Dosages à réactifs marqués

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1 Dosages à réactifs marqués Principe = réaction Ag-Ac un des deux réactifs (Ag ou Ac) est marqué par un traceur Différentes méthodes selon que le traceur est radioactif (RIA), enzymatique (EIA) ou luminescent (FPIA ) Impératifs a) Etape de séparation des complexes [Ag-Ac] / Ag libres b) Emploi d'un support pour certaines méthodes Deux procédés : 1) Méthode compétitive 2) Méthode sandwich

2 Méthodes par compétition - Incubation de 1) Echantillon contenant l'ag à doser 2) Quantité déterminée du même Ag marqué 3) Quantité fixe et limitée de l'ac spécifique 4) Séparation des Ag (Ag*) restés libres et des Ag-Ac : la quantité d'ag présente dans l'échantillon est calculée par le degré d'inhibition de la fixation de l'ag* sur l'ac.

3 Méthodes par compétition Remarques L'Ag marqué (Ag*) est en excès par rapport à l'ac : Pas de sites Ac libres après que la totalité de l'ag* s'est fixée (+++) -Ag froid [Ag*- Ac] Courbe d'étalonnage Pour établir la quantité d'ag froid présente dans l'échantillon, on se reporte à une courbe d'étalonnage établie par le dosage de quantités connues et croissantes d'ag froid. Ag* + Ac [Ag*-Ac] + Ag* libre (= [C1]) Ag + Ag* + Ac [Ag-Ac] + [Ag*-Ac] + Ag libre et Ag* libre (= [C2]) ([C2] > [C1])

4 Méthodes par compétition Méthodes de séparation Différences de comportement des Ag complexés (Ag-Ac) / Ag libres. 1) Piéger les Ag libres (charbon activé) Mesure de la quantité de traceur dans le surnageant (= complexes Ag-Ac) 2) Précipiter les immuns complexes (Ethanol, acide trichloracétique, sulfate d'ammonium, ou anti-globuline). Mesure de la quantité de traceur dans le précipité Impératifs 1) Excès d'ag marqué (quantité fixe et définie de l'ac). 2) Ag et Ac sous forme homogène qu'une seule espèce chimique pour Ag et Ac (une même constante d'affinité) 3) Ag et Ac sont univalents (un Ac ne doit pas fixer plusieurs Ag). 4) Pas d'allostérie (coopérativité). 5) Ag froid et marqué même immunoréactivité vis à vis de l'ac; mêmes propriétés physicochimiques. 6) Pas de perturbation de l'équilibre de la réaction par les méthodes de séparation des complexes Ag-Ac (la méthode de séparation pourrait décrocher des complexes formés). 7) Qu'il soit facile de déterminer parfaitement la quantité d'ag marqué.

5 Avantages et inconvénients Dosage des Ag de faible poids moléculaire (hormones stéroïdes, médicaments...). Mais 1) Marquer l'ag (problème = Ag de faible pm). 2) Excès d'ag + méthode compétitive : de la quantité de signal La plage de mesure est restreinte Précision aux deux extrémités de la courbe d'étalonnage est mauvaise. Problème = faibles (fortes) quantités d'ag faible des signaux émis par le traceur (faible pour les fortes concentrations). 3) Absence d'ag froid grande quantité de traceur (nombreux complexes Ag*-Ac) Faible quantité d'ag froid (à doser) faible des complexes Ag*-Ac 4) Importance de la précision au pipetage: le nombre de sites Ac = constant. Toutes les étapes comptent : la quantité d'ac est critique: La multiplication de faibles variations dans l'introduction des différents réactants, multiplie les erreurs. 5) La réalisation du blanc est parfois difficile (il faut trouver un milieu biologique semblable au milieu à doser en l'absence de l'analyte à doser).

6 Imprécision aux deux extrémités de la courbe d'étalonnage

7 Dosage en phase hétérogh rogène de type non compétitif Dosage immunométrique à deux sites. Principes (on cherche à doser un antigène) o o o o o o L Ac (en excès) spécifique de l'ag est immobilisé sur un support Echantillon = Ag à doser Lavage (éliminer tout ce qui n'a pas réagi avec l'ac immobilisé) Ac marqué (traceur) reconnaissant spécifiquement l'ag Fixation de l'ac marqué sur l'ag complexé à l'ac immobilisé Lavage Mesure du signal Remarque : Excès d'ac réaction totale et non plus à l'équilibre Impératifs 1) Au moins deux déterminants antigéniques sur l'ag à doser épitopes répétitifs ou des épitopes différents ( la spécificité du dosage). 2) L'utilisation d'ac de forte affinité conduisant à l'irréversibilité de la réaction. Dosages (non compétitifs) de type sandwich les plus sensibles Leur gamme utile de dosage la plus étendue

8 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Bleu= Antigène Vert=sites saturés Saturation des sites de fixation non spécifique Bruit de fond, faux positifs etc..

9 Les différentes modalités opératoires signal signal Dosage d Ac Ag Dosage d Ag Ag Indirect Sandwich Direct signal Etc Ag Immunocapture 2 temps «directe»

10 Courbe de calibration (sandwich) DO Échantillon x x x 0 [?] Concentrations

11 Différentes modalités opératoires ELISA en 1 temps Incubation des sérums AVEC le compétiteur ou/et l anticorps marqué ELISA en 2 temps Incubation en étapes distinctes des sérums, puis de l anticorps marqué. Lavages!

12 Avantages et inconvénients 1) La sensibilité est accrue par la présence d'ac en excès. 2) La sensibilité aux faibles concentrations d'ag est bonne : Absence d'ag à doser absence de complexes Ag-Ac* Absence de traceur = mesure nulle. Faible quantité d'ag à doser détection du signal (dépend du traceur). 3) La précision au pipetage a moins d'importance surtout précision à l'introduction de l'échantillon à doser. 4) La vitesse de réaction est accélérée par l'excès d'ac. 5) La zone de travail est plus grande. 6) La réalisation du blanc est facile: il suffit d'immobiliser un réactif différent du réactif immunologique (= Ac) sur la phase solide. Mais Effet crochet pour les concentrations élevées

13 Interférences L effet de zone: Dépendant de facteurs interférents dans le dosage présents dans le sérum : F.R., ions, lipides, anticorps froids etc L effet Crochet: Effet de saturation du système d immunoanalyse en présence d excès d antigène. Que pour les méthodes immunométriques Surtout au cours de techniques en un temps (effet prozone). LA solution aux 2 problèmes : DILUER

14 Dosages en phase homogène Principes : Pas d'étape de séparation. Méthode compétitive. Adapté aux Ag de faible pm (médicaments) Le traceur couplé à l'ag possède une activité différente selon que cet Ag est associé ou non à l'ac. Dosage en phase homogène type EMIT (Enzyme Multiple Immuno Test) Dosages des petites molécules (haptènes). Utilise un conjugué haptène-enzyme. Fixation de l'ac sur le conjugué modification de la conformation moléculaire de l'enzyme modification de la cinétique enzymatique = ou l'activité Méthode compétitive Introduction de l'ag "froid" (à doser) déplacement de l'équilibre Fixation de l'ac ne peut plus se fixer à l'ag marqué par l'enzyme.

15 EMIT Enzyme Multiplied ImmunoTest Mesure de quantification en fonction d une modulation d activité enzymatique Phase homogène compétition 1 temps signal (inversement) proportionnel

16 Les différents types de marquage Fluorochromes Isothiocyanate de Fluorescéine D.O. ab sorption émission Rhodamine Phycoerythrine Cryptates d Europium λ. Enzymes Peroxydase (OPD) A-galactosidase Phosphatase alcaline (TMB, PNPP ) D.O. Spécificité Radio-isotopes Iode 125, Tritium, Phosphore 32 λ.

17 Les outils dérivés de l ELISA MEIA: Microparticle Enzyme Immunoassay Phase hétérogène compétition ou sandwich 1 temps

18 Amplification du signal Complexe biotine-streptavidine Anticorps biotinylé Signal Signal Signal Ag

19 Western blotting Protéines 100 C, 10 min Protéines Dénaturées = Perte de conformation Détergent (SDS) Tampon (Tris) Réducteur (DTT)

20 Western blot Transfert sur une membrane de nitrocellulose et incubation avec le sérum Révélation

21 Immunofluorescence indirecte Rappel technique FITC Ac sériques Aspects de la fluorescence (nucléaire, cytoplasmique...) Titres +++ (1/80 > 1/1000 ème)

22 Cytométrie de flux: Les outils de l immunité cellulaire

23 Les outils de l immunité cellulaire Technique ELISPOT :

24 Les outils de l immunité cellulaire (3)

25 Quel test? Simplicité de mise en œuvre : peu d étapes et peu de manipulations Rapidité d obtention des résultats : temps d incubation, lavages et révélation Répétable: même échantillon, même dosage, même série = même résultat Reproductible : même dosage, même échantillon, date différente = même résultat Sensible : seuil/bruit de fond Dynamique : mesure réalisable sur une large gamme de concentration Applicable à différents types d échantillons : test de récupération Rendement/prix : PRIX de l analyse en fonction des autres paramètres (temps technicien etc..)