Impact Toxique des Nanoparticules sur une Bactérie Modèle
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- Jean-François Lafleur
- il y a 7 ans
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1 Journées Scientifiques de l Environnement - 5 & 6 Mai 28 Impact Toxique des Nanoparticules sur une actérie Modèle Valérie Siron & Roselyne Ferrari 1 nm 2 µm ANR ECCODYN /19
2 Nanoparticules : 1 Å 1 nm 1 nm 1 µm Naturelles Anthropogéniques Industrielles Quantum Dots Fuego de Antigua, Guatemala 2nm 6nm Soleil couchant à Ivry, 1873, Guillaumin Grand Canyon, Arizona, USA Rio solimoes & Rio Negro, Amazonas, razil Oxyde de Silicium 1 µm 1 nm Oxyde de Titane Oxyde de Zinc actérie Magnétotactique 2/19
3 Pourquoi étudier la toxicité des nanoparticules? 28 : 5 produits sur le marché international contiennent des nanoparticules Nombre en augmentation MAIS - Pas de législation l pour le suivi de l utilisation de ces particules dont les caractéristiques révolutionnaires sont évidentes - Trop peu de travaux par des laboratoires indépendants étudient la toxicité de ces nanoparticules Les erreurs du Passé : - Amiante : minéral utilisé dans l industrie entre 196 et : maladie professionnelle reconnue : l asbestose - DDT : 1er Insecticide moderne développé en : DDT accusé d être cancérigène et d empêcher la reproduction Mais toujours utilisé dans la lutte contre le paludisme 3/19
4 Les acteurs de notre étude : Les oxydes de Zinc - ZnO Synthèse des nanoparticules de ZnO ITODYS Université Paris-Diderot Δ18 C A A A A A AA A AA A Surfactants ZnO 1 nm Zn-Acetate Surfactant : Tri-n-octylphosphine oxide (topo) PolyVinylpyrrolidone (pvp) Solvant : Diethylenglycol ZnO : Semi conducteur rayner et al., Nano-Letters (26) Crème solaire 4/19
5 Les acteurs de notre étude : Escherichia coli Dernier Maillon? io-accumulation des nanoparticules dans la chaîne alimentaire ioaccumulation???? Étude de l impact des ZnO sur E. coli Premier Maillon Escherichia coli Organismes environnementaux Shewanella Cyanobactéries 2 µm - actéries pouvant se retrouver dans l environnement - Conditions de croissance bien maîtrisées - Génome entièrement séquencé - anque de «mutants» disponibles 5/19
6 Part 1 Étude du Comportement des nanoparticules de ZnO - Caractérisation des Nanoparticules dans différents milieux : Milieu de synthèse Milieu de culture Luria bertani (L) Milieu naturel : Eau de Seine - Évaluation de la spéciation des nanoparticules dans les milieux testés Protocole 1 - Centrifugation Protocole 2 - Ultrafiltration Résultats d une modélisation dans les milieux 6/19
7 Caractérisation risation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de synthèse se Microscopie Électronique en Transmission (MET) Réseau cristallin d une nanoparticule de ZnO de 19 nm Variabilité dans la taille des particules utilisées pour l étude Forme = bâtonnets Couche de Surfactant Diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) Confirmation de la taille des plus petites particules : 16 +/- 4nm Mise en évidence d agrégats de 15 +/- 2nm dans le DEG Stabilité des nanoparticules de ZnO? 7/19
8 Caractérisation risation des nanoparticules de ZnO dans les milieux testés (a) (b) Milieu de Culture Luria-ertani (L) Agrégation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de culture et dans l eau de Seine (c) (d) Eau de Seine stérilisées Hypothèse : Dans l eau de Seine, association des agrégats des nanoparticules Images de Microscopie Électronique à Transmission 8/19
9 Protocole de Centrifugation Devenir des NPs de ZnO Protocole 1 Fraction du zinc total dans le surnageant % Milieu de Culture L Eau de Seine Prélèvement Interaction NPs/milieu Protocole Quantification du zinc dans le surnageant Centrifugation G NPs dans le culot Temps (h) En L : solubilisation des NPs En eau de Seine : agrégation des NPs Mais Dosage de fraction libre du zinc?? Dosage de nanoparticules de ZnO? ou Dosage d un mélangezno/zn2+? Autre Protocole 9/19
10 Devenir des NPs de ZnO Protocole 2 Eau de Seine UltraFiltration : - Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs - Pas de rétention du zinc ionique, membrane perméable au zinc Fraction du zinc total inférieure à 1KD (%) h 6h Eau de Seine ZnO L eau de Seine n induit pas une solubilisation des nanoparticules Modélisation : 98 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO 1/19
11 Devenir des NPs de ZnO Protocole 2 L Fraction du zinc total inférieure à 1KD (%) UltraFiltration : - Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs - Rétention de 5% du zinc ionique par la Matière organique du milieu h 6h L ZnO L ZnO-topo IV 2,5mM ZnO-pvpII 2,5mM Zn2+ 1,25mM Donc, % de zinc libre est équivalent dans les deux protocoles réalisés Solubilisation d une grande majorité des NPs introduites dans le milieu L Modélisation : 6 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO 11/19
12 Part 2 Étude de la toxicité des nanoparticules de ZnO & Comparaison avec l ion l Zn Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la croissance bactérienne 2. Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la viabilité bactérienne 3. Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactérienne 4. Implication d un éventuel stress oxydatif 12/19
13 Effet des nanoparticules sur la croissance bactérienne (1/2) Dans le milieu de culture - L Nombre d E. coli (1 8 CFU/mL) ZnO Ctl.25mM 1mM Nombre d E. coli (1 8 CFU/mL) croissance Zn 2+ inhibée en fonction 1. du temps d interaction 2. de la concentration Temps (heures) Temps (heures) Les nanoparticules de ZnO inhibent la croissance bactérienne en L Action bactériostatique des nanoparticules 13/19
14 Effet des nanoparticules sur la croissance bactérienne (2/2) Dans le milieu de culture - L Nombre d E. coli (1 8 CFU/mL) ZnO Ctl,25mM 1mM & Nombre d E. coli (1 8 CFU/mL) Zn 2+ Ctl,25mM 1mM 2,5mM ZnO-topo ZnO-pvp Temps (heures) Temps (heures) Pas de différences des effets pour ZnO et Zn2+ Observation de l effet des ions issus de la solubilisation des NPs 14/19
15 Protocole : Effet des nanoparticules sur la viabilité cellulaire - Interaction bactéries / NPs ou Zn2+ à différentes concentrations - Prélèvement à différents temps d incubation, dilutions et étalement sur boite de Pétri - Dénombrement des colonies capables de se multiplier après traitement - Rapport Essai / Contrôle,25 mm 1 mm 2,5 mm ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn 2+ Croissance bactérienne % (essai/contrôle) Temps (heures) L Eau deseine Pas de différence observée entre ZnO & Zn 2+ effet des ZnO solubilisées,25 mm : Toxicité ZnO < Zn 2+ Agrégats de NPs leur action 1mM : Toxicité ZnO > Zn 2+ Agrégats de NPs 2,5 mm : Toxicité ZnO > Zn 2+ Toxicité agrégats de NPs = toxicité Zn 2+ + on la conc en NPs + les agrégats de ZnO 15/19
16 Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactérienne Microscopie Électronique à alayage (ME) Non-traitées Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h) Modification de la morphologie bactérienne et de la taille des bactéries 2 µm 2 µm Microscopie Électronique à Transmission (MET) Non-traitées Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h) 5nm 25 nm Apparition d éléments intracellulaires contenant du zinc et du phosphore 16/19
17 Implication du stress oxydatif dans la toxicité des NPs Comparaison entre une souche sauvage et une souche Sod (délétée des gènes soda sod) 3,5 Sauvage Control 3 2,5 1mM ZnO- TOPOIV 1mM ZnO-PVPII 2 1,5 1mM ZnCl2 Mutant SOD Control 1,5 1mM ZnO- TOPOIV 1mM ZnO-PVPII mM ZnCl2 17/19
18 Étude du Comportement des nanoparticules de ZnO Conclusion Nanoparticules agrégées dans le milieu de synthèse mais également dans les milieux étudiés pour des temps courts d interaction Protocole 1, 2 & modélisation : - L : Solubilisation progressive des nanoparticules de ZnO - Eau de Seine : Agrégation des nanoparticules de ZnO Perspectives Détermination du devenir des nanoparticules dans différents milieux (Ajout de Matière organique de diverses origines, polluants, ) Influence des bactéries sur le devenir des nanoparticules 18/19
19 Étude de la toxicité des nanoparticules de ZnO Comparaison ZnO / Zn 2+ Conclusion Effet bactériostatique & bactéricide des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique en L Effet bactéricide des nanoparticules de ZnO même agrégées en eau de Seine ME : Modification de la morphologie bactérienne MET : Apparition de particules intracellulaires contenant du zinc et du phosphore après traitement au ZnO Perspectives Effet similaire dû à une solubilisation des NPs de ZnO ME : Y a-t-il une modification de la morphologie bactérienne en présence de Zn 2+? MET : Présence des particules intracellulaires avec Zn 2+? En eau de Seine, recherche de sites d action des NPs «agrégées» et poursuite de l étude d un stress oxydatif éventuel 19/19
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