Déjà édités. Fascicules de standardisation : 1 ère édition : ème édition : ème édition : 2005

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2 Déjà édités Fascicules de standardisation : 1 ère édition : ème édition : ème édition : 2005 Fascicules d'évaluation : 1 ère édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : 2006 CD ROM : «Standardisation de l antibiogramme à l échelle nationale selon les recommandations de l OMS»

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4 Comité d organisation : A. ABOUN Institut Pasteur d Algérie Alger H. AMMARI CHU Beni Messous -Alger R. BELOUNI CHU Blida Blida A. BENSLIMANI EHS Dr Maouche Alger. M.F.K. MISSOUM Institut National de Santé Publique Alger K. RAHAL Institut Pasteur d Algérie. H. TALI MAAMAR EHS Dr Maouche Alger. Comité des experts : A. ABOUN Service de Microbiologie Vétérinaire- Institut Pasteur d Algérie - Annexe Kouba. S. BAIT INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional de Laghouat. T. BELAZOUZ Groupe Avicole Centre Division Santé Animale et Environnement Alger N. BELGUENDOUZ INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional d El Taref. S. BENELKADI INMV -Laboratoire Central Vétérinaire El Harrach Alger. S. BENMOHAMED INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional de Mostaganem. N. CHABANE SARI INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional de Tlemcen. S. KECHIH INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda. M.N. KORICHI EHS El Hadi Flici Alger N. KOUTCHOUKALI INMV - Laboratoire Vétérinaire Régional de Constantine. N. ZEMBRI -TAHRAT Institut Pasteur d Algérie Alger Collaboration technique : M. BOUHERAOUA Institut Pasteur d Algérie. M. LALIAM-ZENATI Institut Pasteur d Algérie. N. ZEMBRI-TAHRAT Institut Pasteur d Algérie. Secrétariat : H. SAKHI Institut Pasteur d Algérie. Corrigé par : A. ABOUN Service de Microbiologie Vétérinaire -Institut Pasteur d Algérie - Annexe Kouba. H. AMMARI CHU Beni Messous Alger T. BELAZOUZ Groupe Avicole Centre- Division Santé animale et Environnement- Alger A. BENSLIMANI EHS Dr Maouche Alger. K. RAHAL Institut Pasteur d Algérie. H. TALI MAAMAR EHS Dr Maouche Alger. 4

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6 Sommaire Préambule 11 I. Introduction 13 II. Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie 14 a) à titre curatif 14 b) comme facteurs de croissance 14 III. Liste des antibiotiques suspendus de l homologation 14 IV. Mode opératoire Fiche technique n 1 : Bactéries non exigeantes Fiche technique n 2 : Streptocococcus spp Fiche technique n 3 : Haemophilus spp Fiche technique n 4 : Recherches complémentaires obligatoires Recherche de la résistance de Staphylococcus spp. à l oxacilline Recherche de la Bêta lactamase Recherche de la β-lactamase à spectre élargi chez les Entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp Recherche de Staphylococcus spp. ayant une sensibilité réduite aux glycopeptides Recherche d Enterococcus spp. résistants aux glycopeptides Détection d Haemophilus spp. de sensibilité diminuée aux β-lactamines Fiche technique n 5 : Autres bactéries Yersinia pestis Listeria spp Campylobacter spp Brucella spp. 51 V. Contrôle de qualité 57 VI. Recommandations et suggestions 67 VII. Whonet 73 Références Bibliographiques 79 Annexes Composition des milieux 83 Tables de lecture 84 Décision portant sur l utilisation des additifs dans l alimentation animale 95 Arrêté ministériel concernant les salmonelloses aviaires 96 Remerciements 99 6

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8 Liste des Tableaux et Tables de lecture Tableau 1 : Liste des antibiotiques utilisés à titre curatif 14 Tableau 2 : Liste des antibiotiques à tester pour Entérobactéries et Acinetobacter spp. 19 Tableau 3 : Liste des antibiotiques à tester pour Pseudomonas spp. 19 Tableau 4 : Liste des antibiotiques à tester pour Staphylococcus spp. 20 Tableau 5 : Liste des antibiotiques à tester pour Streptococcus Alpha ou non hémolytique, Streptococcus Bêta-hémolytique et Enterococcus spp. 23 Tableau 6 : Liste des antibiotiques à tester pour Haemophilus spp. 25 Tableau 7 récapitulatif : Recherche de la résistance des Staphylococcus spp. à l oxacilline 33 Tableau 8 : Dilutions des antibiotiques pour les CMI en milieu liquide 48 Tableau 9 : Solvants et diluants pour la préparation des solutions stocks d antibiotiques pour les CMI de Yersinia pestis 49 Tableau 10 : Valeurs critiques des diamètres et des CMI pour Campylobacter spp. 51 Tables de lecture Table de lecture 1 : Valeurs critiques des CMI pour Yersinia pestis 49 Table de lecture 2 : Table de lecture 3 : Table de lecture 4 : Table de lecture 5 : Table de lecture 6 : Table de lecture 7 : Table de lecture 8 : Table de lecture 9 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries chez toutes les espèces animales 84 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P.aeruginosa chez toutes les espèces animales 85 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. chez toutes les espèces animales 86 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. chez toutes les espèces animales. 88 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Streptococcus α hémolytiques et non hémolytiques 89 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Streptococcus β hémolytiques chez toutes les espèces animales. 90 Valeurs critiques des diamètres d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. chez toutes les espèces animales. 91 Valeurs limites des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité 92 Table de lecture 10 : Valeurs critiques pour les molécules antibiotiques ne figurant pas sur les tables du CLSI (d après les recommandations du Comité Français de l antibiogramme de Janvier 2007) 93 8

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10 Préambule La standardisation de l'antibiogramme selon les normes CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recommandées par l'oms, a touché les laboratoires de médecine vétérinaire en 1999, soit 2 ans après les laboratoires médicaux (1997). Certes, le nombre de laboratoires vétérinaires est nettement inférieur au nombre de laboratoires médicaux mais leur impact sur la santé animale et humaine est très important. Le contrôle de qualité de l antibiogramme est pratiqué actuellement par tous les laboratoires qui de plus, participent annuellement à l évaluation externe de la qualité. Nous nous sommes très tôt rendus compte que des bactéries multirésistantes (notamment aux quinolones) étaient isolées chez l'espèce aviaire. Il était par conséquent urgent d'inviter les microbiologistes vétérinaires à se pencher sur la standardisation des listes des antibiotiques à tester en fonction des germes isolés, de l'espèce animale à traiter, et de la nomenclature vétérinaire algérienne afin d orienter la prescription antibiotique. Dans la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques, il faut également tenir compte des antibiotiques prescrits à titre curatif, préventif et utilisés comme facteurs de croissance. C'est le quatrième fascicule de standardisation de l'antibiogramme édité à l'intention des vétérinaires et qui est mis à jour tous les trois ans. Grâce à cette standardisation et à un logiciel "WHONET" actuellement version 5.4 (fourni par l'oms) de saisie des données, des résultats d'antibiorésistances sont édités chaque année. Sept fascicules 2000, 2001, 2002, 2003, 2004,2005 et 2006 ont déjà paru en Algérie. Grâce à ces résultats, le réseau des laboratoires algériens est officiellement répertorié sur Internet par l'oms : Algerian Antimicrobial Resistance Network (AARN). De plus, une page web de ce réseau a été crée sur le site du ministère algérien de la santé ( Son adresse est : Ces résultats seront d'un apport certain dans l'orientation de la politique nationale en matière d'antibiothérapie. Pr. Kheira RAHAL 10

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12 I. Introduction : La standardisation de l antibiogramme en médecine vétérinaire a pris effet en Plusieurs séminaires d évaluation ont été organisés et ont abouti à des résultats préliminaires concernant l état de la résistance des bactéries aux antibiotiques en milieu vétérinaire. Les buts fixés par la standardisation en 2001 ont permis de dépister les souches bactériennes résistantes aux antibiotiques, d exploiter les données afin d instaurer une thérapeutique adéquate et par conséquent de surveiller l évolution de la résistance aux antibiotiques dans notre pays. Notons que l utilisation des antibiotiques chez l animal comme agents thérapeutiques, prophylactiques ou comme promoteurs de croissance peut entraîner une réduction de l efficacité de ces produits en médecine vétérinaire comme en médecine humaine, par suite du développement de souches résistantes. Il y a lieu de signaler que les antimicrobiens efficaces telles les fluoroquinolones et les céphalosporines ne devraient être délivrés que sur ordonnance et utilisés selon les recommandations d un vétérinaire. C est pourquoi il est essentiel que des mesures appropriées de protection de la santé publique soient établies afin de minimiser l apparition et le transfert aux humains de bactéries résistantes par l intermédiaire de la chaîne alimentaire. Malgré les problèmes rencontrés par les microbiologistes au niveau des différents laboratoires vétérinaires régionaux (à savoir le manque d information quant à la mise sur le marché de nouvelles molécules antibiotiques), quelques objectifs tracés ont été atteints à savoir : - La standardisation de l antibiogramme selon la technique CLSI au niveau de tous les laboratoires vétérinaires. - Le dépistage rapide et correct des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. L utilisation d un réseau informatique depuis l année 2005 permet les échanges de données entre les laboratoires vétérinaires à l échelle nationale pour une meilleure surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques. 12

13 II. Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie : a- A titre curatif : La nomenclature algérienne établie en 2004 concerne 178 spécialités homologuées, mais les molécules suivantes sont les plus couramment utilisées sur le terrain. (Tableau 1) Tableau 1 : Liste des antibiotiques utilisés à titre curatif. Familles d antibiotiques Beta lactamines Antibiotiques Ampicilline/amoxicilline Amoxicilline+acide clavulanique Oxacilline Penicilline Cefalexine Ceftiofur/ cefotaxime Cephalothine Familles d antibiotiques Quinolones Antibiotiques Acide nalidixique Acide oxolinique Flumequine Norfloxacine Enrofloxacine Aminosides Neomycine Tetracyclines Tetracycline Macrolides Tilmicosine Erythromycine Spiramycine Polypeptides Colistine Glycopeptides Vancomycine Sulfamides Trimethoprime+sulfamethoxazole b- Antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance : (voir annexes page 95) Tous les antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance ne sont plus incorporés dans l alimentation animale et sont interdits d utilisation depuis Avril 2007 (décision ministérielle du 24 Décembre 2006). III. Liste des antibiotiques suspendus de l homologation : Furanes : Nitrofurantoine Phenicoles : Chloramphenicol. Aminosides : Gentamicine Ces antibiotiques sont cependant testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques. 13

14 IV. Mode opératoire (Fiches techniques) 14

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16 1. Fiche technique n 1 Bactéries non exigeantes Entérobactéries, P. aeruginosa, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Acinetobacter spp. et autres Milieu : - Gélose Mueller Hinton (MH), coulée en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l emploi. Inoculum : - A partir d une culture pure de 18H sur milieu d isolement, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l anse dans 5 à 10ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 59) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, ou bien de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l inoculum. NB : Pour toutes les molécules ayant une charge SFM, l inoculum doit être dilué au 1/100. Ensemencement : - Tremper un écouvillon * stérile dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. * : L écouvillon évite les contaminations du manipulateur et de la paillasse 16

17 Application des disques d antibiotiques : - Il ne faut pas mettre plus de 6 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. Les disques d antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre. - Tester la liste des antibiotiques indiqués dans les tableaux 2, 3 et 4 pages 19, et 20 selon la bactérie isolée. - Presser chaque disque d antibiotique à l aide de pinces bactériologiques stériles pour s assurer de son application. Une fois appliqué le disque ne doit pas être déplacé. Incubation : 18 heures à 35 C **, 24 h pour Acinetobacter spp. - La durée d incubation peut être prolongée dans certains cas : oxacilline, glycopeptides et macrolides. Lecture : - Mesurer avec précision *** les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse métallique, à l extérieur de la boîte fermée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture n 2, 3, 4 et 5 pages 84 à Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistante. NB : Souches de contrôle de qualité : Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC ** : Température optimale de croissance *** : Pour Proteus spp., ne pas tenir compte de la zone d envahissement. 17

18 Tableau 2 : Liste des antibiotiques à tester pour Entérobactéries et Acinetobacter spp. Boites 90mm Espèce Aviaire Espèces Bovine, Ovine, Caprine et Cameline Espèces Canine, Féline Espèce Equine Espèce Cunicole Boîte 1 Ampicilline* Ampicilline Ampicilline* Ampicilline Amoxicilline+ acide clavulanique a Amoxicilline + Amoxicilline + acide clavulanique a acide clavulanique a Ceftiofur / cefotaxime a Neomycine Amoxicilline + acide clavulanique a Ceftiofur/cefotaxime a Ceftiofur / cefotaxime a Ceftiofur/ Ceftiofur / Trimethoprime + cefotaxime a cefotaxime a sulfamethoxazole Tetracycline Trimethoprime + sulfamethoxazole Tetracycline Enrofloxacine Colistine b Acide nalidixique Enrofloxacine Tetracycline Boîte 2 Trimethoprime + sulfamethoxazole Colistine b Furanes c Trimethoprime + sulfamethoxazole Colistine b Tetracycline Cephalothine Chloramphenicol c Norfloxacine Enrofloxacine Cephalothine Cephalothine Boîte Flumequine Cefalexine * ou Amoxicilline Flumequine 3 * * ou Amoxicilline Flumequine Acide oxolinique Tableau 3 : Liste des antibiotiques à tester pour Pseudomonas spp. Antibiotiques Colistine b Ceftazidime a Amoxicilline + acide clavulanique a Enrofloxacine Gentamicine c a : Antibiotique testé pour la recherche de β-lactamase à spectre élargi b : En cas de résistance à la colistine déterminer la CMI par E-test c : Antibiotiques testés uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance * Boite 3 : Inoculum dilué 1/100, valeurs critiques CA-SFM (table de lecture 10 page 93) 18

19 Tableau 4 : Liste des antibiotiques à tester pour Staphylococcus spp. Boîte 90mm Espèce Aviaire Espèces Bovine, ovine, caprine et cameline Espèces Canine et féline Espèce Equine Espèce Cunicole Boîte 1 Penicilline Penicilline Penicilline Penicilline Penicilline a,b Oxacilline a Oxacilline Amoxicilline+Acide clavulanique Gentamicine Oxacilline a,b Cefoxitine a Cefoxitine a Oxacilline a Cefoxitine a,b Néomycine Erythromycine Cefoxitine a Erythromycine Gentamicine b Trimethoprime + sulfamethoxazole Trimethoprime + sulfamethoxazole Vancomycine Enrofloxacine Enrofloxacine Enrofloxacine Enrofloxacine Boîte 2 Trimethoprime + sulfamethoxazole Tetracycline Tétracycline Erythromycine Vancomycine Erythromycine Vancomycine Tilmicosine Boite 3 ** Spiramycine Flumequine Spiramycine a Si OXA R (et FOX R), la souche est résistante à toutes les β-lactamines. b Antibiotiques testés uniquement dans le cadre de l épidemiosurveillance. Boite 3 : Inoculum dilué au 1/100, valeurs critiques CA-SFM (table de lecture 10 page 93). 19

20 2. Fiche technique n 2 Streptococcus spp. Milieu : - Gélose Mueller Hinton additionnée de 5% de sang de mouton, coulée en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l emploi. Inoculum : - A partir d une culture pure de 20 à 24H, sur gélose au sang de mouton, racler à l aide d un écouvillon * des colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l écouvillon dans 5 à 10ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 59) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15min qui suivent la préparation de l inoculum. NB : Pour toutes les molécules ayant une charge SFM, l inoculum doit être dilué au 1/10. Ensemencement : - Tremper un écouvillon stérile ** dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. * L utilisation de l écouvillon à la place de l anse de platine pour la préparation de la suspension bactérienne permet de prélever plus facilement les colonies. ** L écouvillon évite les contaminations du manipulateur et de la paillasse. 20

21 Application des disques d antibiotiques : - Il ne faut pas mettre plus de 4 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. - La liste des antibiotiques à tester, selon la bactérie isolée (Streptococcus spp.) figure dans le tableau n 5 page Presser chaque disque d antibiotique à l aide de pinces bactériologiques stériles pour s assurer de son application. Une fois appliqué, le disque ne doit pas être déplacé. Incubation : 20 à 24 Heures, à 35 C sous CO 2 (5%). Lecture : - Mesurer avec précision le diamètre de la zone d inhibition de la croissance bactérienne et non pas celle de l hémolyse, à l aide d un pied à coulisse métallique, boîte ouverte et bien éclairée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture n 6 et 7 page 89 et Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire, ou Résistante. NB : Souches de contrôle de qualité : Streptococcus pneumoniae ATCC

22 Tableau 5 : Liste des antibiotiques à tester pour Streptococcus Alpha ou non hémolytique, Streptococcus Bêta-hémolytique et Enterococcus spp. Boîtes 90mmØ Streptococcus Alpha ou non hémolytique Streptococcus Bêtahémolytique ** Enterococcus spp Ceftiofur/cefotaxime a Penicilline Ampicilline Boîte1 Erythromycine/ (ERY) b Ampicilline Tilmicosine Clindamycine/ (CLIN) b Ceftiofur/cefotaxime Tetracycline a Enrofloxacine Enrofloxacine Erythromycine / (ERY) b Tetracycline a Erythromycine/ (ERY) b Vancomycine c Vancomycine Clindamycine/ (CLIN) b Chloramphenicol d Boîte 2 Chloramphenicol d Tetracycline a Enrofloxacine Trimethoprime+sulfamethoxazole Vancomycine Trimethoprime+ sulfamethoxazole Boîte 3 * Spiramycine Spiramycine CMI Penicilline Ampicilline Gentamicine Vancomycine ** Pour Streptocoques A, C, G, la liste minimale des antibiotiques à tester est : Pénicilline Erythromycine. Devant toute résistance aux β-lactamines confirmer l identification et les résultats de l antibiogramme. a L interprétation pour Tetracycline est valable pour Doxycycline. b Le disque ERY doit être appliqué près du disque CLIN : Si antagonisme entre disque ERY et disque CLIN, la souche présente une résistance inductible à la clindamycine. Dans ce cas, il faut répondre CLIN Résistant avec commentaire : «Souche Présumée résistante à Clindamycine- Risque d échec thérapeutique». c Détecter les souches de sensibilité diminuée aux glycopeptides. d Antibiotiques testés uniquement dans le cadre de l épidemiosurveillance. *Boite 3 : Inoculum dilué au 1/100, valeurs critiques CA-SFM (table de lecture 10 page 93). 22

23 3. Fiche technique n 3 Haemophilus spp.* Milieu : - Gélose HTM (Haemophilus Test Medium), coulée sur une épaisseur de 4mm. Les géloses sont séchées avant l emploi. La gélose Mueller Hinton au sang cuit n est pas indiquée pour l antibiogramme d Haemophilus. Inoculum : - A partir d une culture pure de 18 à 24H, sur milieu d isolement, racler à l écouvillon * quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l écouvillon dans 5 à 10ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 59) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l inoculum. NB : L inoculum doit être dilué au 1/10 pour tester l ampicilline à 2 µg, la cefalotine et l acide nalidixique. Ensemencement : - Tremper un écouvillon*** stérile dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. - Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. - Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. * La recherche de β-lactamase est obligatoire. ** L utilisation de l écouvillon à la place de l'anse de platine pour la préparation de la suspension bactérienne permet de prélever plus facilement les colonies *** L écouvillon évite la contamination du manipulateur. 23

24 Application des disques d antibiotiques : - La liste des antibiotiques à tester, pour Haemophilus spp. figure dans le tableau si après. - Il ne faut pas mettre plus de 4 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. - Le disque d ampicilline doit être appliqué à côté du disque d amoxicilline+acide clavulanique. - L observation d une synergie entre les deux disques indiquerait la présence d une pénicillinase. Tableau 6 : Liste des antibiotiques à tester pour Haemophilus spp. Boîtes 90mmØ Haemophilus spp Ampicilline a Boîte1 Amoxicilline + ac.clavulanique a Ceftiofur /cefotaxime Tetracycline b Enrofloxacine Boîte 2 Boîte 3 Trimethoprime+sulfamethoxazole Spectinomycine Cephalothine c Ampicilline 2µg c Acide nalidixique Incubation : 16 à 18H à 35 C, en atmosphère enrichie en CO 2 (5%). Lecture : Mesurer avec précision, les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse métallique, boîte ouverte et bien éclairée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture 8 page Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire, ou Résistante. - Attention aux inoculums trop importants, induisant des erreurs de lecture. NB : Souches de contrôle de qualité : Haemophilus influenzae ATCC a : Détection d une Bêtalactamase. b : L interprétation pour Tétracycline est valable pour Doxycycline. c : Détection des souches d Haemophilus influenzae BLNAR (β-lactamase négative, Résistant à l Ampicilline) Boîte 3 : Les molécules testées n ont pas de valeurs critiques du CLSI. Préparer un inoculum à 0,5 Mc Farland (dilué au 1 /10). Se référer aux valeurs critiques du CA-SFM (table de lecture n 9 page 93). 24

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26 4. Fiche technique n 4 Recherches complémentaires obligatoires 4.1. Recherche de la résistance de Staphylococcus spp. à l oxacilline : Test à la cefoxitine (30µg) S.aureus et S.lugdunensis autres SCN 20mm 19mm 25mm 24mm Souche Souche Souche Souche OXA (S) OXA (R) OXA (S) OXA (R) Confirmer par Confirmer par - la recherche de la PLP2a - la détermination de la CMI - ou bien screening test - ou bien la détermination de la CMI - ou bien encore la recherche de gène MecA Test de diffusion du disque de cefoxitine (30µg) : Technique : La résistance des staphylocoques aux isoxazolyl pénicillines (oxacilline) est recherchée à l aide d un disque de cefoxitine (30µg) dans les conditions standards de l antibiogramme. 26

27 Lecture : La lecture du diamètre d inhibition doit se faire à l aide d un pied à coulisse. Pour Staphylococcus aureus : - Si le diamètre de la cefoxitine est 19mm, la souche est dite résistante à l oxacilline. - Si le diamètre de la cefoxitine est 20mm, la souche est dite sensible à l oxacilline. Devant tout problème d interprétation, faire un test de confirmation par la technique du screening à l oxacilline (Test MRSA). Pour Staphylococcus à coagulase négative : - Si le diamètre de la cefoxitine est 24mm, la souche est dite résistante à l oxacilline. Devant tout problème d interprétation, faire une détermination de la CMI à l oxacilline. (technique page 31) Screening test à l oxacilline pour Staphylococcus aureus : Devant tout problème d interprétation du diamètre d inhibition de la cefoxitine faire un screening test. Ce test concerne uniquement Staphylococcus aureus Milieu : - Gélose Mueller Hinton additionnée de 4% de NaCl, (milieu disponible à l IPA) et de 6 µg/ml d oxacilline. - La préparation de la solution d oxacilline se fait de la manière suivante : Diluer 6mg d oxacilline (poudre injectable d un flacon de 1g) dans 10ml d eau distillée stérile, puis faire une dilution au dixième. Répartir la solution obtenue à raison de 2ml par tube ; ainsi conditionnées ces solutions peuvent être conservées à -20 C pendant une semaine, au bout de laquelle elles doivent être renouvelées. - Mettre 2ml de cette solution dans une boîte de 90mm de diamètre, ajouter 18ml de gélose Mueller Hinton additionnée de 4% de NaCl. Mélanger en faisant des mouvements rotatoires. - Laisser solidifier puis sécher. Inoculum : - A partir d une culture pure de 18H sur milieu d isolement, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l anse dans 5 à 10ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 59) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. 27

28 - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l inoculum. Ensemencement : - L ensemencement se fait par spot, en appliquant verticalement sur la gélose l extrémité d un écouvillon trempé dans la suspension bactérienne (ou ensemencer un cadran en entier). - Les souches de référence doivent être testées dans les mêmes conditions. S. aureus ATCC souche sensible à l oxacilline. S. aureus ATCC souche résistante à l oxacilline. Incubation : - 24 H à 35 C en atmosphère normale. Lecture : - La culture de plus d une colonie de la souche test (Photo A ci-dessous) suffit pour indiquer une résistance à l oxacilline, impliquant une résistance à toutes les β-lactamines. S. aureus ATCC Souche à tester : résistante à l oxacilline S. aureus ATCC Photo A : Screening test à l oxacilline chez Staphylococcus aureus. 28

29 Détection de la résistance à l oxacilline des souches de Staphylococcus aureus par la mise en évidence de la PLP2a (ou PBP2 ) : Il existe plusieurs réactifs commercialisés : - SLIDEX MRSA detection : BioMerieux (ref : 73117) - PBP2 test : OXOÏD (ref : DR 0900A) Principe : (BioMerieux) - Les particules de latex sensibilisées par un anticorps monoclonal dirigé contre la PBP2 vont réagir après extraction spécifiquement avec S. aureus meticillino résistant (MRSA) entraînant l apparition d une agglutination visible à l œil nu. - Les souches de S. aureus sensibles à la meticilline (MSSA) n agglutinent pas les particules de latex. Technique : Extraction : - Mettre 4 gouttes du réactif d extraction 1 dans un tube pour microcentrifugeuse. - Prélever 3 öses pleines de culture (öse calibrée de 1µl). - Décharger ces öses dans le liquide d extraction 1. - Fermer le tube à l aide d un bouchon. - Mettre ce tube dans un bain-marie bouillant à température comprise entre 95 C et 100 C pendant 3 minutes. - Retirer le tube et laisser refroidir à température ambiante. - Ajouter une goutte du second réactif d extraction puis homogénéiser la suspension. - Centrifuger à 1500g pendant 5mn. - L agglutination se fera à partir du surnageant. Agglutination : - Ajouter une goutte de latex sensibilisé (par un anticorps monoclonal anti- PBP2 ) dans le cercle test puis déposer 50µl du surnageant (extrait de culture). - Bien mélanger le tout à l aide d un bâtonnet, en étalant le mélange sur toute la surface. - Répéter cette technique d agglutination pour le latex contrôle négatif. 29

30 - Donner à la carte, un léger mouvement de rotation manuellement ou à l aide d un agitateur rotatif pendant 3mn. - Observation : l apparition éventuelle d une agglutination. Lecture : - Présence d agglutination : le test est positif : présence de PBP2 (MRSA+) - Absence d agglutination : le test est négatif : absence de PBP2 (MSRA-) Détermination de la concentration minimale inhibitrice vis à vis de l oxacilline : La CMI à l oxacilline doit être faite pour toutes les souches de Staphylococcus à coagulase négative présentant une résistance à l oxacilline (diamètre de la cefoxitine 24mm). Conditions de manipulation : - La technique se fera sur gélose MH additionnée de 2% NaCl. - L inoculum : une suspension bactérienne de 0,5 Mc Farland sera préparée à partir d une culture pure. - Incubation : 24H à 35 C en atmosphère normale. - La souche de référence Staphylococcus aureus ATCC doit être testée dans les mêmes conditions. Détermination de la concentration minimale inhibitrice en milieu solide : Matériel : - Série de 11 tubes à essai, numérotés de 160µg/ml à 0,16µg/ml. - Série de boîtes de Petri rondes, numérotées de 16 µg/ml à 0,016µg/ml. - Culture de 18h de la souche à tester, ainsi que la souche témoin Staphylococcus aureus ATCC Poudre d antibiotique (oxacilline) titrée ou a défaut celle à usage injectable. - Pipette graduée jetable ou en verre stérile. - Milieu Mueller Hinton + 2% de NaCl gélosé. - Eau distillée stérile. Méthode : 1. Préparation de la gamme de concentration d antibiotiques : Préparation de la solution mère : - On prépare une solution mère à 1600 µg/ml = 16mg de poudre diluée dans 10ml de solvant. 30

31 - Dans le cas où la poudre d antibiotique est titrée, le volume de solvant à rajouter est calculé comme suit : V = 16mg x titre = ml H2O distillée 1600 µg/ml Commencer par la distribution d eau distillée dans chaque tube. A partir de la solution mère, procéder à la distribution de l antibiotique en changeant de pipette chaque fois que c est nécessaire. Prendre 2ml de chaque concentration d oxacilline (160 µg/ml, 80µg/ml à 0,16µg/ml) et la mettre dans les boîtes de Petri correspondantes (16 µg/ml à 0,016µg/m). Pour éviter de gaspiller des pipettes, il est conseillé d utiliser une seule pipette, en allant de la plus faible concentration d antibiotique à la plus élevée. Une boîte témoin est obligatoire pour chaque série de CMI, avec 2ml d eau distillée sans antibiotique afin de contrôler l inoculum. Ajouter dans chaque boite 18 ml de Mueller Hinton + 2% de NaCl fondu et ramené à 45 C. Homogénéiser par mouvements rotatoires et laisser solidifier. Sécher les boîtes. Solution mère d antibiotiques Solution mère (ml) Eau distillée (ml) Concentration en tubes (µg/ml) Concentration en boîtes (µg/ml) 1600 µg/ml 1 ml 0,5 ml 9 ml 9,5 ml pipette Changer de pipette 80µg/mL 2 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 2 ml 3 ml 3,5 ml 7,5 ml ,5 Une seule 2 ml 2 ml 2,5 0,25 Changer de pipette 5 µg /ml 1 ml 0,5 ml 3 ml 3,5 ml 1,25 0,63 0,125 0,063 0,5 ml 7,5 ml 0,32 0,032 Changer de pipette 0,32µg/mL 2 ml 2 ml 0,16 0,016 31

32 2- Inoculum : Préparer les suspensions des souches à tester et des souches témoins, de la même manière que pour l antibiogramme (0,5 Mac Farland), faire une dilution au 1/10 ème. 3- Application : Appliquer 3µl des différentes suspensions sur la gélose à l aide d une anse de platine calibrée (Φ interne de la boucle égale à 3mm), ou à l aide d une micropipette. 4- Incubation : 18h à 24 h à 35 C. 5- Interprétation : Concentration d oxacilline en µg/ ml S R - S.aureus S.coagulase négative 0,25 0,5 Pour S.aureus ATCC 29213, les valeurs critiques pour l oxacilline sont : 0,125 0,5. Tableau 7 récapitulatif : Recherche de la résistance des Staphylococcus sp à l oxacilline. S. aureus S. à coagulase négative Antibiogramme Cefoxitine (30µg) 19 mm Résistant 24 mm Résistant Test de confirmation Screening test à l oxacilline (MH + 4%NaCl + 6µg d oxacilline) CMI à l oxacilline sur MH + 2% NaCl Test rapide de confirmation Test de détection de la PLP2a 4.2. Recherche de la β-lactamase : - La recherche de la sécrétion de β-lactamase est obligatoire pour toute souche de N. gonorrhoeae, Haemophilus spp., Branhamella catarrhalis, Enteroccocus spp. 32

33 - Pour ce faire, plusieurs techniques existent : chromogéniques, microbiologiques et iodométriques. Ces tests doivent être effectués précocement, en raison des implications thérapeutiques évidentes. La technique chromogénique permet de donner les résultats le jour même, mais à défaut de pouvoir la pratiquer, les techniques microbiologiques doivent être utilisées. a. Technique chromogénique : Basée sur l utilisation de disques imprégnés de céphalosporine chromogène, commercialisés et prêts à l emploi. La réaction est instantanée. Le virage au violet indique une réaction positive. b. Technique microbiologique : (test du trèfle) Matériel : Souches de référence : Staphylococcus aureus ATCC sensible à la pénicilline Staphylococcus aureus ATCC résistant à la pénicilline Souches à tester Gélose Mueller Hinton Disque de penicilline G ou ampicilline Technique : - Ensemencer une souche de S. aureus ATCC sur une gélose Mueller Hinton pour Branhamella catarrhalis ou MH au sang cuit pour N.gonorrhoeae et Haemophilus spp. - Appliquer un disque de penicilline G au centre de la boîte dans le cas d un Staphylococcus spp. ou Neisseria gonorrhoeae ou un disque d ampicilline dans le cas d Haemophilus spp. ou Branhamella catarrahlis. - Ensemencer en stries radiales (du centre de la boîte à la périphérie) la souche à tester, une souche témoin négatif (S. aureus ATCC 25923), une souche témoin positif (S. aureus ATCC 43300). - Incuber la boîte 18h à 35 C en atmosphère normale ou 24h en atmosphère enrichie en CO 2 pour Haemophilus spp. et N. gonorrhoeae. Lecture et interprétation : La production de ß-lactamase (penicillinase) par la souche à étudier et la souche témoin positif induit la culture de la souche témoin négatif (sensible à la pénicilline) jusqu au contact du disque d ampicilline ou de pénicilline (Photo B page 35). 33

34 S. aureus ATCC Souche d Haemophilus à tester : productrice de ß-lactamase Disque d'ampicilline S. aureus ATCC Photo B : Production de ß-lactamase chez Haemophilus spp par la technique du trèfle 4.3. Recherche de la β-lactamase à spectre élargi chez les Enterobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. : Définition d une BLSE : Les β-lactamases à spectre élargi ou étendu désignent les enzymes «β-lactamases» produites par les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. Ces enzymes codent pour la résistance aux céphalosporines de 3 ème génération (cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime) et aux monobactam (aztreonam), mais n ont aucune activité vis-à-vis des céphamycines (cefoxitine, moxalactam) ni des carbapenemes (imipeneme) Quand rechercher une BLSE : On recherchera une BLSE devant un diamètre inférieur aux valeurs suivantes : cefotaxime (CTX 27mm), ceftazidime (CAZ 22mm), ceftriaxone (CRO 25mm) et aztréonam(atm 27mm) Méthode de détection de la BLSE : a. Test de synergie : (selon Jarlier et coll) Principe : Les BLSE dérivées des enzymes de classe A (Ambler) sont inhibées par les inhibiteurs de β-lactamases (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam). 34

35 a.1. Entérobactérie : (Photo C page 36) : Technique : La recherche de la ß-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standards de l antibiogramme. (Fiche technique n 1 page 15) en déposant un disque d amoxicilline + acide clavulanique (AMC 20/10µg) à 30mm centre à centre d un disque de céphalosporine de 3 ème génération cefotaxime (CTX 30µg) ou ceftriaxone (CRO 30µg). Incuber 18 H à 35 C. Remarque cette technique permet la mise en évidence des TEM et SHV. Pour les autres BLSE de classe A : CTX-M et CMT : Le test de synergie doit être fait dans les même conditions standard de l antibiogramme en incluant les β-lactamines suivantes : ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX) ou ceftriaxone (CRO) et aztreonam (ATM) en raison de l existence de phénotypes de résistance différents (céfotaximase ou ceftazidimase ). Lecture : - La production d enzyme peut se traduire par l apparition d une image de synergie ou bouchon de champagne entre les disques : Amoxicilline+ acide clavulanique et le cefotaxime Amoxicilline+ acide clavulanique et la ceftazidime Amoxicilline+ acide clavulanique et l aztréonam Interprétation : - On recherchera une BLSE devant un diamètre inférieur aux valeurs suivantes : cefotaxime (CTX 27mm), ceftazidime (CAZ 22mm), ceftriaxone (CRO 25mm) et aztreonam (ATM 27mm). - Chez Proteus mirabilis, P.penneri, P.vulgaris, Morganella morganii,providencia stuartii, les BLSE s expriment à bas niveau dans ce cas, le test de synergie est optimisé en disposant les disques à une distance de 40 à 45mm au lieu de 30mm. Absence de synergie : En l absence d une image de synergie, la production de BLSE sera suspectée devant toute diminution du diamètre autour des disques de céphalosporines de 3 ème génération. Elle peut être due à : 1) La synthèse d une BLSE de type CMT (complexe Mutants TEM) 2) L association de plusieurs mécanismes : BLSE + céphalosporinases hyperproduite (entérobactérie). 35

36 1) La recherche de CMT : se fera en rapprochant les disques CTX- AMC de 20mm et 25mm au lieu de 30mm. 2) La détection des ßLSE chez les souches également hyper productrices de céphalosporinase (enterobacter.) est facilitée : Ou - Par la recherche d une synergie entre amoxicilline + acide clavulanique et cefipime (CFP 30µg) ou cefpirome (CPO 30µg SFM), car ce sont des molécules stables à l action de la céphalosporinases hyperproduite (recommandations du CA-SFM-2007). - Par l inactivation de la céphalosporinase en incluant de la cloxacilline (0,25mg/ml -0,30mg/ml) dans la gélose pour les entérobactéries du groupe 3 (Voir technique page : technique cloxacilline). 3) Par l usage de disque combinant une céphalosporine de 3 ème génération et l inhibiteur enzymatique ou de bandelette E test. Risque d erreur d interprétation : Chez Klebsiella oxytoca, P.vulgaris, P.penneri, Citrobacter koseri, le test de synergie est positif avec aztreonam et / ou ceftriaxone, mais reste négatif avec ceftazidime dont l activité est conservée, signe d hyperproduction de ß-lactamase naturelle chromosomique ou aztréonamase. a.2. Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter.sp : La détection est plus difficile en raison d associations avec d autres mécanismes de résistance tel : hyperproduction de céphalosporinase. Technique : La recherche de la ß-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standards de l antibiogramme (fiche technique n 1 page 17) en déposant un disque de ticarcilline + acide clavulanique (TCC 75/10µg) à 30mm (centre à centre) d un disque de céphalosporine de 3 ème génération ceftazidime (CAZ 30µg) et aztreonam (ATM 30µg). Incuber 18 H à 35 C Lecture : Le test est positif s il y a apparition d une image de synergie ou bouchon de champagne entre les disques : Ticarcilline+ acide clavulanique et la ceftazidime. Ticarcilline +acide clavulanique et l aztreonam. 36

37 S il y a absence de synergie, on peut rechercher la BLSE par : 1- Le rapprochement des disques TCC et CAZ (15mm et 20mm) au lieu de 30mm. 2- La neutralisation de la céphalosporinase : Si la souche est productrice d une céphalosporinase hyper produite il faut faire le test de synergie sur Mueller Hinton additionnée de 250mg/L de cloxaciline. CTX CAZ AMC ATM CRO Photo C : Souche de Klebsiella pneumoniae productrice de ß-lactamase à spectre élargi CRO : ceftriaxone ; ATM : aztreonam ; CAZ : ceftazidime ; CTX: cefotaxime ; AMC : amoxicilline+ acide clavulanique. CPO CAZ ATM TCC CTX Photo D : Souche de Pseudomonas aeruginosa productrice de ß-lactamase à spectre élargi ATM : aztreonam ; CAZ : ceftazidime ; CTX : cefotaxime ; CPO : cefpirome ; TCC : ticarcilline+ acide clavulanique. 37

38 b. Test de confirmation (technique du double disque (Photo E)) Ce test devra être fait systématiquement devant : - L absence de synergie avec diminution des diamètres des Céphalosporines de 3 ème génération. - La présence d une résistance aux molécules suivantes (ampicilline, ticarcilline, cefazoline avec un diamètre <6mm) par contre l amoxicilline +acide clavulanique présente un diamètre d inhibition. Technique : - A partir d une culture de 18H, préparer une suspension d une opacité égale à 0.5McF selon la technique de l antibiogramme (Fiche technique n 1 page 17) - Ensemencer à l aide d écouvillonnage la boite de Mueller Hinton. - Appliquer les disques d antibiotiques : Pour les Entérobactéries : Déposer un disque d AMC (20/10µg) et un disque de céphalosporine de 3 ème génération (cefotaxime 30µg ou ceftriaxone 30µg) à une distance de 30mm (centre à centre). Pour Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. : Déposer un disque de TCC (75/10 µg) avec un disque de céphalosporine de 3 ème génération (ceftazidime 30µg) ou monobactam (aztreonam 30µg) à une distance de 25mm. Certains auteurs signalent une meilleure détection des BLSE en testant un disque de cefoperazone (75µg) avec un disque de TCC (75/10µg). Laisser diffuser les antibiotiques pendant une heure, à la température ambiante (sur la paillasse) la boite sera déposée le couvercle vers le haut. Après 1H d incubation, ôter le disque d AMC et le remplacer par un disque de cefotaxime ou ceftriaxone. Incuber la boîte 18 H à 35 C. 38 Lecture et interprétation : Le test du double disque est positif quand le diamètre d inhibition du disque de céphalosporine de 3 eme génération appliqué après pré diffusion du disque de l AMC ou TCC est supérieur ou égal à 5mm par rapport au diamètre d inhibition du disque de céphalosporine de 3 eme génération. Exp : BLSE, diamètre de la CAZ = 16 mm ; diamètre de l AMC + CAZ = 21 mm. L interprétation du test consiste à répondre : Pour Entérobactéries : souche résistantes à toutes les bêtalactamines sauf pour les cephamycines (cefoxitine) et l imipeneme. Pour les Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. : souches résistantes à toutes les bêtalactamines sauf l imipeneme.

39 Contrôle de qualité : Les mêmes techniques seront réalisées en parallèle pour les souches : E. coli ATCC non productrice de BLSE. K. pneumoniae ATCC productrice de β-lactamase à spectre élargi (BLSE). CTX AMC puis CTX Photo E : K. pneumoniae productrice de BLSE (Test positif : mise en évidence d une BLSE) c. Test à la Cloxacilline : Principe : Pour certaines souches de bacilles à Gram négatif, il est parfois difficile de distinguer sur l antibiogramme habituel les hypersécrétions de céphalosporinases (CHN) des β-lactamases à spectre élargi (BLSE). La cloxacilline ajoutée au milieu pour l antibiogramme (MH) inhibe in vitro les céphalosporinases et reste inefficace sur les pénicillinases des bacilles à Gram négatif. Préparation des boîtes de cloxacilline (oxacilline) Entérobactéries du Groupe 1 et 2 Entérobactérie groupe 3 Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. Concentration en cloxacilline 0,25mg/ml 0,3mg/ml 0,5mg/ml 0,25mg/ml Préparation de la solution cloxa 25mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 30mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 50mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 25mg de Cloxa + 10ml d eau distillée Pour une boîte ronde (90mm) 2ml de la solution +18ml de MH 2ml de la solution +18ml de MH 2ml de la solution +18ml de MH 2ml de la solution +18ml de MH Abréviations : Cloxa : cloxacilline, MH : Mueller Hinton NB : À la place de la cloxacilline on peut utiliser l oxacilline. 39

40 Technique : L antibiogramme sera réalisé sur MH additionné de cloxacilline, ensemencé à l aide d une suspension bactérienne de 0,5 McF (fiche technique 1 page 17). On dépose sur la surface gélosée ensemencée les disques antibiotiques (ß-lactamines) figurant dans le tableau 1 (Entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp.) Incuber 18 Heures à 35 C - NB : un contrôle de qualité sera réalisé avec les souches Escherichia coli ATCC et Pseudomonas aeruginosa ATCC Lecture : - Le test à la cloxacilline est interprété en comparant l antibiogramme réalisé sur MH additionné de cloxacilline à celui réalisé sur MH sans cloxacilline (gardé la veille au frais). Interprétations : L inhibition de la céphalosporinase, entraîne : 1) L apparition des phénotypes sauvages de l entérobactérie, de Pseudomonas aeruginosa ou d Acinetobacter spp. Ou 2) L apparition d autres mécanismes de résistances acquises telles que : - Synthèse de BLSE - Pénicillinase - Imperméabilité Recommandations : 1) Il existe des souches d entérobactéries du groupe 3 ainsi que des souches de Pseudomonas aeruginosa qui sécrètent des céphalosporinases. Il est possible d utiliser des milieux contenant 0,5mg/ml de cloxacilline pour les entérobactéries et 1mg/ml de cloxacilline pour Pseudomonas aeruginosa. - En cas d absence de culture, réaliser une CMI à la cloxacilline de la souche à tester. La concentration pour le test à la cloxacilline sera inférieure de deux dilutions par rapport à la CMI. 2) Chez Enterobacter spp., un disque de cefepime peut être testé à l antibiogramme (pratiquement toujours actif sur les céphalosporinases). L obtention d un diamètre réduit avec déformation de la zone d inhibition, évoque la présence d une BLSE. 40

41 4.4. Recherche de Staphylococcus spp. ayant une sensibilité réduite aux glycopeptides : Définitions : VRSA : Vancomycine Resistant S.aureus Souches de sensibilité diminuée aux glycopeptides : VISA : Vancomycine Intermediate S.aureus GISA : Glycopeptide Intermeditae S.aureus Hétero-VISA : Souches sensibles à la vancomycine avec une sous population vancomycine I et en général I (ou R) à la teicoplanine. La mise en évidence de ces résistances se fait en trois étapes : 1. Critères de présomption ou d alerte. 2. Etape de screening ou criblage. 3. Test de confirmation. 1. Critères de présomption ou d alerte : A l antibiogramme Diamètre <15mm pour vancomycine et 14mm pour la teicoplanine. Une différence de 3mm (au moins) entre les diamètres d inhibition de la vancomycine et la teicoplanine. Présence de colonies dans les zones d inhibition de la vancomycine et/ou teicoplanine. Interactions (synergie ou antagonisme) entre les disques de glycopeptides et β-lactamines. Diamètre pour vancomycine et/ou teicoplanine dans les catégories I ou R. Résistance de la souche à la methicilline, gentamicine ou rifampicine. Lors d infections sévères. 41

42 2. Etape de screening ou criblage : Une au moins de ces 3 techniques doit être utilisée : Milieu Technique Interprétation (+) Témoin (-) Témoin (+) BHI agar +6mg/l vancomycine Spot de 10µl d une suspension 0.5McF/ 24h à 35 C± 2 C 2 colonies S.aureus ATCC25923 S.epidermidis WHO 6 Ou E.faecalis ATCC51299 MH agar + 5mg/l teicoplanine Spot de 10µl d une suspension 0.5McF / 24h à 35 C± 2 C 4 colonies S.aureus ATCC25923 S.epidermidis WHO 6 Ou E.faecalis ATCC51299 BHI agar - E-test modifé - Ecouvillonnage 200µl d une suspension 2McF/ 24 à 48 h 35 C± 2 C Van et Teico 8mg/l Ou Teico seule 12mg/l S.aureus ATCC25923 S.epidermidis WHO 6 Ou E.faecalis ATCC Test de confirmation : Se base sur la détermination des CMI. Ce test de confirmation est obligatoire devant tout test de présomption et /ou de criblage positif. CMI par dilution en milieu gélosé, avec un inoculum de 0,5 Mc Farland dilué au 1/10 puis ensemencer 1 à 2 µl par spot, sur MH agar et 24h d incubation E-test sur gélose MH avec un inoculum de 0,5 Mc Farland et 24 h d incubation. Remarque : la détermination de la CMI ne permet pas d identifier les souches hétéro- VISA. Pour ce faire il faut une analyse de population (pratiquée au niveau d un laboratoire de référence). A défaut, voici les critères qui suspectent une souche hétéro- VISA : CMI à la vancomycine = 4mg/l en E-test Sensibilité à la vancomycine (CMI = 2 ou 4mg/l) et réponse limite à la teicoplanine (CMI = 8mg/l) en E-test. 42