3. METHODES ALTERNATIVES

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1 POURQUOI? Inconvénients des méthodes classiques Besoins: Rapidité Précision Faible coût Spécificité Principe des méthodes alternatives: pas de mise en culture

2 LES ACTIVITES ENZYMATIQUES PHOSPHATASES 4-paranitrophényl phosphate disodique nitrophénol PEROXYDASE H 2 O 2 + 2H + + 2e - + gaïacol H 2 O + Gaïacol réduit REDUCTASE Bleu de méthylène ou Résazurine GLUTAMATE DECARBOXYLASE E. coli cellules/ml

3 LES ACTIVITES ENZYMATIQUES DOSAGE ENZYMATIQUE DU PYRUVATE PYRUVATE lactate LACTATE déshydrogénase + NADH COLORIMETRIE 340 nm FLUORESCENCE 460 nm Pseudomonas sp bact/ml E. Coli bact/ml Salmonella sp bact/ml

4 LES CONSTITUANTS CELLULAIRES L ATP Luciférase + LuciférineH 2 + ATP Mg++ L-LH2.AMP + PP L-LH 2.AMP + O 2 L + AMP + CO 2 + LH 2 + hν 10 4 bactéries / ml 10 2 levures / ml

5 LES CONSTITUANTS CELLULAIRES LES ACIDES NUCLEIQUES DEFT : Direct Epifluorescent Filter Technique Echantillon + Réactif Acridine Orange 5 min, 35 C, Filtration 0,2µ Microscopie à Epifluorescence Cellules mortes ARN/ADN faible Cellules vivantes ARN/ADN fort 10 3 bact/ml

6 LES MESURES PHYSICO-CHIMIQUES Turbidimétrie : loi de Beer Lambert Potentiel redox Impédancemétrie : Z traduit la Conductance (G=1/R), la Capacitance (C) et la Fréquence appliquée (F) Z 2 = 1/G 2 + (1/2πFC) 2 Conductance G augmente, Impédance Z diminue Paramètre mesuré :Temps de détection E. coli bact/ml

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9 LES MESURES PHYSIQUES Exemples de temps d analyse par impédancemétrie ANALYSE FAMT METHODE TRADITIONNELLE 48h IMPEDANCEMETRIE 6-24h Coliformes 24h 6-14h Levures/ Moisissures B. lactiques 5j 3-5j 24-48h 24-48h

10 LA CHROMATOGRAPHIE CPG Alcools, acides gras volatils, acétoïne, CO 2 HPLC Sucres, acides aminés,acides organiques DETECTION, COMPARAISON

11 LES METHODES IMMUNOCHIMIQUES Méthodes directes Méthodes indirectes METHODES IMUNOENZYMATIQUES : ELISA Sandwich Compétition SPECIFICITE Salmonella, Listeria MAIS ENRICHISSEMENT

12 LA CYTOMETRIE DE FLUX

13 LES METHODES MOLECULAIRES

14 LES METHODES MOLECULAIRES Sonde par hybridation : ENRICHISSEMENT NECESSAIRE

15 LES METHODES MOLECULAIRES Sonde par hybridation

16 LES METHODES MOLECULAIRES Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) DIMINUTION DE LA PHASE D ENRICHISSEMENT

17 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES Automatisation? Techniques simplifiées Petrifilm Ensemenceurs SPIRAL Intérêts Limites économiques

18 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES LIMITES DE LA RÉGLEMENTATION Limite de détection ou sensibilité Reproductibilité et répétabilité Justesse Précision Spécificité

19 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES Justesse = X - X vraie et l erreur relative de la justesse = (X - Xv / X) x 100 Précision : Ecart-type S = (X - Xv) 2 / n -1 Coef. Variation = (S / X) x 100 Reproductibilité et Répétabilité Limite de détection Sensibilité = Vrais P / (Vrais P + Faux N) x 100 Spécificité = Vrais N / (Vrais N + Faux P) x 100

20 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES Nombre de germes/ml Mauvaise justesse Bonne précision Mauvaise justesse Mauvaise précision Bonne justesse Bonne précision

21 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES Comparaison de méthodes de détection de Salmonelles MÉTHODE KIT SENSIBILITÉ SPÉCIFICITÉ Immuno. Lumac 91,4 98,5 Transia 95,5 85,5 Organon 88,9 82,6 Sonde ADN GeneTrak 77,5 100

22 4. METHODES CLASSIQUES AUTOMATISEES OU METHODES ALTERNATIVES La qualité microbiologique nécessite méthodes précises, rapides, peu coûteuses Méthodes alternatives Intérêt de l automatisation Problème du seuil de détection Validation : + de 50 méthodes alternatives, dont 20 ISO, validées pour l alimentaire par l AFNOR

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