Modèles Expérimentaux en Toxicologie de la Reproduction Paul Barrow
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- Pierre-Yves St-Georges
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1 Modèles Expérimentaux en Toxicologie de la Reproduction Paul Barrow SFT, Nancy, 20 octobre 2009
2 Plan Modèles pour l évaluation de: o Tératogénèse o Fertilité o Développement post-natale Choix d espèce pour les études réglementaires : o La place des rongeurs, du lapin o Le rôle des primates : Produits de la biotechnologie ICH S6 o Autres espèces (miniporc, chauve-souris, kangourou ) Tests alternatifs (in-vitro et in-vivo).
3 Quel est le meilleur modèle animal pour la détection de la tératogénèse?
4 It s the monkey, stupid!
5 Modèles pour l évaluation de la fertilité et du développement postnatal Le rat (et / ou la souris) est généralement le plus adapté. Les études de fertilité et de développement postnatal sont également possibles chez le lapin (mais moins pratiques). Le singe est peu pratique pour ces études : o Phase d accouplement de plusieurs mois o Maturation mâle confondue par les relations de dominance o Cyclicité des femelles o Interaction mère-petit très étroite. Mais l histopathologie des organes reproducteurs chez le singe ou le chien peut apporter beaucoup d informations: o A condition que les animaux soient matures.
6 Choix d espèce Considérations : o Pharmacologie o Métabolisme o Pharmacocinétiques o Physiologie / développement comparatif Choix presque imposé : o Rat o Lapin o Éventuellement la souris
7 Rongeurs (rat / souris) Avantages : o Développement très bien étudié o Large gamme de méthodes et dosages disponibles Ex. tests neurocomportementaux, dosages hormones, immuno o Vaste expérience en toxicologie Banques de données Réponses toxiques bien caractérisées Inconvénients : o Différences hormonales Action lutéinique de prolactine Rôle de gonadotrophines dans la gestation Rôle de prostaglandines dans le déclenchement de la parturition
8 Lapin Avantages : o Développement bien étudié o Vaste expérience en tératogénèse Banques de données Réponses toxiques bien caractérisées Inconvénients : o Peu utilisé en toxicologie générale o Très sensible aux antibiotiques o Peu de méthodes et dosages disponibles Ex. tests neurocomportementaux, dosages hormones, immuno o Manipulation postnatale difficile Mais possible
9 Etude de développement chez le lapin 50 / lot 25 / lot post-natale L35 G28 M-14j M-1j G6 G29 25 / lot césarienne
10 Hébergement portées - lapin
11 Inconvénients du singe Approvisionnement difficile o beaucoup de singes nécessaires : 1 seul fœtus par femelle taux d avortement élevé en laboratoire o durée de vie très longue Peut-être utile pour évaluer les risques éventuels identifiés chez le rongeur Mais, parfois incontournable o Ex. produits de la biotechnologie
12 ICH S6 Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals oligne directrice en cours de révision oproposition en cours de discussion: Enhanced pre- and post-natal study design chez le primate pour les mab Stewart, Reproductive Toxicology 28 (2009)
13 Enhanced pre- and post-natal study design ~24 par lot
14 Etude pre- et postnatale améliorée Inconvénients : o Peu d animaux Encore moins de fœtus / petits Peu de puissance statistique o Pas d exposition avant jour 20 de gestation (confirmation de grossesse par l ultrason) Moins problématique pour les mabs o Pas de césarienne Examen des fœtus par imagerie Examen des petits à la naissance.
15 Autres espèces? ICH S5: cobaye, hamster, furet, chien o Pas d utilisation sous conditions BPL Une alternative très pratique: le miniporc o Avantages : Bon modèle pour certains aspects de développement humain: SNC, cardiovasculaire, tractus digestif, peau, immuno Utilisation en toxicologie générale o Inconvénients : Taille des truies gestantes Cher
16
17 Placentation Porc Chien, chat Ruminants Rongeurs, primates
18 Chiroptera Fertilisation, implantation ou développement embryonnaire différés selon espèce.
19 Macropodidae Nouveau né joey équivalent à l embryon humain de 7 semaines
20 Méthodes alternatives préconisées par ILSI / HESI Cellules de souche embryonnaires (EST) Embryon entier (WEC) o Rat, souris, lapin Poisson zèbre (Danio rerio) / Xenopus
21 Embryonic Stem Cell Test (EST) Cellules de souche pluripotentes, ex. souris D3 o Evaluation de différentiation en cardiomyocytes Modèle de prédiction mathématique o Comparaison des courbes de différentiation et de mortalité cellulaire évaluée avec des cultures d ES et 3T3 (fibroblaste). Perspectives : o Différentiation vers d autres phenotypes, ex. neurones, ostéoclastes o Utilisation de ES d origine humaine (hes) o High throughput screening par cytométrie de flux avec coloration fluorescent o Génomiques (microarray) Cartographie de la génome disponible
22 EST - cardiomyocytes J0 Gouttelettes suspendues de culture de cellules uniques J3 Corps embryoide mis en culture J5 Distribué en plaques 24 puits J10 Indentification de foci de contractivité Van Dartel et al. Reproductive Toxicology 28 (2009)
23 Whole Embryo Culture (WEC) G10 à G12 G0 G6 G16 G22 fertilisation implantation mise bas Développement précoce non évalué: Formation du tube neural Développement tardif non évalué: Cerveau, face, palais, extrémités PCR temps réel?
24 WEC Avantage : o Permet l évaluation détaillée de processus dysmorphologiques déjà identifié in-vivo à la concentration plasmatique réelle Ex. malformation cardiovasculaire Inconvénients : o N économise pas d animaux Besoin de femelles gestantes Besoin de sérum o Durée de développement très limitée
25 Poisson zèbre (Danio rerio) 0h fertilisation 0 à 5h exposition 24h battement du cœur 48h fin d organogenèse 5j larve Yang et al. Reproductive Toxicology 28 (2009)
26 ZF (Danio rerio) Avantages : o Organisme complexe o Développement rapide o Elevage facile 1000 œufs / j o Développement embryonnaire hors de la mère o Transparence o Automatisation / screening à haut débit possible Souche transgénique avec marquage fluorescent o Profil toxico génomique relativement similaire aux mammifères Inconvénients : o Différences physiologiques et morphologiques v l humain o Différences de métabolisme / activation o Pharmacocinétiques - ex. aspirine et amoxycilline non absorbés Bioanalyse nécessaire
27 FETAX (Xenopus) 120h après fertilisation Control Phocomelia (thalidomide)
28 Validation ECVAM (et autres) EST, WEC et ZF ont correctement classifié 80% de produits chimiques : o tératogène fort, tératogène faible et non tératogène. Mais, la liste de produits testés n inclut pas de molécules rendues tératogène par l activation métabolique.
29 Limitation des tests in-vitro Système fermé o pas d activation métabolique pré incubation avec S9 possible Pas d'influences maternelles o métaboliques o physiologiques ex. nifedine action hypotensive chez la mère Durée de développement limitée Faux positifs assez nombreux o 10% EST et ZF, 20% WEC
30 Le futur Knudsen, 2009, ETS Education Course
31 Résumé Les rongeurs et le lapin sont toujours les espèces de choix pour l évaluation de la tératogenèse et de la reproduction en général o Le miniporc est une espèce intéressante pour l évaluation de la tératogenèse Les primates sont peu pratiques, mais parfois incontournables o Ex. produits de la biotechnologie Le rôle du lapin est en train d être élargi, grâce en partie à de nouvelles études réglementaires sur les vaccins Les tests alternatifs (EST, WEC, ZF) sont intéressants pour le screening très préliminaire des produits chimiques
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