lasers detection. Currently, 100 different ratios of red and orange fluorescence identify 100 distinctly coloured sets of microspheres. Differently microspheres coloured sets can be individually coupled on surface to a specific probe, a peptide or an antibody. This allows detection of specific alleles, antibodies or peptides. This article traces the development and use of coloured microsphere-based flow cytometric assays in variable domains such as histocompatibility, immunology, infectiology, genetic, cancerology and biochemistry. Key Words: Luminex, Microbead, Fluorescence. INTRODUCTION La technologie Luminex 100 microsphere system (Luminex Corporation, Austin, USA) est une nouvelle technologie, qui allie les compétences de la technique de cytométrie en flux à deux lasers (Luminex 100 Analyzer, Luminex Corporation, Austin, USA) et une utilisation de microsphères ou microbilles en polystyrène. Il s agit d un système multi-analytique puissant puisque jusqu à 100 microbilles différentes peuvent être inclues dans un même puits de la plaque d analyse, ce qui laisse augurer de grandes capacités d analyses. De plus, cette technologie est susceptible d intéresser de nombreuses disciplines biologiques, car de nombreux tests sont actuellement commercialisés ou sont en étape de recherche et développement. Cet article décrit dans un premier temps le principe de la technologie Luminex, puis ses applications actuelles dans différentes disciplines biologiques. 1) PRINCIPE ET DESCRIPTION DU SYSTÈME 1.1) Les microsphères: Il s agit de billes de polystyrène de 5,6 µm de diamètre. Lors de leur fabrication, deux fluorochromes sont incorporés à l intérieur des billes. Pour chaque bille, il existe un ratio précis de la quantité des deux fluorochromes incorporés [16]. Les billes, mélangées au début de l analyse, sont entraînées dans la veine liquide, séparées et identifiées pendant la phase d acquisition des données [11, 34]. A la sortie de la veine liquide, les billes excitées par le laser rouge à 633 nm vont reémettre une fluorescence rouge (675 nm) et infra-rouge (>712 nm). Chaque bille reémet d une façon différente et sera identifiée par les intensités des 2 fluorescences rouge et infra-rouge enregistrées par un capteur à la sortie du flux. Chaque bille a ainsi son propre code couleur d identification, et plusieurs billes différentes (ju- Riprodotto da Immunoanal Biol Spéc 2004; 19: con l autorizzazione del coordinatore di CORATA, Prof. Jacques Ingrand 341 LigandAssay 9 (4) 2004

2 squ à 100 actuellement) peuvent être mélangées dans un seul tube ce qui multiplie considérablement les possibilités d analyses. [11, 34]. Les billes, via leurs groupements carboxylates, servent de support solide à différentes molécules se liant de façon covalente par des groupements aminés: il s agit d antigènes purifiés, de différents anticorps de capture ou de différentes sondes nucléiques caractéristiques d allèles particuliers [11, 17, 18]. La proportion de cibles fixées à une microsphère est d environ 1 à Ces billes présentent l inconvénient d être très sensibles à la lumière [11]. 1.2) Le cytomètre Le terme " cytomètre " est quelque peu mal choisi pour la dénomination de cet appareil, car il n y a pas d analyses cellulaires. Cependant, le principe est identique, puisqu une suspension de billes subit l aspiration, puis le trajet dans une veine liquide. A la sortie de la veine liquide, les billes sont excitées par un jeu de deux lasers, ayant chacun un rôle précis (Figure 1): - le laser rouge à diode (633 nm), qui excite les fluorochromes incorporés aux billes de polystyrène émettant dans le rouge et infrarouge, correspondant au code couleur de chaque bille, et permettant l identification Figure 1 Lasers rouge et vert excitant une microsphère précise de chacune. - le laser vert, qui excite le fluorochrome qui est couplé à une molécule reporter. Cette molécule reporter (Anti-immunoglobuline ou produit d amplification) permet de détecter l interaction antigène / anticorps ou sonde / amplicon se produisant à la surface de la bille, après addition d un conjugué marqué avec un fluorochrome émettant dans le vert. Généralement, il s agit de la phycoérythrine qui, excitée à 532 nm, réemet à 575 nm. La fluorescence émise témoigne alors de la réaction en surface, et détermine la positivité de la réaction en fonction d un seuil de fluorescence propre à chaque bille. Le fluorescence émise par le fluorochrome reporter est détectée par un photomultiplicateur à la sortie de la veine liquide [11, 16]. 1.3) Le lecteur de microplaques et l ordinateur pilotant le logiciel d acquisition des données Des plaques de 96 puits (type ELISA) sont utilisées. Une aiguille descend dans chaque puits, aspire le mélange réactionnel dans la veine liquide. Les billes sont excitées à la sortie du flux, par le jeu de deux lasers. Les billes sont détectées et comptées jusqu à ce que chacune d entre elles ait été détectée au moins 100 fois, soit au moins évènements comptés (100 x 100) (figure 2). Pendant cette lecture, on peut suivre en temps réel cette acquisition, par la progression du pic d acquisition des données. Le logiciel d acquisition permet de détecter et d éliminer les doublets de billes, qui ne sont pas utilisés dans le pic d acquisition (figure 3). Si le pic n apparaît pas pendant la lecture, il s agit essentiellement d un problème de bouchage d aiguille ou alors d un problème de niveau de l aiguille, celle-ci ne descendant pas assez profondément dans le puits pour aspirer le mélange réactionnel. Pendant l acquisition, il est également possible de suivre le positionnement du nuage de billes au sein d un masque pré-établi, chaque nuage correspondant à un lot de microsphères (figure 4). Une déviation du nuage de billes par rapport à son masque peut être observée quelquefois. Il s agit alors soit d un défaut de marquage interne des microsphères, soit d un mauvais réglage de l appareil, dont les lasers sont sensibles aux Figure 2 Comptage des billes lors de l acquisition LigandAssay 9 (4)

3 Figure 3 Pic d acquisition des données Figure 4 Classification des nuages de billes selon les fluorescences rouge et infra-rouge émises variations de température. En effet, une variation de 3 C autour de la valeur seuil impose une nouvelle calibration. Il est donc fortement conseillé de placer cet automate dans une pièce climatisée, afin de ne pas avoir trop de variations de la température des lasers sur plusieurs jours ou dans la même journée. Les recommandations du fabriquant sont de recalibrer les lasers tous les 15 jours environ, s il n y a pas de variation de leur température. Une autre possibilité correspond à une mauvaise conservation des kits, les billes étant photosensibles. 1.4) Caractéristiques de cette technologie Plusieurs considérations sont à prendre en compte pour évaluer cette méthodologie: - La spécificité: elle dépend de la qualité des antigènes purifiés, des anticorps ou des sondes qui recouvrent les billes [34]. - La sensibilité: elle dépend de la qualité du marquage fluorescent et de la stabilité de celui-ci. Il faut savoir que les billes sont très sensibles à la lumière. Les lavages effectués au sein de certains protocoles peuvent aussi influencer la sensibilité de la méthode (perte de billes) [34]. - La simplicité et le temps de manipulation: les protocoles pour lesquels on s affranchit d étapes de lavages, ou de dénaturation de l ADN favorisent la praticabilité des techniques [34]. Chaque plaque de réaction contient 96 puits, et le temps moyen de lecture d un puits varie de 20 secondes à 1 minute 30 en moyenne. - La possibilité de multiplexage des analyses [16]. Par exemple, il existe une possibilité de quantifier le taux de 15 cytokines dans un seul tube [8], ou de détecter les différents allèles d un locus HLA [23]. Les possibilités de multiplexage offrent la possibilité d avoir jusqu à 100 billes différentes dans le même tube. - Le coût: pour l instant, le coût à l achat d un automate est relativement élevé. L investissement nécessite d avoir de grandes séries d examens pour rentabiliser l achat, ou de multiplier les analyses pouvant être pratiquées sur cet automate. 343 LigandAssay 9 (4) 2004

4 1.5) Applications Les analyses réalisables sont les suivantes: - des recherches d anticorps: les billes sont alors couplées avec des antigènes purifiés. Les anticorps éventuellement présents chez le patient se fixent sur les antigènes couplés aux billes. La révélation de cette réaction antigène-anticorps en surface de la bille se fait par l utilisation d une anti-immunoglobuline humaine marquée avec un fluorochrome émettant dans le vert comme la phycoérythrine (figure 5) [13, 27, 30, 31] - des recherches de peptides particuliers, lorsque les billes sont couplées avec des anticorps de capture, la révélation se faisant avec un second anticorps anti-peptide marqué avec un fluorochrome émettant dans le vert (figure 6) [1, 24, 34]. - des recherches d allèles particuliers lorsque les billes sont couplées avec des sondes nucléiques spécifiques permettant de reconnaître des amplicons [5, 9, 23, 32]. L ADN et/ou l ARN cible est donc d abord amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques biotinylées. Les produits de PCR biotinylés obtenus sont ensuite dénaturés. Les amplicons biotinylés et dénaturés sont ensuite mis en contact avec le jeu de billes. La fixation d un amplicon à la sonde spécifique présente à la surface d une bille sera révélée en utilisant de la streptavidine conjuguée à de la phycoérythrine. En effet, la streptavidine se lie à la biotine des amplicons (figure 7). Un autre procédé peut être employé, il est basé sur une amplification de l ADN cible par une PCR asymétrique. Cette dernière utilise deux amorces, dont une en excès marquée avec de la biotine. Cette amplification permet l obtention d amplicons double brin et simple brin marqués à la biotine. L obtention directe de simples brins permet de s affranchir de l étape de dénaturation de l ADN. - de la quantification: cette technologie peut également être utilisée pour réaliser une quantification soit des protéines, soit d ADN et/ou d ARN. Pour que la quantification soit possible, il faut obtenir une réponse proportionnelle à la quantité de cibles recherchées: il est donc nécessaire de connaître précisément le nombre de sites de fixation potentiels de la cible présent dans chaque puits, que celui-ci ne soit pas limitant, puis de réaliser des gammes étalons [4, 10]. Figure 5 Détection d anticorps à l aide de la technologie Luminex Figure 6 Détection d antigènes à l aide de la technologie Luminex LigandAssay 9 (4)

5 Figure 7 Détection d allèles spécifiques avec la technologie Luminex 2 ) LES APPLICATIONS ACTUELLES DE LA TECHNOLOGIE LUMINEX Les applications sont nombreuses et concernent des domaines variés. Les deux plus grands domaines concernés sont la génétique grâce à la réaction d hybridation moléculaire, et l immunologie, grâce à la réaction antigène/anticorps. De ces deux grands domaines découlent d autres nombreuses applications en cancérologie, en infectiologie, en biochimie 1.1) Histocompatibilité Deux sociétés commercialisent en France cette technologie dans le domaine HLA. Il s agit des sociétés InGen (Rungis, France) et BioNoBis (Montfort l Amaury, France). La société InGen commercialise des kits de détection et d identification des anticorps anti-hla de classe I et de classe II d isotype IgG (Labscreen, One Lambda Inc., Canoga Park, CA, USA], ainsi que des kits de typage HLA des loci HLA A, B, DRB1, DQB1, (PCR-SSO en milieu liquide (Séquence Specific Oligonucleotide)) de niveau de résolution générique, soit un niveau de résolution à 2 digits (Labtype, One Lambda Inc., Canoga Park, CA, USA). La société BioNoBis commercialise également des kits pour la recherche d anticorps anti-hla de classe I et II d isotype IgG et des kits pour la réalisation de typages génériques HLA (Loci HLA A, B, DRB1, DQB1 par PCR-SSO en milieu liquide) (Lifematch, Orchid Diagnostics, Stamford, USA). Pour ces deux sociétés, un kit de typage HLA-Cw de niveau de résolution générique devrait sortir courant Par comparaison avec des tests Elisa de détection des anticorps anti-hla, la technologie Luminex est moins consommatrice de sérum, peut être réalisée en un temps plus court [27], mais requiert un équipement plus coûteux [30]. La sensibilité de cette technique est variable selon les études: sensibilité comparable à celle d un test Elisa [28], ou sensibilité meilleure [12]. Par comparaison avec la technique de cytométrie en flux classique, la technique Luminex se montre d une sensibilité équivalente, mais d une meilleure spécificité pour la détection des anticorps anti- HLA [3]. Cette technique est donc sensible, simple et reproductible, et remplace progressivement dans certains laboratoires les techniques plus conventionnelles de détection des anticorps anti-hla comme la lymphocytotoxicité complément dépendante [6]. Plusieurs laboratoires européens, dont certains en France, se sont équipés de cette technologie, pour le dépistage et l identification d anticorps anti- HLA en routine. Concernant les typages HLA, l étude de Osowski et al. [23] démontre que la technologie Luminex utilisée pour réaliser des typages HLA-A, B, et DRB1 de niveau de résolution générique permet de diminuer, pour chaque locus, le nombre d ambiguïtés rendues, par rapport à une technique plus conventionnelle de reverse PCR-SSO sur membrane. Actuellement, de nombreux laboratoires d histocompatibilité ont réalisé des essais encourageants, et certains ont même intégré cette technique en routine pour le rendu des typages HLA. 1.2) Immunologie La méthodologie Luminex est utilisée pour quantifier les cytokines. Tout d abord, cette quantification a été réalisée principalement in vitro dans le surnageant de cultures cellulaires ou in vivo dans les sérums animaux [4, 11, 14, 18,21]. En 2002, l étude de Prabhakar et al. [26] fait mention du dosage de cytokines pro-inflammatoires (TNF α IL 1β, IL6, IL8) dans le sérum de sujets sains, avec des performances de dosages équivalentes à ceux réalisés avec un test Elisa. Une étude récente de De Jager et al. [8] rapporte la détection et la quantification de 15 cytokines (IL- 1α, IL- 1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IFN γ, TNF) simultanément dans le surnageant de culture de cellules mononuclées issus d individus sains et de patients atteints de maladies auto-immunes. Les résultats ont été satisfaisants, et d une sensibilité comparable à un test Elisa classique. Les sociétes commercialisant des kits de dosage de cytokines sont les suivantes: Bender Medsystems (San Bruno, CA, USA), Bio-Rad Lifesciences (Hercules, CA, USA), Biosource International (Camarillo, 345 LigandAssay 9 (4) 2004

6 Le Luminex a été utilisé pour des travaux de recherche, permettant de mesurer le niveau d expression de 4 cytokines, en culture cellulaire et dans le plasma de souris atteintes de tumeur. Les cytokines recherchées participent au processus d angiogénèse tumorale, et le profil d expression des cytokines pourrait permettre dans l avenir d orienda Immuno-analyse & Biologie spécialisée CA, USA), Linco Research (St Charles, Missouri, USA), Quiagen (Valancia, CA, USA), R&D systems (Minneapolis, MN, USA), Rules based Medicine (Austin, USA), Upstate (Charlottesville, VA, USA). Cette technologie est également utilisée pour détecter des auto-anticorps développés par les patients atteints de maladies auto-immunes. Une étude française de Rouquette et al. [29] a comparé la détection des 9 auto-anticorps suivants (anti-adn, anti-ssa, anti-ssb, anti-sm, anti-rnp, anti-scl70, anti-jo-1, anti-ribosome, et anti-centromère) par cette technique à microsphères et par les techniques plus conventionnelles (Immunofluorescence ou Elisa). Les concordances entre cette nouvelle méthode et les méthodes de routine varient de 99,1% à 100% selon les auto-anticorps [29]. Actuellement, quatre sociétés commercialisent des kits pour détection d auto-anticorps en France: Biomédical Diagnosctics (Marne La Vallée, France), Inova Diagnostics Inc. (San Diego, CA, USA), Zeus Scientifics Inc. (Raritan, NJ, USA), Bio-Rad Lifesciences (Hercules, CA, USA). Enfin, l équipe de Dasso et al. [7] a aussi utilisé la technologie Luminex100 comparativement à une technique ELISA, afin de quantifier des immunoglobulines sériques et fécales. Le test ELISA se montre moins reproductible et plus chronophage. Certaines sociétés commercialisent également des kits de détection concernant la détection des IgE spécifiques dirigés contre certains pneumallergènes ou trophallergènes, comme par exemple la société Immune Tech (Menlo Park, CA, USA). 1.3) Infectiologie L étude de Smith et al. [32] a utilisé la technologie Luminex pour déterminer et quantifier des acides nucléiques des virus de l immunodéficience humaine (VIH), du virus de l Hépatite C (HCV), et des Herpès Simplex Virus (HSV). Dunbar et al. [10] ont couplé aux microsphères des sondes de capture spécifiques du gène de l ARN 23S ribosomal de certains pathogènes (Escherichia col, Salmonella, Listeria monocytogenes et Campylobacter jejuni), permettant ainsi de détecter 10 3 à 10 5 copies du génome de chaque bactérie. La même équipe a également couplé aux microsphères des anticorps spécifiques des mêmes microorganismes, permettant la détection de protéines bactériennes. La révélation de la fixation des protéines bactériennes s effectue avec des anticorps biotinylés qui reconnaissent eux-mêmes la streptavidine couplée à la phycoérythrine. Les microorganismes sont détectables à un taux inférieur ou égal à 1000 microorganismes / ml [10]. Cette technologie a été également employée pour détecter des anticorps dirigés contre certains composants viraux (polysaccharide de Haemophilus influenza de type b, toxines de Clostridium tetani et de Corynebacterium diphteriae), avec des résultats satisfaisants par rapport à une technique Elisa plus conventionnelle (diminution du temps de travail et du coût de réactifs pour un niveau de détection comparable) [25]. Jones et al. [15] utilisent cette technologie pour rechercher une corrélation entre différentes souches de virus respiratoire syncitial (VRS), et la susceptibilité d infection à répétition, en détectant des anticorps dirigés contre certains épitopes de la protéine G virale. Une étude américaine de Opalka et al. [22] utilise cette méthodologie afin de déterminer simultanément le titre en anticorps contre les Papillomavirus humains (ou HPV), principalement HVP 6 et 11 associés à des lésions génitales bénignes et HPV 16 et 18, associés à un risque accru de cancer cervical. L étude de Bellisario et al. [2] a montré la possibilité de détecter les anticorps dirigés contre trois antigènes du VIH (p24, gp120 et gp 160) par la technologie Luminex. Cette dernière se montre sensible, précise, et rapide. Le coût par test a été évalué à 1$. 1.4) Génétique Les billes marquées avec des oligosondes nucléotidiques permettent la détection de polymorphismes ou de mutations. Cinq mutations communes du gène CFTR ont été analysées: F508, W1282X, G542X, 621+G T et N1303K. Les primers d amplification sont marqués en 5 par de la biotine. Après amplification, les amplicons biotinylés sont incubés avec les billes. Les amplicons sur les sondes portées par les billes, sont ensuite révélés avec de la streptavidine couplée à la phycoérythrine. Cet essai a permis de détecter sans aucune ambiguïté cinq principales mutations du gène CFTR de façon simultanée, mais la possibilité de couplage des sondes aux billes étant nombreuses, il sera possible dans le futur d utiliser des sondes caractéristiques de 50 mutations CFTR [9]. Certaines sociétés commercialisent des kits de détection des mutations du gène CFTR par technologie Luminex, comme Genaco (Austin, USA), ou ERAgene (Madisson, USA). Colinas et al. [5] ont également déterminé les variants de ß-globine humaine sur du sang de nouveaux-nés dont le génotype était connu, et ce de façon tout à fait satisfaisante. Taylor et al. [33] utilisent cette technologie afin de détecter une vingtaine de polymorphismes nucléotidiques chez 633 patients. La détection par Luminex 100 est comparée à celle utilisant une méthode OLA (Oligonucleotide ligation assay). La concordance de détection des deux techniques est de 99,3%. Les auteurs ont remarqué que le meilleur fluorochrome permettant de détecter la réaction en surface de la bille était la phycoérythrine, par rapport au R6G ou au TAMRA. Actuellement, la majorité des études de détection des polymorphismes de l ADN est réalisée en couplant l analyse mutiplexe de la technologie Luminex, à d autres méthodes de biologie moléculaire telles que la technique OLA déjà citée ci-dessus [33] ou le technique SBCE (Single Based Chain Extension) [20]. Les applications concernant la génétique seront sans doute amenées à se développer de façon croissante, car on peut envisager de coupler aux billes n importe quelle sonde spécifique d allèles, qu il s agisse de polymorphismes, ou de mutations. 1. 5) Cancérologie LigandAssay 9 (4)

7 ter la thérapeutique [19]. Weber et al. [35] ont réalisé des essais d immunothérapie à partir de vaccination à base de peptides tumoraux chez les patients atteints de mélanome. Afin d apprécier la réponse immunitaire engendrée, ils ont mesuré le taux de plusieurs cytokines, dont le TNFa grâce à cette technique utilisant des microsphères. La société Rules Based Medicine Inc. (Austin, USA) commercialisent des kits de détection de marqueurs tumoraux (AFP, CA125, PSA, ACE). 1.6) Biochimie Bellisario et al. [1] ont utilisé ce système multi-analytique afin de rechercher une hypothyroïdie congénitale sur des sérums de nouveau-nés. Cette technologie permet une détection simultanée de la TSH et de la T4 libre. Dans l avenir, en rajoutant à cet essai des microsphères permettant la détection de 17-hydroxyprogestérone, et la trypsine immunoréactive, Pass [24] propose de détecter ainsi simultanément trois maladies chez le nouveau-né, à savoir en plus de l hypothyroïdie congénitale, l hyperplasie congénitale des surrénales et la mucoviscidose. D autres paramètres biochimiques peuvent être recherchés par le Luminex. L éventail des analyses le plus complet est fournie par la société Rules Based Medicine Inc. [Austin, USA], dont les kits permettent la détection de paramètres aussi variés que: calcitonine, insuline, T3, T4, TSH, apolipoprotéine, 1.7) Autres applications Le système multi-analytique Luminex peut être utilisé à des fins de recherche pour explorer les voies de signalisation intra-cellulaires, qui permettent la phosphorylation de protéines via l action des kinases (kits Quiagen par exemple). 3) CONCLUSION La technologie Luminex semble prometteuse pour plusieurs raisons. En effet, il s agit d une technologie transversale pouvant trouver des applications dans la quasi-totalité des disciplines biologiques. D une part, elle est simple et robuste, d autre part, l éventail des analyses réalisables est large (recherche d anticorps, d antigènes, analyses de biologie moléculaire). De plus, le nombre d examens qu il est possible d effectuer en un temps relativement court est important, et il s agit d une technologie pouvant être utilisée à la fois en routine pour un diagnostic mais également à des fins de recherche. La perspective de pouvoir commander des billes nues, avec possibilité pour chaque laboratoire de coupler ce qu il désire en fonction de ses thématiques de recherche est extrêmement séduisante. REMERCIEMENTS Nous remercions la société Bionobis pour les illustrations fournies. RÉFÉRENCES 1. Bellisario R, Colinas RJ, Pass KA. Simultaneous measurement of thyroxine and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay. Clin Chem 2000; 46: Bellisario R, Colinas RJ, Pass KA. Simultaneous measurement of antibodies to three HIV-1 antigens in newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed microsphere-based immunoassay. Early Hum Dev 2001; 64: Bray RA, Wilmoth-Hosey L, Chapman P, Gebel HM. Utility of labscreen for the identification and characterization of HLA alloantibodies. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Carson RT. Vignali DAA. Simultaneous quantitaion of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J Immunol Methods 1999 ; 227: Colinas J, Bellisario R, Pass KA. Multiplexed genotyping of ß-globin variants from PCR-amplified newborn blood spot DNA by hybridation with allele specific oligodeoxynucleotides coupled to an array of fluorescent microspheres. Clin Chem 2000 ; 46: Crupmton J, Lavingia B, Vorhaben R, Stastny P. Antibody screening with multiplexed polystyrene beads coated with HLA class I antigens. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Dasso J, Lee J, Bach H, Mage RG. A comparison of ELISA and flow microsphere-based assays for quantification of immunoglobulins. J Immunol Methods 2002 ; 263: De Jager W, Te Velthuis H, Prakken BJ, Kuis W, Rijkers GT. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin Diagn Lab Immunol 2003 ; 10: Dunbar SA, Jacobson JW. Application of the Luminex LabMAP in rapid screening in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene: a pilot study. Clin Chem 2000 ; 46: Dunbar SA, Vander Zee CA, Olivier KG, Karem KL, Jacobson JW. Quantitative multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP system. J Microbiol Methods 2003 ; 53: Fulton RJ, McDade RL, Smith PL, Kienker LJ, Kettman JR Jr. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clin Chem 1997 ; 43: Goggins R, Lorber MI, Geiselhart LA. Luminex labscreen mixed as a qualitative antibody screening assay. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Goggins R, Wolfe K, Lorber M, Geiselhart LA. Antibody screening via Luminex Labscreen. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Gordon RF, McDade RL. Multiplexed quantification of human IgG, IgA and IgM with the FlowMetrix system. Clin Chem 1997 ; 43: Jones LP, Zheng HQ, Karron RA, Peret TC, Tsou C, 347 LigandAssay 9 (4) 2004

8 Anderson LJ. Multiplexed assay for detection of strain-specific antibodies against the 2 variable regions of the G protein of respiratory syncitial virus. Clin Diag Lab Immunol 2002 ; 9: Joos TO, Stoll D, Templin MF. Miniaturised multiplexed immunoassays. Curr Opin Chem Biol 2001 ; 6: Keij JF, Steinkamp JA. Flow cytometric characterization and classification of multiple dual-color fluorescent microspheres using fluorescence lifetime. Cytometry 1998 ; 33, Kettman J, Davies T, Chandler D, Olivier K, Fulton R. Classification and properties of 64 multiplexed microsphere sets. Cytometry 1998 ; 33: Keyes KA, Mann L, Cox K, Treadway P, Iversen P, Chen YF, Teicher BA. Circulating angiogenic growth factor levels in mice bearing human tumors using Luminex Multiplex technology. Cancer Chemother Pharmacol 2003 ; 51: Lizard G, Duvillard L, Wedemeyer N, Muller C, Ghiringhelli F, Cesbron A, Poncelet P, Gallet F, Kahn E, Gambert P, Gohne W. Microbilles, nanobilles et cytométrie: applications à l analyse et à la purification cellulaire et moléculaire. Pathol Biol 2003 ; 51: Olivier KG, Kettman JR, Fulton RJ. Multiplexed analysis by use of the FlowMetrix system. Clin Chem 1998 ; 44: Opalka D, Lachman CE, Mac Mullen SA, Jansen KU, Smith JF, Chirmule N, Esser MT. Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on virus-like particules for human papillomavirus types 6, 11, 16 and 18 by a multiplexed luminex assay. Clin Diagn Lab Immunol 2003 ; 10: Osowski LD, Jakubek J, Woronkowicz M, Littleton N, Kukuruga D. The Luminex microbead array assay is an excellent sequence specific oligonucleotide probe (SSOP) method for HLA-A, B, DR antigen level typing. Hum Immunol 2003 ; 64 (10 suppl): S Pass KA. Commentary on: use of microsphere immunoassay for simplified multianalyte screening of thyrotropin and thyroxine in dried blood spots from newborns. Clin Chem 2003 ; 49: Pickering JW, Martins TB, Schroder MC, Hill HR. Comparison of a multiplexed cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for quantification od antibodies to tetanus, diphteria, and Haemophilus influenzae type b. Clin Diag Lab Immunol 2002 ; 9: Prabhakar U, Eirikis E, Davis HM. Simultaneous quantification of proinflammatory cytokines in human plasma using the LabMAP assay. J Immunol Methods 2002 ; 260: Pretl K, Chesterton KA, Sholander JT, Leffell MS, Zachary AA. Accurate, rapid characterization of HLA-specific antibody using Luminex technology. Hum Immunol 2003 ; 64: S Ray BL, Ebner D, Balazs I. Identifying HLA alloantibodies using Luminex microspheres. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Rouquette AM, Desgruelles C, Laroche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassay, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003 ; 120: Scholander JT, Graziani JA, Schillinger KP, Zachary AA, Leffell MS. Luminex technology for tests of HLA-specific antibodies. Hum Immunol 2002 ; 63 (10 suppl): S Seideman J, Peritt D. A novel monoclonal antibody screening method using the Luminex-100 microsphere system. J Immunol Methods 2002; 267: Smith PL, Walkerpeach CR, Fulton RJ, Dubois DB. A rapid sensitive multiplexed assay for detection of viral nucleic acids using the FlowMetrix system. Clin Chem 199 ; 44: Taylor JD, BrileyD, Nguyen Q, Long K, Iannone MA, Li MS, Ye F, Afshari A, Lai E, Wagner M, Chen J, Weiner MP. Flow cytometric platform for high throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques 2000; 30: Vignali DA. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods 2000 ; 243: Weber J, Sondak VK, Scotland R, Phillip R, Wang F, Rubio V, Stuge TB, Groshen SG, Gee C, Jeffery GG, Sian S, Lee PP. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor added to a multipeptide vaccine for resected stage II melanoma. Cancer 2003 ; 97: LigandAssay 9 (4)