ETUDES FONCTIONELLES SUR MODELES CELLULAIRES

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1 ETUDES FONCTIONELLES SUR MODELES CELLULAIRES - LES TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT TISSULAIRE ET CELLULAIRE - LA CYTOMETRIE EN FLUX - LES CULTURES CELLULAIRES Professeur Jean CAMBAR Laboratoire de Biologie cellulaire Faculté de Pharmacie Université Bordeaux-Ségalen

2 PLAN DETAILLE LES TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT TISSULAIRE ET CELLULAIRE CAS PARTICULIER DE LA CYTOMETRIE EN FLUX LES CULTURES CELLULAIRES

3 LES TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT TISSULAIRE ET CELLULAIRE Problème du fractionnement d un mélange cellulaire Pourquoi en faire?

4 OBJECTIFS PROBLEME POSE Un organe est constitué d un ensemble de cellules différentes (ex : cœur, rein, vaisseau), Sauf cas rares de cellules spontanément isolées, (immunologie, hématologie), il faut donc préalablement dissocier l organe ou le tissu, Séparer ensuite les différents types cellulaires isolés à partir d un mélange cellulaire complexe, Utiliser les méthodes classiques de séparation d un mélange de protéines, adaptées à la survie des cellules et respectant l intégrité des cellules en vue de leur éventuelle mise en culture, Intérêt de l obtention d un seul type cellulaire en biologie, en pharmacologie ou en toxicologie.

5 INTERET PRATIQUE DE LA SEPARATION DE CELLULES Un organe est toujours constitué de plus d un type cellulaire (cf cours d histologie) Exemples: le cœur, une artère, le rein, etc. Pour connaitre la structure et/ou la fonction d un type cellulaire, il faut que les cellules soient isolées des autres et qu elles constituent une population homogène purifiée. Domaines d intérêt: la biochimie, la cytologie, la culture cellulaire, l hématologie.

6 PRINCIPE DE LA SEPARATION CELLULAIRE STRUCTURE ORGANISEE (ORGANE,TISSU) SUSPENSION CELLULAIRE SEPARATION OU TRI CELLULAIRE CENTRIFUGATION CHROMATOGRAPHIE D AFFINITE CYTOMETRIE EN FLUX ULTRA-CENTRIFUGATION

7 Techniques «douces» de fractionnement, attaque enzymatique et/ou mécanique ménagée (trypsine), préservant l intégrité des cellules (cultures cellulaires), Techniques «plus brutales» d homogénéisation et de lyse cellulaire, préservant l intégrité des organites sub-cellulaires Technique encore plus brutale d homogénéisation pour les dosages biochimiques tissulaires. Disparition de la structure cellulaire ou sub-cellulaire d origine. FRACTIONNEMENT TISSULAIRE, CELLULAIRE ET SUB-CELLULAIRE

8 PARALELLE ENTRE SEPARATION DE PROTEINES ET DE CELLULES Vous avez déjà entendu parler des techniques classiques de séparation d un mélange de protéines, comme: - la CENTRIFUGATION, - la CHROMATOGRAPHIE, - ou l ELECTROPHORESE Ces mêmes méthodes ont été adaptées à la séparation d un mélange de cellules, en essayant de préserver la structure initiale.

9 LES PRINCIPALES METHODES DE SEPARATION D UN MELANGE CELLULAIRE LA SEDIMENTATION LA CENTRIFUGATION CELLULAIRE L ULTRACENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE LA CYTOELECTROPHORESE L IMMUNO - SELECTION CELLULAIRE ( OU CHROMATOGRAPHIE D AFFINITE CELLULAIRE) LA CYOMETRIE EN FLUX

10 APPLICATIONS BIOLOGIQUES DE LA SEDIMENTATION C est la méthode de fractionnement la plus simple, rapide et économique avec des performances limitées. Elle utilise la gravitation universelle 1 g Il faut pouvoir séparer des cellules de grande différence de taille ou de densité. L application, que vous connaissez tous, est la donnée biologique de base: NFVS, Numération Formule - Vitesse de Sédimentation (des hématies)

11 LA CENTRIFUGATION CELLULAIRE ET SES APPLICATIONS Historique (augmenter g) Formule et interprétation Les différents modes de centrifugation en gradient de densité discontinu ou continu Applications

12 FORMULE DE BASE ET INTERPRETATION La formule de la vitesse de déplacement V d une particule (une cellule par exemple) n est pas à connaitre par coeur: V= dr/dt= a 2. (ρp ρm). ω 2. r / 18η 1/ V est donc proportionnelle: - au carré du diamètre (a) de la particule, - à la différence de densité de la particule (ρp) et du milieu (ρm) - au carré de la vitesse angulaire du rotor (ω 2. r ) 2/ V est donc inversement proportionnelle: - à la viscosité (η) du gradient de densité

13 LES DIFFERENTS MODES DE CENTRIFUGATION Nous venons de voir que la séparation de deux particules (= par approximation, aux cellules) dépend de deux paramètres majeurs: le diamètre et la densité cellulaires La séparation peut donc se faire grâce à la seule différence de densité cellulaire (centrifugation isopycnique) ou la séparation peut se faire grâce à la différence de densité et de diamètre cellulaires ( velocity centrifugation)

14 L ULTRACENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE DEFINITION: Centrifugation à grande vitesse supérieure à g et pouvant atteindre jusqu à à g. PRINCIPE: Selon la taille et la densité, on peut séparer les sous - fractions cellulaires, en faisant varier la vitesse de rotation et le temps de rotation. MATERIEL: Des ultra-centrifugeuses réfrigérées (échauffement avec la vitesse de rotation) à basse température, de plus en plus rapides. RESULTATS: C est la méthode de référence pour séparer les organites sub-cellulaires purifiés (noyaux, mitochondries, microsomes, ribosomes, etc..). Risque de contamination. Marqueurs spécifiques.

15 PREPARATION DES ECHANTILLONS Voulant obtenir les sous - fractions cellulaires, il faut faire éclater les cellules. En règle générale, on pratique un broyage mécanique des tissus; c est l homogénéisation des tissus. On peut aussi procéder, par lyse osmotique ou par vibration par ultrasons, en rompant les membranes plasmiques cellulaires, tout en préservant les autres biomembranes des organites.

16 IMPORTANCE DE L ULTRACENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE EN BIOLOGIE CELLULAIRE Couplée avec la microscopie électronique, l ultracentrifugation a permis, dans les années 50-60, la découverte et la connaissance de la structure et de la biochimie d organites majeurs, comme les lysosomes, les peroxysomes ou les ribosomes.

17 OBTENTION DES SOUS - FRACTIONS CELLULAIRES - Prélèvement et dissection d un échantillon(biopsie de tissu ou d organe) - Homogénéisation tissulaire par broyage mécanique - Différentes centrifugations (1000, ou g) - Centrifugation 1 (1.000g): NOYAUX et surnageant (S1) - Centrifugation 2 (10.000g): MITOCHONDRIES et S2 - Centrifugation 3 ( g): MICROSOMES et S3 - Centrifugation 4 (10.000g): On reprend la fraction Microsomes. On ajoute un détergent pour décoller les RIBOSOMES des membranes du RETICULUM. Centrifugation.

18 SEPARATION DE SOUS - FRACTIONS CELLULAIRES PAR CENTRIFUGATION Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3 ème édition

19 SOUS - FRACTION NUCLEAIRE Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3 ème édition

20 SOUS - FRACTION MITOCHONDRIALE Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3 ème édition

21 SOUS - FRACTION GOLGIENNE Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3 ème édition

22 SOUS - FRACTION MICROSOMES ORIGINE DE LA FRACTION MICROSOMES Biologie moléculaire de la cellule Lodish, 3 ème édition

23 3/ LA CYTOELECTROPHORESE a/ Généralités sur l électrophorèse et la cyto - électrophorèse b/ Cyto - électrophorèse en régime continu et sur gradient de densité c/ Techniques d électrophorèse dans l espace

24 ELECTROPHORESE ET CYTOELECTROPHORESE On peut séparer des protéines dans un champ électrique selon leur différence de charge: c est l électrophorése. De même, on peut séparer des cellules dans un champ électrique selon leur différence de charge, liée à leur surface cellulaire: c est la cyto - électrophorèse. - en règle générale, les cellules sont électro - négatives; origine de cette électro-négativité? Mais, dans des conditions pathologiques, l électro - négativité diminue. - technique particulièrement utilisée en immunologie.

25 EXPERIENCES D ELECTROPHORESE ET DE CYTOELECTROPHORESE DANS L ESPACE La séparation de deux particules est, sur terre, limitée par la gravité. La séparation dans un champ électrique s accompagne d un échauffement (effet Joule). Dommageable pour les cellules. Dans l espace, en apesanteur, lors des vols Apollo et Soyouz, des expériences ont permis de séparer des matériaux et des cellules 500 à 700 fois plus abondants et 4 à 5 fois plus purs que sur terre. (ex.: obtention de cellules neuroendocrines, de neuromédiateurs).

26 4/ IMMUNOSELECTION CELLULAIRE (= CHROMATOGRAPHIE D AFFINITE CELLULAIRE) - principe de la chromatographie d affinité - les phases non miscibles ligand/matrice - séparation des cellules selon leurs propriétés de surface membranaire - les différents ligands pour immunoadsorber les cellules (anticorps, hormones, lectines) - applications

27 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE Biologie moléculaire de la cellule Alberts, 4 ème édition

28 LA CHROMATOGAPHIE D AFFINITE Biologie moléculaire de la cellule Alberts, 4 ème édition

29 PRINCIPE DE LA CHROMATOGAPHIE D AFFINITE La chromatographie d affinité (moléculaire ou cellulaire) occupe une place importante dans les méthodes de séparation des molécules biologiques et des cellules d un mélange. Le principe repose sur l adsorption spécifique et réversible d une substance ou d une cellule sur un ligand immobilisé irréversiblement, luimême fixé sur un support appelé matrice. Les acteurs en présence: matrice / ligand / cellules à séparer.

30 REFLECHISSEZ QUELQUES SECONDES!! Quel est le but de cette expérimentation? Obtenir une suspension pure de cellules Pour cela, il faut détacher les cellules de leur ligand spécifique La liaison ligand/cellule DOIT être REVERSIBLE A l inverse, la liaison matrice/ligand DOIT être IRREVERSIBLE, car la même colonne sert plusieurs fois.

31 Les différents ligands pouvant immuno-adsorber les cellules Nous venons de voir que le mélange de cellules présentant des surfaces membranaires variables va se présenter devant un ligand fixé solidement sur des billes, la matrice support. Les ligands se lient à des constituants membranaires de la cellule, qui peuvent être par exemple: - des anticorps (reconnus par un antigène ) - des hormones (reconnues par un récepteur), -des lectines (reconnues par des sucres des glycoprotéines)

32 TRI CELLULAIRE PAR CYTOMETRIE EN FLUX (FACS) Principe et définition Originalité de la technique : analyse multiparamétrique cellule par cellule d un mélange cellulaire complexe (plusieurs critères possibles) Principe de l appareil et principaux éléments de l analyseur Approche qualitative (analyse) et quantitative (tri) Les paramètres cellulaires mesurables par cytofluorimétrie Traitement du signal et interprétation des résultats Quelques applications (biologie cellulaire, hématologie, cancérologie, toxicologie cellulaire)

33 LES PRINCIPALES METHODES DE SEPARATION D UN MELANGE DE CELLULES ET LE(S) CRITERE(S) DE SELECTION - LA CENTRIFUGATION CELLULAIRE - et L ULTRACENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE Densité, taille - LA CYTOELECTROPHORESE Charge électrique - L IMMUNO - SELECTION CELLULAIRE ( OU CHROMATOGRAPHIE D AFFINITE CELLULAIRE) - Caractères structuraux spécifiques - LA CYOMETRIE EN FLUX De très nombreux paramètres à la fois

34 Principe et technique (1) - Place originale parmi les méthodes de séparation cellulaire - Les caractéristiques essentielles de la technique Des capteurs spécifiques sont capables de mesurer la fluorescence de différents fluorochromes, qui peuvent se positionner à la surface ou à l intérieur de la cellule

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36 Principe et technique (2) - Utilisation de sondes fluorescentes spécifiques - Les paramètres cellulaires mesurables - Exemple du marquage des protéines et des acides nucléiques -Principe du fonctionnement - Les principaux éléments de l analyseur - Approche qualitative (analyse) - Approche quantitative (tri cellulaire)

37 QUELQUES APPLICATIONS DE LA CYTOMETRIE EN FLUX - Etude du cycle cellulaire - Analyse des chromosomes (caryotype) - Viabilité cellulaire (cytotoxicité) - Etude de la membrane cellulaire - Etude des cellules immunitaires - Application en hématologie - Application en cancérologie

38 LA CYTOMETRIE EN FLUX: APPLICATION A LA TOXICITE CELLULAIRE (1) POPULATION TEMOIN Documents personnels

39 LA CYTOMETRIE EN FLUX: APPLICATION A LA TOXICITE CELLULAIRE (2) POPULATIONS TEMOIN ET INTOXIQUEE Documents personnels

40 LES CULTURES CELLULAIRES

41 PLAN DE LA PARTIE «CULTURE CELLULAIRE» - bref historique - modèles in vivo et in vitro - principe et définition - la technique de mise en culture - quelques applications - application du futur: la thérapie cellulaire

42 BREF HISTORIQUE - Technique introduite, dès la fin du XIXéme siècle, utilisée en histologie et en embryologie, puis en cancérologie. - Développement des méthodes, dites alternatives à l expérimentation animale, dans les années Essor considérable en recherche publique et privée, notamment dans l industrie pharmaceutique, avec le développement de la pharmaco-toxicologie cellulaire.

43 DES MODELES IN VIVO A IN VITRO ORGANISME ENTIER (rat, souris, homme) IN VIVO ORGANE ISOLE IN VITRO (rein, cœur, ventricule, duodénum, iléon) TRANCHES D ORGANE (foie, rein, cerveau) SUSPENSION CELLULAIRE Etude directe Cultures cellulaires Sous-fractions cellulaires

44 RETENEZ BIEN LA DIFFERENCE ENTRE L IN VIVO ET L IN VITRO!! QUAND S ARRETE L IN VIVO? OU COMMENCE L IN VITRO?

45 PRINCIPE ET DEFINITION La culture d organes ou de tissus permet la conservation prolongée de cellules vivantes à l extérieur d un organisme vivant. On peut ainsi conserver des fragments de tissus prélevés aseptiquement, dans des conditions stériles, dans un milieu nutritionnel riche pendant plusieurs (dizaines) de jours, placés dans une étuve, à la température de l organisme, chez qui a été prélevé le tissu.

46 La technique des cultures cellulaires Ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de l organisme: Cultures primaires Dissociation du tissu (Enrichissement) Mise en culture

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48 LA TECHNIQUE DE MISE EN CULTURE - prélèvement de l échantillon, - dissociation tissulaire (attaque mécanique ou enzymatique) - mise en culture (conditions de stérilité) - développement de la culture - surveillance de la culture (température, ph, teneur en CO2, absence de virus ou de bactéries) - étude directe, repiquage, congélation,

49 QUELQUES REMARQUES SUR LA TECHNIQUE DES CULTURES CELLULAIRES - Modèles in vitro vs in vivo - Cultures histiotypique et organotypique - Culture cellulaire en monocouche ( assise cellulaire unique), sur un support. - Possibilité d observation directe sous un microscope photonique, dit inversé. - Grande analogie entre une culture cellulaire en monocouche et une coupe histologique pour la microscopie photonique. Mais, la différence: c est un tissu vivant non fixé.

50 BOITES DE CULTURE ET BOITES DE PETRI POUR LA CULTURE CELLULAIRE COMME SUPPORT CELLULAIRE Documentations techniques

51 EXEMPLES DE DIFFERENTES TAILLES DE BOITE DE CULTURE SELON L USAGE

52 DIFFERENTES BOITES MULTI - PUITS DE CULTURE INTERET PRATIQUE Documentations techniques

53 PIPETTE MULTI-CANAUX POUR ENSEMENCER DES BOITES MULTI-PUITS Culture of animal cells Freshney, 4 ème édition

54 HOTTE A FLUX LAMINAIRE POUR LA MISE EN CULTURE EN MILIEU STERILE Culture of animal cells Freshney, 4 ème édition

55 ETUVE THERMOSTATEE (37 ) A CO2 POUR CULTIVER LES CELLULES Culture of animal cells Freshney, 4 ème édition

56 MICROSCOPE INVERSE POUR L OBSERVATION DIRECTE DES CULTURES Documentations techniques

57 Cellules épithéliales en culture (avant et à confluence) Définition de la confluence Avant confluence A confluence Documents personnels

58 EXEMPLE DE CONTAMINATION D UNE CULTURE CELLULAIRE Documents personnels

59 CONGELATION DE CELLULES CULTIVEES POUR CONSERVATION (STOCKAGE)

60 Utilisation des lignées cellulaires en cultures cellulaires (Intérêt) Lignées cellulaires établies Un seul type cellulaire Type spécifique Immortelles Prolifération rapide

61 QUELQUES APPLICATIONS DES CULTURES CELLULAIRES Connaissance de la structure et de la physiologie cellulaire sur tissu vivant, Maintien des cellules dans des conditions «physiologiques» comme in vivo, Etude de la toxicité cellulaire Etude directe de la contraction cellulaire Utilisation future des cellules en culture pour la thérapie cellulaire

62 LES INSERTS POUR LES CULTURES DE CELLULES EPITHELIALES POLARISEES Documents techniques

63 CINETIQUE DE VARIATION DE TAILLE D UNE CELLULE MUSCULAIRE EN CULTURE Documents personnels

64 METHODES IMMUNOHISTOCHIMIQUE REVELATION DES FILAMENTS D ACTINE Documents personnels

65 % Mortalité Cellulaire COURBE DE TOXICITE DETERMINATION DE LA CI SFV 0 % 0 SFV 5 % 0, mm Tox Documents personnels

66 % Mortalité Cellulaire SFV 0 % SFV 5 % 0, Cytotox mm Cytométrie en flux Documents personnels

67 CULTURE CELLULAIRE ET THERAPIE CELLULAIRE DEFINITION La thérapie cellulaire consiste en l injection de cellules humaines à un patient dans le but de prévenir, traiter ou atténuer sa maladie. APPLICATIONS EN PATHOLOGIE Les cellules obtenues, par prélèvement direct ou après prolifération en cultures cellulaires, sont injectées au patient (= greffe cellulaire). Exemples de greffes de cellules sanguines (leucémie), cutanées (greffe de peau chez les brûlés), musculaires (infarctus du myocarde) ou nerveuses (pathologies neurodégènératives).