VALIDATION ANALYTIQUE. Patrick Séraissol

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2 I-GENERALITES

3 PROBLEMATIQUES Demande croissante en résultats d analyses dans différents domaines: -Environnemental (polluants eaux, sols ) -Agro-alimentaire (sécurité aliments ) -Pharmaceutique (contrôle qualité) -Médico-légal (expertise) -Industrie en général (Qualité des résultats) Garantir la fiabilité et la traçabilité des résultats Mise en place d une organisation pour répondre à ce besoin

4 HISTORIQUE 1990-Conférence de Washington sur la validation des méthodes bioanalytiques 1992-Conférence de Barcelone 1994-Conférence de Munich 1997-Commission SFSTP (Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques) 1999-Meeting Bioval99 à Londres 2000-Groupe de travail à Crystal City (Food and Drug Administration- FDA) 2005-Groupes de travail internationaux

5 REFERENTIELS FDA (CDER Décembre 1998) «Guidance for Industry-Bioanalytical Methods Validation for Human Studies» FDA (CDER Mai 2001) «Guidance for Industry-Bioanalytical Methods Validation» intégration de l immunologie et de la microbiologie Texte ICH (International Conference on Harmonisation- -Q2A Validation des procédures analytiques: Définitions et terminologie (1995) -Q2B Validation des méthodes analytiques : Méthodologies (1997) -Annexe (Q1A,B et CStabilité; Q3A,B et Cimpuretés; Q6A et BSpécification STP PHARMA Pratiques -(1992) 2, 4, Méthodologies -(1992) 2, 4, Exemple d application -(2003) 13, 3, Harmonisation des approches -(2006) 16, 1, Statistiques Normes (ISO 5725 ) EMEA European Medicines Agency (06/09/2011) applicable au 01/02/2012

6 REFERENTIELS

7 DEFINITIONS Bioanalyse Dosage de substances actives au sein de matrices biologiques (plasma, sérum, sang total, tissus) en vue d établir des paramètres pharmacocinétiques ou bien d analyser des substances toxiques.

8 DEFINITIONS Validation Analytique ICH (International Conference on Harmonisation) Le but de la validation d une procédured analyse est de démontrer qu elle correspond à l usage pour lequel elle est prévue. Relie une procédure à une application. USP (Unated States Pharmacopeia) La validation d une méthode analytique est le procédé par lequel il est établi que les performances de la méthode correspondent aux exigences requises par l application prévue. Normes réglementaires ou fait par les firmes. FDA (Food and Drug Administration) Valider, c est établir à l évidence, avec un degré de confiance élevé et sous forme documentée, qu un procédé déterminé permet d obtenir un produit (ou un service) qui atteint effectivement des spécifications définies à l avance. Indication de statistique et de rapport d analyse.

9 OBJECTIFS Démontrer les performances de la procédure de dosage pour l application prévue (prouver que les résultats obtenus sont fiables, ceci dans des limites bien définies). Maitrise des étapes critiques de la procédure (mettre en exergue les points critiques) Résolution en amont de problèmes analytiques

10 QUE VALIDER???

11 QUAND VALIDER???

12 GENESE D UNE VALIDATION

13 Ex de mise en œuvre de validation

14 Limites d acceptation

15 Limites d acceptation

16 Limites d acceptation

17 Limites d acceptation

18 II-VALIDATION d une procédure d analyse physicochimique

19 validation analytique SCIENTIFIQUES Garantir la fiabilité d une méthode (précise et exacte) ETUDE SCIENTIFIQUE DE LA FIABILITE D UNE METHODE OBJECTIFS INDUSTRIEL Choix des protocoles d analyse (minimiser les coûts avec des méthodes optimisées) REGLEMENTAIRES Rôle important dans les études pharmacocinétiques, de métabolisme, de bioéquivalence

20 Finalités o Description claire de la procédure d analyse «MODE OPERATOIRE NORMALISE» o Mode de prélèvement de l échantillon o Appareillage o Description précise des modalités de préparation de l échantillon, des conditions d analyse, des précautions opératoires o Vérification de la procédure o Traitement des données brutes et formules de calculs o Choix des tests de performance «en routine» o Vérification de l environnement d analyse

21 Etudes réalisées en amont de la validation d une procédure analytique o Qualification de l appareillage o Optimisation des conditions opératoires o Préparation des échantillons o Mesure de la solution analytique o Définition d une substance de référence

22 Critères de validation: critères généraux application o Spécificité, sélectivité o Fonction réponse o Courbe de calibrage, linéarité o Intervalle de dosage (amplitude) o Exactitude, biais o Précision o Répetabilité o précision intermédiaire o Seuil de détection o Seuil de quantification o Identification o Essai limite (impuretés) o Dosage (principe actif, impuretés)

23 APPARAILLAGE HPLC

24 Rendement d extraction Le rendement d extraction absolu peut être défini comme étant le rapport des signaux mesurés, d une part, après traitement de l échantillon chargé avec une quantité connue, d autre part, après injection directe dans le système analytique d une gamme non biologique de référence contenant une concentration équivalente de substance à examiner.

25 Rendement d extraction Réponse TR Sans extraction Après extraction Temps

26 Spécificité (Specificity) C est l aptitude d une méthode à engendrer un signal ne dépendant que de la seule substance à mesurer en présence d autres substances potentiellement présentes (impuretés, produits de dégradation, métabolites, composés endogènes) Nb - en HPLC on préfère parlé de sélectivité En pratique on réalise des blancs avec des matrices provenant d au moins 6 origines différentes

27 Spécificité (Specificity)

28 Spécificité (phase de pré-validation) Conc. Obtenues Tracé idéal Biais constant Biais proportionnel Conc. théorique

29 Linéarité (Linearity) La linéarité d une procédure d analyse est son aptitude, à l intérieur d un certain intervalle de concentrations, à fournir des résultats directement proportionnels à la concentration (ou la quantité) de substance à analyser dans l échantillon.

30 Linéarité SFSTP: 6 points de gamme X , Washington Conférence: 5 à 8 points de gamme X Penninckx: 3 à 4 points de gamme X Mc Dowall: 4 points de gamme X

31 Linéarité et phase de validation o Etude de la fonction réponse: Réponse = f (Conc.) o Fonction monotone (tjr dans le sens de la conc) o Constance de la variabilité de réponse (homogéneité des variances de la réponse sur tout le domaine de concentrations)scédasticité o Détermination du domaine de calibrage (domaine de linéarité) o Validation du modèle o Etude de la linéarité proprement dite Conc. Calculées = f (Conc. Vraies)

32 Linéarité et phase de validation o OBTENTION DES DONNEES BRUTES o Sélection du plan expérimental o Réalisation des expérimentations o CREATION DU MODELE o Evaluation visuelle du modèle o Elimination des valeurs aberrantes (ex: droite de Henry,test de dixon) o Calcul du modèle (ex: y=ax+b) o VALIDATION DU MODELE o Méthodes des résidus Yobs Ycal en fonction de C o Analyse de variances (corrélation, qualité de l ajustement) o Test de l ordonnée à l origine i=nb réplicat J=nb conc K=nb jour o PROPOSITION D UNE FONCTION REPONSE X ijk

33 Buts de l étude de linéarité Etablir les conditions de l analyse de routine : - nombre de solutions témoins - distribution au sein du domaine de concentrations tout en réduisant la charge de travail de l analyse de routine gardant les exigences d exactitude et de précision

34 Linéarité (Valeurs aberrantes) 2 types Valeurs aberrantes Valeurs aberrantes dans la dues à la régression distribution des réponses par concentration Analyse des résidus - Cause expérimentale - Etude statistique (Dixon) Au moins 4 replicats / conc. pour éliminer 1 point aberrant Au moins 6 replicats / conc. pour éliminer 2 points aberrants Le nombre total de valeurs aberrantes est au plus égal à 2

35 Elimination valeurs aberrantes z Droite de Henry avec toutes les mesures x

36 Elimination valeurs aberrantes z Droite de Henry après suppression de 2 valeurs aberrantes x

37 Linéarité (Régression linéaire) Réponse Y Yi valeurs calculées par le modèle Résidu: b Pente a Yi valeurs observées Y Y= ax+ b e=yi-yi Concentration X

38 Linéarité (validation modèle régression) X i j k série (jours) Nb de pts de concentration Nb de réplicat Représentation graphique Modèle de régression Y=aX+b Analyse des résidus Analyse de variances Proposition d une fonction réponse

39 Rappel : Loi normale centrée réduite Si nous substituons à la variable x, la variable µ nous obtenons la loi normale centrée réduite. Sa moyenne est égale à 0. L unité de la variable est σ On peut ainsi calculer la valeur µ correspondant à toute valeur de x Remarque : on obtient généralement les valeurs caractéristiques u = 1,96 pour P = 97,5% soit 1-P=2,5% u = 3,09 pour P = 99,9% soit 1-P=0,1%

40 Linéarité (Analyse des résidus) Validité du modèle: les résidus réduits appartiennent à une distribution normale, centrée, réduite Résidu: S=ecart type Σ e i 2 e i =Yi-Yi distribution e i : e i = 0; S(x,y) = n- 2 Distribution des résidus réduits e i S (x,y) [ t (0,05) = 1,96 ] + 1,96-1,96 [SCE= Σ (Yi Yi) 2 ] Conc.

41 Linéarité (Analyse des résidus) +1,96 Homosédasticité: - 1,96 +1,96-1,96 Conc. Conc. Homogénéité des variances sur tout le domaine de concentration Hétérosédasticité: Réduire domaine de concentration Facteur de pondération

42 Linéarité (Analyse de variances) Validité du modèle: Homogénéité des variances (test de Cochran) Existence d une pente significative (test de Fisher) Validité de la droite de régression Homosédasticité Test de Cochran: C = S 2 max / Σ S 2 J C < C (α, k, n-1) α=% tolérance; k=nb de pt de gamme; n=nb de mesure

43 Linéarité (Analyse de variances) Existence d une pente significative Test de Fischer: F = S 2 régression / S 2 résiduelle F >> F (α,1,n-2) S 2 régression Y S 2 résiduelles moyenne Conc.

44 Linéarité (Analyse de variances) Validité de la régression: comparaison de l erreur d ajustement et de l erreur expérimentale Test de Fischer: F = S 2 ajustement / S 2 expérimentale Y S 2 ajustement S2expérimentale F < F(α,k-2,N-k) Valeur ajustée Moyenne expérimentale Conc.

45 Linéarité (test de l ordonnée à l origine) Pour une équation de la forme: y=ax+b On a: a=pente et b=ordonnée à l origine b est obtenue par régression linéaire et on calcul S(b) S= écart type Test de Student: t = t < t (α, N-2) b 0 S (b) α=valeur vrai de b

46 Linéarité (Intervalle de confiance) Y Y G X 1 (X i X) 2 Y i + t x S(x i,y i ) + N Σ (X i X) 2 Conc. X

47 Linéarité (Stratégie en routine) a1 et a2 b1 et b2

48 Précision (Precision) La précision d une procédure analytique exprime l étroitesse de l accord (degré de dispersion) entre une série de mesures provenant de multiples prises d un même échantillon homogène analysé selon les conditions décrites. Indication sur les erreurs aleatoires 3 niveaux: répétabilité (repeatability) précision intermédiaire CV R CV r (intermediate precision) reproductibilité (reproducibility)

49 Précision ou fidélité

50 Précision La précision mesure l écart de chaque mesure individuelle par rapport à la moyenne des mesures d un volume d échantillon unique et homogène: on calcule un coefficient de variation Minimum 3 concentrations x 5 (suivant référentiel) ± 15%

51 Précision Réponse QC High QC Low X LLOQ QC Medium Concentrations X ULOQ

52 Précision Ecart - type / Moyenne x 100 QC Low QC Medium QC High mg/l Valeur théorique Valeur observée Moyenne (mg/l) Ecart-type (mg/l) Precision (CV %)

53 Répétabilité Reproductibilité (fidélité intermédiaire) Répétabilité «intra-run» «intra-jour» Reproductibilité «inter-run» «inter-jour» 1 seule fois Plusieurs fois: -plusieurs runs sur plusieurs jours -1 run par jour sur plusieurs jours

54 Exactitude (Accuracy) L exactitude d une procédure analytique exprime l étroitesse de l accord entre une valeur qui est acceptée comme conventionnellement vraie ou une valeur de référence et la valeur trouvée (=la valeur moyenne obtenue en appliquant la procédure analytique un certain nombre de fois)

55 Exactitude (Accuracy) Accuracy Comparaison valeur individuelle / valeur vraie erreur systématique + erreur due au hasard trueness Bias valeur vraie Comparaison valeur moyenne / valeur vraie erreur systématique + erreur due au hasard Comparaison valeur moyenne à long terme/ erreur systématique

56 Exactitude L exactitude mesure l écart de la moyenne des résultats par rapport à la vraie valeur (valeur théorique): on calcule un biais Minimum 3 niveaux de concentrations x 5 (suivant référentiel) ± 15% de la concentration théorique

57 Exactitude Réponse QC Low <3 x LLOQ X LLOQ QC Medium Cible Bas Cible Moyen Cible Haut Concentrations QC High = 75 % ULOQ X ULOQ

58 Exactitude (Moyenne - Valeur théorique)/valeur théorique x 100 QC Low QC Medium QC High mg/l Valeur théorique Valeur observée Moyenne (mg/l) Exactitude (%)

59 Précision et exactitude Non précis et non exacte Non précis et exacte Précis et non exacte Précis et exacte

60 Précision et exactitude xi = µ + précision + biais xi - µ = précision + biais = erreur totale xi = µ + précision Précision = erreur aléatoire xi = résultat individuel (valeur mesurée) X = résultat moyen µ = valeur vraie (inconnue) X = µ + Biais Biais = erreur systématique xi = µ + précision Précision = erreur aléatoire

61 Exactitude/Précision 0 % Biais

62 Exactitude/Précision La différence entre le résultat et la valeur vraie doit être dans l intervalle d acceptation [-λ, λ] Avec λ = limite d acceptation (15%) xi = résultat individuel (valeur mesurée) X - µ < λ + 15% - 15% X = résultat moyen µ = valeur vraie (inconnue) 0 % Biais X-µ=0

63 Exactitude/Précision Attention : + 15% - 15% Précision < 15 % et Biais < 15 % 0 % Biais X-µ=0

64 Limite de détection (Detection limit) La limite de détection d une procédure analytique est la plus petite quantité d une substance qui peut être détectée mais non nécessairement quantifiée comme une valeur exacte. Elle peut être exprimée comme une quantité ou une concentration dans la substance analysée.

65 Limite de détection (Detection limit) o Basée sur une évaluation visuelle o Basée sur le rapport signal / bruit (entre 3:1 et 2:1) o Basée sur l écart type de l intercepte (σ) et la moyenne des pentes du modèle (S) DL = 3,3 σ / S o Basée sur la courbe de calibrage (écart type de l ordonnée à l origine) validée par plusieurs mesures réelles à la concentration limite

66 Limite de quantification (Quantification limit) La limite de quantification d une procédure analytique est la plus petite quantité d une substance qui peut être quantifiée avec une exactitude et une précision définies. Elle peut être exprimée comme une quantité ou une concentration dans la substance analysée.

67 Limite de quantification (Quantification limit) o Basée sur une évaluation visuelle o Basée sur le rapport signal / bruit (entre 10:1) o Basée sur l écart type de l intercepte (σ) et la moyenne des pentes du modèle (S) DL = 10 σ / S o Basée sur la courbe de calibrage (intervalle de confiance) validée par plusieurs mesures réelles à la concentration limite: exactitude,précision

68 Robustesse

69 Notion de test de robustesse Modification volontaire d un,ou plusieurs critères, du mode opératoire ou des conditions analytiques Changement de %age de solvant en HPLC, T de séparation, ph, etc ) Élaboration d un plan d expérience (ou algorithme simplex) Application de la méthode Mesure et calcul des performances Mise en évidences des points critiques

70 III-PROFIL D EXACTITUDE

71 Profil d exactitude (principe)

72 Profil d exactitude (construction)

73 Outil de décision: Profil d exactitude

74 Exemples 1: Profil d exactitude pour le dosage d un conservateur

75 Exemples 2: Profil d exactitude

76 Erreur totale

77 Conclusion

78 Remerciements Merci de votre attention

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