DES de Biologie Médicale Enseignement d Immunologie. ET01 & ET02 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

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1 DES de Biologie Médicale Enseignement d Immunologie ET01 & ET02 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) Adrien Six (adrien.six@upmc.fr) Phnom Penh Université Pierre et Marie Curie septembre

2 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 2

3 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 3

4 Réaction antigène/anticorps 4

5 Réaction antigène/anticorps 5

6 Production d anticorps monoclonaux 6

7 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 7

8 Précipitation en milieu liquide 8

9 Précipitation interfaciale Technique du ring test (test qualitatif) 9

10 Diffusion unidimensionnelle 10

11 Diffusion simple bidimensionnelle Technique de Mancini Immunodiffusion radiale 11

12 Technique d Ouchterlony Précipitation en milieu solide Immunodiffusion double 12

13 Immunoélectrophorèse (Grabar/Williams) Combine électrophorèse et immunodiffusion double: 1. Séparation électrophorétique d une source d antigènes selon leur charge 2. Immunodiffusion radiale des antigènes séparés 3. Immunodiffusion d une source d anticorps déposée dans une gouttière sur l un ou l autre des côtés des antigènes séparés 4. Formation éventuelle d arcs de précipitation Analyse qualitative 13

14 Immunoélectrophorèse en fusée Technique de Laurell: - Analyse quantitative - Nécessité que l Ag soit chargé négativement 14

15 Immunoélectrophorèse bidimensionnelle Analyse qualitative & quantitative 15

16 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 16

17 Réaction d agglutination Qualitatif: très sensible; Quantitatif: peu précis 17

18 Test de Coombs direct Recherche d anticorps anti-rhésus chez le nouveau-né 18

19 Test de Coombs indirect Recherche d anticorps anti-rhésus chez la mère 19

20 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 20

21 RIA/ELISA RadioImmunoAssay/Enzyme-linked ImmunoSorbentAssay 21

22 ELISA indirect 22

23 ELISA sandwich 23

24 ELISA compétitif 24

25 ELISpot 25

26 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 26

27 Immunoprécipitation 27

28 Western blot

29 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 29

30 Immunofluorescence - principe 30

31 Immunofluorescence - exemple Coupe de pancréas: Anticorps «vert» dirigé contre GAD (glutamic acid decarboxylase) marque les cellules β des îlots de Langerhans Anticorps «orange» dirigé contre l hormone glucagon marque les cellules α 31

32 Cytométrie de flux (1) 32

33 Cytométrie de flux (2) 33

34 Cytométrie de flux (3) 34

35 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 35

36 Tri cellulaire par «panning» 36

37 Tri cellulaire par cytométrie 37

38 Tri cellulaire magnétique 38

39 Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie) 1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel 2. Réactions de précipitation 3. Réactions d agglutination 4. RIA; ELISA 5. Immunoprécipitation; Western blot 6. Immunofluorescence 7. Techniques de tri cellulaire 8. Conclusion 39

40 Sensibilité des techniques de détection 40

41 PCR-ELISA A. VanderBorght et al. (1999) J.Immunol.Methods 223:47. 41

42 Immuno-PCR M. C. Case et al. (1999) J.Immunol.Methods 223:93. 42

43 Panama-blot D. Stahl et al. (2000) J.Immunol.Methods 240:1. 43

44 Immunoproteomics Francisco J. Quintana, Peter H. Hagedorn, Gad Elizur, Yifat Merbl, Eytan Domany, and Irun R. Cohen. Functional immunomics: Microarray analysis of IgG autoantibody repertoires predicts the future response of mice to induced diabetes. PNAS 101: ,

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