ÉTUDE DU MODE D ACTION D UN HERBICIDE : L ATRAZINE. Delecolle J. Mandavid H., Pesticides et Phytoprotection. Université de Strasbourg

Transcription

1 ÉTUDE DU MODE D ACTION D UN HERBICIDE : L ATRAZINE Delecolle J. Mandavid H., Pesticides et Phytoprotection. Université de Strasbourg Détermination et comparaison du I50 de l Atrazine sur une plante sensible, l Épinard, et une plante résistante, le Maïs. Introduction : L Atrazine est un herbicide de classe C inhibiteur du photosystème II. Il se fixe sur la protéine D1 (à la place de la plastoquinone), empêchant le transfert d électrons nécessaire à la photosynthèse. Utilisé de nombreuses années, il a été interdit dans l Union Européenne à cause de sa toxicité pour l environnement, mais continue à être utilisé dans de nombreux pays. Le I50 permet de déterminer la sensibilité d une plante à un herbicide. C est la concentration d herbicide qu il faut pour atteindre la moitié de l effet maximal de l herbicide. Il est plus simple ensuite de comparer les I50 de plusieurs plantes à un même herbicide afin d adopter le meilleur traitement pour chaque culture. Le travail que nous allons effectuer a pour but de déterminer in vitro le I50 de l Atrazine sur le transport des électrons dans les chloroplastes d Épinard et de Maïs. Pour cela nous allons quantifier le transport des électrons dans les chloroplastes à l aide d un accepteur d électrons artificiel : le DCPIP (2,6- dichlorophénolindophénol). Le DCPIP oxydé est bleu. Lorsqu il accepte 2e- et 2H+ il se réduit et devient incolore. Nous utiliserons cette propriété pour déterminer le transport des électrons par suivi spectrophotométrique. Expérience: Dans un premier temps nous allons extraire les chloroplastes des feuilles d Épinards et de Maïs. Nous effectuons un broyage des feuilles dans un tampon d extraction, puis une filtration, une centrifugation, et une remise du culot en suspension. Toutes ces étapes se font à froid afin de limiter les réactions enzymatiques qui pourraient détruire les chlorophylles. Puis nous déterminons le rendement d extraction des chlorophylles pour connaître la quantité de chloroplastes présente dans notre extrait. Nous utilisons l absorbance des chlorophylles A et B à 663nm et 645nm, ainsi que les formules de MacKinney : [Chlorophylle a]µg/ml=12,7xdo663-2,69xdo645 [Chlorophylle b] µg/ml=22,9xdo645-4,68xdo663 Nous avons obtenu : DO645 = 0,443 et DO663 = 1,020 Au final nous obtenons une concentration totale en chlorophylles de 346,6 µg/ml. Nous diluons ensuite notre extrait pour obtenir une concentration donnée de 30 µg/ml pour les études avec l Atrazine. Enfin nous mesurons l intensité du transport d électrons en présence de concentrations croissantes d Atrazine. Pour cela nous préparons un milieu réactionnel contenant les chloroplastes (30 µg/ml), un tampon de réaction, le DCPIP (0,5mL à 0,55mM). A ce milieu nous ajoutons de l Atrazine à des concentrations croissantes de 0,1/0,15/0,2/0,25/0,3/0,4/0,5/1 µm. Trois témoins sont également fait : - Le premier sans Atrazine, est le témoin zéro, le blanc.

2 - Le second sera placé à l obscurité afin de mimer le 100% d inhibition (pas de photosynthèse). La présence ou non d Atrazine n est pas importante. - Le troisième contenant du méthanol, permettant de vérifier si les effets observés suite aux expériences ne sont pas dus au méthanol dans lequel l Atrazine est stockée. Les 8 tubes Atrazine + 2 témoins sont éclairés environ 10min. Puis une mesure de chacun des 11 tubes de la DO à 600nm (λmax du DCPIP) est faite et la courbe de la DO600nm en fonction de la concentration en Atrazine est tracée. Le témoin méthanol a donné une absorbance nulle, ce qui signifie que le méthanol n a pas d impact sur la photosynthèse et sur nos résultats. Le témoin obscurité nous a donné une DO de 0,664. Ceci correspond au maximum d inhibition de la photosynthèse. Pour déterminer le I50, nous prenons la moitié de cette valeur (0,332) et grâce à la courbe que nous avons obtenue, déterminons la concentration en Atrazine correspondant à la moitié du maximum d inhibition de la photosynthèse de notre plante (courbe ci- dessus). Le I50 de l Épinard que nous avons eu est de 0,22µM. Chaque groupe d étudiant a déterminé soit le I50 de l Épinard, soit le I50 du maïs, afin de comparer les résultats. Ceux ci sont présentés dans le tableau ci- dessous. I50 epinard I50 maïs Groupe ISIE Groupe PE Groupe VRV- BVI Moyenne 0,18 0,22 Nous obtenons un I50 légèrement plus faible pour l Épinard, ce qui est normal car c est une plante sensible à l Atrazine, donc la concentration nécessaire pour atteindre la moitié d inhibition totale de la photosynthèse doit être inférieure à une plante résistante. Néanmoins les résultats observés ne nous montrent pas une différence significative entre la plante résistante et la plante sensible. En effet, nous aurions dû obtenir pour le maïs un I50 beaucoup plus important que celui de l Épinard. Le rapport des moyennes des I50 du Maïs sur l Épinard nous indique que le maïs

3 est 1,2 fois plus résistant que l Épinard. Nous pouvons donc critiquer les résultats obtenus car ils ne reflètent pas les résultats attendus, qui voudraient que le Maïs soit beaucoup plus résistant que l Épinard. La résistance du Maïs vis à vis de l Atrazine est due à la métabolisation de l herbicide par les enzymes de défense telle que la DIMBOA (2,4- dihydroxy- 7- methoxy- 1,4-2H- benzoxazin- 3(4H)- one) qui greffe un groupement hydroxyle pour former l hydroxyatrazine inactive, et la GST (Glutathion- S- Transférase) qui greffe un glutathion qui désactive l Atrazine. Nous allons donc poursuivre l étude des mécanismes de détoxication d herbicides en étudiant l activité enzymatique de la GST dans les racines et les feuilles de Maïs. Étude de la GST chez le Maïs : Introduction : La GST (Glutathion-S-Transferase) fait partie d une famille d enzyme qui joue un rôle important dans la détoxication des xénobiotiques. Elles catalysent la formation de complexes Glutathion (GSH)- herbicides. Nous souhaitons mesurer la détoxication d herbicides en mesurant l activité enzymatique de la GST dans les racines et les feuilles de plantules de Maïs. Expérience : Pour ce faire, nous avons broyé selon deux protocoles différents (détaillés en TP) des feuilles et racines dans de l azote liquide afin d éviter toutes dégradations des GST causées par les oxydations et les enzymes (protéases). Puis nous avons mélangé le broyat avec un tampon contenant : du Tris HCL (permettant d ajuster le PH), EDTA (chélateur d ions bivalents, inhibe les protéases), du DTT (antioxydant). Enfin nous avons ajouté du PVPP, qui est un polymère de haut poids moléculaire et qui chélate les polyphénols libérés hors du broyage (et qui risquent d inhiber des activités enzymatiques). 1) Dosage des protéines Afin de connaitre la concentration totale en protéines présente dans le mélange, nous avons effectué une gamme étalon avec du BSA (courbe ci-dessous). Gamme étalon: absorbance à 595nm du milieu en fonction de la quantité croissante en BSA (mg) DO 595nm 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,012x + 0,0148 R² = 0, BSA (mg)

4 Extrait protéique (en µl) Nous avons ensuite mesuré l absorbance de solutions contenant des volumes d extrait protéique de 10, 20 et 30 µl de racines (R) et feuilles (F) selon les deux protocoles (1 et 2). A l aide de l équation de la courbe de la gamme étalon, y = 0,012x+0,0148, nous avons pu calculer la concentration protéique des différentes solutions. (Voir tableau ci-dessous). Exemple : Pour l extrait protéique 30 µl de feuilles du protocole 1, l absorbance observée est de A l aide de l équation de la courbe, on peut calculer x = ( ,0148)/0,012 = 28.2mg. Nous avions 30µL d extrait donc la concentration protéique est de 28.2/3/10= 0.939mg/mL. F1 R1 F2 R Do 595nm 0,129 0,225 0,353 0,013 0,052 0,121 0,055 0,295 0,324 0,098 0,209 0,320 Concentration protéique (en mg/ml) 0,952 0,876 0,939 0,015 0,155 0,295 0,335 1,17 0,859 0,693 0,809 0,85 On observe une concentration protéique supérieure dans les feuilles que dans les racines. C est un résultat attendu car les feuilles contiennent des chloroplastes dans lesquels est présent un nombre important de protéines. (Protéines vertes + protéines blanches) comme la RUBISCO, protéine la plus abondante sur terre. 2) Activité enzymatique de la GST Dans un seconde temps, afin de mesurer la quantité de GST présente dans le l extrait, nous avons effectué un test enzymatique, possible grâce à la formation d un complexe entre le GSH (forme réduite du Glutathion) et le CDNB, qui est un substrat artificiel des GSTs. La réaction est la suivante : Glutathione (GSH) + 1-chloro-2,4 dinitrobenzene (CDNB) CDNB-GSH conjugué Le complexe CDNB-GSH conjugué possède un taux d absorption maximal à 340nm (coefficient d extinction molaire : 9600M-1 cm-1.) La GST catalysée par la formation de CDNB-GSH produit un thioether dinitrophenyl qui peut être détecté par spectrophotométrie à 340nm. L activité GST est mesurée en mélangeant l extrait protéique avec les substrats (GSH et CDNB) ainsi que du tampon Phosphate dans des cuves appropriées (1 ou 3mL). L apparition du complexe CDNB-GSH conjugué est donc mesurée par spectrophotométrie (λ=340nm). Une unité de GST est définie comme étant la quantité d enzyme produisant 1mmol de CDNB- GSH conjugué par minute. Les résultats obtenus sont dans le tableau suivant : F1 R1 Témoin 1 F2 R2 Témoin 2 Pente (en U da/min) , , On constate que l activité enzymatique est plus forte dans les racines que dans les feuilles, que ce soit par le protocole 1 ou 2. Néanmoins il apparaît une différence d ordre de grandeur entre les deux méthodes. A l aide de la pente et de la concentration protéique, on peut calculer l activité protéique selon la formule suivante :

5 Activité protéique = (Pente x facteur de dilution) / (coefficient d extinction molaire x concentration protéique) Exemple : Pour l extrait protéique 30 µl de feuilles du protocole 1, l activité protéique est donc : (0,1184 x 1 x 1000) / (9,6 x 0,025 x 0,939) = 525,38 nmoles/min/l. Extrait protéique (en µl) Activité protéique en nmoles/min/mg de protéines F1 R1 F2 R , On constate une activité protéique moyenne de : nmoles/min/mg de protéines dans les feuilles nmoles/min/mg de protéines dans les racines (sans prendre en compte l activité protéique de l extrait de racines 10 µl du protocole 1, qui est une valeur aberrante, pouvant être due à une erreur de manipulation ou du fait que l échantillon n était pas homogène au moment du pipetage des 10 µl (cellules grisées) ce qui a entrainé le fait que la concentration protéique était si faible). Conclusion : Nous observons 3.8 fois plus d activité protéique dans les racines que dans les feuilles, ce qui peut sembler normal vu que les racines sont plus exposées aux stress biotiques, donc sont plus aptes à se défendre que les feuilles. De plus, énormément de pesticides sont solubles dans l eau afin d entrer dans la plante. Or la porte d entrée de l eau dans la plante est le système racinaire. Il est donc normal d observer une plus grande activité d enzyme de détoxication telle que la GST au niveau des racines. L utilisation de deux protocoles différents, dont l un issu d une publication de Del Buono et al. (2006), nous a permis d observer l importance des manipulations et de la préparation des échantillons. Avec le protocole de Del Buono, nous avons travaillé avec des volumes plus grands, ce qui a facilité les manipulations par rapport au protocole 2. En contre partie nous devions utiliser plus de matière première végétale (2g contre 0,5g) et de tampon d extraction (10mL contre 0,5mL), ce qui augmente les coûts de l expérience. Au final, les résultats restent cohérents d un protocole à l autre (plus d activité protéique dans les racines que dans les feuilles). Néanmoins lorsque nous comparons les résultats des activités protéiques des feuilles du protocole 1 avec ceux du protocole 2, ainsi que ceux des racines du protocole 1 avec le protocole 2, nous observons d assez grandes disparités, que nous n aurions pas dues avoir car nous sommes partis de la même matière première végétale. Il est donc nécessaire de répéter les expériences plusieurs fois, avec les deux protocoles, afin d obtenir des résultats plus fiables et exploitables et d accéder aux moyennes et écart-types. Ainsi nous pourrons déterminer quel protocole est le plus judicieux à utiliser pour étudier la GST.