ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON APPLICATIONS DU TEST DE COOMBS EN MEDECINE VETERINAIRE CANINE THESE

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1 ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n 47 APPLICATIONS DU TEST DE COOMBS EN MEDECINE VETERINAIRE CANINE THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 4 septembre 2007 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par Gerber Emmanuelle Née le 23 février 1982 à Colmar

2 "Toujours imbus des principes d'honnêteté qu'ils auront puisés et dont ils auront vu des exemples dans les Ecoles, ils ne s'en écarteront jamais. Ils distingueront le pauvre du riche. Ils ne mettront point à un trop haut prix des talents qu'ils ne devront qu'à la bienfaisance et à la générosité de leur patrie. Enfin, ils prouveront par leur conduite qu'ils sont tous également convaincus que la fortune consiste moins dans le bien que l'on a que dans celui que l'on peut faire." Serment de Bourgelat (1777)

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4 A Monsieur le Professeur Jérôme Etienne, Doyen de la faculté de Médecine de Lyon, Qui m a fait l honneur d accepter la présidence de mon jury de thèse. Avec toute ma gratitude et mes hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Luc Chabanne, De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m a fait l honneur d encadrer ce travail et de me guider tout au long de sa réalisation. Merci pour vos conseils. A monsieur le Professeur Jean Luc Cadoré, De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m a fait l honneur d accepter de juger ce travail sans hésitation. Sincères remerciements. A madame le Docteur Pastor Mélanie, De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m a fait le plaisir de me suggérer ce sujet de travail Et qui a accepté de m aider dans l élaboration de ce travail. Merci.

5 A Xavier, Comment décrire tout ce que tu représentes pour moi en quelques lignes? Une thèse n y suffirait pas Tu es celui avec qui et pour qui j avance chaque jour un peu plus vers le bonheur. Merci pour tout ce que tu m as apporté, tout ce que tu m apportes et, je l espère, tout ce que tu m apporteras encore.

6 A MA FAMILLE A mes parents, Pour m avoir soutenue en toute circonstance. Pour m avoir permis d assouvir chacune de mes passions, l équitation d abord, mon métier ensuite. Pour votre amour et pour avoir fait de moi ce que je suis aujourd hui. A Célia la plus petite de mes petites soeurs, Trouve ici toute la tendresse que je te porte, même si je ne te le montre certainement pas assez. A Stéphanie la plus grande des petites soeurs, Pour tous ces moments passés à se chamailler pour des broutilles, à se tirer les cheveux et à se faire pleurer. Pour ces trop rares instants de confidences. A papi et mamie, Pour l affection inconditionnelle que vous nous portez à toutes les trois, Malgré l éloignement et la rareté de mes appels téléphoniques, sachez combien vous comptez pour moi. A pépé et mémé, J aurai tellement apprécié que vous soyez là pour partager ce moment avec moi, et vous certainement encore plus. A Aline, ma cousine d Australie (!), En souvenir de notre enfance passée à construire des cabanes, à essayer de monter un club nature, à raconter nos secrets à la «boite aux lettres jaune», à faire des batailles de crêpes. En souvenir de ton mariage pour lequel tu m as fait l immense plaisir de me demander d être ton témoin. J espère encore partager beaucoup avec toi malgré mon éloignement et mes nouvelles qui s espacent de plus en plus désolée pour ce silence, sache que je pense souvent à vous.

7 A MES AMIS A Clément, Pour ta présence dans les bons comme les mauvais moments ; tu es l ami que chacun espère trouver un jour. A Arno, Pour ton calme et ta disponibilité. J espère que ta vie avec Gaëlle sera à l avenir plus facile, vous le méritez. A Anne Laure, Pour ton caractère bien trempé derrière lequel se cache une grande gentillesse ainsi qu une générosité exceptionnelle. Je sais que tu vas trouver l âme sœur, tu es une fille formidable! A Alex et Neige, Pour les soirées bières-pizzas, pour les soirées Vodka-baignoire... A la vôtre!!! A Bruno et Amélie, A Bruno pour sa perfection et à Amélie pour sa «sportivité». Vous êtes adorables tous les deux, je vous souhaite beaucoup de bonheur. A Dron, Pour ta vision décalée de toutes les choses de la vie, qui m a fait beaucoup rire. A Ped et Kitty, En souvenir des vacances à la mer, des trajets en voiture Nord Est-Lyon et de toutes les soirées OBI qui sont vraiment de la «Connerie» euh pardon «Folie». Merci à toi Ped, pour ton coté déjanté heureusement bien tempéré par Kitty! A Kro et Aurélie, Pour toutes ces moments passés avec vous à refaire le monde! A Yoko, mon cher fils de clinique, Tu m as surprise par tes qualités au cours de notre année de clinique commune. Conserve ce grand cœur et laisse ton foie un peu tranquille ensuite seulement ta dulcinée te tombera dans les bras ;-).

8 A TOUTES CES PERSONNES QUI M ONT FORMEES A tous mes professeurs, Merci d avoir cru en moi. Aux vétérinaires qui m ont accueilli en stage ou en remplacement, Merci de m avoir fait confiance. Et tout particulièrement, merci: *Patrice et Brigitte pour votre accueil si chaleureux et votre sympathie. *Aux vétos de la Clinique des Roches (Villefontaine), pour m avoir fait confiance tous ces week end de garde. Et surtout pour être la preuve vivante qu il est possible de travailler en couple!! Dédicace particulière à Céline et Guillaume! *Louis Phillipe, autrement dit au Doc, pour m avoir donnée confiance en moi surtout pour les chirurgies, pour m avoir appris à faire de vrais nœuds de matelot breton et pour m avoir permis de découvrir ta clientèle alsacienne si sympathique! Merci aussi à leurs ASV ; Danièle sans qui je crois que j aurai été perdue cet été 2006 et Peggy si spontanée et si efficace. Enfin un Grand Merci à Babette et Slim, Pour toutes ces heures passées au labo d hémato avec vous, pour votre aide si précieuse dans la réalisation de mes tests de Coombs, pour le thé de 11 heures et les ragots colportés. A toi Slim, je te souhaite de trouver au moins le bonheur puisque que tu ne crois plus au grand Amour. A toi Babette, pour ton regard si calme et si raisonné sur la vie.

9 AUX ANIMAUX Aux chevaux. A Siam, Parti brutalement, trop tôt. A Bounty, Si tu n avais pas besoin de litière tu pourrais être le chat parfait. A Tayot, Le chat parfait! A tous ces chiens qui ont donné leur sang pour la science et pour le test de Coombs! A toux ceux qui au moins auront lu ces premières pages, MERCI!

10 SOMMAIRE SOMMAIRE... 1 TABLE DES ILLUSTRATIONS... 7 TABLE DES TABLEAUX... 9 LISTE DES ANNEXES LISTE DES ABREVIATIONS INTRODUCTION LE TES T DE COO MBS, ORIGINE, PRINCIPE ET DEFINITIO N I. Historique A) La découverte du test à l antiglobuline B) Le test direct à l antiglobuline C) Les utilisations du test au cours du XXème siècle Anémies hémolytiques acquises Agglutinations bactériennes Détection des anticorps «réagines» L antiglobuline, molécule d étape dans les tests immunologiques II. Interactions antigène-anticorps in vitro A) Facteurs influençant l agglutination La sensibilisation (a) Complémentarité stérique (b) Complémentarité électrique et affinité Agglutination (a) Potentiel ζ (zêta) (b) Théorie des ponts ou du réseau (c) Anticorps complets et incomplets (i) Hémagglutination directe...28 (ii) Hémagglutination artificielle...29 B) Immunoglobuline G et complément Le complément (a) Voie classique et voie des lectines (b) La voie alterne Complément et hématies

11 III. Tests de Coombs : définition et principe A) Le test de Coombs direct à chaud Définition Principe de réalisation du test de Coombs direct Production de l antiglobuline B) Test de Coombs à froid : cas particulier des anticorps froids C) Test de Coombs indirect Principe Réalisation IV. Indications du test de Coombs en médecine vétérinaire A) Diagnostic des anémies suspectes d une origine immunologique Définition Classification des anémies hémolytiques à médiation immune (a) Classification selon l origine de l anémie (b) Classification selon l antigène impliqué dans l anémie immunologique Nature du revêtement anticorps (a) Site de destruction des hématies selon les anticorps impliqués (b) Classes des anticorps (c) Isotype de l anticorps et clinique Diagnostic d une anémie immunologique B) Intérêt du test de Coombs dans le suivi du traitement de l animal C) Conduite diagnostique et pronostique des maladies auto-immunes systémiques

12 LE TES T DE COO MBS EN PRATIQ UE : PRES ENT ET FUTUR EN MEDECINE VETERINAIRE I. Réalisation du test de Coombs direct à chaud : méthodologie A) Prélèvement de l échantillon et conditions d envoi B) Lavage des hématies Intérêt des lavages Technique C) Préparation de la suspension érythrocytaire D) Choix du réactif E) Préparation de la gamme de dilution de l antiglobuline F) Test G) Incubation Durée d incubation Température d incubation ph d incubation H) Création de témoins Témoins positifs Témoins négatifs I) Lecture du test J) Interprétation et sanction II. Interprétation des résultats A) Test de Coombs direct à froid positif B) Test de Coombs direct à chaud Premier et deuxième cas : test positif aux immunoglobulines Troisième cas : test positif au complément III. Valeur diagnostique du test de Coombs en médecine vétérinaire A) Praticabilité B) Fiabilité Exactitude Précision Détectabilité C) Critères d efficacité Spécificité du test de Coombs

13 (a) Définition des faux-positifs (b) Origine des faux-positifs (i) Des causes techniques...74 (ii) Des causes biologiques...74 (c) Amélioration de la spécificité du test de Coombs Sensibilité (a) Définition et origine des faux-négatifs (i) Une mauvaise condition de pratique du test...77 (ii) Autres raisons...78 (b) Amélioration de la sensibilité du test de Coombs (i) Test de Coombs direct à froid...78 (ii) Solutions salines à faible concentration...79 (iii) Prétraitement enzymatique...79 (iv) Utilisation de substances macromolécualires...79 (v) Techniques alternatives au test de Coombs Bilan : sensibilité et spécificité du test de Coombs direct IV. Techniques alternatives au test de Coombs A) Test direct à l antiglobuline liée à une enzyme (DELAT) Principe du test Réalisation Avantages Inconvénients B) Test par immunofluorescence (cytométrie de flux directe) Principe et réalisation Avantages et inconvénients C) Gel tests Principe du test Réalisation Avantages et inconvénients

14 DETERMINATIO N DU SEUIL DE POSITIVITE DU TES T DE COO MBS : ETUDE EXPERIMENTALE I. Matériel et méthode A) Echantillon B) Réalisation de tests de Coombs direct Réalisation des tests de Coombs Choix du réactif Bilan II. Résultats A) Définition de la positivité du test de Coombs direct B) Résultats C) Définition d un seuil Seuil du test de Coombs direct à chaud Seuil de positivité du test de Coombs direct à froid III. Discussion A) Représentativité de l échantillon Etude de la répartition des populations canines en fonction du sexe Etude de la répartition des populations canines en fonction des classes d âge Etude de la répartition des populations canines en fonction des races B) Seuil de positivité du test de Coombs CONCLUSION ANNEXES BIBLIOGRAPHIE

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16 TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : Carlo Moreschi, d après (COOMBS, 1998) Figure 2 : Complémentarité stérique, d après (DAGUET, 1971) Figure 3 : Potentiel ζ, d après (BACH, 1993) Figure 4 : Structure d une immunoglobuline, d après (DAGUET, 1971) Figure 5 : Théorie des ponts, d après (TIZARD, 2004) Figure 6 : Agglutination érythrocytaire en fonction du potentiel ζ, d après (BACH, 1993) Figure 7 : Voies classique et alterne d'activation du complément, d après (TIZARD, 2004).32 Figure 8 : Principe de réalisation du test de Coombs direct à chaud, d après CHABANNE, 2004) Figure 9 : Production de l antiglobuline, d après (CHABANNE, 2004) Figure 10 : Principe du test de Coombs indirect, d après (SLAPPENDEL, 1986) Figure 11 : Représentation schématique du mécanisme de fixation des anticorps sur l hématie lors d AHMI, d après (DAY, 1999) Figure 12 : Exemple de méthodologie de réalisation du test direct à l antiglobuline selon la technique sur tube (notice d utilisation des laboratoires MP biomedicals, Solon, OH, USA) Figure 13 : Principe du lavage des hématies, d après (CHABANNE, 2004) Figure 14 : Représentation schématique du phénomène de zone, d après (GENETET, 1997) Figure 15 : Cas particuliers des anticorps qui s éluent (IgM) : l agglutination à partir du complément, d après (CHABANNE, 2004) Figure 16 : Représentation schématique du DELAT, d après (JONES et al., 1987; WARDROP, 2005) Figure 17 : Représentation schématique des résultats obtenus lors du gel test et gradation de ces résultats, d après (WARDROP, 2005) Figure 18 : Représentation schématique d une carte de gel-test, d après (LAPIERRE et al., 1990) Figure 19 : Hémogramme : valeurs de référence chez le chien, d après (JAIN, 1973) Figure 20 : Centrifugeuse utilisée dans l étude Figure 21 : Réalisation de la suspension érythrocytaire Figure 22 : Microplaque à fond conique Figure 23 : Lecture du test de Coombs direct Figure 24 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à chaud en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée Figure 25 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à froid en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée Figure 26 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable «sexe», entre la population de référence et l échantillon Figure 27 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable «classes d âge», entre la population de référence et l échantillon Figure 28 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable «race» entre la population de référence et l échantillon

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18 TABLE DES TABLEAUX Tableau 1 : Propriétés des différents isotypes d immunoglobulines, d après (TIZARD, 2004) Tableau 2 : Maladies associées à une anémie hémolytique à médiation immune chez le chien et le chat, d après (WERNER, 1980) Tableau 3 : Classification pathogénique des anémies immunologiques (DAY, 1998) Tableau 4 : Classification des AHMI, d après (STEWART & FELDMAN, 1993; PELLERIN et al., 1994) Tableau 5 : Comparaison de la sensibilité du test de Coombs sur 11 chiens atteints d anémie hémolytique à médiation immune, d après (JONES et al., 1990) Tableau 6 : Comparaison du test de Coombs direct à 37 C réalisé avec deux antiglobulines différentes, d après (KUCINSKIENE et al., 2005) Tableau 7 : Comparaison du test de Coombs direct réalisé à 37 C et à 4 C, d après (KUCINSKIENE et al., 2005) Tableau 8 : Interprétation du test de Coombs direct, d après (SLAPPENDEL, 1979); (SCHLAM, 1980; JONES, 1984) Tableau 9 : Détectabilité des épreuves sérologique usuelles, d après (PASTORET et al., 1990) Tableau 10 : Différents type d anticorps détecté par le TCD lors de l étude de 1979 de Slappendel (SLAPPENDEL, 1979) Tableau 11 : Interprétation du test de Coombs direct ; faux-positifs et faux-négatifs, d après (SLAPPENDEL, 1979; SCHLAM, 1980; JONES, 1984) Tableau 12 : Sensibilité et spécificité comparées du TCD réalisé de manière classique sur plaque et de la cytométrie de flux Tableau 13 : Protocole utilisé dans le cadre de l étude Tableau 14 : Résultats positifs des tests de Coombs direct à chaud et à froid en fonction du titre d antiglobuline Tableau 15 : Modalités de chaque variable démographique prises en compte pour l étude de la représentativité de l échantillon Tableau 16 : Répartition des populations canines selon leur sexe Tableau 17 : Répartition des populations canines selon leur classe d âge Tableau 18 : Répartition des populations canines selon leur race

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20 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 : Notice de l antiglobuline VMRD (Pullman, WA, USA) 113 Annexe 2 : Notice de l antiglobuline utilisée sur l échantillon (MP Biomedicals (Solon, OH, USA)). 116 Annexe 3 : Fiche établie pour chaque chien de l échantillon Annexe 3 : Sexe des chiens de l échantillon. 119 Annexe 4 : Race des chiens de l échantillon 120 Annexe 5 : Age des chiens de l échantillon. 121 Annexe 6 : Hémogramme des chiens de l échantillon. 122 Annexe 7 : Résultats des tests de Coombs

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22 LISTE DES ABREVIATIONS AHMI Anémie Hémolytique à Médiation Immune ACD Acide citrique-citrate-dexose BFI Basse Force Ionique CPD Citrate-Phosphate Dexose DELAT Direct Enzyme-Linked Antiglobulin Test EDTA Ethylène Diamine Tetra-Acétique ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay Fab Fragment variable Fc Fragment constant IFD Immunofluorescence Directe IgA Immunoglobuline A IgG Immunoglobuline G IgM Immunoglobuline M L.E.S. Lupus Erythémateux Systémique L.I.S.S. Low Ionic Saline Solution MrPAH Mixed reverse Passive Antiglobulin Haemagglutination p. cent Pour cent (%) PVP PolyVinylePyrolydone RAST Radio-Allergo-Sorbent-Test RCLAAR Red Cell Linked Antigen-Antiglobulin Reaction Rh Rhésus TCD Test de Coombs Direct TCI Test de Coombs Indirect

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24 INTRODUCTION Les maladies auto-immunes sont des maladies encore méconnues ou mal connues en médecine vétérinaire car respectivement insuffisamment ou abusivement diagnostiquées. La plus connue de ces maladies est l anémie hémolytique à médiation immune, dont la première découverte chez le chien est rapportée en 1954 par Miller (MILLER et al., 1954), exactement 50 ans après la première description faite chez l homme (DONATH & LANDSTEINER, 1904; MILLER et al., 1954). L origine immunologique de l affection n a été prouvée qu en 1945 (COOMBS et al., 1945) grâce au développement d un nouveau test : le test de Coombs ou test à l antiglobuline. Ces maladies immunologiques sont d un diagnostic difficile car les anomalies du système immunitaire concomitantes à la maladie peuvent sensibiliser le patient à de nombreuses autres affections rendant le tableau clinique souvent très polymorphe. C est pourquoi la recherche de paramètres biologiques fiables et accessibles se révèle nécessaire pour une démarche diagnostique rigoureuse. Le test de Coombs est un paramètre souvent évoqué et fréquemment utilisé dans un but diagnostic de telles maladies. Bien connu et utilisé en médecine humaine, cet outil biologique est intéressant mais il convient de mieux l évaluer ; de nombreuses publications rapportent en effet un manque de spécificité et de sensibilité du test de Coombs. Quel est le principe du test de Coombs, dans quels cas permet-il le diagnostic d une anémie auto-immune? Les réponses à ces interrogations sont apportées dans la première partie de ce travail. La seconde partie, plus pratique, fait le point sur les connaissances actuelles concernant le protocole de réalisation de ce test. Enfin une troisième partie, expérimentale, permet de définir un seuil de positivité pour les tests de Coombs directs à chaud et à froid; seuil qui est le point clef lors de l interprétation du résultat d un test de Coombs

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26 Première partie - Le test de Coombs, origine, principe et définition Étude bibliographique

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28 I. Historique Le test de Coombs doit son nom à un vétérinaire, Sir Robin Coombs, qui le mit au point en 1945 lors d études effectuées avec les scientifiques Rob Race et Arthur Mourant à l Université de Cambridge en Angleterre (COOMBS, 1994; COOMBS, 1998). A) La découverte du test à l antiglobuline L histoire du test de Coombs débute lorsque qu éclate la seconde guerre mondiale. Le nombre important de transfusions sanguines réalisées à cette époque poussa le gouvernement britannique à encourager la recherche dans ce domaine. Le système ABO était alors le seul phénotype globulaire connu. C est en 1940 que Landsteiner et Wiener découvrirent le système Rhésus (Rh) et prouvèrent son importance clinique. Par la suite le docteur Race réalisa un travail de recherche fondamental sur ce nouveau système sanguin, travail qui fut la base de la nomenclature génétique et immunologique de ce système. L une des premières publications de Race sur ce sujet démontre l existence d anticorps particuliers qu il nomma anticorps «incomplets» (RACE, 1944) : normalement en milieu salin on observe une agglutination lorsque les anticorps Rh (plus connu sous le nom d anticorps anti-d) sont mis en présence de globules rouges D positifs. Or Race remarqua que certains anticorps, pourtant combinés avec les globules rouges D positifs, ne provoquaient pas d hémagglutination. Ces anticorps n étaient détectables que lors de l utilisation d un test dit «bloquant». Celui-ci consistait en la mise en solution de globules rouges D positifs dans un sérum contenant les anticorps «incomplets» qui rendaient alors l agglutination possible et visible (WIENER, 1984). Entre 1944 et 1945 le vétérinaire et immunologiste Robin Coombs, rencontra Arthur Mourant et Rob Race. C est alors qu il entendit parler pour la première fois de ce que Rob Race appelait les anticorps Rh «incomplets» ou «bloqués». Coombs fut intéressé par ces molécules et commença par les étudier grâce à l électrophorèse (COOMBS, 1998). L histoire raconte que Coombs eu l idée du test à l antiglobuline lors d un voyage en train de Londres à Cambridge alors qu il lisait des articles sur la théorie de Paul Ehrlich concernant les «chaînes latérales» (théorie selon laquelle la réaction immunitaire fait intervenir les chaînes latérales des récepteurs présents à la surface des cellules, qui ne se lient qu'à certains groupes chimiques des toxines). C est à ce moment qu il eut une vision des hématies et des anticorps incomplets. A l image de Kekulé et sa vision de l atome de carbone tétravalent, il pressentit la nécessité de l intervention d une autre molécule qui viendrait se lier aux anticorps de deux hématies différentes et qui favoriserait ainsi l agglutination (COOMBS, 1998). En effet en utilisant un anticorps anti-anticorps (autrement dit, une antiglobuline) en milieu salin, des «ponts» peuvent être formés entre les cellules permettant ainsi leur agglutination. Quelques temps auparavant, le docteur Carlo Moreschi (figure 1), avait déjà décrit le principe général de ce test, cependant son travail avait eu très peu d écho (MORESCHI, 1908), et ce n est que de nombreuses années plus tard que les trois chercheurs découvrirent ses publications

29 Figure 1 : Carlo Moreschi, d après (COOMBS, 1998). B) Le test direct à l antiglobuline Coombs, Mourant et Race travaillèrent plusieurs semaines afin de mettre au point un anti-sérum dirigé contre les globulines humaines. Ils émirent l hypothèse que les anticorps dirigés contre les globulines humaines pouvaient être produits par des lapins immunisés avec ces globulines. Les anticorps contenus dans le sérum de ces lapins (antiglobulines humaines) pouvaient ensuite se fixer aux hématies sensibilisées par les anticorps incomplets. Ils prouvèrent de cette manière l efficacité et la sensibilité du test à l antiglobuline. A la suite de ces recherches, Coombs déclara avec perspicacité : «ce test doit avoir de nombreuses applications pratiques car il permet certainement de détecter des degrés très fins de sensibilisation cellulaire dans tous les systèmes de réactions anticorps-antigène» (COOMBS et al., 1945). Les trois scientifiques poursuivirent donc leurs recherches en testant les globules rouges de nouveaux nés suspects d anémie hémolytique, car il était connu que l agglutination spontanée des hématies de ces enfants était très rare. Ils prouvèrent alors que la majorité des sérums des enfants malades réagissaient positivement au test. Par ailleurs c est au cours de ces recherches que les scientifiques découvrirent le système Kell (COOMBS et al., 1946). Fort de ses connaissances vétérinaires, Coombs prouva l utilité de son test dans le diagnostic des anémies hémolytiques dans les espèces animales comme les muletons, les poulains pur-sang et les porcelets (COOMBS, 1998; WARDROP, 2005)

30 C) Les utilisations du test au cours du XXème siècle 1 Anémies hémolytiques acquises En 1946, Borman, Doud et Louttit (BORMAN et al., 1946) documentèrent l utilité du test à l antiglobuline dans le cadre de la détection d une autosensibilisation des globules rouges chez les patients atteints de ce qu ils appelèrent «une anémie hémolytique acquise». C est par ailleurs lors de ces recherches que l attention des scientifiques fut attirée sur l utilisation d une dose optimale d antiglobuline afin d éviter les faux-négatifs dus aux phénomènes de zone (VAN LOGHEM et al., 1950). 2 Agglutinations bactériennes Les résultats de certaines études ont permis de révéler l utilité du test dans la détection d agglutinations bactériennes. Ainsi Morgan et Schütze travaillèrent sur la détection de l agglutination provoquée par les bactéries du genre Shigella shiga et Salmonella typhi (MORGAN & SCHUTZE, 1946). De même d autres travaux prouvèrent que l utilisation de l antiglobuline permettait de révéler une fièvre Q chronique pour laquelle un simple test d agglutination du sérum était négatif, alors qu il était positif lors d une fièvre Q aiguë (COOMBS & STOKER, 1951). La découverte des différents isotypes (ou classes) d immunoglobulines (IgG, IgM, et IgA) permit de comprendre ce phénomène : les cas de brucelloses aigues provoquaient la formation d IgM, tandis que les cas chroniques n étaient révélés que par des réactifs spécifiques d IgG et/ou d IgA (KERR et al., 1967). Un test spécifique fut alors adapté pour détecter les agglutinations bactériennes : le MrPAH ou Mixed reverse Passive Antiglobulin Haemagglutination (COOMBS et al., 1978). 3 Détection des anticorps «réagines» Pendant longtemps (de 1921 à 1967), un problème majeur en immunologie fut l absence de test permettant de détecter les anticorps responsables des maladies allergiques telles que le rhume des foins, l asthme ou toutes autres expressions de réactions anaphylactiques. Ces anticorps spécifiques étaient désignés sous le terme de «réagines» (aujourd hui IgE). Ce type d anticorps thermolabiles ne pouvait alors être mis en évidence que par des tests cutanés de sensibilisation (intradermoréaction par exemple). S appuyant sur le même principe que celui du test à l antiglobuline est né le test RCLAAR (red cell linked antigen-antiglobulin reaction) (COOMBS et al., 1968). L antiglobuline fut par la suite marquée par un radio-isotope ce qui donna naissance au test RAST (Radio-allergo-sorbent-test), test de référence dans la détection des IgE (TIZARD, 2004)

31 4 L antiglobuline, molécule d étape dans les tests immunologiques De nos jours l antiglobuline est indispensable car elle est très souvent utilisée au cours d une des étapes de réalisation de nombreux tests immunologiques. Bien souvent l antiglobuline porte un marqueur qui peut être un fluorochrome dans les techniques par immunofluorescence (WELLER & COONS, 1954), un radio-isotope (comme l 125 Iode) utilisé en radio-immunologie, ou une enzyme utilisée en immunocytochimie et en immunoenzymologie. Grâce à cette découverte, l utilisation du test de Coombs permit par la suite la découverte des groupes sanguins humains, notamment des systèmes Kell, Duffy et Kidd, et il assura une sécurité supplémentaire lors des transfusions (BECK & TILZER, 1996). Selon de nombreux auteurs, aucun autre système n a actuellement surpassé le test à l antiglobuline dans le domaine de la détection des alloanticorps incomplets (ou IgG). En 1962, l American Association of Blood Bank Transfusion Standards for Accreditation of a Blood Bank Transfusion Service inclue le test à l antiglobuline dans le protocole à mettre en place avant toute transfusion (BECK & TILZER, 1996). Ce test fut donc un test phare en hématologie car il a permis de mieux comprendre et d explorer certaines réactions antigène-anticorps. Cette étude se poursuit dans la logique de Coombs et ses collaborateurs et va permettre à présent d explorer les interactions antigène-anticorps

32 II. Interactions antigène-anticorps in vitro Pour comprendre le principe du test de Coombs, il est indispensable de connaître la nature des mécanismes régissant les interactions entre les anticorps et les antigènes, ainsi que le rôle des immunoglobulines et du complément parfois présents sur les globules rouges. Dans le cadre de l immuno-hématologie, l interaction entre un antigène érythrocytaire et son anticorps complémentaire se manifeste par l observation d une agglutination, d une hémolyse et / ou d une précipitation (American Association of Blood Banks Technical Manual Committee, 2002). La plupart des tests dans ce domaine utilisent l agglutination car elle est le reflet de la fixation des anticorps sur les cellules exprimant des antigènes membranaires. A) Facteurs influençant l agglutination L agglutination se déroule en deux étapes : la sensibilisation, correspondant à la phase de liaison entre un anticorps et un antigène érythrocytaire, et l agglutination sensu stricto correspondant cette fois ci à la formation de ponts entre les cellules sensibilisées. Un certain nombre de conditions doit être réuni pour que ces deux étapes se déroulent correctement. 1 La sensibilisation La sensibilisation est une réaction stéréospécifique entre un antigène et son anticorps complémentaire. (a) Complémentarité stérique La sensibilisation n est effective que si la complémentarité est parfaite entre les épitopes (sites antigéniques de liaison) et les paratopes (régions de liaison des anticorps aux antigènes) (figure 2). Ces interactions spécifiques tiennent aux configurations spatiales particulières des anticorps qui assurent une complémentarité stérique à la molécule ou à une partie de la molécule d antigène avec laquelle l anticorps réagit (DAGUET, 1971). Anticorps (Ac) (Ac) Antigène (Ag) (Ac) Paratope (Ac) (Ac) - Epitope (Ag) (Ac) Figure 2 : Complémentarité stérique, d après (DAGUET, 1971)

33 (b) Complémentarité électrique et affinité En plus de cette complémentarité stérique, la stéréospécificité nécessite une complémentarité électrique résultant de la superposition de forces attractives et répulsives non covalentes de faible énergie et pouvant être aussi bien des liaisons hydrogènes, électrostatiques (appelées aussi liaisons ioniques), des interactions apolaires (nommées également liaisons hydrophobes) ou bien des forces de Van Der Waals. C est ce qui explique que la réaction entre un antigène et son anticorps est une réaction d équilibre (BERZOFSKY et al., 1993; PAUL, 1993). Chacune de ces liaisons a des propriétés thermodynamiques différentes. Certaines conditions physico-chimiques influencent la réversibilité de la réaction. Par exemple, la chaleur, l acidification du milieu ou l apport d ions en grande quantité dissocient les liaisons. D autre part, l intensité de ces liaisons varie au minimum à l inverse de la distance séparant l antigène de l anticorps. Elles sont donc d autant plus fortes que cette distance est faible, c'est-à-dire que les structures sont complémentaires car cela permet aux forces d attraction de s exercer pleinement. En d autres termes, la stabilité et la force, c'est-à-dire la sensibilité de la liaison antigène-anticorps sera d autant plus grande que les aires de contact seront étendues (BACH, 1993; GENETET, 1997). note : L affinité de la réaction entre un antigène (Ag) et un anticorps (Ac) à l équilibre se [Ag/Ab] K0= [ Ag ] Avec : [Ag] concentration en antigènes libres [Ac] concentration en sites anticorps libres K0 constante d équilibre d affinité (ou d association) du système Plus la constante d affinité K0 est élevée, plus il y aura d anticorps combinés avec les antigènes lorsque l équilibre sera atteint (HUGHES-JONES, 1963). De même, plus la constante d affinité est élevée, plus la liaison entre l antigène et l anticorps est difficile à rompre. Cette double complémentarité (stérique et électrique) assure la spécificité de la réaction antigène-anticorps, c'est-à-dire qu un site anticorps ne peut se fixer qu à un épitope et un seul. Habituellement un antigène porte plusieurs épitopes qui seront reconnus par autant de d anticorps différents, chacun étant spécifique d un seul épitope de l antigène. 2 Agglutination Lorsque les globules rouges ont été sensibilisés, un nombre important de facteurs va entrer en jeu et favoriser ou empêcher l agglutination. Comment et pourquoi les immunoglobulines ajoutées à la solution d hématies sensibilisées, permettent-elles l agglutination?

34 (a) Potentiel ζ (zêta) En milieu salin neutre, il existe entre les hématies une différence de potentiel électrique ou potentiel ζ (zêta), résultant de forces antagonistes : la tension inter faciale (qui tend à agréger les cellules entre elles) et les forces de répulsion (prédominantes) qui s opposent à l agrégation des cellules et assurent la stabilité de la suspension (OSS & ABSOLOM, 1983). Dans ce milieu, les cations sont attirés par les anions de l acide N-acétyl-neuraminique de la membrane érythrocytaire. Les cations s accumulent autour de l hématie et forment un nuage cationique dont la densité maximale est proche de la membrane érythrocytaire (couche interne). Au niveau de la couche externe (plan de clivage) la densité du nuage cationique est plus faible. Le potentiel ζ est la différence entre les charges électriques situées à la surface des hématies (nuage interne) et celles du nuage externe (figure 3). La différence de potentiel entre ce nuage de cations solidaires de l'hématie et le milieu neutre est de -15 mv. Ce potentiel ζ est déterminé grâce à la mesure de la mobilité des hématies dans un champ électrique. Selon Pollack, le potentiel ζ est proportionnel à la charge σ des hématies, inversement proportionnel à la constante diélectrique D du milieu, et à la racine carrée de la force ionique µ (STRATTON et al., 1973), soit : ζ = f(σ / D.µ -2 ) Avec : σ charge des hématies D constante diélectrique du milieu µ force ionique du milieu f constante Particules électronégatives Couche anionique Couche cationique Couche interne Couche externe Figure 3 : Potentiel ζ, d après (BACH, 1993). Les particules électronégatives (hématies) sont entourées d un nuage cationique proche de la particule (couche interne) et d un second nuage cationique, plus éloigné. La différence de potentiel (en mv) de ces deux couches correspond au potentiel ζ

35 (b) Théorie des ponts ou du réseau Afin de comprendre la théorie des ponts, il est nécessaire de se souvenir de la structure d un anticorps. Le schéma de Porter (PORTER, 1973) de la structure des immunoglobulines montre que ces molécules sont constituées de deux chaînes lourdes (en violet sur la figure 4) et deux chaînes légères (en vert sur la figure 4), et qu elles peuvent se dissocier après traitement par une enzyme, en une partie Fc constituée de deux fragments de chaînes lourdes, et en deux fragments Fab, qui contiennent le site anticorps de liaison à l'antigène (TIZARD, 2004). Paratope Fab Fc Figure 4 : Structure d une immunoglobuline, d après (DAGUET, 1971). Les immunoglobulines sont constituées par deux chaînes lourdes (H), en violet sur la figure et deux chaînes légères (L), en vert sur le dessin. Les chaînes légères sont constituées d une partie constante (CL) et d une partie variable (VL). Les chaînes lourdes sont constituées d une partie variable (VH) et de plusieurs parties constantes (CH1, CH2, CH3) Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype. Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté C L. Les chaînes lourdes comportent, selon l'isotype (tableau 1), trois ou quatre domaines constants C H 1, C H 2, C H 3 et C H 4. Les domaines constants ne sont pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément. Les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc) sont capables de lier les anticorps

36 IgG IgA IgM IgE IgD Lymphocytes Basophile B Mastocytes Sang Localisation Sang Muqueuses Sécrétions Proportion 70-75% 15-20% des anticorps sériques Lymphocytes B 10% Moins de 1% Moins de 1% Valence 2 2 à 4 2 à Rôle Neutralisation Agglutination Agglutination Allergie des toxines, Neutralisation Voie Neutralisation bactéries et des bactéries classique du des parasites virus et des virus complément Activation des lymphocytes B Tableau 1 : Propriétés des différents isotypes d immunoglobulines, d après (TIZARD, 2004). Les anticorps (historiquement nommés Ig car ils ont servi à la définition du terme immunoglobuline) sont subdivisés en classes ou isotypes, selon la structure des domaines constants des chaînes lourdes : les chaînes γ, α, µ, ε et δ correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Il existe également des sous-classes d'immunoglobulines, reflétant des différences plus fines entre chaînes lourdes. L'homme possède ainsi quatre sous-classes d'igg et 2 sous-classes d'iga. Il existe également des isotypes de chaînes légères, celles-ci pouvant être κ (kappa) ou λ (lambda). Un anticorps possède également quatre domaines variables situés aux extrémités des deux «bras». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (V H ) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (V L ) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène ; un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques, d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps. On suppose donc qu'un site anticorps se lie à l'antigène situé sur une hématie, et que le second site de l'immunoglobuline se lie à l'antigène situé sur une seconde hématie, constituant ainsi un "pont" moléculaire entre les deux hématies qui se trouvent donc agrégées entre elles (figure 5). De proche en proche le nombre d'hématies est de plus en plus important, jusqu'à constituer des agglutinats importants et visibles à l'oeil nu. Immunoglobuline Hématie 1 Hématie 2 Figure 5 : Théorie des ponts, d après (TIZARD, 2004)

37 (c) Anticorps complets et incomplets Cependant tous les anticorps ne sont pas suffisamment efficaces pour provoquer une agglutination cellulaire (BACH, 1993; TIZARD, 2004). En milieu salin, l agglutination spontanée des hématies est le fait d anticorps dits complets ou agglutinants, principalement d isotype IgM car ils possèdent des sites anticorps suffisamment éloignés et un poids moléculaire plus élevé (900 kda pour les IgM et 160 kda pour les IgG) pour pouvoir passer outre le potentiel ζ. Dans les autres cas, essentiellement les anticorps d isotype IgG, on parle d anticorps incomplets, ils sont alors simplement revêtants (figure 6). Mais il existe également des anticorps IgG agglutinants. En effet la notion d anticorps agglutinant et non agglutinant est relative car elle dépend de la structure moléculaire de l anticorps (IgG ou IgM), mais aussi de la densité des déterminants antigéniques présents à la surface des cellules et du milieu lui-même (force ionique). Couche externe IgM Couche interne Potentiel ζ Hématie Hématie IgG Figure 6 : Agglutination érythrocytaire en fonction du potentiel ζ, d après (BACH, 1993). (i) Hémagglutination directe Comme nous venons de le voir, l agglutination des hématies en suspension dans une solution physiologique (NaCl, 0,15M) peut être réalisée par les anticorps «agglutinants» ou «complets» spécifiquement fixés à leur surface, sans recours à des modifications artificielles du milieu. Cette agglutination peut être obtenue à la température de 4 C, 22 C ou éventuellement 37 C

38 (ii) Hémagglutination artificielle Les IgG présentent une distance entre leurs sites de liaison trop faible pour pouvoir provoquer une agglutination. Par conséquent, elles se fixent sur les membranes érythrocytaires mais ne produisent pas d agglutination in vitro en milieu salin neutre (NaCl à 0,9%). Cette agglutination peut cependant être obtenue in vitro, à 37 C, grâce à des artifices techniques qui réduisent la charge négative des hématies (cas des protéases) ou augmentent la constante diélectrique du milieu (cas des macromolécules comme l albumine, le dextran ou le PVP), et permettent de passer outre le potentiel ζ. La mise en suspension des hématies dans un milieu macromoléculaire (albumine, dextran, PVP) permet de sensibiliser l agglutination, par augmentation de la constante diélectrique du milieu. En traitant les hématies par une enzyme comme la papaïne, la trypsine, la broméline ou la ficine (JONES & DARKE, 1975; OSS & ABSOLOM, 1983; BARKER & JONES, 1993b) ; on supprime un certain nombre de charges négatives à la surface de l'hématie grâce à la protéolyse de l acide N-acétylneuraminique, ce qui diminue le potentiel zêta par la diminution de σ (charge des hématies), et permet alors à une IgG de provoquer une agglutination. Cela est vérifié chez le chien, espèce pour laquelle le potentiel ζ est plus élevé que chez l homme pour lequel l effet de la papaïne sur le potentiel n est pas jugé suffisant pour être seul responsable de l agglutination. Ce traitement permet également une meilleure accessibilité de certains épitopes (dégagement stérique et augmentation du nombre de sites antigéniques accessibles) et la redistribution des sites antigéniques à la surface de l'hématie. Mais ces enzymes détruisent aussi d'autres antigènes des hématies (antigènes FY en particulier) et ne permettent donc pas de mettre tous les anticorps en évidence. Par contre cette technique est très sensible pour mettre en évidence les anticorps des systèmes Rhésus, P1, et Lewis (CHABERT et al., 1997). Chaque enzyme est ainsi plus ou moins adaptée à la recherche de certains anticorps. Enfin, la technique à l'antiglobuline permet de mettre en évidence, de façon spécifique, la présence d'un anticorps fixé sur une hématie. Au premier anticorps fixé sur l'antigène de groupe sanguin, anticorps incapable de diminuer suffisamment à lui seul le potentiel zêta du globule, on ajoute des immunoglobulines animales qui reconnaissent l'immunoglobuline fixée et viennent y adhérer (d où le nom d antiglobuline). La masse moléculaire de l'ensemble du complexe fixé sur l'antigène augmentant d'autant, l'agglutination peut avoir lieu. La réaction d agglutination comporte deux étapes : la fixation de l anticorps à son antigène spécifique qui a toujours lieu et l agglutination des hématies sensibilisées par les anticorps qui ne se produit pas systématiquement. La réaction d agglutination fait intervenir plusieurs facteurs que sont : la classe d immunoglobuline de l anticorps, la concentration en anticorps, le nombre de sites antigéniques à la surface des hématies et leur localisation, la température, le ph et le potentiel ζ

39 L agglutination directe des hématies concerne essentiellement les IgM, mais toutes n en sont pas capables. Un petit nombre d IgM peuvent ainsi réagir comme des anticorps incomplets en s éluant à 37 C. Cependant leur responsabilité peut être indirectement reconnue car les hématies porteuses d IgM fixent de façon irréversible la fraction C3 du complément. C est pourquoi l antiglobuline doit pouvoir réagir lorsque les globules rouges présentent des protéines du complément (essentiellement C3) à leur surface. B) Immunoglobuline G et complément 1 Le complément Le système du complément est un ensemble de protéines membranaires ou circulantes. Leur rôle initialement reconnu était de compléter l'action des immunoglobulines sériques, d'où leur nom. Lors des étapes précoces d une infection, la cascade du complément peut être activée via trois voies distinctes. Chacune de ces voies présente une séquence de réactions menant à l activation d une protéase appelée C3 convertase. Ces réactions consistent en une activation séquentielle de protéases dans laquelle un zymogène (précurseur de pleine longueur) est clivé en deux fragments : un long ; qui est une protéase à sérine active (codé avec l indice b) et un court qui joue le rôle de médiateur soluble (codé avec l indice a). Les différentes voies (classique et alterne) activant le complément aboutissent donc à la formation d'une C3 convertase, point de départ de la voie effectrice commune qui détruit la cible en formant un canal transmembranaire, permettant l'entrée de molécules d'eau dans la cellule. Les principales protéines du complément sont numérotées de C1 à C9 (BACH, 1993; BERZOFSKY et al., 1993; PAUL, 1993). Le système du complément possède plusieurs fonctions importantes : la cytolyse d'une cellule ou d'un agent pathogène, l'activation du système immunitaire par les petits fragments de clivage pro-inflammatoires, l'opsonisation de certains agents permettant leur phagocytose, et le métabolisme des complexes immuns circulants grâce aux récepteurs des fragments du complément. Deux voies possibles d activation du complément existent : la voie classique et la voie alterne (figure 7). (a) Voie classique et voie des lectines La voie classique est activée par le complexe antigène-anticorps. Seules les IgG1, IgG3, les IgM, et faiblement les IgG2 sont capables d'entraîner la cascade des évènements. La fixation de deux ou plusieurs immunoglobulines d'igg ou une molécule d'igm pentamérique, à la surface d'un micro-organisme, permet à leur région Fc de fixer le premier composant de la voie classique : C1. C1 est un gros complexe, composé de trois sous composants: C1q, C1r et C1s. Quand C1q lie le complexe antigène-anticorps, il active C1r, qui devient protéolytique, et clive C1s pour amorcer la cascade de protéolyse. La voie des lectines est initiée par la protéine de liaison du mannose ou MBP (Mannan Binding Protein). En effet le mannose est un sucre présent sur de nombreuses molécules membranaires des bactéries ou virus

40 Dans ces deux voies, la C3 convertase est formée à partir des molécules C4b et C2b fixées à la membrane, C4 et C2 ayant été clivés par le complexe C1 de la voie classique ou le complexe MBP (Mannose Binding Protein) de la voie des lectines. (b) La voie alterne La voie alterne du complément est initiée par des composants qui s activent spontanément à la surface des agents infectieux. La protéine C3 possède la particularité de se cliver spontanément, donnant le facteur C3b qui se lie au facteur B. Dans la voie alterne, la C3 convertase est formée par les facteurs C3b complexés à Bb. Bb est issu du clivage du facteur B par une protéase plasmatique, le facteur D. Les C3 convertases clivant C3 en C3b et C3a ; la voie alterne peut ainsi servir de boucle d amplification à toutes les voies. Le C3b est le principal effecteur et agit comme une opsonine en se liant de façon covalente à l agent pathogène afin de permettre une destruction par les phagocytes équipés du récepteur au C3b. Le C3a est un médiateur de l inflammation. Le C3b peut se lier à la C3 convertase afin de former une C5 convertase produisant à partir du C5, le C5a, le plus important médiateur de l inflammation et le C5b qui initie les événements tardifs de l activation du complément. Ces événements tardifs correspondent à une séquence de réactions de polymérisation dans laquelle les composants terminaux du complément interagissent afin de former le complexe d attaque membranaire (C5b, C6, C7, C8 et C9). Ce complexe est capable de créer un pore dans la membrane des cellules des micro-organismes pouvant mener à leur destruction. L activation du complément nécessite la présence dans le milieu de tous les composants du complément, de calcium et de magnésium ionisé (d où l impossibilité d une activation du complément lorsque le sang est prélevé sur EDTA qui chélate ces ions). L hémolyse in vitro est liée à la réaction antigène-anticorps, puis à l activation de la voie classique du complément jusqu à C9, aboutissant à des lésions membranaires et à la lyse des hématies

41 Figure 7 : Voies classique et alterne d'activation du complément, d après (TIZARD, 2004). Le système du complément est constitué d environ 25 protéines qui complètent l action des anticorps dans la défense immunitaire. Les facteurs du complément circulent sous forme inactivée dans le sang. Lorsque la première protéine du complément est activée (par un antigène se liant à un anticorps par exemple) la cascade enzymatique s active. Le produit final est un cylindre de protéines s enchâssant dans la membrane cellulaire. Sous l action des fluides et des molécules entrant ou sortant de la cellule, celle-ci éclate. 2 Complément et hématies Il est assez rare de trouver des IgG et/ ou des protéines du complément sur les surfaces membranaires des hématies saines. Si l on considère des hématies normales (c'est-à-dire des hématies pour lesquelles le test à l antiglobuline s est révélé être négatif) on peut compter entre 5 et 90 molécules d IgG par hématie, avec une moyenne de 39 immunoglobulines G (MERRY et al., 1982). Le nombre de protéines du complément C3 par globule rouge varie bien plus. On peut ainsi en compter entre 5 et 560 par hématie (ROSENFIELD & JAGATHAMBAL, 1978; MERRY A.H. et al., 1983)