LE TEST D IMMUNODIFFUSION OU TEST D OUCHTERLONY : RECHERCHE D UN ANTIGÈNE

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1 Fiche sujet - candidat A des fins expérimentales, des lapins reçoivent par injections un antigène. Ils produisent alors des anticorps spécifiques contenus dans leur sérum et qui peuvent être mis en évidence par la méthode d Ouchterlony. On cherche à identifier l antigène injecté à un lapin. Matériel : - une plaque chauffante et une balance électronique, un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0mL ; - une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar, un flacon d eau distillée, un flacon de solution tampon phosphate (PBS), une spatule ; - deux petites boîtes de Petri ; une pipette 0mL et pipeteur, un tube emporte-pièce et un cure-dent ou une aiguille lancéolée ; - un marqueur (pour marquer la boîte de Petri) ; éventuellement un gabarit de perçage ; - sérum du lapin (= S) ; il contient des anticorps dirigés contre l antigène inconnu injecté ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d antigènes protéiques : pancréatine= P ; caséine= C ; hémoglobine= H ; albumine de sérum de bœuf (BSA)=B ; - un compte-goutte pour chaque produit, des gants ; une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir. Activités et conditions des activités Capacités et principaux critères d'évaluation Barème Réaliser une manipulation d après un protocole 4 respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation et rangement de la paillasse Adopter une démarche explicative 3. Réaliser la partie I du protocole de la fiche technique candidat. Appeler l examinateur pour vérifier la qualité des boîtes de gel et obtenir éventuellement une boîte de secours 2. Après lecture du protocole de la fiche technique candidat (partie II et III ), choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri et l indiquer sur le schéma de la fiche réponse candidat. Justifier ce choix. Appeler l examinateur pour vérifier et obtenir éventuellement un document de secours 3. Réaliser les parties II et III du protocole de la fiche technique candidat. Appeler l examinateur pour obtenir les résultats 4. Représenter sur la fiche réponse le résultat fourni. Réaliser deux schémas qui représentent au niveau moléculaire : - la formation de l arc de précipitation, - l absence d arc. Pour la représentation des anticorps, utiliser le modèle de la fiche réponse. 5. A partir des résultats fournis, déterminer quel est l antigène injecté au lapin. Justifier votre réponse. Réaliser une manipulation d après un protocole respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation et rangement de la paillasse Traduire des informations par des schémas Adopter une démarche explicative 6 5 2

2 Fiche technique - candidat Principe de la méthode d Ouchterlony C est l immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l œil nu. Celui-ci est dû à l interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation d un complexe immun. Le temps de réaction est de l ordre de 24h (c est la raison pour laquelle, après avoir réalisé le protocole, vous disposerez, pour lire les résultats, d une boîte préparée à l avance). PROTOCOLE I - Préparation d un gel d Agar à couler dans deux boîtes de Pétri pour test d Ouchterlony (une boîte pour s exercer). Peser dans la coupelle 0,2g d Agar prélevés à l aide de la spatule. 2. Verser 4 ml de tampon puis l Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l Agar avec la spatule. 3. Chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l ébullition). 4. Retirer à l aide de la pince en bois et attendre une minute pour manipuler le Bécher sans se brûler. 5. Pipeter 5 ml de gel d Agar chaud et fluide et le verser dans une boîte de Pétri. 6. Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. 7. Recommencer pour la deuxième boîte de Pétri (boîte pour s exercer). 8. Ne pas remuer les boîtes avant prise du gel d Agar : environ 5 mn. II- Préparation du test :. Creuser les puits nécessaires dans le gel d Agar d une boîte de Pétri. 2. Utiliser le gabarit ci-contre (ou celui fourni) pour répartir les puits nécessaires. S exercer avec la deuxième boîte pour creuser les puits avec l emporte-pièce. 3. Utiliser le cure-dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire. III- Réalisation du test :. Marquer sur la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. 2. Remplir les puits : le produit, prélevé dans un tube avec un compte goutte propre, doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d agar. 3. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant. Gabarit de perçage dans le gel d Agar

3 Fiche réponse - candidat ETABLISSEMENT : Classe : Nom : Prénom : Schéma à compléter modèle de l anticorps pour la schématisation SCHEMAS A rendre à l issue de l épreuve - Utiliser le verso si nécessaire

4 Fiche barème d évaluation Capacités et critères d évaluation (en gras, évaluation pendant de la séance) Barème Nom des candidats 2. Adopter une démarche explicative - puits central avec sérum de lapin ; puits périphériques contenant chacun un antigène ou l eau distillée - justification : possibilité de rencontre entre les anticorps du sérum central et tous les antigènes périphériques* * fournir un document de secours au candidat qui ne franchit pas cette étape.. et 3 Réaliser une manipulation d après un protocole - respect des étapes du protocole - pipetage, dissolution, chauffage pour préparation de la gélose - obtention d un gel «propre» (surface égalisée, pas de bulle) - réalisation soignée des 6 puits en respectant le gabarit - marquage efficace des puits sur la boîte - utilisation judicieuse du matériel :à vérifier lors de la manipulation ( compte-goutte par produit, dépôts soignés, qualité du pipetage, dépôt des produits conforme au marquage) - organisation et rangement de la paillasse 4. Représenter une observation par un schéma - tracé de l arc correctement placé - schémas soignés, titres pertinents - schéma du complexe immun : traduisant complémentarité Ag-Ac, avec au moins 3 Ag (pour précipitation et obtention du complexe immun) - schéma en absence d arc : donc absence de complémentarité Ac-Ag 5. Adopter une démarche explicative pour répondre au problème posé - l antigène injecté au lapin est la BSA - justification = arc de précipitation entre le sérum et le puits contenant la BSA, spécificité antigène anticorps Note / 20

5 Fiche laboratoire et évaluateurs /2 Matériel par poste : - une plaque chauffante et une balance électronique sur paillasse professeur, (utilisables par plusieurs groupes si nécessaire) ; - un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0mL, une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar ; - un flacon d eau distillée, un flacon de solution tampon phosphate (PBS), une spatule, pipette 0 ml et pipeteur ; - deux petites boîtes de Pétri de 6cm de diamètre; éventuellement un gabarit de perçage ; - un tube emporte-pièce et un cure-dent + une aiguille lancéolée + un marqueur (pour marquer la boîte de Petri) ; - sérum du lapin (= S) ; il contient des anticorps dirigés contre l antigène inconnu injecté ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d antigènes protéiques : pancréatine = P caséine = C hémoglobine = H albumine de sérum de bœuf (BSA) = B - un compte-goutte pour chaque produit, des gants ; une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir. MATERIEL NECESSAIRE A LA PREPARATION - gabarit de perçage des puits (certains lycées utilisent comme gabarit de perçage un couvercle percé de boîte de Petri ; le fournir alors au candidat) ; - emporte-pièce de 4 et 5 mm de diamètre (certains lycées utilisent un tube avec poire d aspiration, le fournir alors au candidat) ; - Tampon phosphate salé (phosphate buffer saline PBS) : NaCl : 8 g ; NaH 2 PO 4, 2H 2 O : 0,4 g Na 2 HPO 4, 2H 2 O : 2,7 g ou Na 2 HPO 4 anhydre :,08 g Eau distillée : 000 m - solutions d antigènes utiles en fonction de la manipulation ; ici, BSA à 0,% dans PBS. PREPARATION DE BOITES DE GELOSE DE SECOURS ET BOITES DE RESULTATS Les boîtes peuvent être préparées la veille. Les quantités sont données pour 0 boîtes : - préparer 50 ml d une solution d agar-agar à,5% dans le PBS ph 7,2 ; - placer 5 ml de la solution tiède dans les boîtes de Petri ; - laisser reposer 20 min à température ambiante ; - découper une rondelle de papier filtre du diamètre interne du couvercle, l imprégner d eau et la placer dans le couvercle.

6 Fiche laboratoire et évaluateur 2/2 PREPARATION DE BOITES RESULTATS AU MOINS 24H AVANT L EPREUVE (en cas d impossibilité on utilisera la «fiche résultats - candidat») - Creuser et remplir les puits selon le protocole (fiche technique candidat) et le document résultat - candidat - Les puits ayant été remplis avec les réactifs grâce à une pipette Pasteur ou un compte goutte fin (sans bulles ni débordement), l incubation est réalisée en plaçant les boîtes dans la chambre humide à température ambiante. - La lecture peut se faire au bout de 24 à 48 h, en plaçant les boîtes sur un fond noir et éventuellement en éclairage rasant. - Pour conserver les résultats, placer alors les boîtes à 4 C. Pour éviter l utilisation de produits on pourra : utiliser des boîtes de résultats conservées au congélateur après un TP formatif (veiller à ce que les désignations et la position de l arc soient corrects), faire des boîtes avec des sérums restants après le TP formatif, conservés au congélateur (au minimum le sérum anti-bsa et la solution de BSA nécessaires pour obtenir l arc. Utiliser alors le même protocole que pour le TP formatif. FOURNISSEURS : - SIGMA, l Isle d Abeau Chesnes BP 70, ST QUENTIN FALLAVIER ; tampon PBS en pastilles, sérums divers, protéines antigéniques... ( section immunologie du catalogue ) ; - SORDALAB, ZA des Poupettes, 9580 VILLENEUVE SUR AUVERS ; kit test d Ouchterlony. REMARQUES A L ATTENTION DE L EXAMINATEUR Evaluation de la question 2 - Fournir un document de secours au candidat qui ne franchit pas l étape de la question 2. - L examinateur doit être exigent sur la réalisation du protocole et par conséquent être présent auprès du candidat au moment où celui-ci distribue les produits (point 3 du protocole) dans les puits de manière à noter au plus juste le point 2 de la grille d évaluation. Rôle du document de secours - Le document de secours n est fourni que si le candidat n a pas placé l anticorps dans le puits central ; on admet toute disposition pour les puits périphériques. - Si le document de secours est fourni, le candidat n obtient pas les points correspondants à la question 2 mais peut continuer l épreuve. Le document de secours et le document résultats peuvent être imprimés (impression couleur de bonne qualité) ou affichés à l écran : utiliser alors les documents affichables : 06_I7_B_Pro_65_Secours et 06_I7_B_Pro_65_Result Prescriptions Autorisations Blouse Gants Lunettes Calculette Papier brouillon Oui, non fournie Oui, fournis non non Fourni par l établissement.

7 Fiche secours - candidat BOITE PRESENTANT LA DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS

8 Fiche résultats candidat A n utiliser qu en cas d impossibilité de préparation d une boîte de résultats par le laboratoire BOITE DE RÉSULTATS PRESENTEE SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus dans les mêmes conditions expérimentales avec les produits réels : sérum de lapin immunisé et solutions antigéniques.

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