MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Dimension: px
Commencer à balayer dès la page:

Download "MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN"

Transcription

1 CHAPITRE MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN RÉSUMÉ La maladie hémorragique du lapin (MHL) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë qui atteint le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) et est provoquée par un calicivirus. Une maladie semblable, dénommée syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les lièvres (Lepus europaeus). L agent étiologique est un calicivirus différent, mais antigéniquement proche du virus de la MHL (RHDV pour Rabbit haemorrhagic disease virus). La MHL est caractérisée par une morbidité et une mortalité élevées (40 à 90 %), et se propage très rapidement par transmission directe ou indirecte. L infection peut se produire par voie nasale, conjonctivale ou orale. La transmission de la MHL est facilitée par la stabilité élevée du virus dans l environnement. La période d incubation varie de 1 à 3 jours, et la mort se produit habituellement en 12 à 36 h après le début de l hyperthermie. Les manifestations cliniques ont principalement été décrites pour l infection aiguë (signes nerveux et respiratoires, apathie et anorexie). Les lésions sont spécifiques et évidentes, autant macroscopiquement que microscopiquement. On constate une nécrose hépatique et une coagulopathie intravasculaire disséminée (CIVD) massive dans tous les organes et les tissus. Les lésions les plus importantes se retrouvent dans le foie, la trachée et les poumons. Des pétéchies sont visibles dans presque tous les organes et sont accompagnées d une diminution de la coagulation sanguine. Identification de l agent pathogène : le foie contient les titres viraux les plus élevés et est l organe le plus approprié pour la mise en évidence du virus. Comme aucune condition de croissance satisfaisante ou milieu de culture de cellules sensibles n a pu être établie, l isolement in vitro ne peut être employé. Le test d hémagglutination (HA) sur globules rouges humains du groupe sanguin O a été le premier test utilisé pour le diagnostic de routine en laboratoire de la MHL. Cependant d autres tests (microscopie électronique indirecte, méthode immuno-enzymatique (ELISA), marquage immunohistologique, amplification en chaîne par polymérase (PCR) et Western Blot) ont montré des niveaux de sensibilité et de spécificité plus élevés. Épreuves sérologiques : la caractérisation et le titrage des anticorps spécifiques résultant de l infection normale ou de l immunisation sont réalisés par inhibition de l hémagglutination ou par ELISA, indirect ou de compétition. Les réactifs suivants sont préparés : antigène à partir de foie de lapin infecté, sérum anti-rhdv de lapins convalescents ou hyperimmunisés et sérum négatif de lapins sensibles à l infection par le RHDV. Plusieurs laboratoires ont produit des anticorps monoclonaux (AcM). Quelques-uns ont produit un antigène recombinant, la protéine structurale VP60 exprimée en système baculovirus, antigène qui peut être employé à des fins diagnostiques. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : le contrôle indirect de la maladie est réalisé par la vaccination, en utilisant un vaccin inactivé préparé à partir de suspensions clarifiées de foie de lapins expérimentalement infectés, ensuite inactivées ainsi qu adjuvées. Les animaux vaccinés produisent rapidement une immunité complète contre l infection par le RHDV (et ceci dans les 5 à 10 jours). Les données expérimentales indiquent que la protection vaccinale peut s étendre sur une longue période (plus de 1 an). A. INTRODUCTION La maladie hémorragique du lapin (MHL) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë des lapins européens sauvages et domestiques (Oryctolagus cuniculus) Manuel terrestre de l OIE 2008

2 La MHL a été rapportée pour la première fois en 1984 en République Populaire de Chine (26) ; actuellement elle a été signalée dans plus de 40 pays en Asie, en Amérique centrale, en Europe et en Océanie. Des épizooties ont également été enregistrées au Mexique, en Arabie Saoudite ainsi qu en Afrique du Nord et de l Ouest. En 2000 et 2001, 3 épizooties indépendantes ont été enregistrées aux États-Unis d Amérique. À la fin de l année 2004, elle a aussi été rapportée en Uruguay et en 2005 encore aux Etats-Unis. La MHL est enzootique dans la plupart des régions du monde. L agent causal de la MHL est un calicivirus de 32 à 35 nm de diamètre et sa capside est constituée d un polypeptide unique (60 kda), son génome est constitué d un ARN de 7437 kb et un ARN sous-génomique de 2,2 kb (8, 28, 29, 33). La protéine de capside (VP60) du virus de la MHL (RHDV) se compose de deux domaines distincts liés par une région charnière : les résidus en positions de la partie N-terminale constituent le domaine intérieur et les résidus au-delà des positions , c est-à-dire de la partie C-terminale, constituent le domaine saillant. Dans l image globale de la capside, ces domaines forment une couche interne et une couche externe, cette dernière étant caractérisée par des structures en forme d arche. Cette structure est également en corrélation avec les caractéristiques antigéniques du RHDV, et les déterminants antigéniques principaux sont situés dans la partie C-terminale de VP60 (3, 4, 35, 41). Depuis 1991, un second type de particule virale a été identifié comme composant principal dans approximativement 5 % des échantillons RHDV-positifs, c est-à-dire pris sur des lapins présentant une évolution longue de la maladie (7). Les caractéristiques de cette particule sont : i) une surface lisse et un diamètre plus petit que le RHDV ; ii) sa protéine est de 28 à 30 kda ; iii) elle réagit avec les sérums de lapins convalescents de la MHL et avec des anticorps monoclonaux (AcM) anti-rhdv réagissant avec la partie N-terminale de la VP60 du RHDV, et iv) elle est négative à l hémagglutination (HA). Cette particule virale plus petite correspond à la coque interne du RHDV, et 2 hypothèses ont été proposées pour expliquer son origine. Granzow et al (19) ont supposé qu elle résultait du génome tronqué du RHDV ou d une expression défectueuse de son génome. Cependant, Barbieri et al. (1) ont observé ce qui suit : i) une forte corrélation entre une présence plus grande de particules lisses de RHDV (s-rhdv) dans les organes et l apparition d IgM spécifiques anti-rhdv au jour 3 ou 4 post-infection ; ii) la présence de grandes quantités de s-rhdv dans le foie et la rate seuls et pas dans la circulation sanguine, comme cela se produit dans la phase de virémie de MHL aiguë ; et iii) la découverte de fragments de la VP60 ayant différentes masses moléculaires (41 à 30 kda) durant la transition entre RHDV et s-rhdv. De cela, ils concluent que la genèse de la particule s-rhdv est due au processus de dégradation qui est probablement la conséquence du nettoyage physiologique des complexes immuns IgM-RHDV formés en grandes quantités lors du début de la réponse humorale. Indépendamment de son origine, l identification de cette deuxième particule dans le foie peut être considérée comme un marqueur de la forme subaiguë/chronique de la MHL, qui évolue habituellement entre les jours 4 et 8 post-infection et est suivie de la mort du lapin ou, moins souvent, par son rétablissement (1). La plupart des isolats viraux connus de MHL semblent appartenir à un seul sérotype. Les séquences complètes de souches du virus de la MHL d origines géographiquement différentes ont été publiées. Les comparaisons révèlent une homologie assez proche en termes de séquence génomique avec peu ou pas de changements dans la composition en acides aminés (différences variant de 2 à 5 %). Néanmoins des isolats qui montrent des variations dépendant de la température de l hémagglutination (2) ont été décrits, et plus récemment un variant génétique et antigénique du RHDV a été décrit simultanément en Italie (3) et en Allemagne (35). Ce variant RHDV, appelé RHDVa présente des changements en acides aminés 3 fois plus importants que dans les isolats précédemment séquencés, ceci en surface de la région exposée E (aa ) qui contient les épitopes principaux des calicivirus. Un set d anticorps donné qui protègent contre l infection par le RHDV a été testé négativement par réaction immuno-enzymatique (ELISA) contre un antigène du RHDVa. Cependant, des lapins expérimentalement vaccinés avec le vaccin actuellement disponible contre le RHDV ont été protégés lors d un challenge avec le RHDVa, même si c était avec une efficacité inférieure (3, 35). Une étude épidémiologique menée dans le but de comparer le taux de diffusion en Italie du RHDV et du RHDVa au cours des dernières années (24) a montré que le RHDVa est présent dans la plupart des régions d Italie et qu il remplace rapidement la «souche classique» de RHDV. En dehors d Italie, le RHDVa a été reconnu pratiquement en même temps en Allemagne ; il a aussi provoqué les premières enzooties de MHL aux États-Unis pendant le printemps 2000, en Uruguay pendant l hiver 2004 et encore aux États-Unis en Il a aussi été détecté en France (2000) et à Malte (2004), ce qui suggère que le RHDVa pourrait diffuser dans d autres pays européens qui ont souffert de la maladie depuis de nombreuses années. Par ailleurs, en tenant compte des séquences génétiques du RHDV déposées dans la base de données NCBI, il semble que le RHDVa est aussi présent en République populaire de Chine. Un autre virus, provisoirement appelé calicivirus du lapin (RCV) et apparenté au RHDV, a été identifié chez des lapins sains (5, 6). Il est significativement différent des isolats précédemment caractérisés de RHDV en terme de pouvoir pathogène, titrage viral, tropisme tissulaire et séquence primaire de la protéine structurale. Il est avirulent, se réplique dans l intestin à un bas titre et a une homologie génomique d environ 92 % avec le RHDV. Les résultats d expériences de protection croisée indiquent que le RCV ne pourrait pas infecter les lièvres. En outre, Manuel terrestre de l OIE

3 les données antigéniques et les comparaisons de séquence ont démontré qu il est plus proche du RHDV que du virus du syndrome du lièvre brun européen (EBHSV) (5). Un des résultats de l emploi à grande échelle des tests sérologiques sur diverses populations de lapins est la preuve supplémentaire que, en plus du RCV, un ou plusieurs virus non pathogènes ressemblant au RHDV (RHDV-like) sont présents dans les populations de lapins sauvages dans une grande partie du sud-est de l Australie et en Nouvelle-Zélande (11, 31, 34). Des anticorps vis-à-vis de la MHL ont été détectés dans des sérums collectés en Europe entre 1975 et 1987, ce qui démontre que des virus RHDV-like étaient déjà présents mais n avaient pas été détectés avant l apparition des premiers symptômes de la maladie. De récents arguments sérologiques (taux élevés d anticorps découverts dans des régions ou la MHL n a jamais été ni signalée ni suspectée) laissent à penser que des souches non-pathogènes circulent dans les populations de lapins sauvages en Europe (27). Une étude conduite en Grande-Bretagne a montré que des particules d ARN apparentées au RHDV étaient présentes dans les sérums récoltés depuis 1955, ce qui confirment que des virus RHDV-like existaient en Europe bien avant les premières preuves de l existence de la MHL (30). Cependant, selon les auteurs (30, 40), le RHDV provoque une infection persistante chez les lapins possédant des anticorps spécifiques en l absence de mortalité ; comme par ailleurs, la souche responsable ne pouvait pas être distinguée au plan phylogénétique des isolats pathogènes connus, les auteurs suggèrent que «de nombreuses voire la plupart des souches de RHDV pourraient se propager selon des modalités «pathogènes» ou «non-pathogènes». Le RHDV est très stable et résistant dans l environnement. Le pouvoir infectieux du virus n est réduit ni par traitement au chloroforme, ni par l éther, ni par la trypsine, ni par exposition à ph 3, et ni par chauffage à 50 C pendant 1 h. Le virus survit durant au moins 225 jours dans une suspension d organe maintenue à 4 C, au moins 105 jours à l état déshydraté sur tissu à température ambiante, et au moins 2 jours à 60 C, autant en suspension d organe qu à l état déshydraté (36). Des travaux récents suggèrent que le RHDV peut survivre dans des carcasses de lapin sur le terrain pendant au moins 3 mois, tandis que le virus exposé directement aux conditions extérieures n est viable que moins d un mois (22). Il garde également son pouvoir infectieux à des températures basses, et reste tout à fait stable lors des processus de congélation/décongélation. Le RHDV est inactivé par l hydroxyde de sodium à 1 % et par d autres agents (par ex. l eau de javel) qui causent la destruction des protéines virales par une augmentation du ph supérieure à 12. Le traitement à 4 C par du formol entre 1 et 1,4 % ou par de la béta-propiolactone entre 0,2 et 0,5 % inactive le virus mais n altèrent pas son immunogénicité. Dès lors, une fois traités, les virus peuvent être utilisés pour la production de vaccins. Le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) est la seule espèce connue à être infectée par la MHL. Aucun autre lagomorphe, tel le lapin du volcan du Mexique (Romerolagus diazzi), le lapin à queue noire (Lepus californicus) et le lapin de garenne d Amérique du Nord (Sylvilagus floridanus), ne s est avéré sensible (20). L inoculation de suspension de tissus provenant de lapins infectés à 28 espèces différentes de vertébrés autres que les lapins a échoué à reproduire la maladie et aucune réplication du virus n a été détectée par transcription réverse et amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) (18). Une maladie semblable, nommée le syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les lièvres (Lepus europaeus), mais son agent étiologique, qui est également un calicivirus, est différent du RHDV, bien qu il lui soit antigéniquement apparenté. L alignement des séquences d ARN des génomes du EBHS et du RHDV montre une identité nucléotidique de 71 %, et l alignement des acides aminés montre une identité de 78 % et une similitude de 87 % (41). L infection croisée expérimentale de lapins avec l EBHS et de lièvres avec le RHDV ne se produit pas (23). Des études récentes ayant tenté de démontrer la sensibilité du lapin à l EBHSV ont indiqué une prévalence diffuse du virus dans une population sauvage de lapins de garenne et la possibilité d induire une maladie clinique et une mortalité chez un petit nombre de ces lapins de garenne expérimentalement infectés (Lavazza données non publiées). La MHL est caractérisée par une morbidité élevée et un taux de mortalité qui se situe entre 40 et 90 %. L infection se produit chez les lapins de tout âge, mais la maladie clinique n est seulement observée que chez les adultes et les jeunes animaux de plus de 40 ou 50 jours. Le mécanisme pathogénique de résistance des jeunes animaux est encore inconnu (7). Une différence a été observée dans la réponse inflammatoire cellulaire dans le foie d adultes sensibles et de jeunes lapins résistants à la suite d une infection par le RHDV. L augmentation persistante des transaminases hépatiques à la suite d une infection par le RHDV chez les jeunes lapins pourrait être un indicateur d une infection subaiguë ou chronique, ce qui pourrait avoir des conséquences dans la transmission du virus (13, 14). L évolution clinique de la maladie peut être suraiguë, aiguë, subaiguë ou chronique. Les manifestations cliniques ont été décrites principalement pour l infection aiguë, puisque habituellement il n existe aucun signe clinique dans la forme suraiguë, et que la forme subaiguë est caractérisée par des signes similaires, mais plus légers. La période d incubation varie de 1 à 3 jours ; la mort peut survenir 12 à 36 h après le début de la fièvre (> 40 C). Pendant une épizootie, un nombre limité de lapins (5 à 10 %) pourra développer une forme chronique ou subaiguë de la maladie. Ces animaux meurent souvent 1 à 2 semaines plus tard, probablement suite à une dysfonction hépatique. Les lésions primaires sont de la nécrose hépatique et de la splénomégalie. Les lésions 1038 Manuel terrestre de l OIE 2008

4 pathologiques sont variables et peuvent être légères, elles incluent un foie friable, une augmentation des volumes du foie et de la rate, et une intense coagulopathie intravasculaire. Cette coagulopathie massive est généralement la cause d hémorragies dans toute une série d organes et d une mort soudaine (20, 39). Dans la maladie subaiguë et la maladie chronique, un ictère des oreilles, de la conjonctive et des muqueuses est clairement évident. Les signes cliniques et les lésions macroscopiques et microscopiques observés chez les lièvres atteints de EBHS sont très similaires à ceux décrits pour la MHL chez le lapin. À l autopsie, les principales découvertes sont de l œdème et de la congestion de la trachée avec un contenu hémorragique spumeux, de la dégénérescence hépatique, de la splénomégalie et un ictère généralisé (7). La maladie chez les lièvres dure légèrement plus longtemps et cause un taux de mortalité un peu plus bas (autour des 50 %) que la MHL chez le lapin ; le pic de mortalité chez des lièvres expérimentalement infectés est généralement observé entre 60 et 90 h post-infection. 1. Identification de l agent pathogène B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC Le foie contient le titre viral le plus élevé (de 10 3 DL 50 [dose létale 50 %] à 10 6,5 DL 50 ) et est l organe de choix pour l identification virale du RHDV comme du EBHSV. La quantité de virus présente dans d autres parties du corps est directement proportionnelle à la vascularisation ; ainsi la rate et le sérum peuvent servir de matériel alternatif de diagnostic quoique moins efficaces. Des niveaux plus élevés en particules sous-virales ont été signalés dans la rate plutôt que dans le foie de certains animaux morts de la forme subaiguë/chronique de la MHL (1). Le traitement initial de l échantillon de diagnostic est presque identique quelque soit la méthode de diagnostic à appliquer, à l exception des techniques d immunomarquage. Un fragment d organe est homogénéisé mécaniquement dans une solution physiologique tamponnée au phosphate à 5-20 % (w/v) (PBS), ph 7,2-7,4, filtré à l aide de gaze et clarifié par centrifugation à g pendant 15 min. À cette étape, le surnageant peut être directement examiné par un test d hémagglutination (HA) ou par un ELISA. Si l échantillon doit être examiné au microscope électronique (EM), il est envisageable de réaliser une seconde centrifugation à g pendant 15 min, avant l ultracentrifugation finale. Pour la détection par PCR, l ARN viral contenu dans les échantillons peut être extrait des tissus homogénéisés non centrifugés. Comme aucune condition de croissance satisfaisante n a pu être établie, l isolement in vitro du RHDV ou du EBHSV ne peut pas être inclus dans les méthodes de diagnostic. L inoculation de suspensions de tissus de lapins infectés ne permet pas de reproduire la maladie et aucune réplication du virus n a été détectée par la technique de la transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) chez 28 espèces de vertébrés autres que le lapin (18). L inoculation au lapin reste donc la seule manière d isoler, de propager et de titrer le pouvoir infectieux du virus. Cependant, l infection expérimentale n est pas pratique comme méthode de diagnostic de routine, bien que cela puisse être utile dans le cas où des échantillons donneraient des résultats de tests équivoques (exemple : HA négatif/elisa positif) ou pour le diagnostic initial dans des pays où la MHL n est pas censée exister. L infection expérimentale est cependant utile pour la production en grandes quantités d antigènes viraux pour les réactifs diagnostiques et pour produire des vaccins inactivés. Pour faire des essais expérimentaux réussis, les lapins concernés doivent être entièrement sensibles au virus, c est-à-dire qu ils devraient être âgés de 40 ou 50 jours et ne pas posséder d anticorps spécifiques, même à bas titre. La MHL peut être reproduite par utilisation de suspensions de foie filtrées et traitées aux antibiotiques, inoculées soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse, soit per os. Quand la maladie est cliniquement évidente, les signes et les lésions post mortem sont identiques à ceux décrits pour une infection naturelle. Une augmentation de la température corporelle est enregistrée entre 18 et 24 h post-infection, suivie, aux alentours de 70 à 90 % des cas, de mort entre 24 et 72 h post-infection. Quelques individus peuvent survivre jusqu à 6 jours après l infection. Les animaux qui surmontent la maladie montrent seulement une hyperthermie transitoire, de l abattement et de l anorexie, mais présentent une forte séroconversion saisissante qui peut être facilement détectée 4 à 6 jours après l infection. a) Test d hémagglutination L HA a été le premier test utilisé pour le diagnostic de laboratoire en routine de la MHL (26). Il devrait être réalisé avec des globules rouges (GR) humains de groupe O, fraîchement collectés, stockés toute une nuit dans de la solution d Alsever, et lavés avec du PBS à 0,85 % et à ph 6,5 (gamme de 6-7,2). L HA est moins évidente voire inexistante lorsque des GRs d autres espèces sont utilisés. Les GRs lavés sont suspendus dans du PBS à 0,75 %. Une dilution double du surnageant clarifié d un homogénat à 10 % de tissus de foie ou de rate est incubé avec un volume égal de GRs lavés dans une plaque de microtitrage scellée à 4 C, de préférence. Après 1 h (entre 20 min et 2 h) d incubation, l hémagglutination à une dilution > à 1/160 est considérée comme positive. Des titres moins élevés pourraient être considérés comme douteux, et Manuel terrestre de l OIE

5 devraient être vérifiés par d autres méthodes. Aux alentours de 10 % des échantillons sont positifs par ELISA ou microscopie électronique, mais donnent des résultats négatifs au test d hémagglutination (HA faux négatifs). Certains isolats de RHDV peuvent montrer des différences dépendant de la température dans leurs caractéristiques d hémagglutination (2) et pourraient montrer une activité HA seulement lorsque le test est réalisé à 4 C. Néanmoins les faux négatifs au HA sont principalement détectés dans les organes de lapins montrant une forme subaiguë/chronique de la maladie et cela dépend des caractéristiques des particules lisses, tronquées de RHDV. Les organes de lièvres donnent rarement un titre significatif quand le protocole HA RHDV est utilisé. Pour mettre en évidence une activité HA dans des organes provenant de lapins infectés par le EBHSV, une procédure modifiée doit être adoptée : toutes les étapes sont effectuées à 4 C, la suspension d organe est traitée avec un volume égal de chloroforme, et les GRs ne sont pas utilisés à un ph plus élevé que 6,5 (7). Même avec cette méthode, environ 50 % seulement des échantillons donnent un résultat positif, car cette maladie est le plus souvent subaiguë ou chronique chez les lièvres et que le virus doit donc avoir les caractéristiques antigéniques et structurales typiques des particules s-rhdv (7). En raison de la difficulté pratique d obtenir et de conserver des cellules sanguines humaines du groupe O, ainsi que du risque de travailler avec ces cellules, et de la difficulté d obtenir des résultats répétables, ce test a été remplacé par la détection du virus par ELISA. b) Microscopie électronique La microscopie électronique en coloration négative peut être réalisée par la méthode dite «méthode de la goutte». Une grille recouverte de formvar/carbone est placée sur une goutte de suspension d organe (préparée de la façon décrite dans la section B.1), et laissée pendant 5 min. Après avoir enlevé l excès de fluide avec le bord d un morceau de papier filtre déchiré, la grille est laissée, flottant sur une goutte à 2 % de phosphotungstate de sodium (NaPT), ph 6,8, pendant 1,5 min. L excès de coloration est enlevé et la grille peut être observée à un grossissement de Du fait de la faible sensibilité de la méthode de la goutte, il est envisageable de centrifuger l échantillon dans le but de concentrer les particules virales. Le culot obtenu après ultracentrifugation d au moins g pendant 30 min ou, alternativement en utilisant une Beckman Airfuge à 21 psi durant 5 min est resuspendu dans du PBS ou de l eau distillée, déposé sur une grille pendant quelques minutes, et ensuite coloré tel que décrit par avant. Les virions de la MHL sont visibles sous forme de particules sans membrane, de 32 à 35 nm de diamètre, présentant une structure interne (25 à 27 nm de diamètre), délimitée par un anneau duquel radient 10 petites projections périphériques à distribution régulière. Les particules lisses (s-rhdv) sont identifiées par la perte complète des portions externes, devenant parfaitement hexagonales et plus petites, avec seulement l anneau de la capside visible (1, 7, 19). Dans le but de réaliser un diagnostic, notamment lorsque les autres méthodes donnent des résultats douteux, la meilleure méthode microscopique est une technique immuno-électromicroscopique (IEM). Cette méthode utilise soit un sérum hyperimmun anti-rhdv, obtenu de lapin ou d autres espèces, soit des AcMs spécifiques, qui sont incubés avec un volume équivalent de l échantillon pendant 1 h à 37 C avant ultracentrifugation. La réaction immunologique induit l agglutination des particules virales dans un agrégat qui est rapidement et aisément identifié à l EM. Les méthodes immunologiques utilisant l or sont également appliquées pour mieux visualiser les virions et les protéines virales. L EBHSV peut aussi être identifié dans des échantillons diagnostiques par examen en EM. En outre, la méthode IEM utilisant du sérum convalescent anti-ebhsv ou des AcMs spécifiques anti-ebhs peut être appliquée pour identifier l EBHSV. En utilisant des antisérums spécifiques pour l EBHSV et le RHDV, il est possible de différencier les deux virus. c) Méthodes immuno-enzymatiques La détection de virus par un ELISA se fonde sur une technique de type «sandwich» et beaucoup de techniques dérivées ont été décrites. Une procédure utilise les réactifs, solutions, temps et température qui sont employées dans l ELISA de compétition (c-elisa) pour la sérologie (voir section B.2.b), excepté que la concentration en Tween 20 est 2 fois plus importante (0,1 % [v/v]). La microplaque utilisée doit avoir de bonnes capacités d absorption (par exemple Nunc Maxisorp immunoplate). L homogénat de foie est resuspendu à 10 % (w/v) dans du PBS classique ; 50 µl est le volume de base à utiliser à chaque étape. Le tampon d ELISA utilisé pour toutes les étapes est du PBS avec 1 % d extrait de levure (ou l albumine sérique bovine [BSA]), et du Tween 20 0,1 %, ph 7,4. Toutes les étapes d incubation durent de 50 à 60 min à 37 C en agitation douce. Après toutes ces étapes, 3 lavages de 3 à 5 min doivent être réalisés en employant du PBS avec du Tween 20 0,1 %. Des homogénats de foie de lapin positif et négatif pour la MHL doivent être utilisés comme témoins. La peroxydase de raifort (HRPO) peut être couplée à des IgG purifiées d un sérum polyclonal ou à des AcMs (voir section B.2.b). Les AcMs anti-rhdv ont été produits dans plusieurs laboratoires et peuvent être utilisés à la place de sérums polyclonaux. Plus récemment, des AcMs 1040 Manuel terrestre de l OIE 2008

6 reconnaissant des épitopes spécifiques exprimés seulement par le variant RHDVa ont été également produits (Capucci, données personnelles). Pour mieux caractériser l antigénicité des isolats de virus de la MHL par un ELISA sandwich, il est envisageable de tester chaque échantillon 4 fois, et d utiliser 4 conjugués HRPO différents, par exemple 2 AcMs reconnaissant le même déterminant antigénique présent à la surface du virus et exprimé soit par la souche classique soit par le variant RHDVa, un sérum hyperimmun anti-rhdv polyclonal (qui pourrait identifier des «nouveaux variants potentiels» ou des virus apparentés, comme le EBHSV) et un pool d AcMs reconnaissant des épitopes internes qui peut détecter les particules s-rhdv lisses, dégradées telles que le EBHSV. Un ELISA de capture d antigène alternatif utilisant des anticorps anti-rhdv de moutons comme anticorps de capture et un AcM pour la détection du RHDV a été décrit (10). Protocole (exemple) Pour les étapes qui ne sont pas indiquées spécifiquement, voir la procédure du c-elisa pour la sérologie (section B.2.b.). i) Sensibiliser la plaque avec un sérum hyperimmun anti-rhdv et un sérum RHDV négatif, le dernier servant de témoin vis-à-vis de réactions non spécifiques (échantillons faux positifs). Pour chaque échantillon, 4 puits doivent être sensibilisés avec le sérum positif et 4 puits avec le négatif. ii) Diluer l extrait de foie au 1/5 et au 1/30 (2 répliques pour chaque dilution) dans le tampon d ELISA (voir ci-dessus), directement dans les puits de la plaque (par exemple ajouter 45 µl du tampon dans tous les puits de la plaque, ajouter 10 µl de l échantillon dans les deux premiers puits et ensuite, après basculement, transférer 9 µl dans le second puits). Traiter les témoins, aussi bien le positif que le négatif, de la même façon que les échantillons. iii) Après incubation et lavage (voir ci-dessus), incuber avec le conjugué HRPO. iv) Après une dernière série de lavages, ajouter le substrat chromogénique. L orthophénylènediamine (OPD) doit être utilisée comme substrat de la peroxydase pour le développement final de la réaction. Employer du tampon 0,15 M de citrate phosphate, ph 5,0, avec 0,5 mg/ml d OPD et 0,02 % de H 2 O 2. La réaction est arrêtée après 5 min par addition de 50 µl de H 2 SO 4 1 M. v) L absorbance est lue à 492 nm. Les échantillons positifs sont ceux montrant une différence > 0,3 dans l absorbance, entre les puits recouverts avec du sérum RHDV-positif et ceux recouverts avec du sérum négatif. Habituellement, à la dilution 1/30, les échantillons positifs récoltés de lapins présentant la forme classique aiguë de la MHL donnent une valeur d absorbance > 0,8, tandis que la valeur des échantillons négatifs, à la dilution 1/5, varie de 0,1 à 0,25. Pour le diagnostic de l EBHSV, il est possible d utiliser cet ELISA sandwich RHDV-spécifique, mais, du fait de la forte différence antigénique existant entre les 2 virus, il y a un risque d obtenir des résultats faux négatifs. De plus, l adoption d une technique d ELISA sandwich spécifique à l EBHSV utilisant autant un sérum de lièvre anti-ebhsv positif à haut titre, ou réagissant avec des AcMs RHDV (4, 7), ou des AcMs EBHSV spécifiques, à la place de sérum de lapin, est fortement recommandée (7). d) Immunomarquage Des tissus fixés dans du formol tamponné à 10 % et incorporés dans de la paraffine peuvent être immunomarqués en utilisant une méthode avec de la peroxydase à complexe avidine-biotine (ABC). Les coupes sont d abord déparaffinées dans du xylène et de l alcool, contre-marquées avec de l hématoxyline pendant 1 min et rincée avec de l eau du robinet. Elles sont ensuite mises dans un bain de méthanol contenant de l H 2 O 2 3 % et lavées avec du PBS, 3 fois, pendant 5 min à chaque lavage. Pour limiter le bruit de fond dû aux liaisons non spécifiques des anticorps, les échantillons sont incubés avec du sérum normal de lapin pendant 1 h à température ambiante avant addition de biotine. Les coupes sont incubées toute la nuit dans une chambre humide à température ambiante avec du sérum biotinylé anti-rhdv de lapin ou des AcMs, puis sont lavées comme décrit auparavant et incubées encore pendant 30 min à 37 C avec une peroxydase ABC. Les coupes sont ensuite lavées 3 fois. De l amino-éthyl-carbazole est utilisé comme substrat. Enfin, les coupes sont rincées à l eau du robinet et montées (37). Un intense marquage des noyaux et un marquage cytoplasmique diffus des cellules nécrotiques du foie, principalement dans les régions périportales, sont caractéristiques et spécifiques. Un marquage positif des macrophages et des cellules de Kupffer est aussi observé, tout comme des réactions hépatocellulaires. Des réactions positives sont aussi détectées dans les macrophages des poumons, de la rate et des nœuds lymphatiques, ainsi que dans les cellules rénales mésangiales (37). Manuel terrestre de l OIE

7 Des cryosections de tissus fixées dans du méthanol peuvent être directement immunomarquées par incubation pendant 1 h avec du sérum anti-rhdv de lapin conjugué à la fluorescéine ou des AcMs. De la fluorescence spécifique peu être détectée dans le foie, la rate et les glomérules rénaux. e) Épreuve Western Blot Lorsque les autres tests tels que l HA ou l ELISA donnent des résultats douteux (faible positivité) ou que les échantillons sont suspectés contenir des particules s-rhdv, l analyse par une épreuve de Western Blot est utile pour poser le diagnostic final. Les échantillons homogénéisés sont préparés comme décrit précédemment, et les particules virales sont par la suite concentrées (10 fois) par ultracentrifugation ( g pendant 90 min) à travers un coussin de sucrose à 20 % (w/w). Le surnageant ainsi que le culot peuvent être examinés pour détecter, respectivement, la sous-unité 6S du RHDV (4) et la protéine structurale VP60 dénaturée du RHDV ou un de ses fragments de protéolyse, dont la taille peut varier de 50 à 28 kda. Un échantillon témoin positif et un négatif devraient être systématiquement utilisés. Les protéines du RHDV peuvent être mises en évidence avec des anticorps polyclonaux ou des AcMs. Si des AcMs sont utilisés, ils pourraient reconnaître des épitopes continus. Les AcMs spécifiques identifiant un épitope interne ou caché pourraient être également utilisés pour détecter l EBHSV. Un sérum hyperimmun anti-rhdv de lapin est moins efficace que des AcMs afin de reconnaître le même profil de bande (5). Les protéines de l échantillon sont dénaturées durant 2 min à 100 C en présence de Tris 60 mm, ph 6,8, de sodium dodécyl sulfate (SDS) 2 %, de béta-mercapto-éthanol 2 %, et de glycérol 5 %, séparées sur du SDS/PAGE 10 % (gel d électrophorèse en polyacrylamide), et ensuite transférées par électroblotting à des membranes de nitrocellulose ou de PVDF (fluorure de polyvinylidène), dans du Tris 25 mm, de la glycine 192 mm ph 8,3 et du méthanol 20 % (v/v) à 1,5 A pendant 1 h avec refroidissement ou à 0,15 A toute la nuit. Après le transfert, les membranes sont saturées pendant 30 à 60 min avec de l albumine sérique bovine (BSA) 2 %, dissoute dans du tampon phosphate, ph 7,4, et incubées pendant 2 h à température ambiante avec le sérum approprié dilué dans du tampon phosphate, ph 7,4, et de la BSA 1 %. Les filtres sont lavés complètement avec du PBS et sont incubés pendant 1 h avec des immunoglobulines anti-espèce marquées à la phosphatase alcaline à une dilution prédéterminée par titrage. Finalement, les filtres sont encore lavés et le substrat chromogène (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate nitro blue tétrazolium) est ajouté. Les échantillons positifs et le témoin positif produiront un modèle identique à celui des protéines de poids moléculaire, respectivement de 60 kda (la protéine structurale simple de RHDV) ou 41 à 28 kda (le fragment de la VP60 associé à la transition de RHDV vers s-rhdv), lorsque l on examine le culot et 6 kda (sous-unité) lorsque l on examine le surnageant. L analyse par Western Blot peut aussi être utilisée pour identifier l EBHSV. Le protocole du test est identique. Le modèle de bandes protéiques, détectées en employant un sérum polyclonal anti-ebhsv ou des AcMs anti-rhdv croisant, est similaire. Cependant, le pourcentage d échantillons montrant de la dégradation virale est plus grand et donc des fragments de poids moléculaire inférieur, provenant de la protéine structurale VP60, sont souvent observés. f) Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques L application de la RT-PCR pour la détection d acides nucléiques RHDV-spécifiques a été décrite par plusieurs auteurs (18, 21). Du fait du faible niveau de variation dans les séquences des isolats du RHDV et la haute sensibilité de la PCR, la transcription réverse suivie d une PCR (RT-PCR) constitue le test de diagnostic direct idéal pour la MHL. Cette méthode est appliquée sur des échantillons d organes (le foie de préférence), d urine, de fèces et de sérum en utilisant différentes amorces oligonucléotidiques dérivées de la région génomique codant la capside (région N-terminale). L ADNc obtenu de la réaction de RT est habituellement amplifié par PCR comme décrit par Guittre et al. (21). Pour révéler le produit de PCR, le milieu de réaction d amplification d ADN est chargé sur un gel d agarose pour électrophorèse. Si besoin, la spécificité du produit de PCR peut être déterminée par séquençage ou Southern blot et hybridation avec une sonde interne marquée avec un isotope radioactif. Une méthode similaire de RT-PCR a été utilisée pour identifier un RCV non pathogène (3). Plusieurs amorces, spécifiques pour le gène de la polymérase du RHDV et complémentaires à des gènes de la protéine VP60 et de l ORF2, sont utilisées et les fragments amplifiés sont analysables par Southern Blot. La RT-PCR constitue une méthode extrêmement sensible pour la détection du RHDV, et est 10 4 fois plus sensible que l ELISA (21). Elle n est pas strictement nécessaire pour le diagnostic de routine mais elle plus sensible, appropriée et rapide que les autres tests Manuel terrestre de l OIE 2008

8 De même, une RT-PCR a été employée pour la détection et la caractérisation de souches du EBHSV (25, 32). Une RT-PCR multiplex en temps réel utilisant des sondes TaqMan et des standards externes pour la quantification de l ARN a été récemment mise au point comme test supplémentaire pour la détection du RHDV. Cette épreuve présente une sensibilité de 100 %, une sensibilité analytique de 10 copies par puits et une linéarité allant de 10 1 à copies. Cette méthode a été utilisée pour quantifier l ARN du RHDV lors d infections expérimentales de lapins vaccinés et chez des lapins convalescents d une MHL (15, 16). Une technique d hybridation in situ utilisant autant des sondes ADN sens et antisens a été développée pour rechercher la présence de RHDV dans des échantillons de tissus (17). Cette méthode est très sensible et peut être utilisée pour le diagnostic précoce de MHL puisqu il donne des résultats positifs dès 6 à 8 h après l infection. Cependant, elle est coûteuse et difficile à effectuer, et est donc principalement indiquée pour les études de recherche. 2. Épreuves sérologiques L infection par le RHDV peut être diagnostiquée par une détection de la réponse spécifique en anticorps. La réponse humorale ayant une grande importance dans la protection de l animal face à la MHL, la détermination du titre en anticorps spécifiques après vaccination ou chez les animaux convalescents est prédictive de la capacité d un lapin à résister à l infection par le RHDV. Trois techniques de base sont appliquées pour le diagnostic sérologique du RHDV : l inhibition d hémagglutination (IH) (26), l ELISA indirect (i-elisa) et le c-elisa (7). Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients. En tenant compte de la disponibilité en réactifs et de la complexité technique pour effectuer ces tests, l IH est la méthode la plus commode, suivie par le i-elisa et le c-elisa, respectivement. D un autre coté, les 2 ELISA sont plus rapides et plus faciles que l HI, particulièrement lorsqu un grand nombre d échantillons sont testés. La spécificité du c-elisa est nettement plus grande que celle atteinte avec les deux autres méthodes (7). Une méthode alternative c-elisa a été décrite (9). Pour une meilleure interprétation sérologique et un meilleur classement du statut immunologique des lapins, une combinaison de techniques ELISA distinguant les réponses en anticorps IgA, IgM, et IgG est également disponible. D autres tests (Capucci, données non publiées, 12) peuvent être utilisées pour des recherches particulières et lorsqu un haut niveau de sensibilité est nécessaire pour détecter des anticorps dans des espèces non-cibles ou des anticorps induits par réaction croisée avec des antigènes similaires au RHDV (voir section A Introduction). Ces tests incluent : i-elisa : l antigène est fixé à la phase solide via un AcM spécifique du RHDV (1H8). Il a une sensibilité légèrement plus élevée que le c-elisa, rendant possible la détection d anticorps impliqués dans les réactions croisées et de faible avidité. ELISA en phase solide (SP-ELISA) : l antigène purifié est directement adsorbé à la phase solide et du fait de la déformation du virus, les épitopes internes sont exposés. Par conséquent il détecte un spectre plus large d anticorps et a une plus haute sensibilité et une plus faible spécificité. ELISA sandwich pour la détection des IgM et des IgG dans les échantillons de foie et de rate préalablement examinés par des tests virologiques : un tel test est particulièrement utile quand la détection du virus est difficile notamment pour les tests diagnostics sur les animaux qui meurent de la forme chronique de la maladie. Dans ce cas, un haut niveau d IgM spécifique du RHDV et un niveau faible voir inexistant d IgG sont les signes d une infection par la MHL. a) Inhibition de l hémagglutination Antigène : l antigène est préparé en utilisant des foies de lapins infectés prélevés rapidement après leur mort. Le foie est homogénéisé dans du PBS 10 % (w/v), ph 6,4, et clarifié par 2 centrifugations consécutives à faible vitesse (500 g pendant 20 min et g pendant 30 min). Le surnageant, prélevé des tubes de telle sorte à éviter la couche superficielle des lipides, est filtré à travers une membrane à pores de 0,22 µm, titré par HA, et enfin réparti en aliquots, qui sont stockés à 70 C. Échantillons de sérum : avant d être testés, les sérums sont inactivés par incubation à 56 C pendant 30 min. Les sérums sont ensuite traités avec du kaolin 25 % (dilution finale du sérum : 1/10) à 25 C pendant 20 min et centrifugés. Ceci est suivi par un second traitement au kaolin, également à 25 C pendant 20 min, cette fois avec un volume de 1/10 de GR humains de groupe O agglutinés à 50 %. Ceux-ci sont collectés frais, gardés toute une nuit dans de la solution d Alsever et lavés dans du PBS 0,85 %, ph 6,5. Les sérums sont clarifiés par centrifugation. Manuel terrestre de l OIE

9 ! Protocole i) Placer 50 µl de sérum dans le premier puits d une plaque de microtitrage et faire des dilutions doubles dans les puits 2 à 8 en utilisant du PBS et de la BSA 0,05 %. ii) iii) iv) Ajouter 25 µl d antigène RHDV contenant 8 unités HA à chaque puits et incuber la plaque à 25 C pendant 30 à 60 min. Ajouter 25 µl de globules rouges de groupe O à une concentration de 2 à 3 % à chaque puits et laisser reposer à 25 C pendant 30 à 60 min. Titrer l antigène avec chaque test pour vérifier que 8 HA/25 µl ont été utilisés et inclure des sérums témoins positif et négatif. Le titre du sérum est la dernière dilution montrant une inhibition de HA. Le seuil positif des titres sériques est corrélé au titre des sérums témoins négatifs ; cela varie habituellement de 1/20 à 1/80. En raison de la difficulté pratique d obtenir et de conserver des globules rouges humains de groupe O et le risque de travailler avec ceux-ci et du fait de la difficulté d obtenir des résultats confirmés, ce test tend à être remplacé par un ELISA. b) ELISA de compétition Antigène : une souche de référence internationale n est pas encore disponible ; néanmoins, comme un seul sérotype a été identifié jusqu ici à travers le monde, des résultats fiables peuvent être obtenus par différents laboratoires utilisant chacun son propre virus de référence. Même les anticorps induits par les variants identifiés de RHDV sont reconnus par la méthode de référence décrite ici. De plus, le test peut aussi facilement détecter les anticorps venant d une infection de lapins avec le RCV non pathogène, du fait de sa haute corrélation génétique avec le RHDV (5, 6). L antigène peut être préparé comme décrit auparavant pour l IH (section B.2.a), en prenant comme précaution de le conserver à 20 C dans du glycérol à 50 % (v/v) pour éviter le gel. Si nécessaire, le virus peut être inactivé avant l addition de glycérol, en utilisant de l éthylènimine binaire (BEI) à 33 C pendant 24 h. L antigène peut être prétitré par ELISA et après être utilisé comme agent limitant : par exemple la dilution correspondant 60 à 70 % de la taille plateau (valeur d absorbance à 492 nm dans la gamme 1,1 1,3). Sérum anti-rhdv : des sérums spécifiques polyclonaux ayant de hauts titres anti-rhdv peuvent être obtenus de différentes manières. Deux voies actuellement utilisées sont décrites ci-dessous : i) des lapins sont infectés avec un extrait à 10 % de foie RHDV-positif dilué au 1/100 dans du PBS pour obtenir des sérums de convalescence (21 à 25 jours) contenant un haut niveau d IgG anti-rhdv. Comme le taux de mortalité lié au RHDV est haut, il est nécessaire d infecter au moins 10 à 15 lapins séronégatifs ou d infecter des lapins qui ne sont que partiellement protégés (par exemple 4 à 8 lapins infectés dans les 3 à 7 jours post-vaccination. Les lapins qui survivent à l infection 21 à 25 jours post infection doivent être saignés afin d obtenir du sérum en phase de convalescence. Au lieu de saigner tout de suite les lapins, il est possible de les inoculer à nouveau 3 à 4 mois après l infection initiale puis de les saigner 10 à 15 jours plus tard pour obtenir des sérums hyperimmuns contre le RHDV. ii) le RHDV est purifié à partir des foies des lapins infectés expérimentalement qui meurent d une forme aiguë de la maladie (entre 28 et 40 h après l infection), en utilisant une des méthodes qui ont été publiées (4, 7, 8, 28, 33). Après, le RHDV purifié peut être utilisé pour immuniser des moutons ou des chèvres en accord avec des protocoles classiques utilisant un adjuvant huileux. La même procédure peut aussi être utilisée pour inoculer des lapins si le virus purifié est inactivé avant l inoculation. Les AcMs anti-rhdv pourraient être utilisés à la place du sérum polyclonal. La purification d IgG de lapin et leur conjugaison à l HRPO peuvent être réalisées suivant les protocoles de référence. L anticorps conjugué est titré par un ELISA sandwich en présence ou en absence d antigène de RHDV (foie de lapin négatif). Il est ensuite utilisé à la plus haute dilution montrant un maximum (haut plateau) d absorbance (si le sérum avait un bon titre anti-rhdv, la valeur du conjugué HRPO devrait se situer entre 1/1 000 et 1/3 000). Sérums témoins : le sérum négatif est prélevé sur lapins entièrement sensibles à l infection par le RHDV. Le sérum positif est soit un sérum convalescent dilué au 1/100 dans un sérum négatif ou un sérum récolté sur un animal vacciné Manuel terrestre de l OIE 2008

10 ! Protocole (exemple) i) Le sérum de lapin anti-rhdv dilué à un titre prédéterminé, par exemple 1/5 000 dans du tampon carbonate/bicarbonate 0,05 M, ph 9,6, est adsorbé sur une microplaque ELISA de haute capacité d adsorption (par exemple une immunoplaque Nunc Maxisorb) à 4 C toute une nuit ; ii) Laver la plaque 3 fois pendant 3 à 5 min chaque fois dans du PBS ph 7,4, avec du Tween 20 à 0,05 % (PBST). Lorsque les plaques ne sont pas utilisées immédiatement, elles peuvent être conservées, fermées dans un sac en plastique, pendant 1 mois à 20 C ; iii) Distribuer 25 µl de PBST avec 1 % d extrait de levure (PBSTY) ou 1 % de BSA (PBST-BSA) dans chaque puits nécessaire de la plaque (voir ci-dessous). Ajouter 7 µl du premier échantillon de sérum aux 2 premiers puits (A1 et B1), 7 µl du second sérum aux 2 seconds puits (C1 et D1), et continuer avec le 3 e (E1 et F1) et le 4 e (G1 et H1) sérum, et compléter ainsi la première colonne. Si des données qualitatives sont nécessaires (positives /négatives), répéter l opération dans la seconde colonne avec les échantillons de sérum de 5 à 8, et dans la 3 e colonne avec les échantillons de 9 à 12, et ainsi de suite. Si le titre du sérum nécessite d être déterminé, ce sérum peut être dilué par la suite. Agiter la plaque, et utiliser une micropipette à 8 voies pour transférer 7 µl des puits de la colonne 1 vers les puits de la colonne 2. Cela correspond à une dilution 4 fois du sérum. Cette dernière opération peut être répétée 1 fois (titre 1/160), 2 fois (titre 1/640) ; ou 4 fois (titre 1/10 240). Même dans le cas de testage de sérum pour des données qualitatives (une seule dilution), ou pour obtenir un titre final (plusieurs dilutions), compléter les 12 puits restants libres de chaque plaque avec les sérums témoins. Ajouter 7 µl de sérums positifs aux puits G7 et H7, et 7 µl de sérums négatifs aux puits G10 et H10, ensuite les diluer 1 ou 2 fois (1/40 à 1/160) ; iv) Ajouter 25 µl par puits d antigène suspendu dans du PBSTY à tous les puits de la plaque, à une dilution double de la dilution décidée, comme décrit dans la section «antigène» (voir la première partie de la description de la méthode ELISA) ; v) Incuber la plaque à 37 C sur une plateforme oscillante pendant 50 à 60 min ; vi) Laver la plaque comme décrit dans l étape ii) ; vii) Ajouter 50 µl par puits d IgG anti-rhdv de lapins conjugués avec l'hrpo à la dilution décidée, comme décrit ci-dessus dans la section «sérum anti-rhdv» (voir la première partie de la description de ce test ELISA) ; viii) Incuber la plaque à 37 C sur une plateforme oscillante pendant 50 à 60 min, et laver comme décrit à l étape ii) en ajoutant un quatrième lavage de 3 min ; ix) Utiliser 50 µl par puits d OPD comme donneur d hydrogène dans les conditions suivantes : 0,5 mg/ml d OPD dans 0,15 M de tampon phosphate/citrate, ph 5, et 0,02 % de H 2 O 2. Arrêter la réaction après 5 min par addition de 50 µl par puits de H 2 SO 4 1 M ; x) Lire la plaque avec un spectrophotomètre en utilisant un filtre de 492 nm. Le sérum est considéré comme négatif lorsque la valeur d absorbance de la première dilution (1/10) diminue de moins de 15 % par rapport à la valeur de référence (dilution au 1/10 du sérum témoin négatif), tandis qu il est considéré positif lorsque la valeur d absorbance diminue d au moins 25 % ou plus. Lorsque la valeur d absorbance de la dilution 1/10 diminue entre 15 % et 25 % de la valeur de référence, le sérum est considéré comme douteux. Le titre du sérum correspond à la dilution donnant une valeur d absorbance égale à 50 % (± 10) de la valeur moyenne des 3 dilutions du sérum négatif. Un large éventail de titres peut être détecté, et ceci selon la provenance de l échantillon. Les sérums positifs varient de 1/640 à 1/ chez les lapins convalescents, de 1/80 à 1/640 chez les lapins vaccinés et de 1/10 à 1/160 en cas d infection non pathogène. La connaissance de l origine des échantillons laisse le choix de réaliser le test sur une ou plusieurs dilutions. Tester seulement la première dilution donne un résultat positif ou négatif. Le titre est établi en testant toutes les dilutions, jusqu à la sixième. En raison des différences antigéniques significatives existant entre le RHDV et le EBHSV (8, 30), les techniques sérologiques décrites ci-dessus, qui utilisent le RHDV comme antigène, ne sont pas recommandées pour le diagnostic sérologique de l EBHS. Malgré cela, une méthode ELISA directe pourrait être employée pour la détection des sérums de lièvres positifs et négatifs pour l EBHSV ; en fait, l adsorption du RHDV dans la phase solide d une plaque d ELISA expose à des réactions antigéniques croisées. Alternativement, un c-elisa spécifique pour l EBHSV peut être développé de manière similaire, en utilisant des réactifs spécifiques (antigènes et antisérums) préparés comme décrit ci-dessus pour le RHDV. Manuel terrestre de l OIE

MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN

MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN CHAPITRE 2.8.3. MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN RÉSUMÉ La maladie hémorragique du lapin (RHD) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë qui atteint le lapin européen (Oryctolagus cuniculus)

Plus en détail

TP 13 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay.

TP 13 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay. BTSA 1 Diagnostics biologiques Module M55 TP 13 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay. Recherche du seuil de sensibilité d un test Elisa Les objectifs de cette séance : Réaliser une technique ELISA. Déterminer

Plus en détail

Fiche n 13 : Démarches diagnostics des infections virales

Fiche n 13 : Démarches diagnostics des infections virales Fiche n 13 : Démarches diagnostics des infections virales Prélèvement : qualité du prélèvement qualité des résultats et d interprétation prélèvement précieux : respiratoire (48h max à 4 ) et LCR (24h max

Plus en détail

Diagnostic et suivi des infections virales DUACAI 16/03/2017

Diagnostic et suivi des infections virales DUACAI 16/03/2017 Diagnostic et suivi des infections virales DUACAI 16/03/2017 1 Diagnostic & suivi des infections virales - Définitions Identifier la nature et la cause d une infection Est-ce une infection virale? Quel

Plus en détail

ATELIER ELISA. Le matériel utilisé pendant cet atelier a été fourni par : réf : K06ELI ou K07ELI. Jeulin réf :

ATELIER ELISA. Le matériel utilisé pendant cet atelier a été fourni par : réf : K06ELI ou K07ELI. Jeulin réf : ATELIER ELISA Formation Académique : 14-15 Mars 2013 Le matériel utilisé pendant cet atelier a été fourni par : l APBG réf : K06ELI ou K07ELI Jeulin réf : 11503084 Sordalab réf : ELISA Tableau comparatif

Plus en détail

Mise en situation et recherche à mener

Mise en situation et recherche à mener TP 20 : Principes et intérêts de la vaccination 1 Activité 1 : évaluation de l immunisation Mise en situation et recherche à mener Après une vaccination, l organisme réagit par la production d anticorps

Plus en détail

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE Série : Sciences et Technologies de Laboratoire Spécialité : Biotechnologies SESSION 2013 Sous-épreuve écrite de Biotechnologies Coefficient de la sous-épreuve : 4 Ce sujet est

Plus en détail

SVANOVIR Neospora-Ab. Neospora caninum iscom (ELISA) Test d anticorps

SVANOVIR Neospora-Ab. Neospora caninum iscom (ELISA) Test d anticorps SVANOVIR Neospora-Ab Neospora caninum iscom (ELISA) Test d anticorps Contenu N d article 10-2950-02 Microplaque / Microtitre plate ) Microplaques (96puits) sensibilisées avec l antigène non infectieux

Plus en détail

TP 14 Techniques d immunofluorescence.

TP 14 Techniques d immunofluorescence. TP 14 Techniques d immunofluorescence. Dépistage immunologique de la toxoplasmose par IFI Les objectifs de cette séance : Réaliser une technique IFI. Manipuler un microscope à épifluorescence. Apprendre

Plus en détail

TP 16 TECHNIQUES D IMMUNOPRÉCIPITATION

TP 16 TECHNIQUES D IMMUNOPRÉCIPITATION TP 16 TECHNIQUES D IMMUNOPRÉCIPITATION Techniques étudiées : Mancini, outcherlony et l immunoélectrophorèse. Les objectifs de cette séance : Comprendre les différentes techniques d immunoprécipitation

Plus en détail

Microbiologie BIOL Les virus: introduction et caractères généraux

Microbiologie BIOL Les virus: introduction et caractères généraux Microbiologie BIOL 3253 Les virus: introduction et caractères généraux Les virus Organismes acellulaires simples. Parasites intracellulaires obligatoires. Virologues Scientifiques qui étudient les virus.

Plus en détail

Immunomarquage après inclusion Fixation gluta-oso4 et inclusion Araldite

Immunomarquage après inclusion Fixation gluta-oso4 et inclusion Araldite Immunomarquage après inclusion Fixation gluta-oso4 et inclusion Araldite Anticorps secondaire marqué à l'or Anticorps primaire Anticorps secondaire Cellule à identifier Domaine d application: Immunomarquage

Plus en détail

Mise en situation et recherche à mener

Mise en situation et recherche à mener TP 20 : principes et intérêts de la vaccination 1 Activité 1 : évaluation de l immunisation Mise en situation et recherche à mener Après une vaccination, l organisme réagit par la production d anticorps

Plus en détail

Document 4 : Evolution du taux d anticorps d un individu suite à une vaccination contre le virus de l hépatite B

Document 4 : Evolution du taux d anticorps d un individu suite à une vaccination contre le virus de l hépatite B TP n 20 Le principe de la vaccination et l évaluation d une immunisation : le test ELISA Thème 3-A-3 Lors d une primo-infection, le système immunitaire produit des anticorps et des lymphocytes T cytotoxiques

Plus en détail

Implémentation d une méthode de détection du virus de la diarrhée virale bovine au sein de la fondation de promotion des productions andines PROINPA

Implémentation d une méthode de détection du virus de la diarrhée virale bovine au sein de la fondation de promotion des productions andines PROINPA Implémentation d une méthode de détection du virus de la diarrhée virale bovine au sein de la fondation de promotion des productions andines PROINPA Marjolaine Martin Introduction Cadre du travail: La

Plus en détail

VIROLOGIE. S.Serre, Responsable des opérations de diagnostic sanitaire

VIROLOGIE. S.Serre, Responsable des opérations de diagnostic sanitaire VIROLOGIE S.Serre, Responsable des opérations de diagnostic sanitaire SOMMAIRE Recommandations FELASA Virologie : pourquoi la sérologie? Choix des animaux Critères d évaluation Principe des méthodes Interprétation

Plus en détail

DOSAGE D ANTICORPS PAR L UTILISATION DU TEST ELISA

DOSAGE D ANTICORPS PAR L UTILISATION DU TEST ELISA Fiche sujet - candidat Après une vaccination, l organisme réagit par la production d anticorps dirigés contre l antigène injecté. Une mémoire immunitaire se met en place et lors d un second contact avec

Plus en détail

DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE La mission d un laboratoire de virologie - Le diagnostic par isolement des virus et leur identification (grippe, entérovirus) - Suivre l évolution biologique de l infection - Prévenir

Plus en détail

SVANOVIR MG-Ab. Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps

SVANOVIR MG-Ab. Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps SVANOVIR MG-Ab Mycoplasma gallisepticum Test d anticorps Contenu N d article 10-1300-02 Microplaque / Microtitre plate Microplaque (96 puits) sensibilisée avec l antigène non infectieux MG (scellée et

Plus en détail

Protocole Western Blot

Protocole Western Blot Protocole Western Blot A) Préparation des solutions mères Pour l électrophorèse Solution HCl 1M (Stock à température ambiante) : Resolving gel (gel de séparation) buffer 3M à ph=8, 8; Tris-HCl 3M et 0,5M

Plus en détail

Recherche des matières protéiques d'origine végétale dans les vins et les moûts

Recherche des matières protéiques d'origine végétale dans les vins et les moûts Méthode OIV-MA-AS315-12 Méthode Type IV Recherche des matières protéiques d'origine végétale dans les vins et les moûts (Résolution Oeno 24/2004) La technique développée ci-après permet de déterminer la

Plus en détail

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE Série : Sciences et Technologies de Laboratoire Spécialité : Biotechnologies SESSION 2013 Sous-épreuve écrite de Biotechnologies Coefficient de la sous-épreuve : 4 Ce sujet est

Plus en détail

ANNATUT. [Année ] Qcm issus des Tutorats. Correction détaillée

ANNATUT. [Année ] Qcm issus des Tutorats. Correction détaillée ANNATUT [Année 2012-2013] Qcm issus des Tutorats Correction détaillée SOMMAIRE 1. QCM Mixtes... 3 Correction :... 6 Le tutorat est gratuit. Toute reproduction ou vente sont interdites. Page 2 sur 7 2011

Plus en détail

05_I7_B_Pro_03.doc I7- Immunologie Fiche sujet - élève RECHERCHE D ANTICORPS ANTI-BSA (ALBUMINE DE SERUM DE BŒUF) PAR L'UTILISATION DU TEST ELISA

05_I7_B_Pro_03.doc I7- Immunologie Fiche sujet - élève RECHERCHE D ANTICORPS ANTI-BSA (ALBUMINE DE SERUM DE BŒUF) PAR L'UTILISATION DU TEST ELISA Fiche sujet - élève L organisme réagit à l introduction d un élément étranger par la production d anticorps. On cherche à déterminer si un lapin a été contaminé par un élément étranger. On utilise pour

Plus en détail

LE SIDA, une maladie causée par un rétrovirus : le VIH

LE SIDA, une maladie causée par un rétrovirus : le VIH LE SIDA, une maladie causée par un rétrovirus : le VIH On sait aujourd hui que le VIH est transmis par voie sexuelle, sanguine et de la mère à l enfant au cours de la grossesse : il se propage donc par

Plus en détail

RESOLUTION OIV/OENO 427/2010

RESOLUTION OIV/OENO 427/2010 RESOLUTION OIV/OENO 427/2010 CRITÈRES POUR LES MÉTHODES DE QUANTIFICATION DES RESIDUS POTENTIELLEMENT ALLERGENIQUES DE PROTÉINES DE COLLAGE DANS LE VIN L'ASSEMBLÉE GÉNÉRALE Vu l'article 2 paragraphe 2

Plus en détail

Acteurs de la réponse immunitaire

Acteurs de la réponse immunitaire Acteurs de la réponse immunitaire ANTICORPS Synthétisé par les plasmocytes issus d un lymphocyte spécifique d un antigène donné Objectifs : Apporter un esprit critique argumenté aux différentes méthodes

Plus en détail

DOSAGES RADIO-IMMUNOLOGIQUES. Dr Y.BOUKLIA HASSENE

DOSAGES RADIO-IMMUNOLOGIQUES. Dr Y.BOUKLIA HASSENE DOSAGES RADIO-IMMUNOLOGIQUES Dr Y.BOUKLIA HASSENE 2 Objectifs Citer les caractéristiques d un dosage RIA Décrire les caractéristiques et les contingents d une réaction Ag-Ac. Citer le principe d un compteur

Plus en détail

Le virus de l Hépatite B

Le virus de l Hépatite B Cours : Biochimie N 11 Professeur Tiollais Le 05/11/2007 à 10h30 Ronéotypeur : Julien GANEM Le virus de l Hépatite B Cette ronéo sera en ligne sur http://clement.ad.free.fr/fac/fac.html. Merci à Clément!

Plus en détail

AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003

AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003 AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2003 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE - PHYSIOLOGIE Premier jour OSTEOBLASTES ET PHOSPHATASE ALCALINE L os est un tissu en perpétuel renouvellement.

Plus en détail

Immunologie. Kit test immunodétection principe ELISA (24 tests) Réf : Français p 1. Version : 7110

Immunologie. Kit test immunodétection principe ELISA (24 tests) Réf : Français p 1. Version : 7110 Réf : 117 104 Français p 1 Version : 7110 Kit test immunodétection principe ELISA (24 tests) 1 Introduction Prêt à l emploi, pas de préparation ni matériel spécifique Une simple dilution à l eau déminéralisée

Plus en détail

Infection. transformante. Infection aiguë lytique. Infection persistante. Infection. Cellule infectée par le virus. latente.

Infection. transformante. Infection aiguë lytique. Infection persistante. Infection. Cellule infectée par le virus. latente. DIVERSITE DES INFECTIONS VIRALES Dr Rafik HARRATH Laboratoire de Virologie, Faculté de Pharmacie de Monastir Les infections virales Infection transformante Infection aiguë lytique Infection latente Cellule

Plus en détail

Résistances aux antiviraux Les méthodes virologiques d'analyse de la sensibilité des souches virales

Résistances aux antiviraux Les méthodes virologiques d'analyse de la sensibilité des souches virales Revue critique de l'actualité scientifique internationale sur le VIH et les virus des hépatites n 47 - juillet-août 96 Résistances aux antiviraux Les méthodes virologiques d'analyse de la sensibilité des

Plus en détail

Introduction au test ELISA

Introduction au test ELISA Introduction au test ELISA MD13793 Sommaire I. Composition du produit II. Accessoires nécéssaires III. Principe IV. Protocole V. Guide du professeur I. Composition du produit Cette expérience est destinée

Plus en détail

Guide 3 de l OIE. Réactifs sérologiques de référence internationaux destinés au titrage des anticorps. 1. Introduction

Guide 3 de l OIE. Réactifs sérologiques de référence internationaux destinés au titrage des anticorps. 1. Introduction Guide 3 de l OIE Réactifs sérologiques de référence internationaux destinés au titrage des anticorps 1.1. Objet 1. Introduction Le présent document fournit des lignes directrices applicables à la préparation,

Plus en détail

Dosage d anticorps par le test Elisa

Dosage d anticorps par le test Elisa TP23 Dosage d anticorps par le test Elisa Après une vaccination, l organisme réagit par la production d anticorps dirigés contre l antigène injecté. Une mémoire immunitaire se met en place, par la présence

Plus en détail

2

2 1 2 Au total, 3 types de test moléculaires sont disponibles en virologie médicale. Ces tests incluent les tests de détection et de quantification de l ARN du VHC à l aide de méthode en temps réel (PCR

Plus en détail

Bovilis BVD L essentiel du contrôle de la Diarrhée Virale Bovine/ Maladies des Muqueuses

Bovilis BVD L essentiel du contrôle de la Diarrhée Virale Bovine/ Maladies des Muqueuses Bovilis BVD L essentiel du contrôle de la Diarrhée Virale Bovine/ Maladies des Muqueuses La protection fœtale démontrée La BVD: Une pathologie à impact économique considérable La Diarrhée Virale Bovine/

Plus en détail

Méthodes et stratégies de diagnostic virologique.

Méthodes et stratégies de diagnostic virologique. Méthodes et stratégies de diagnostic virologique marie-edith.lafon@u-bordeaux.fr 2014-2015 Méthodes virologiques courantes Méthodes directes : détecter l agent infectieux ou l un de ses composants - infectiosité

Plus en détail

Qu attendre de la Biologie Moléculaire en Bactériologie. Florence DOUCET-POPULAIRE Centre Hospitalier de Versailles Université Paris 5

Qu attendre de la Biologie Moléculaire en Bactériologie. Florence DOUCET-POPULAIRE Centre Hospitalier de Versailles Université Paris 5 Qu attendre de la Biologie Moléculaire en Bactériologie Florence DOUCET-POPULAIRE Centre Hospitalier de Versailles Université Paris 5 Particularités liées à la Bactériologie Majorité des bactéries d intérêt

Plus en détail

Kit de Groupage sanguin

Kit de Groupage sanguin Présentation Kit de Groupage sanguin 13352-13353 NOTICE Retrouvez l ensemble de nos gammes sur : www.pierron.fr ÉQUIPEMENT PÉDAGOGIQUE SCIENTIFIQUE DIDACTIK CS 80609 57206 SARREGUEMINES Cedex France Tél.

Plus en détail

INTERET DE LA PCR EN TEMPS REEL DANS LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI DES HEPATITES B ET C

INTERET DE LA PCR EN TEMPS REEL DANS LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI DES HEPATITES B ET C La PCR en temps réel est fondée sur la détection et la quantification des produits d amplification au cours de la réaction de PCR, dans le tube fermé, plutôt qu à la fin de la réaction comme c est le cas

Plus en détail

ZytoLight SPEC DDIT3 Dual Color Break Apart Probe

ZytoLight SPEC DDIT3 Dual Color Break Apart Probe ZytoLight SPEC DDIT3 Dual Color Break Apart Probe Z-2100-200 Z-2100-50 5 (0,2 ml) 5 (0,05 ml) Pour la détection des translocations impliquant le gène DDIT3 dans la région 12q13.3 par hybridation in situ

Plus en détail

EXPRESSION ET ANALYSE DE

EXPRESSION ET ANALYSE DE EXPRESSION ET ANALYSE DE PROTÉINES DE FUSION DANS DES CELLULES HUMAINES EN CULTURE Assistants : Fabrizio Vacca Katarina Trajkovic - 1 - 1. Introduction Le but de cette expérience est d étudier des protéines

Plus en détail

Immunofixation sérique

Immunofixation sérique Immunofixation sérique 23 Octobre 2013 Lionel BEY Département Diagnostic SEBIA Principe de l immunofixation sérique Dépôt de l échantillon (1 min) L échantillon est déposé 6 fois à différentes dilutions

Plus en détail

STOCKAGE DES REACTIFS...

STOCKAGE DES REACTIFS... PROTOCOLE DÉTAILLÉ 1. INTRODUCTION. page 2 2. COMPOSITION DU KIT.. page 2 3. STOCKAGE DES REACTIFS... page 2 4. EQUIPEMENTS ET MATERIELS REQUIS (NON FOURNIS DANS LE KIT).. page 3 5. PRECAUTIONS D EMPLOI...

Plus en détail

Adenovirus. Salmonelloses(non typhiques) Escherichia coli entéropathogènes (EPEC) Escherichia colientéro-hémorragiques (EHEC)

Adenovirus. Salmonelloses(non typhiques) Escherichia coli entéropathogènes (EPEC) Escherichia colientéro-hémorragiques (EHEC) GASTRO-ENTERITES VIRALES Affections fréquentes, de courte durée Troubles digestifs aigus Multiplication virale au niveau des entérocytesde l intestin grêle Baisse de l activité enzymatique des cellules

Plus en détail

Licence L3 mention Biologie (parcours BCGMP & BBM) UE-Contrôle de l'expression génétique chez les eucaryotes

Licence L3 mention Biologie (parcours BCGMP & BBM) UE-Contrôle de l'expression génétique chez les eucaryotes Licence L3 mention Biologie (parcours BCGMP & BBM) UE-Contrôle de l'expression génétique chez les eucaryotes Année universitaire 2006/2007 1 ère session 9 mai 2007 = = = = = = = = = = = = = = = = = = =

Plus en détail

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE 1/7 SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n 5 Épreuve de biologie 29 novembre 2014 Durée : 2 heures Le sujet comporte 2 parties indépendantes. Thème 1 Le candidat s appuiera essentiellement sur une analyse

Plus en détail

Virologie. Dr. Florence ABRAVANEL, MCU-PH Laboratoire de Virologie, CHU de Toulouse

Virologie. Dr. Florence ABRAVANEL, MCU-PH Laboratoire de Virologie, CHU de Toulouse Virologie Dr. Florence ABRAVANEL, MCU-PH Laboratoire de Virologie, CHU de Toulouse 06/09/2006 Qu est-ce qu un virus? Aspect fonctionnel : entité qui se caractérise par : un seul type d acide nucléique

Plus en détail

TD TRANSCRIPTION 1 I II III IV P σ. Radioactivité 125 cpm cpm 130 cpm cpm. α 2 ββ Marqueurs + + α 2 ββ. 3 kb.

TD TRANSCRIPTION 1 I II III IV P σ. Radioactivité 125 cpm cpm 130 cpm cpm. α 2 ββ Marqueurs + + α 2 ββ. 3 kb. TD TRANSCRIPTION 1 Problème 1 A) Un chercheur a cloné, dans un vecteur plasmidique, un insert de 5 kb, correspondant à une très petite portion du chromosome d Escherichia coli (génome complet d E. coli

Plus en détail

Morphologie et structure du HBV

Morphologie et structure du HBV Morphologie et structure du HBV Histoire naturelle Infection primaire 95 % 5 % Guérison Persistance Hépatite chronique Porteur inactif Cirrhose Hépatocarcinome Evolution des marqueurs dans l hépatite B

Plus en détail

Préparation des échantillons biologiques. Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse

Préparation des échantillons biologiques. Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse Une fois les échantillons reçus par le laboratoire de toxicologie, ils doivent être rapidement analysés, mais dans le cas échéant, tous les milieux biologiques doivent être conservés entre +2 et 8 C, jusqu

Plus en détail

Dépistage du VIH chez la femme enceinte. Diagnostic d infection de l enfant né de mère VIH+

Dépistage du VIH chez la femme enceinte. Diagnostic d infection de l enfant né de mère VIH+ Dépistage du VIH chez la femme enceinte Diagnostic d infection de l enfant né de mère VIH+ CNR Infections Rubéoleuses Materno-fœtales Christelle VAULOUP-FELLOUS Faculté de Médecine Paris Sud Service de

Plus en détail

Herpès génital et grossesse Faisabilité/intérêt des prélèvements «à l aveugle»

Herpès génital et grossesse Faisabilité/intérêt des prélèvements «à l aveugle» Herpès génital et grossesse Faisabilité/intérêt des prélèvements «à l aveugle» Point de vue du Virologue Marianne COSTE-BUREL, Service de Virologie, CHU NANTES Quelques Chiffres (rapport HAS mai 2016)

Plus en détail

X- Rôles multiples de l ARN. A- L ARN catalytique

X- Rôles multiples de l ARN. A- L ARN catalytique X- Rôles multiples de l ARN A- L ARN catalytique ! Seules les protéines ont une activité catalytique : idée profondément ancrée en biochimie! Arguments Structures tridimensionnelles variées Diversité chaînes

Plus en détail

Diagnostic Biologique en Microbiologie

Diagnostic Biologique en Microbiologie Diagnostic Biologique en Microbiologie Pourquoi avoir recours au diagnostic biologique? Etiologie Dépistage Evaluation pronostique, suivi thérapeutique Optimisation thérapeutique Epidémiologie. Diagnostic

Plus en détail

Mise au point d une méthode d immuno-enzymologie appliquée au contrôle d un médicament

Mise au point d une méthode d immuno-enzymologie appliquée au contrôle d un médicament 1 ETSL Mise au point d une méthode d immuno-enzymologie appliquée au contrôle d un médicament TP 6 GABIN-GAUTHIER 03/05/2010 I. BUT... 2 1. ETAPE DE «COATING» (SENSIBILISATION)... 2 2. AGENT «BLOQUANT»...

Plus en détail

Dosage spectrophotométrique de protéines. Méthode de Bradford

Dosage spectrophotométrique de protéines. Méthode de Bradford UE 2-2 ième année S3-1 - Apprentissage des techniques et gestes de base Dosage spectrophotométrique de protéines Méthode de Bradford Cécile Batandier Objectifs : Ce TP met en œuvre la mesure colorimétrique

Plus en détail

AUTO IMMUNITE. ANTICORPS ANTI-TISSULAIRES H. BAUFINE-DUCROCQ, Paris. ANTICORS ANTI-PHOSPHOLIPIDES H. BAUFINE-DUCROCQ, Paris

AUTO IMMUNITE. ANTICORPS ANTI-TISSULAIRES H. BAUFINE-DUCROCQ, Paris. ANTICORS ANTI-PHOSPHOLIPIDES H. BAUFINE-DUCROCQ, Paris AUTO IMMUNITE ANTICORPS ANTI-TISSULAIRES ANTICORS ANTI-PHOSPHOLIPIDES COMPLEXES IMMUNS CIRCULANTS FACTEUR RHUMATOÏDE ANTICORPS ANTI-TISSULAIRES Les procédures communes aux prélèvements et particulières

Plus en détail

Les recherches menées sur le virus Y de la pomme de terre (PVY)

Les recherches menées sur le virus Y de la pomme de terre (PVY) Action 1.1 : Développer et renforcer des outils d identification et de caractérisation des parasites majeurs du plant de pomme de terre Les recherches menées sur le virus Y de la pomme de terre (PVY) mieux

Plus en détail

Outils de génie génétique 1.TERMINOLOGIE ENZYMES UTILISÉS SONDES MOLECULAIRE ET HYBRIDATION MOLECULAIRE

Outils de génie génétique 1.TERMINOLOGIE ENZYMES UTILISÉS SONDES MOLECULAIRE ET HYBRIDATION MOLECULAIRE Outils de génie génétique 1.TERMINOLOGIE ENZYMES UTILISÉS SONDES MOLECULAIRE ET HYBRIDATION MOLECULAIRE 1 Terminologie ADN recombinant : combinaison de deux molécules d ADN appartenant à deux espèces différentes;

Plus en détail

TP d étude de la complémentation et de la recombinaison de la région rii chez le bactériophage T4

TP d étude de la complémentation et de la recombinaison de la région rii chez le bactériophage T4 TP d étude de la complémentation et de la recombinaison de la région rii chez le bactériophage T4 I. Introduction A. Phage T4 1. Structure Ce TP a pour but d étudier la complémentation et la recombinaison

Plus en détail

UE 605 : TD concepts de bases en immunologie

UE 605 : TD concepts de bases en immunologie UE 605 : TD concepts de bases en immunologie EXERCICE 1 Commentez les expériences du tableau suivant Expériences Résultats Ablation du thymus d'une Greffe de peau de rat La peau n'est pas rejetée jeune

Plus en détail

Encéphalites à tiques et nouveaux vaccins

Encéphalites à tiques et nouveaux vaccins Encéphalites à tiques et nouveaux vaccins D. Christmann Hôpitaux Universitaires Strasbourg CEMI 17 : ACTUALITES SUR LES ARBOVIROSES. 15 et 16 mars 2012 Institut Pasteur Virus TBE (1) Famille Togaviridae

Plus en détail

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE Série : Sciences et Technologies de Laboratoire Spécialités : - Biotechnologies - Sciences physiques et chimiques en laboratoire SESSION 2015 Sous-épreuve écrite de Chimie biochimie

Plus en détail

Questions / réponses sur le coronavirus responsable du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) Mise à jour août 2014

Questions / réponses sur le coronavirus responsable du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) Mise à jour août 2014 Questions / réponses sur le coronavirus responsable du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) Mise à jour août 2014 Qu est-ce que le MERS-CoV? Le MERS-CoV est un coronavirus (CoV) qui provoque

Plus en détail

PACES STAGE DE PRÉ RENTRÉE UE 2. Méthodes d études

PACES STAGE DE PRÉ RENTRÉE UE 2. Méthodes d études PACES 2011-2012 STAGE DE PRÉ RENTRÉE UE 2 Méthodes d études Immunomarquage Il permet de visualiser différents types de molécules. Ligands : molécules qui ont une grande affinité et spécificité avec les

Plus en détail

Taq Ozyme HS ADN polymérase thermostable rapide à démarrage à chaud («Hot Start»)

Taq Ozyme HS ADN polymérase thermostable rapide à démarrage à chaud («Hot Start») Taq Ozyme HS à démarrage à chaud («Hot Start») OZYA002-25 25 unités OZYA002-250 250 unités OZYA002-1250 5 x 250 unités Stockage et stabilité : un an à -20 C MANUEL D UTILISATION P.1 SOMMAIRE Descriptif...

Plus en détail

Immunofluorescence appliquée au sérodiagnostic de la toxoplasmose

Immunofluorescence appliquée au sérodiagnostic de la toxoplasmose 1 ETSL Immunofluorescence appliquée au sérodiagnostic de la toxoplasmose TP 5 Première partie GABIN-GAUTHIER 04/02/2010 I. LA TOXOPLASMOSE... 2 II. PRINCIPE DES REACTIONS D IMMUNOFLUORESCENCE... 2 1. PRINCIPE

Plus en détail

Une maladie qui touche le système immunitaire : le SIDA (syndrome d immunodéficience acquise)

Une maladie qui touche le système immunitaire : le SIDA (syndrome d immunodéficience acquise) Immunologie = partie de la médecine et de la biologie qui étudie l immunité. Immunité = capacité à résister, à limiter le développement, à se débarrasser d une maladie après avoir été infecté par un agent

Plus en détail

CORRECTIONS EXERCICES IMMUNITE

CORRECTIONS EXERCICES IMMUNITE CORRECTIONS EXERCICES IMMUNITE I. RESTITUTIONS DES CONNAISSANCES 1. Schémas à titrer et à légender Schéma 1 : Surface d un lymphocyte T4 On observe des particules du virus VIH bourgeonnant à la surface

Plus en détail

Viande de cheval ou viande de bœuf?

Viande de cheval ou viande de bœuf? Fête de la science 2016 Viande de cheval ou viande de bœuf Viande de cheval ou viande de bœuf? Quand une entreprise qui fabrique des lasagnes affiche qu elles sont «pur bœuf», on ne doit pas trouver d

Plus en détail

«Contexte et questions posées

«Contexte et questions posées Maisons-Alfort, le 18 septembre 2007 AVIS de l Agence française de sécurité sanitaire des aliments sur la possibilité de restriction des zones réglementées pour la fièvre catarrhale ovine LA DIRECTRICE

Plus en détail

INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE.

INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE. INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE isabelle.dhennin@u-picardie.fr De l ADN à la protéine Avril 2003 : fin du séquençage du génome humain I- Séquençage de l ADN 1- extraction

Plus en détail

Guide d adaptation des protocoles manuels sur le logiciel Flo400

Guide d adaptation des protocoles manuels sur le logiciel Flo400 Guide d adaptation des protocoles manuels sur le logiciel Flo400 Sommaire Avant propos:... 3 Les adaptations de protocoles et d expériences... 4 Légende :... 4 Généralités sur les Protocoles (ISH, IHC

Plus en détail

Nexxo-Prep duo, Gel Extraction & PCR Clean-Up

Nexxo-Prep duo, Gel Extraction & PCR Clean-Up Nexxo-Prep duo, Gel Extraction & PCR Clean-Up Kit d extraction d ADN, par sur colonne, composé des éléments nécessaires pour la purification de produits de PCR, de digestion de restriction, de synthèse

Plus en détail

PROTOCOLE DE CONTROLE PONCTUEL DU MARCHE : DEPISTAGE DES ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VHC

PROTOCOLE DE CONTROLE PONCTUEL DU MARCHE : DEPISTAGE DES ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VHC PROTOCOLE DE CONTROLE PONCTUEL DU MARCHE : DEPISTAGE DES ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VHC 1. Objectif : Le but de cette étude est de contrôler la sensibilité et la spécificité du test de dépistage rapide

Plus en détail

BVDV I - INTRODUCTION II - PRINCIPE DU TEST

BVDV I - INTRODUCTION II - PRINCIPE DU TEST BVDV Test ELISA pour le diagnostic antigénique du virus de la diarrhée virale bovine Test sandwich de détection de la protéine NS3 sur leucocytes Test diagnostique pour bovins Monocupule I - INTRODUCTION

Plus en détail

MALADIE DES MUQUEUSES = B. V. D.

MALADIE DES MUQUEUSES = B. V. D. MALADIE DES MUQUEUSES = B. V. D. REFERENTIEL TECHNIQUE DE GARANTIE D UN ANIMAL NON-IPI Réf/BVD/01 Page 1 sur 1 PREAMBULE Ce document décrit les différentes méthodes validées par les Groupements de Défense

Plus en détail

Diagnostic au laboratoire de l hépatite B Protéine C AgHBc Protéine Pré-S2 Protéine S Protéine Pré-S1 AgHBs Marqueurs sérologiques AgHBs Anticorps anti-hbs ADN viral 42nm Particule de Dane Polymérase Anticorps

Plus en détail

Spécifications du dosage HIV Ag/Ab Combo (CHIV) sur ADVIA Centaur et ADVIA Centaur XP

Spécifications du dosage HIV Ag/Ab Combo (CHIV) sur ADVIA Centaur et ADVIA Centaur XP Spécifications du dosage HIV /Ab Combo (CHIV) sur ADVIA Centaur et ADVIA Centaur XP Des réponses pour la vie. Spécifications du dosage HIV /Ab Combo (CHIV) sur ADVIA Centaur et ADVIA Centaur XP Domaine

Plus en détail

Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Montpellier pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel.

Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Montpellier pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel. Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Montpellier pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel. Ce fichier numérique ne peut être reproduit, représenté,

Plus en détail

Etude d une cellule animale : l hépatocyte

Etude d une cellule animale : l hépatocyte Etude d une cellule animale : l hépatocyte Histologie (9 points) 1. Donner la définition du grossissement d un microscope. Vous disposez d un morceau de papier millimétré. Le placer sur la platine du microscope.

Plus en détail

ALLwell Ingenasa Ingezim Gluten Quick

ALLwell Ingenasa Ingezim Gluten Quick ALLwell Ingenasa Ingezim Gluten Quick ELISA kit Cat. # LFD030-Q TEST immunoenzymatique pour la détection quantitative du gluten dans les échantillons alimentaires et environnementales Mode d emploi Lire

Plus en détail

STRATÉGIE DE SURVEILLANCE ET DE LUTTE CONTRE LA FIÈVRE APHTEUSE

STRATÉGIE DE SURVEILLANCE ET DE LUTTE CONTRE LA FIÈVRE APHTEUSE ROYAUME DU MAROC Office National de Sécurité Sanitaire des Produits Alimentaire Direction des Services Vétérinaires STRATÉGIE DE SURVEILLANCE ET DE LUTTE CONTRE LA FIÈVRE APHTEUSE Situation de la fièvre

Plus en détail

Le virus. Le virus de l immunodéficience humaine (VIH) a été découvert en Il appartient à la famille des rétrovirus.

Le virus. Le virus de l immunodéficience humaine (VIH) a été découvert en Il appartient à la famille des rétrovirus. Le virus Le virus de l immunodéficience humaine (VIH) a été découvert en 1983. Il appartient à la famille des rétrovirus. On distingue le VIH de type 1 dont la répartition est mondiale et le VIH2 plus

Plus en détail

DES de pathologie : Pathologie moléculaire. Techniques d analyse de l ADN

DES de pathologie : Pathologie moléculaire. Techniques d analyse de l ADN DES de pathologie : Pathologie moléculaire Techniques d analyse de l ADN J.F. Emile Service de pathologie, Hôpital Ambroise Paré Faculté de Médecine Paris-Ile de France Ouest et INSERM U602 Pathologie

Plus en détail

5. Conditionnement et conservation de l échantillon

5. Conditionnement et conservation de l échantillon 1. Objet E-IV-5V1 RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES STAPHYLOCOQUES PATHOGÈNES et/ ou Staphylococcus aureus. FILTRATION SUR MEMBRANE Cette procédure décrit la méthode de recherche et de dénombrement des staphylocoques

Plus en détail

RECHERCHE D'UNE MOLECULE RESPONSABLE D'ALLERGIES DANS DES LAITS (VACHE SOJA)

RECHERCHE D'UNE MOLECULE RESPONSABLE D'ALLERGIES DANS DES LAITS (VACHE SOJA) Fiche sujet - candidat L ingestion par l Homme d une protéine, la β-lactoglobuline bovine (BLG), peut être responsable d allergies. Pour les personnes allergiques, il peut être recommandé de remplacer

Plus en détail

Etude des interactions anticorps antigène et du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire

Etude des interactions anticorps antigène et du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire Groupe 1 BALLIANA Antoine BRESSE Claire DEPOUSIER Estelle ESPRABENS Loïc LE FLOHIC Swan MUIRAS Aude SCHOR Arthur Etude des interactions anticorps antigène et du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire

Plus en détail

Taq'Ozyme Purple Mix2

Taq'Ozyme Purple Mix2 Taq'Ozyme Purple Mix2 OZYA007-40 - 40 réactions OZYA007-200 - 200 réactions (avec supplément de MgCl 2 ) OZYA007-200XL - 200 réactions (avec supplément de MgCl 2 ) OZYA007-1000 - 1000 réactions (avec supplément

Plus en détail

Les antigènes. Dr M.Messatfa Maitre assistant en immunologie Date;25/10/2015

Les antigènes. Dr M.Messatfa Maitre assistant en immunologie Date;25/10/2015 Faculté de médecine de Mostagenem Cours d immunologie fondamentale: Date;25/10/2015 Les antigènes Dr M.Messatfa Maitre assistant en immunologie m_immuno@yahoo.fr I) Antigène Immunogénicité et Antigénicité

Plus en détail

GCH-2103: Biotechnologie industrielle et environnementale, A10 Laboratoire #1: Analyse instrumentale

GCH-2103: Biotechnologie industrielle et environnementale, A10 Laboratoire #1: Analyse instrumentale GCH-2103: Biotechnologie industrielle et environnementale, A10 Laboratoire #1: Analyse instrumentale Objectifs Ce laboratoire a pour but d'initier les étudiants aux techniques analytiques quantitatives

Plus en détail

PREPARATION DES ECHANTILLONS

PREPARATION DES ECHANTILLONS PREPARATION DES ECHANTILLONS PURIFICATION OF CD4 + T CELLS Unwanted cells are crosslinked to red blood cells Ficoll- Hypaque spin plasma enriched CD4+T cells Ficoll-Hypaque red blood cells and rosetted

Plus en détail

TD de Biologie Moléculaire (hybridation 1)

TD de Biologie Moléculaire (hybridation 1) UE BIO12 TD (hybridation 1) Année 2007-2008 Corinne MAUREL-ZAFFRAN L2 SV TD de Biologie Moléculaire (hybridation 1) RAPPEL DE QUELQUES NOTIONS SUR L HYBRIDATION Beaucoup de méthodes de biologie moléculaire

Plus en détail

MALADIES INFECTIEUSES DES LAPINS

MALADIES INFECTIEUSES DES LAPINS Samuel Boucher*, Ghislaine Le Gall- Reculé**, Bernadette Le Normand***, Stéphane Bertagnoli****, Jean-Luc Guérin****, Anouk Decors*****, Stéphane Marchandeau******, Georges Plassiart******* * Labovet Conseil

Plus en détail

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE

BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE BACCALAURÉAT TECHNOLOGIQUE Série : Sciences et Technologies de Laboratoire Spécialités : - Biotechnologies - Sciences physiques et chimiques en laboratoire SESSION 2013 Sous-épreuve écrite de Chimie biochimie

Plus en détail

Dartrose: état des lieux des essais en cours (au champ et au laboratoire)

Dartrose: état des lieux des essais en cours (au champ et au laboratoire) Dartrose: état des lieux des essais en cours (au champ et au laboratoire) Alice PASDELOU Karima BOUCHEK Guillaume BEAUVALLET ARVALIS Institut du végétal Objectifs Réaliser une collection d isolats de Colletotrichum

Plus en détail

Principales réactions Ag-Ac utilisées en biologie

Principales réactions Ag-Ac utilisées en biologie Principales réactions Ag-Ac utilisées en biologie Frédéric Boudard, MCU Faculté de Pharmacie, Montpellier IUP, 2016-2017 Généralités tube sec Sang total anticoagulant coagulation centrifugation Sérum Plasma

Plus en détail