Biologie Moléculaire. Compétences Techniques. Compétences. Micropipetage- Mesurer de petits volumes

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1 Biologie Moléculaire Compétences Techniques Compétences Micropipetage Préparation de solutions Travailler avec les concentrations Dilutions Quantités Électrophorèse sur gel d agarose Micropipetage- Mesurer de petits volumes Permet la mesure de microlitres (µl) X moins que 1 millilitre 2-20 µl µl µl Max ml 0.2mL 1mL 1

2 Réglage du volume- P20 Dizaines (0, 1=10 or 2=20) Unités (0-9) Décimale (1-9 = ) Réglage du volume- P200 Centaines (0, 1=100 ou 2=200) Dizaines (0, 1-9=10-90) Unités (1-9) Réglage du volume - P1000 Milliers (0, 1=1000) Centaines (0, 1-9= ) Dizaines (0, 1-9=10-90) 2

3 Utilisation du micropipetteur Étape 1 Insérer embout Étape 3 Insérer embout dans la solution a être prise Étape 4 Aspirer l échantillon en relâchant lentement le piston Étape 2 Peser piston jusqu au Premier arrêt Étape 5 Retirer pipetteur Livraison Commencer à livrer 1 er arrêt =livrer 2 e arrêt = expulsion Directives pour reproductibilité optimale Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON PROFONDEUR D IMMERSION consistante 3-4mm sous la surface EVITER les bulles d airs Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur 3

4 Préparation des Solutions Définitions Solution Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique Solution composée de deux composantes Soluté Partie qui est dissoute ou diluée Habituellement la plus petite quantité Solvant (OU Diluent) Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout Habituellement le plus grand volume Concentrations Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas solvant) Façons communes d exprimer les concentrations: Concentration Molaire (Molarité) Pourcentages Masse par volume Rapports 4

5 Molarité No de Moles de soluté/litre de solution Masse de soluté : donnée en gramme (g) Poids moléculaire (PM) : donné en gramme par mole (g/mole) Pourcentages Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que : V/V volume de soluté/100 ml de solution M/M Masse de soluté/ 100g de solution M/V Masse de soluté/100 ml de solution Tous représentent des fractions de 100 Pourcentages (suite) %V/V Ex. 4.1L soluté/55l solution =7.5% %M/V Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas! Ex. 16g soluté/50ml solution =32% Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas! % M/M Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9% Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas! 5

6 Masse par volume Une masse (quantité) par volume Ex. 1kg/L Connaître la différence entre une quantité et une concentration! Dans l exemple ci-dessus 1 litre contient 1kg (une quantité) Quelle quantité retrouverait-on dans 100ml? Quel est le pourcentage (m/v) de cette solution? Les rapports Façon d exprimer la relation entre différents constituants Exprimés d après le nombre de parties de chaque composante Ex. 24 ml de chloroforme + 25 ml de phénol + 1 ml d isoamylalcool Donc 24 parties + 25 parties + 1 partie Rapport: 24:25:1 Combien de parties y a-t-il dans cette solution? La préparation des solutions Dilution Réduire une Concentration Une Fraction 6

7 Dilutions Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes Exemple : Faire du jus d orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d orange congelé avec trois (3) cannettes d eau Dilutions (suite) Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution Dans l exemple du jus d orange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour l exemple du jus : «un dans quatre». Dilutions (suite) Un autre exemple : Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite «un dans dix», car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux). 7

8 Dilutions (suite) Un autre exemple : Une (1) partie d acide concentré est diluée avec 100 parties d eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d acide parties d eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite un dans cent un. Dilutions (suite) Remarquez que les dilutions n ont pas d unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre Exemple : 1/10 ou «un dans dix» Ou: 1/(1+9) Dilutions (suite) Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée. 8

9 Dilutions (suite) Exemple: Deux (2) parties d un colorant sont diluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose : 2 parties de colorant = 1.0 Volume total de 10 parties x 2 x = 10 x = 5 La dilution est exprimée comme étant 1/5. Problème Deux parties de sang sont diluées avec cinq parties de saline Quelle est la dilution? 2/(2+5) = 2/7 =1/ ml de saline sont ajoutés à 0,05 L d eau Quelle est la dilution? 10/(10+50) = 10/60=1/6 Qu est que cela veut dire?? Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de l échantillon ajouté à 9 parties de diluant. Si cette solution était préparée à un volume final de 110 ml, quels volumes de soluté et de solvant doivent être utilisés? Ceci représente 1 partie d échantillon ajoutée à 9 parties de diluant. En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties? 9

10 Problème : Plus d un ingrédient Vous désirez préparer 15 ml d une solution qui contient deux ingrédients (solutés) Dilutions requises Soluté 1: 1/10 Soluté 2: 1/3 Exprimer chaque composante étant diluée sur le même dénominateur commun! Soluté 1: 1/10 = 1.5/15 Soluté 2: 1/3 = /15 Donc 1.5 partie de soluté partie de soluté parties de solvant Déterminer la fraction requise: (La dilution) Déterminer le facteur de réduction = (Le facteur de dilution) Qu est que j ai Qu est que je veux Ex. Vous avez une solution de 25 mg/ml et vous voulez obtenir une solution de 5mg/ml Donc le facteur de réduction est de: 25mg/ml = 5 (Facteur de dilution) 5mg/ml La fraction est égale à 1/le facteur de dilution= 1/5 (la dilution) Exemple Comment est-ce que vous prépareriez 25 ml d une solution de 2mM à partir d un solution mère de 0.1M 10

11 Problème #1 Préparer 25mL d une solution de 2mM à partir d un stock de 0.1M Quel est le facteur de dilution requis? Quelle est la dilution requise? Quelles volumes de solvant et de soluté sont requis? Solution #1 Fractions : 2mM = 0.002M (ce que je veux) Stock = 0.1M (ce que j ai) Facteur de dilution = (ce que j ai)/(ce que je veux) Facteur de dilution = 0.1/0.002 = 50x Dilution requise = 1/Fd = 1/50 Volume d une partie = (Volume final)/(# de parties) Volume d une partie = 25mL/50 parties = 0.5mL/partie Solution #1 (suite) Volume de soluté 1 partie * 0.5mL/partie = 0.5mL Volume de solvent (50 1) parties *0.5mL/partie = 24.5mL 11

12 Quantités Les quantité ne sont PAS des concentrations! Ex 1. Deux pommes par sac = une concentration Deux pommes = une quantité Ex 2. 10g par 100 ml = une concentration 10g = une quantité D une concentration aux quantités La concentration indique la quantité dans un volume donné Ex. 1mM = 1 millimole par chaque litre Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimole? Les rapports Façon d exprimer les solutions en indiquant le rapport entre les différentes composantes: Rapports masses Rapports molaires Rapports volumes 12

13 Les rapports masses Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml d eau Convertir les unités pour qu elles soit les mêmes 12g de NaCl dans 100g d eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12g/12g : 100g/12g Le rapport NaCl : eau = 1:8,3 Les rapports molaires Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml d eau Convertir les unités en moles 12g/(58g/mole) de NaCl dans 100g/(18g/mole) d eau 0,2 mole de NaCl : 5,6 moles d eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 0,2mole/0,2mole : 5,6moles/0,2moles Le rapport NaCl : eau = 1:28 Les rapports volumes Ex. 12ml d alcool sont ajoutés à 1L d eau Convertir les unités pour qu elles soit les mêmes 12ml d alcool dans 1000ml d eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12ml/12ml : 1000ml/12ml Le rapport Alcool : eau = 1:83,3 13

14 Électrophorèse sur gel d agarose Séparation de molécules d acides nucléiques simples ou doubles brins d après leur taille et leur conformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Pouvoir de résolution entre fragments 100pb Plasmide non digéré sur gel - Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes La migration est une fonction de la taille et de la conformation Super enroulé Relâché Multimèrs? relâché - multimèrs Super enroulé + Migration d ADN linéaire-plasmide digéré La vitesse de migration est une fonction de la taille Les plus petits fragments migrent plus rapidement La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log 10 de la taille 14

15 Migration d ADN linéaire-plasmide digéré bp 850 bp 750 bp 600 bp 200 bp 100 bp + 100,000 Déterminer les tailles Taille (pb) Distance (mm) 23, , , , Taille paire de base 10,000 1,000 B 2, , A Distance, mm Visualisation: Bromure d éthidium Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Fluorescent sous les UV Liaison proportionnelle à La taille La quantité La conformation 15

16 Que peut-on déterminer d une électrophorèse sur gel d agarose? Est-ce qu il y a de l ADN Combiens de conformations Combien de fragments Taille des fragments Taille totale des molécules d acides nucléiques Nombre de coupures Linéaire? Circulaire? 16

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