La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital

Transcription

1 Chapitre 1 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Eric Pailhoux, Maëlle Pannetier, Béatrice Mandon-Pépin Chez les mammifères, comme chez toutes les espèces ayant un déterminisme du sexe génétique (Genetic Sex Determination, GSD), le sexe génétique, ou chromosomique, se met en place à la fécondation (figure 1.1). Le choix du sexe génétique dépend du chromosome sexuel apporté par le gamète fécondant du parent hétérogamétique. Chez l ensemble des mammifères, le parent hétérogamétique est le mâle, porteur de deux gonosomes (ou chromosomes sexuels) distincts nommés conventionnellement Y et X (on parle d un système XX/XY). Chez les espèces possédant une hétérogamétie femelle, les gonosomes sont nommés W et Z et on parle d un système ZZ/ZW. Ce système est rencontré chez certains poissons, batraciens, et reptiles ainsi que chez les oiseaux. La seconde étape de la différenciation sexuelle est la différenciation des gonades, contrôlée par le sexe génétique (figure 1.1). Chez les mammifères thériens (marsupiaux et placentaires), un seul gène gonosomique, porté par le chromosome Y est nécessaire et suffisant pour induire la différenciation testiculaire : il s agit du gène SRY (Sex-determining Region of Y chromosome). Son ablation, par délétion ou mutation, entraîne une inversion sexuelle de type femelle XY (décrite chez l homme, la souris, le taureau, le cheval) ; à l inverse, la présence du gène SRY chez un individu XX entraîne une inversion sexuelle de type mâle XX (démontrée chez l homme lors de translocations et chez la souris par transgénèse). Dès les premières étapes de la différenciation gonadique, la gonade va produire les hormones sexuelles stéroïdiennes : androgènes chez le mâle et œstrogènes chez la femelle. En plus des androgènes, le testicule fœtal produit une deuxième hormone clé, l AMH (Anti-Müllerian Hormone). C est par le biais des hormones testiculaires (androgènes et AMH) que les organes génitaux internes et externes vont à leur tour se différencier chez le mâle (figure 1.1, et voir p. 34). Les sécrétions hormonales testiculaires et ovariennes jouent également un rôle crucial dans la mise en place des caractères présentant un dimorphisme sexuel (masculinisation de certaines zones du cerveau, comportement sexuel chapitre 16, métabolisme hépatique, caractères sexuels secondaires). La différenciation des gonades est donc une étape primordiale dans la mise en place du sexe de l individu. Une différenciation gonadique inverse par rapport au sexe génétique (testicules chez des XX, ovaires ou agénésie gonadique chez des 19

2 La reproduction animale et humaine XY) entraîne une inversion sexuelle complète de l individu ; une différenciation gonadique imparfaite (présence simultanée d ovaires et de testicules) entraîne des phénotypes d hermaphrodisme. Figure 1.1. Grandes étapes de la différenciation sexuelle chez les mammifères. La différenciation sexuelle chez les mammifères se déroule en trois grandes étapes : la détermination du sexe génétique, puis gonadique, puis phénotypique. La détermination du sexe génétique se réalise à la fécondation et dépend du chromosome sexuel X ou Y apporté par le spermatozoïde. La différenciation du sexe gonadique se fait en conformité avec le sexe génétique, sous la dépendance d un gène de différenciation testiculaire porté par le chromosome Y, SRY. La différenciation du sexe phénotypique est contrôlée par la production hormonale des gonades, au cours de la vie fœtale puis au moment de la puberté. 20

3 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Aspects cellulaires de la différenciation gonadique Par leurs deux fonctions, endocrine et exocrine, les gonades sont à la base de la différenciation sexuelle de l individu, de ses capacités reproductives et par extension, du maintien de l espèce. La gonade présente deux caractéristiques spécifiques. En premier lieu, c est le seul organe assurant le maintien de la lignée germinale et son développement en cellules haploïdes hautement différenciées : les gamètes. Autrement dit, la gonade est le seul organe dans lequel se réalise la division réductionnelle du patrimoine génétique de l individu : la méiose. En second lieu, c est le seul organe qui possède, à l origine de sa formation, une double potentialité (bi- potentiel), à savoir la possibilité de se différencier en testicule ou en ovaire. Dans les deux sexes, les gonades se forment à partir du rein intermédiaire appelé mésonéphros. Cet organe situé dans la cavité abdominale à côté du rein définitif (métanéphros), est le siège de la formation des gonades et d une partie du tractus génital, puis dégénère au cours du développement fœtal (disparu à la naissance). Les ébauches gonadiques, également nommées crêtes génitales, se forment sur la face interne du mésonéphros, par multiplication des cellules de l épithélium cœlomique et des cellules du mésenchyme sous-jacent. C est durant cette période de formation des crêtes génitales, que les précurseurs des cellules germinales, qui se différencient dans les tissus extra-embryonnaires, à la base de l allantoïde, vont migrer et coloniser les crêtes génitales (figure 1.2) pour constituer le stock de cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells, PGC). Les PGC se multiplient durant leur migration et après leur arrivée dans les crêtes génitales. La migration fait intervenir des mécanismes de chimiotactisme cellulaire où le facteur KITLG (KIT-Ligand, molécule sécrétée) et son récepteur membranaire KIT (exprimé par les PGC) jouent un rôle prépondérant. Ces deux facteurs sont également impliqués dans la multiplication des PGC. La formation des crêtes génitales et leur colonisation par les PGC sont identiques dans les deux sexes. L ébauche gonadique, bi-potentielle à ces Figure 1.2. Migration des cellules germinales primordiales. Coupe sagittale d un embryon de mammifère correspondant à un embryon de 9 jpc chez la souris et 28 jpc chez l homme. Les cellules germinales primordiales prennent naissance dans les tissus extra-embryonnaires, à la base de l allantoïde, et traversent l intestin primitif pour venir coloniser les crêtes génitales. 21

4 La reproduction animale et humaine stades, est qualifiée de gonade indifférenciée. Suite à cette période, plus ou moins longue selon l espèce considérée (tableau 1.1), la gonade va rapidement s engager dans une différenciation testiculaire ou ovarienne suivant le sexe chromosomique de l individu (Wilhelm et al., 2007). Tableau 1.1. Chronologie de la différenciation des gonades et du tractus génital. D après (1) Raynaud, 1942 ; Zhou et al., 2008 ; DeFalco et Capel, 2009 ; (2) Pailhoux et al., 2002 ; (3) Josso, 1981 ; Sajjad, Formation de la gonade indifférenciée Colonisation des crêtes génitales par les cellules germinales primordiales Souris (1) Chèvre (2) Homme (3) 10 jpc 25 jpc 4 sem 10,5-11,5 jpc jpc 4-5 sem Mâles Femelles Mâles Femelles Mâles Femelles Formation des cordons séminifères 12,5 jpc 36 jpc 6-7 sem Différenciation des cellules de Leydig 12,5 jpc 40 jpc 8 sem Régression des canaux de Müller 14 jpc 46 jpc 8 sem Masculinisation des organes génitaux 16 jpc 42 jpc 9-10 sem externes Distance ano-génitale augmentée Début de la prophase méiotique 5 jpp 13,5 jpc 2-3 mpp 55 jpc 9 sem Début de formation des follicules 2 jpp 80 jpc 14 sem primordiaux Régression des canaux de Wolff 15 jpc 70 jpc 10 sem jpc : jours post-coïtum, jpp : jours post-partum, mpp : mois post-partum, sem : semaines post-fécondation. Chronologie des principaux événements Après la naissance, les gonades mâles et femelles présentent une organisation spatiale similaire (figure 1.3, planche I). Les cellules germinales sont entourées des cellules de soutien : cellules de Sertoli chez le mâle et cellules folliculaires (ou de la granulosa) chez la femelle. Ces deux types cellulaires (germinal et soutien) constituent l unité fonctionnelle de base de la gonade : les tubes séminifères chez le mâle et les follicules ovariens chez la femelle. À l extérieur de ces unités fonctionnelles se localisent les cellules productrices des stéroïdes (cellules de Leydig chez le mâle, cellules des thèques chez la femelle) ; les cellules endothéliales ; et les fibroblastes constituant le tissu conjonctif (figure 1.3, planche I). Le testicule renferme de plus des cellules myoïdes péri-tubulaires qui entourent les tubes séminifères et font partie intégrante de ces tubes ; on ne connaît pas d équivalent ovarien de ce type cellulaire (Brennan et Capel, 2004). Bien que l organisation des gonades adultes soit similaire entre les deux sexes, la chronologie des événements conduisant à leur édification diffère d un sexe à l autre, notamment en ce qui concerne la formation des unités fonctionnelles de base. Ainsi, la formation des cordons séminifères représente l événement initial de la différenciation testiculaire, alors que la formation des follicules (ou folliculogenèse) constitue 22

5 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital l événement terminal de la différenciation ovarienne. Ce décalage semble intimement lié à la différenciation des cellules germinales qui suivent un destin différent en fonction du sexe de l individu et vont notamment réaliser la division méiotique à des périodes très différentes entre mâle et femelle (figure 1.4). En effet, lors de la formation des cordons séminifères, les cellules germinales, enfermées au sein des cordons, vont entrer en quiescence, adoptant ainsi un destin mâle. L entrée en méiose des cellules germinales mâles ne débutera qu un peu avant la puberté selon un processus continu tout au long de la vie de l individu. Au contraire, dans l ovaire en différenciation, l un des premiers Figure 1.4. Différenciation des gonades femelles chez plusieurs espèces de mammifères. A. Chez la femme et les ruminants (brebis, vache, chèvre), la synthèse d œstrogènes (barres grises), l entrée en méiose des cellules germinales et la formation des follicules ovariens ont lieu au cours du développement fœtal de l ovaire. Chez la lapine, la synthèse d œstrogènes a lieu précocement mais le blocage au stade diplotène des cellules germinales et la formation des follicules se déroulent après la naissance. B. Chez les espèces qui ne produisent pas d œstrogènes au cours de la période fœtale (rongeurs : souris, rate), la durée entre le début de la différenciation gonadique et le début de l entrée en méiose des cellules germinales femelles est très réduite. La formation des follicules ovariens a lieu en période postnatale. jpc : jours post-coïtum ; jpp : jours post-partum. 23

6 La reproduction animale et humaine événements caractéristiques de la voie femelle est l entrée en méiose des cellules germinales, puis leur blocage en prophase I (tableau 1.1 et figure 1.4 ; chapitres 2 et 3). C est seulement ensuite que les ovocytes I ainsi générés s entourent d une assise de cellules somatiques pour former les follicules ovariens. Ces follicules constituent la seule réserve disponible de gamètes. Le stock de follicules, et donc d ovocytes, est établi très tôt au cours du développement, et ce pour toute la vie reproductive de l individu femelle. Le mâle, quant à lui, possède des cellules germinales dites «souches» (spermatogonies) qui sont capables, à partir de la puberté, de se multiplier puis d entrer en méiose de façon à renouveler en permanence le stock de spermatozoïdes. Le testicule De nombreux travaux, essentiellement réalisés chez la souris, ont permis de mettre en évidence les événements morphogénétiques impliqués dans la formation d un testicule. Chez cette espèce, la gonade mâle est la première à présenter un processus de différenciation et à dévoiler son orientation sexuelle d un point de vue morphologique. Deux événements majeurs sont observés : la formation des cordons testiculaires (futurs tubes séminifères) et l apparition d une vascularisation typique du testicule (développement de l artère testiculaire à la surface de la gonade). Les cellules de Sertoli Parmi les cellules somatiques de la gonade indifférenciée, les cellules de soutien sont les premières à adopter un destin selon le sexe de l individu. Chez le mâle, les cellules de Sertoli sont les cellules de soutien du testicule car elles constituent le support de croissance et de maturation des cellules germinales. La première étape de la différenciation testiculaire consiste en la spécification des précurseurs des cellules de Sertoli (pré-sertoli), qui se fait sous l effet de l expression du gène SRY, qui n a lieu que dans ce type cellulaire chez la souris. En partenariat avec SF1 (Steroidogenic factor 1 ou NR5a1), SRY active l expression de SOX9 (SRYrelated HMG-box gene 9) induisant la différenciation des cellules de Sertoli (Sekido et Lovell-Badge, 2008). Celles-ci agissent ensuite comme un maître d œuvre, orchestrant la différenciation des autres types cellulaires du testicule tels que les cellules de Leydig, les cellules myoïdes péri-tubulaires, les cellules germinales et les cellules endothéliales, grâce aux facteurs paracrines qu elles sécrètent. En particulier, les cellules de Sertoli sont responsables de la migration des cellules endothéliales depuis le mésonéphros vers la gonade XY. Ces cellules vont s associer juste en dessous de l épithélium cœlomique pour former le vaisseau cœlomique (future artère testiculaire) et le réseau d artérioles (Martineau et al., 1997 ; Brennan et al., 2002 ; Combes et al., 2009). Le nombre de cellules de Sertoli est important pour la différenciation testiculaire. Dès les premiers stades, la gonade XY présente une taille plus importante que la gonade XX, suite à une augmentation de la prolifération cellulaire au niveau de l épithélium cœlomique chez les mâles. L inhibition de cette étape de prolifération par l injection d inhibiteurs (5-fluoro-uracile, méthotrexate) chez la souris (entre 10,8-11,2 jours post-coïtum jpc) empêche l expression de SOX9 ainsi que la formation des cordons testiculaires (Schmahl et Capel, 2003). 24

7 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Formation des cordons testiculaires et vascularisation La formation des cordons testiculaires est le premier événement morphologique qui permet de distinguer un testicule d un ovaire (dès 12,5 jpc chez la souris). Les cordons testiculaires se composent de trois lignées cellulaires : les cellules germinales enfermées par une couche de cellules de Sertoli, dont l ensemble est entouré par les cellules myoïdes péri-tubulaires (figure 1.3, planche I). Les cordons testiculaires peuvent se former en l absence de cellules germinales, comme démontré chez les souris KIT-/-, dépourvues de cellules germinales. Par contre, une contribution de cellules provenant du mésonéphros est nécessaire à l édification des cordons testiculaires. En effet, chez la souris, les tubes séminifères ne peuvent se former dans une gonade XY isolée (sans mésonéphros) ou lorsque celle-ci est séparée du mésonéphros par une membrane imperméable aux cellules (Buehr et al., 1993). Ce sont en fait les cellules endothéliales qui migrent depuis le mésonéphros vers l épithélium cœlomique de la gonade XY qui sont impliquées dans l édification des cordons. L utilisation d un anticorps bloquant la VE-cadhérine inhibe la migration de ces cellules et le développement de la vascularisation testiculaire, mais perturbe également la formation des cordons (Combes et al., 2009). La mise en place des cordons sexuels débute lorsque les cellules de Sertoli nouvellement différenciées entourent des faisceaux de cellules germinales. Par la suite, les interactions cellulaires entre les cellules de Sertoli et les cellules endothéliales migrant depuis le mésonéphros induisent l édification des cordons proprement dite. Enfin, les cellules de Sertoli vont contrôler la maturation des cordons testiculaires en régulant leur forme et leur taille. Elles développent entre elles des jonctions cellulaires spécifiques et produisent des protéines de la matrice extracellulaire, conjointement avec les cellules myoïdes péri-tubulaires, pour former une membrane basale qui définit la structure des cordons (Combes et al., 2009). Si la migration des cellules endothéliales est indispensable à la formation des cordons testiculaires, elle est aussi nécessaire à la mise en place d une vascularisation typique de la gonade mâle. Dans les premiers stades de développement, la vascularisation primitive à partir du mésonéphros est similaire dans les gonades XX et XY (jusqu à 11,5 jpc chez la souris). Une vascularisation spécifique du mâle se développe ensuite, après l expression de SRY. Le développement du système artériel dans le testicule permet la mise en place d un flux sanguin depuis le mésonéphros vers le vaisseau cœlomique. Ce système induirait une augmentation du flux sanguin au niveau du testicule, permettant une bonne exportation des hormones testiculaires. Les cellules de Leydig Les cellules de Leydig sont les cellules stéroïdogènes qui se différencient dans le deuxième compartiment du testicule, l espace interstitiel. Ces cellules produisent des androgènes qui sont essentiels pour la masculinisation et l apparition des caractères sexuels primaires et secondaires. Chez les mammifères, il existe deux populations différentes de cellules de Leydig : fœtales et adultes (chapitre 5). Chez la souris, les cellules de Leydig fœtales sont présentes dans le testicule de 12,5 jpc jusqu à la naissance. La fonction première de ces cellules est de synthétiser 25

8 La reproduction animale et humaine la testostérone, dès leur différenciation, qui induit la masculinisation du tractus génital interne et externe (Drews, 2000 ; Barsoum et Yao, 2006). Les cellules de Leydig fœtales produisent également l Insulin-like factor 3 (INSL3), impliqué dans la descente testiculaire de la cavité abdominale au scrotum (Adham et al., 2000). Les cellules de Leydig adultes se différencient après la naissance et maintiennent la production d androgènes pendant la puberté et la vie adulte. La production de testostérone par ces cellules de Leydig est responsable du développement et du maintien de la spermatogenèse, du développement et de l activité de l appareil génital, et de la mise en place et du maintien des caractères sexuels secondaires. Les cellules de Leydig adultes ont une origine différente de leurs homologues fœtaux. Elles se forment à partir de cellules précurseurs fusiformes indifférenciées de l espace interstitiel du testicule (Siril Ariyaratne et al., 2000), alors que les cellules de Leydig fœtales se forment à partir de cellules du mésenchyme des crêtes génitales. L ovaire La formation d un ovaire peut être divisée en trois étapes principales : la différenciation ovarienne précoce avec la différenciation des cellules somatiques et la multiplication des cellules germinales ; l initiation de la méiose des ovogonies puis son blocage au stade de la prophase I ; et enfin la formation des follicules ovariens. La différenciation ovarienne précoce Dans la gonade femelle, les premiers signes d une différenciation ovarienne surviennent à des stades de développement variables selon les espèces (figure 1.4). Chez les ruminants, la localisation corticale des cellules germinales dans l ovaire est détectable avant la formation des cordons séminifères dans le testicule. Après l arrivée des cellules germinales, le premier changement morphologique au sein de l ovaire fœtal (à partir de 38 jpc chez la brebis) est l établissement de contacts entre les ovogonies et les cellules somatiques (cellules pré-granulosa) qui sont proches de l épithélium ovarien (figure 1.5A). Des cordons ovigères vont alors se former dans la partie corticale de l ovaire et devenir de larges structures tubulaires ouvertes du côté de l épithélium de surface ovarien. Une organisation cortex/médulla est alors clairement visible dans la gonade fœtale de ces espèces (visible également chez la truie et la femme). Ces cordons ovigères se maintiennent lorsque les cellules germinales entrent en prophase I de méiose (vers 55 jpc chez la brebis) et sont présents jusqu à la formation des follicules qui intervient à partir de 75 jpc chez la brebis (figure 1.5A). Durant la formation des cordons ovigères, les cellules germinales continuent de proliférer activement. Les changements morphologiques dans la gonade femelle sont aussi associés à une stéroïdogenèse active chez les ruminants : chez la chèvre (Pannetier et al., 2006), la brebis et la vache (Baillet et Mandon- Pépin, 2012). Des œstrogènes sont produits par les cellules somatiques de l ovaire précoce (32 jpc chez la brebis) avec un pic de sécrétion au moment de la formation des cordons ovigères (42-46 jpc). Puis, le taux d œstrogènes décline fortement lorsque les ovogonies entrent en méiose (figure 1.5A). 26

9 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Figure 1.5. Chronologie des principales étapes clés du développement ovarien et organisation structurale de l ovaire en formation chez la brebis (A) et la souris (B). A. L ovaire en développement des ruminants est précocement sous imprégnation des œstrogènes produits par des cellules localisées dans la zone médullaire. Une organisation structurale se met en place dans la zone corticale avec l apparition de cordons ovigères qui renferment des «nids» de cellules germinales. Les premières cellules germinales à entrer en méiose sont localisées dans la partie corticale profonde, celle qui est en contact avec la zone médullaire. B. Chez la souris, les cordons ovigères se forment après l entrée en méiose des cellules germinales. La synthèse d œstrogènes n est détectée dans l ovaire qu après la naissance, au moment de la formation des follicules. Cette organisation morphologique de l ovaire fœtal (cortex/médulla) n est pas retrouvée chez toutes les espèces. Chez les rongeurs, dans la gonade en différenciation, les PGC, dispersées dans l ovaire, vont immédiatement entrer dans le processus de méiose (à 13,5 jpc chez la souris). Chez ces espèces, peu de changements morphologiques sont observés jusqu à quelques jours avant la naissance, où de nombreuses cellules germinales de la partie centrale de l ovaire fœtal vont dégénérer par apoptose, créant par contraste un enrichissement en ovocytes dans la partie corticale (figure 1.5B) (Yao et al., 2004). Une structure en cordons ovigères se met alors en place avant la 27

10 La reproduction animale et humaine naissance (Ruby et al., 1969 ; Edson et al., 2009 ; Baillet et Mandon-Pépin, 2012). Avant la méiose, on ne retrouve pas de stéroïdogenèse active dans l ovaire fœtal des rongeurs (figure 1.5B). Les œstrogènes sont sécrétés par les ovaires en développement de nombreuses autres espèces : les marsupiaux, les poissons, les reptiles et les oiseaux (Baillet et Mandon-Pépin, 2012) suggérant qu ils jouent un rôle important dans le contrôle de la différenciation ovarienne précoce des mammifères non-rongeurs. La méiose des cellules germinales ovariennes Dans l ovaire en développement, les cellules germinales vont arrêter leur prolifération mitotique et entrer en prophase I de méiose. Cette étape de méiose est divisée en cinq sous-étapes (leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, diacinèse), chacune caractérisée par des modifications chromosomiques (condensation, appariement des homologues, formation du complexe synaptonémal, recombinaison homologue et intra-chromosomique, décondensation ; chapitre 3). La prophase I de méiose est initiée de façon synchrone entre les ovogonies chez les rongeurs ou asynchrone chez l homme, les ruminants, et le lapin. Les quatre premières sous-étapes de la prophase I se déroulent pendant la vie fœtale chez la femelle, puis les cellules germinales vont rester bloquées au stade diplotène jusqu à l éventuelle ovulation chez l adulte. La période d initiation de la méiose diffère entre les deux sexes puisque chez le mâle, la méiose ne débute qu après la naissance (5-8 jours post-partum jpp chez la souris, 3 mois environ chez le bélier). Ces différentes étapes sont intimement régulées par l expression de gènes spécifiques. Pour pouvoir entrer dans le processus de méiose, les cellules germinales doivent acquérir une «compétence à la méiose». Cette compétence est acquise via l expression du gène DAZL (Deleted in Azoospermia-like), et seules les ovogonies ayant exprimé ce gène pourront s engager dans la prophase I de méiose. La méiose est dépendante de l acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A, chez de nombreuses espèces comme la souris, le rat, l homme, le poulet et les amphibiens (Baillet et Mandon-Pépin, 2012). Selon les espèces, l AR est produit soit localement dans l ovaire fœtal soit par le mésonéphros. Il induit, via ses récepteurs RAR (Retinoic Acid Receptor), l expression de STRA8 (Stimulated by Retinoic Acid, gene 8), un de ses gènes cibles. Dans l ovaire fœtal, l expression de STRA8 est aussi, pour une moindre part, sous la dépendance du gène DMRT1 (Doublesex and Mab3 Related Transcription factor 1) (Krentz et al., 2011). STRA8 est indispensable pour la synthèse pré-méiotique d ADN (réplication de l ADN des cellules germinales au stade pré-leptotène), l initiation de la méiose et la progression de la méiose dans les cellules germinales des deux sexes (Anderson et al., 2008). Dans le testicule fœtal, l enzyme CYP26b1 (Cytochrome P b1), produite par les cellules de Sertoli, dégrade l AR, empêchant ainsi la production de STRA8. De plus, le facteur germinal Nanos2 empêche les cellules germinales mâles d entrer en méiose (Suzuki et Saga, 2008). Ceci explique que la méiose soit initiée plus tardivement chez le mâle que chez la femelle. Les gènes impliqués dans le déroulement de la prophase I interviennent dans les deux sexes mais sont régulés différemment selon le stade de développement. La poursuite de la prophase I dans les ovogonies se réalise via l expression de plusieurs gènes méiose-spécifiques (gènes impliqués 28

11 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital dans la formation du complexe synaptonémal, des cassures doubles brins, de l appariement des chromosomes, de leur réparation ). Chez la souris, l invalidation de certains de ces gènes (par exemple : Dmc1, Spo11, γh2ax) entraîne des blocages en prophase I de méiose conduisant à une stérilité chez les mâles et à des phénotypes variables chez les femelles (de fertiles à sub-fertiles ou complètement stériles). Les mécanismes de régulation de la méiose sont donc différents selon les sexes. La formation des follicules ovariens La formation des follicules, ou folliculogenèse basale (sans contrôle endocrinien), est le processus par lequel plusieurs cellules somatiques (précurseurs des cellules de granulosa) vont entourer une cellule germinale femelle bloquée au stade diplotène de prophase I (figure 1.6). Les premiers follicules formés, appelés follicules Figure 1.6. Formation des follicules ovariens (ou folliculogenèse basale). Elle se produit après l entrée en méiose des cellules germinales et se déroule soit en période fœtale chez de nombreux mammifères, soit après la naissance chez les rongeurs et le lapin. La folliculogenèse dite basale est indépendante des hormones gonadotropes. Le nombre de follicules primordiaux obtenus à la fin de la folliculogenèse constitue la réserve de cellules germinales femelles disponibles pendant toute la vie reproductive. Ce stock folliculaire ne fera ensuite que décroître. 29

12 La reproduction animale et humaine primordiaux, sont ainsi constitués d un ovocyte entouré par quelques cellules somatiques aplaties. Cette formation a lieu pendant la période fœtale (à partir de 75 jpc chez la brebis et semaines chez l homme) ou quelques jours après la naissance (2-5 jpp chez la souris, 7-10 jpp chez le lapin) dans un ovaire morphologiquement organisé en cortex et médulla. La formation des follicules résulte de la fragmentation des cordons ovigères qui débute à l interface de la médulla et du cortex puis remonte vers l épithélium de surface de l ovaire. Les follicules primordiaux ainsi formés constituent le stock de follicules disponibles tout au long de la vie de reproduction de la femelle. Cette période de régression des cordons ovigères et de formation des follicules est aussi associée à une atrésie massive des cellules germinales, toutes celles n étant pas suffisamment entourées de cellules somatiques vont dégénérer. Modèles génétiques de la différenciation gonadique La description des gènes impliqués dans la différenciation gonadique chez les mammifères a débuté en 1990, avec la découverte du déterminant testiculaire SRY, et a grandement progressé jusqu alors, notamment suite au développement des techniques d étude des catalogues de transcrits (transcriptome) d un organe ou d un type cellulaire. Si l on identifie actuellement plusieurs milliers de gènes (~ 3000 à 13,5 jpc chez la souris) présentant un dimorphisme sexuel d expression gonadique (plus exprimé dans la gonade d un sexe par rapport à l autre), on ne connaît la fonction que de quelques gènes majeurs (Jameson et al., 2012). La plupart de ces gènes majeurs ont été découverts chez l homme dans les pathologies d inversion du sexe dans lesquelles ils ont été trouvés mutés. Leurs fonctions ont quant à elles été élucidées principalement chez la souris par des études génétiques (addition ou suppression génique). Deux modèles génétiques de la différenciation testiculaire et ovarienne seront présentés : le modèle murin et un modèle alternatif intégrant des résultats obtenus principalement chez la chèvre (Pannetier et Pailhoux, 2011). Le modèle murin Chez la souris, le gène clé de la différenciation testiculaire est Sox9 (figure 1.7A). Sox9 code pour un facteur de transcription exprimé faiblement dans la gonade indifférenciée des deux sexes. L augmentation de son expression est initiée dans les cellules pré-sertoli du testicule par SRY et SF1, puis amplifiée et maintenue par SF1, SOX9 lui-même, ainsi que par deux boucles d amplification : l une impliquant FGF9 et son récepteur FGFR2 (FGF Receptor 2), l autre impliquant la prostaglandine D2 (PGD2) et par conséquent l enzyme PGDS (Prostaglandin-D Synthase) qui produit la PGD2 à partir de la PGH2. Lorsque l expression de Sox9 est augmentée, la protéine SOX9 active Fgf9 et Pgds, en retour FGF9/FGFR2 et PGD2 vont amplifier l expression du gène Sox9. Ce système permet non seulement l augmentation de l expression de Sox9 dans les cellules l ayant initialement exprimé sous contrôle de SRY (régulation autocrine), mais également le recrutement de cellules de Sertoli (~ 10 %) n ayant pas exprimé Sry (régulation paracrine). L augmentation de 30

13 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Figure 1.7. Gènes majeurs impliqués au moment du choix gonadique, dans le modèle murin (A) et dans le modèle caprin (B). A. Chez la souris mâle, SRY et SF1 activent le gène SOX9 responsable de la différenciation des cellules de Sertoli puis du testicule. Chez la femelle, les gènes RSPO1 et WNT4 vont être responsables du destin ovarien des cellules somatiques et germinales via la voie β-caténine. B. Chez la chèvre, en plus de la voie RSPO1/WNT4/β-caténine, le gène FOXL2 est très impliqué dans la différenciation ovarienne précoce. Un des rôles de FOXL2 est d inhiber l expression du gène DMRT1 dans le lignage somatique de la gonade XX. DMRT1 pourrait constituer un autre régulateur positif clé du gène SOX9 chez la chèvre et les espèces où FOXL2 et les œstrogènes interviennent en période de différenciation précoce de la gonade. 31

14 La reproduction animale et humaine l expression de Sox9 conduit à la différenciation de la cellule de Sertoli en induisant un programme génétique testiculaire (dont l activation du gène AMH) tout en inhibant le programme ovarien (inhibition de la voie β-caténine). Par différents facteurs sécrétés (INSL3, DHH, voie Notch), la cellule de Sertoli va ensuite induire la différenciation des autres types cellulaires du testicule. Pour la différenciation ovarienne, une voie majeure a été identifiée : la voie β-caténine canonique activée par deux facteurs sécrétés par les cellules somatiques, ayant une action complémentaire, R-spondin1 (RSPO1) et WNT4 (Wingless-type MMTV integration site family, member 4) (figure 1.7A). Ces deux facteurs agissent via des récepteurs membranaires et entraînent la stabilisation de la protéine β-caténine dans le cytoplasme. L augmentation de la β-caténine dans le cytoplasme induit sa translocation dans le noyau où elle va agir comme facteur de transcription en régulant ses gènes cibles, encore non identifiés. Les protéines RSPO1 et WNT4 agissent sur les cellules somatiques de l ovaire en induisant un programme génétique ovarien et en inhibant le programme génétique testiculaire (Fgf9, Sox9). De plus, la protéine RSPO1 agit sur les cellules germinales femelles dans lesquelles l activation de la voie β-caténine canonique est un pré-requis pour l initiation de la méiose (Chassot et al., 2011). Le modèle caprin Chez la chèvre, ainsi que chez de nombreux mammifères, l ovaire précoce en différenciation produit des œstrogènes avant l entrée en méiose des cellules germinales. On parle d espèces à méiose «retardée» par opposition aux espèces à méiose «immédiate», observée chez certains rongeurs dont la souris. Cette différence dans la production d œstrogènes semble expliquer la différence de fonction du gène FOXL2 (Forkhead box L2) entre la chèvre et la souris ; FOXL2 étant, entre autres, un activateur clé du gène CYP19 (Cytochrome P450 aromatase) codant l aromatase, unique enzyme capable de synthétiser les œstrogènes à partir des androgènes (Pannetier et al., 2006). La perte de fonction totale du gène FOXL2 chez la chèvre (mutation récessive) conduit à une inversion sexuelle complète des individus XX qui développent très précocement des testicules en lieu et place des ovaires (Pannetier et al., 2012). Par opposition, la perte de fonction totale du gène Foxl2 chez la souris entraîne une infertilité femelle due à une absence de formation des follicules primaires, mais pas d inversion sexuelle précoce de l ovaire. Ainsi, les résultats obtenus chez la chèvre démontrent que la différenciation ovarienne des espèces à méiose «retardée» nécessite l action de deux voies géniques d égale importance, la voie RSPO1/WNT4/β-caténine conservée chez la souris et la voie FOXL2/CYP19/ œstrogènes, voie éliminée chez la souris et les espèces à méiose «immédiate» ne produisant pas d œstrogènes ovariens avant l entrée en méiose (figure 1.7A, B). Cette différence majeure concernant la voie femelle semble également avoir un impact sur la voie mâle dans l espèce caprine. En effet, l antagoniste mâle du gène FOXL2 serait DMRT1, en plus de SOX9. De ce fait, l initiation de l augmentation de l expression de SOX9 dans le testicule pourrait être due conjointement à un effet direct de SRY et SF1 sur SOX9, et à un effet indirect de SRY, où SRY régulerait positivement DMRT1 qui en cascade activerait SOX9 (figure 1.7B). Là encore, la 32

15 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital perte de fonction du gène Dmrt1 chez la souris n entraîne qu un blocage de la spermatogenèse uniquement visible à partir de 20 jours après la naissance, alors que la perte d une dose de DMRT1 chez l homme (mutations hétérozygotes entraînant une haplo-insuffisance) conduit à un phénotype d inversion sexuelle de type femme XY où la différenciation testiculaire précoce ne se réalise pas. Le déterminisme du sexe dans l évolution Depuis une vingtaine d années et suite à la découverte du déterminant testiculaire SRY, notre vision de la conservation des mécanismes du déterminisme du sexe n a cessé d évoluer. À l heure actuelle, il reste difficile de qualifier cette voie développementale de «voie conservée» ou de «voie divergente» entre les différentes espèces. En effet, la plupart des gènes impliqués dans la différenciation gonadique des mammifères se retrouvent également chez de nombreux vertébrés mais leur rôle précis, ainsi que leur place dans la cascade génétique conduisant à la différenciation testiculaire ou ovarienne, peuvent varier d une espèce à l autre. Néanmoins, il semble acquis que la conservation des mécanismes régissant la différenciation gonadique se fait «du bas vers le haut». C est-à-dire que les fonctions effectrices de base (par exemple l AMH, ou les gènes codant les enzymes impliquées dans la synthèse des stéroïdes) sont plus conservées que les gènes contrôlant ces fonctions ; euxmêmes plus conservés que les gènes déterminants, placés au sommet de la cascade génétique et, par définition, localisés sur les chromosomes sexuels (Graves, 2006). Ainsi le gène CYP19 de la famille des cytochromes P 450, codant l enzyme aromatase responsable de la conversion des androgènes en œstrogènes, est exprimé dans la différenciation ovarienne de la plupart des vertébrés étudiés, à l exception des rongeurs qui ne produisent pas d œstrogènes ovariens précocement. Cette expression de l aromatase dès le début de la différenciation ovarienne est observée aussi bien chez des espèces ayant un déterminisme du sexe génétique (GSD) que chez des espèces à déterminisme du sexe sensible à la température (Temperature-dependent Sex Determination, TSD ; cas de certains reptiles). Du fait de cette conservation du «bas vers le haut», les gènes déterminants du sexe peuvent être différents selon les espèces considérées, et leur nombre est certainement important. Actuellement, seulement quatre ont été identifiés. Curieusement, ce sont principalement des déterminants testiculaires, quel que soit le système génétique associé (XX/XY vs ZZ/ZW). Parmi ces quatre déterminants, on compte : SRY pour l ensemble des mammifères thériens mis à part quelques exceptions chez certains rongeurs comme les souris naines africaines (Veyrunes et al., 2010), des homologues du gène DMRT1 chez le xénope (DM-W), le poisson médaka (DMY/Dmrt1bY) et le poulet (où DMRT1 est sur le chromosome Z), un homologue du gène de l AMH (amhy) chez un poisson de Patagonie (Odontesthes hatcheri), sdy (Sexually Dimorphic on the Y chromosome) chez la truite et différents autres salmonidés (Yano et al., 2012). Il est à noter que mis à part sdy (dernier découvert et gène homologue aux gènes du système immunitaire), les autres déterminants (homologues de DMRT1 et 33

16 La reproduction animale et humaine AMH) sont apparentés aux gènes impliqués dans la différenciation gonadique des mammifères. Les gènes homologues de DMRT1 et DMRT1 lui-même représentent, à l heure actuelle, la structure génique la plus conservée de la différenciation gonadique. En effet, DMRT1 ou ses homologues sont impliqués dans la différenciation testiculaire depuis les invertébrés tels que la drosophile et le ver Caenorhabditis elegans jusqu aux mammifères, homme y compris, en passant par les poissons (médaka), les batraciens (xénope) et les oiseaux (poulet). Bien que ce gène soit très conservé, son rôle et sa place dans la cascade génique conduisant à la formation de la gonade mâle varient selon l espèce considérée, même au sein des mammifères où des divergences d importance de DMRT1 apparaissent entre la souris et l homme. La différenciation du tractus génital Le développement des voies génitales mâles et femelles a lieu après la différenciation gonadique, à partir de deux paires de canaux, issus du mésonéphros, qui coexistent dans les deux sexes lors des premiers stades de développement : les canaux mésonéphrotiques et paramésonéphrotiques. Le sexe externe, quant à lui, se différencie à partir du sinus urogénital (Magre et Vigier, 2001). Le sexe externe représente le seul critère de définition du sexe de l état civil dans l espèce humaine. La différenciation du tractus génital interne Les canaux mésonéphrotiques ou canaux de Wolff dérivent de canaux du mésonéphros. Ils s ouvrent sur le sinus urogénital. Un peu au-dessus de leur abouchement, chacun de ces canaux émet un diverticule, le bourgeon urétéral, qui rejoint le métanéphros, futur rein définitif (figure 1.8). Le canal paramésonéphrotique ou canal de Müller se forme à partir d une invagination de l épithélium cœlomique le long du mésonéphros. Les canaux de Müller s enfoncent dans le mésonéphros latéralement aux canaux de Wolff et progressent en direction caudale. Au pôle inférieur du mésonéphros, le canal de Müller va croiser le canal de Wolff et se diriger vers la ligne médiane du fœtus où il fusionne avec son homologue opposé. La fusion de ces deux canaux forme un canal impair qui bute sur le sinus urogénital sans toutefois s y jeter. Il forme néanmoins une petite saillie à l intérieur du sinus urogénital, de part et d autre de laquelle s abouchent les deux canaux de Wolff. Le premier événement qui témoigne de la mise en place d un tractus de type mâle est la régression des canaux de Müller (tableau 1.1), sous l action de l AMH, sécrétée par les cellules de Sertoli. Ces canaux disparaissent complètement à la 9 e semaine de vie fœtale chez l homme. Au cours de cette période, la sécrétion d AMH par les testicules est maximale. Cette hormone agit localement sur les canaux paramésonéphrotiques qui ne sont sensibles à l AMH qu au cours d une courte période. Rapidement après le début de la régression des canaux de Müller, la virilisation des canaux de Wolff se met en place sous l action de la testostérone sécrétée par les cellules de Leydig. Initialement, ces canaux servaient de canaux excréteurs pour les reins embryonnaires (mésonéphros). Avec le développement des 34

17 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital Figure 1.8. Tractus génital au stade indifférencié dans l espèce humaine (environ 6 semaines post-fécondation). Les canaux paramésonéphrotiques (canaux de Müller) se développent latéralement aux canaux mésonéphrotiques (canaux de Wolff) dans leur partie proximale. Au niveau distal, les canaux paramésonéphrotiques se rejoignent sur le plan médian, fusionnent et entrent dans le sinus urogénital par sa partie postérieure. Au niveau de la partie distale des canaux mésonéphrotiques, émergent les futurs uretères qui s abouchent aux reins définitifs. reins définitifs (métanéphros), et sous l action des androgènes, les canaux de Wolff vont être à l origine des voies génitales mâles, passant ainsi d une fonction urinaire à une fonction reproductive. Leur maintien et leur différenciation sous l effet de la testostérone vont donner naissance aux canaux efférents, épididymes, canaux déférents, et vésicules séminales. Chez la femelle, en absence d androgènes et d AMH, les canaux de Wolff dégénèrent et les canaux de Müller se différencient en pavillons, oviductes, utérus et tiers supérieur du vagin (tableau 1.1). La différenciation des organes génitaux externes Alors que le tractus génital interne se met en place chez le fœtus, l appareil génital externe se différencie (figure 1.9). Chez le mâle comme chez la femelle, le tractus 35

18 La reproduction animale et humaine Figure 1.9. Développement des organes génitaux externes du fœtus humain. D après External Genitalia Development for 09bio224 Dr Carman on Human Reproduction. Les différents stades de développement sont indiqués en semaines post-conception. externe émerge à partir d une ébauche bi-potentielle dès 4 semaines de vie fœtale dans l espèce humaine. Suite à la prolifération de cellules mésenchymateuses, des renflements apparaissent de chaque côté de la membrane cloacale formant 36

19 La différenciation sexuelle des gonades et de l appareil génital les bourrelets labio-scrotaux et les plis urogénitaux qui se rejoignent à leur extrémité antérieure pour donner le tubercule génital (Wilson, 1999). Au cours de la 7 e semaine, le tubercule génital s allonge, donnant le phallus, aussi long chez le mâle que chez la femelle. Suite à la séparation de l intestin postérieur et du sinus urogénital par le développement du septum uro-rectal (futur périnée), la membrane cloacale est ensuite divisée en une membrane urogénitale (ventrale) et une membrane anale (dorsale). Ces membranes se rompent une semaine plus tard par apoptose cellulaire, permettant aux sinus urogénital et ano-rectal de s ouvrir dans la cavité amniotique. L aspect morphologique des organes génitaux externes est similaire dans les deux sexes jusqu à la 9 e semaine de grossesse. La dihydrotestostérone (DHT), produite localement (par les tissus cibles) par réduction de la testostérone via l enzyme 5α-réductase, est responsable de la masculinisation du tractus génital externe. Le tubercule génital s allonge pour former le pénis et entraîne avec lui les replis urogénitaux. Ces replis qui circonscrivent la gouttière urogénitale fusionnent sur le bord ventral du pénis et isolent l urètre pénien définitif. Les parties postérieures des bourrelets labio-scrotaux fusionnent à leur tour sur la ligne médiane (raphé) et forment le scrotum. À 14 semaines de vie fœtale, l appareil génital externe est différencié chez le mâle ; néanmoins, le pénis continue à croître au cours des deux derniers trimestres de grossesse. De plus, les testicules commencent à migrer depuis la cavité péritonéale vers le scrotum à partir de 10 semaines de grossesse. Ce déplacement se fait sous l action conjuguée de la croissance, d hormones telles que la testostérone et INSL3 (toutes deux produites par les cellules de Leydig), et grâce au gubernaculum testis (cordon ligamentaire). La descente testiculaire se réalise en deux phases distinctes et séquentielles : la phase trans-abdominale et la phase trans-inguinale. La phase trans-abdominale est essentiellement due à la traction exercée par le gubernaculum testis. L extrémité céphalique du gubernaculum se fixe au testicule, alors que son extrémité caudale s attache dans la région des bourrelets labio-scrotaux. Entre la 7 e et la 12 e semaine, le gubernaculum se raccourcit et attire les testicules, leur épididyme et leurs vaisseaux vers le bas. Cette phase se déroule sous le contrôle d INSL3 qui régulerait le développement du cordon ligamentaire. Les testicules restent dans le voisinage du canal inguinal du 3 e au 7 e mois puis entrent dans le canal inguinal et pénètrent dans le scrotum autour du 9 e mois de grossesse. Cette deuxième phase de descente trans-inguinale se réalise sous le contrôle de la testostérone. L absence de production d INSL3 ou de testostérone empêche la descente testiculaire, induisant une pathologie nommée cryptorchidie. Chez les fœtus femelles, le développement des organes génitaux externes résulte à la fois de l absence d androgènes, et de la présence d œstrogènes sécrétés par le placenta et les ovaires fœtaux (Yang et al., 2010), sauf chez les rongeurs où l ovaire ne produit pas de stéroïdes au cours de la vie fœtale. Le tubercule génital ne s allonge que très peu, puis régresse dès la 14 e semaine et devient le clitoris. Les plis urogénitaux ne fusionnent pas et le sinus urogénital reste largement ouvert avec l urètre à sa partie antérieure et le vagin à sa partie postérieure (portion vestibulaire du sinus). Les plis urogénitaux non fusionnés donneront naissance aux petites lèvres, alors que les plis labio-scrotaux vont former les grandes lèvres, qui fusionnent à l arrière pour donner la commissure labiale postérieure, alors qu antérieurement elles forment le mont pubis (figure 1.9). 37

20 La reproduction animale et humaine Perspectives Nos connaissances de la différenciation sexuelle ont considérablement progressé lors de ces 20 dernières années. Ces avancées ont été rendues possibles principalement par les études de pathologies génétiques affectant cette voie de développement et conduisant à des phénotypes plus ou moins prononcés d inversion sexuelle ; pathologies regroupées maintenant sous le terme DSD (Disorders of Sex Development). Il reste cependant de nombreux cas de DSD à élucider chez l homme et les autres mammifères, et de nombreux gènes impliqués dont la fonction reste à découvrir. Avec la quête de plus de 30 ans du déterminant testiculaire, aboutissant à la découverte de SRY en 1990, le chromosome Y a pris une place prépondérante dans notre vision de la différenciation sexuelle. Il ne faut pourtant pas oublier que le chromosome X est aussi un gonosome, 10 fois plus riche en gènes que le chromosome Y, et que bien qu il ne porte pas le déterminant sexuel, sa présence en doubles copies (femelle) ou en simple copie (mâle) a une importance non négligeable dans la sexualisation de l individu, et probablement même aux étapes de développement antérieures à la différenciation gonadique (Wijchers et al., 2010). Références bibliographiques Adham I.M., Emmen J.M., Engel W., The role of the testicular factor INSL3 in establishing the gonadal position. Mol. Cell. Endocrinol., 160 (1-2), Anderson E.L., Baltus A.E., Roepers-Gajadien H.L., Hassold T.J., de Rooij D.G., van Pelt A.M., Page D.C., Stra8 and its inducer, retinoic acid, regulate meiotic initiation in both spermatogenesis and oogenesis in mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 105 (39), Baillet A., Mandon-Pepin B., Mammalian ovary differentiation - a focus on female meiosis. Mol. Cell. Endocrinol., 356 (1-2), Barsoum I., Yao H.H., The road to maleness: from testis to Wolffian duct. Trends Endocrinol. Metab., 17 (6), Brennan J., Capel B., One tissue, two fates: molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet., 5 (7), Brennan J., Karl J., Capel B., Divergent vascular mechanisms downstream of Sry establish the arterial system in the XY gonad. Dev. Biol., 244 (2), Buehr M., Gu S., McLaren A., Mesonephric contribution to testis differentiation in the fetal mouse. Development, 117 (1), Chassot A.A., Gregoire E.P., Lavery R., Taketo M.M., de Rooij D.G., Adams I.R., Chaboissier M.C., RSPO1/β-catenin signaling pathway regulates oogonia differentiation and entry into meiosis in the mouse fetal ovary. PLoS ONE, 6 (10), e Combes A.N., Wilhelm D., Davidson T., Dejana E., Harley V., Sinclair A., Koopman P., Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol., 326 (1), DeFalco T., Capel B., Gonad morphogenesis in vertebrates: divergent means to a convergent end. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 25, Drews U., Local mechanisms in sex specific morphogenesis. Cytogenet. Cell Genet., 91 (1-4), Edson M.A., Nagaraja A.K., Matzuk M.M., The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocr. Rev., 30 (6), Graves J.A., Sex chromosome specialization and degeneration in mammals. Cell, 124 (5), Jameson S.A., Natarajan A., Cool J., DeFalco T., Maatouk D.M., Mork L., Munger S.C., Capel B., Temporal transcriptional profiling of somatic and germ cells reveals biased lineage priming of sexual fate in the fetal mouse gonad. PLoS Genet., 8 (3), e