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- Ernest Lefebvre
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1 RIDA QUICK Malaria Code produit : N7006 Code produit : N7007 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstrasse 17, D Darmstadt, Allemagne Téléphone : +49 (0) , Fax : +49 (0) C
2 1. Application Pour usage diagnostique in vitro. RIDA QUICK Malaria est un test d immunochromatographie rapide destiné à détecter de manière qualitative les antigènes de Plasmodium falciparum (P.f.), Plasmodium vivax (P.v.), Plasmodium ovale (P.o.) et Plasmodium malariae (P.m.) dans le sang total. Il est conçu pour établir un diagnostic rapide de paludisme dès l apparition des premiers symptômes cliniques. 2. Résumé et explication du test Dans de nombreux pays tropicaux, le paludisme reste un problème grave, voire un problème grandissant dans certaines régions. On distingue trois types de paludisme différents. Sa forme la plus dangereuse est celle provoquée par l agent pathogène Plasmodium falciparum. Plus connue sous le nom de paludisme tropical, cette forme de paludisme est presque seule responsable des décès et représente la majorité des maladies palustres importées dans les pays industrialisés. Les agents pathogènes des autres types de paludisme sont Plasmodium vivax et Plasmodium ovale (paludisme tertiana) etplasmodium malariae (paludisme quartana). Depuis quelques années, Plasmodium knowlesi occupe la cinquième place du classement des agents pathogènes du paludisme. Il présente un potentiel infectieux similaire à celui de P. falciparum ; il ne peut être distingué de P. malariae au microscope et l on confond souvent les deux. Tous les agents pathogènes du paludisme sont transmis par la piqûre d'un moustique anophèle femelle. La période d incubation peut durer quelques jours (paludisme tropical) à plusieurs années (paludisme quartana). Les symptômes du paludisme sont relativement peu caractéristiques. Ils s apparentent souvent à des symptômes similaires à ceux de la grippe, sans les signes du rhume. Ils comprennent généralement des accès de fièvre avec frissons, des maux de tête, des douleurs dorsales et des douleurs dans les membres. En cas de développement atypique, les symptômes peuvent être principalement d ordre gastro-intestinal. Des symptômes de sous-fébrilité et d afébrilité peuvent également survenir. Dans le cas du paludisme tropical, des complications engageant le pronostic vital peuvent survenir à partir du sixième jour d infection. Elles peuvent être évitées moyennent un traitement efficace administré suffisamment tôt. Aussi, un diagnostic rapide est indispensable. La prophylaxie du paludisme implique d éviter les piqûres de moustiques et, si nécessaire, de prendre un traitement antipaludique en dosage préventif ou thérapeutique. Pourtant, plusieurs formes de résistance se sont déjà développées contre chaque traitement antipaludique actuellement disponible, notamment dans le cas de Plasmodium flaciparum. Néanmoins, la chimioprophylaxie peut permettre de réduire considérablement le risque d'infection par le paludisme dans les régions présentant des résistances à plusieurs médicaments. La prise d'un traitement antipaludique en automédication en cas de besoin (traitement de réserve) est uniquement envisagée pour les courts séjours dans les régions sujettes au paludisme ou les séjours dans des régions à très faible risque d'infection par le paludisme, ainsi que dans les cas d intolérances connues aux traitements prophylactiques. Dans ces différents cas, il est RIDA QUICK Malaria
3 recommandé d utiliser un test rapide de dépistage du paludisme facile à utiliser et adapté au déplacement en question. En particulier dans les régions dépourvues de médecin en exercice spécialisé dans les maladies tropicales, un test rapide de dépistage du paludisme est très utile pour établir un diagnostic rapide et ainsi permettre de prévenir les retards susceptibles d engager le pronostic vital. Ainsi, si le test rapide donne un résultat positif, le traitement pris durant ces séjours pourra être utilisé de manière ciblée. La méthode standard habituellement appliquée pour établir le diagnostic minimal du paludisme en laboratoire est la détection de plasmodies dans le sang périphérique à l aide de la technique de l «étalement de sang épais» après une coloration de Giemsa. Le test rapide RIDA QUICK Malaria est une solution alternative rapide qui peut être exécutée par des personnes sans qualification spécifique. Ce test peut également servir de méthode de dépistage dans le cadre des examens en série réalisés dans les banques de sang. En cas de morphologie parasitaire difficile à identifier au microscope ou de morphologie parasitaire difficile à évaluer, ce test peut également servir de test de confirmation de dépistage du paludisme. Le test rapide RIDA QUICK Malaria est également parfaitement adapté pour assurer le suivi thérapeutique dans la mesure où il peut détecter la réduction du nombre d antigènes plasmodiaux en circulation dans le sang, même lorsque la morphologie plasmodiale des différents stades du frottis sanguin ne sont plus reconnaissables au microscope. Néanmoins, le diagnostic définitif du paludisme repose sur l examen du sang au microscope, qui est lui-même étayé par d autres paramètres de laboratoire conjointement avec le diagnostic clinique du patient. 3. Principe du test Le test RIDA QUICK Malaria est un test d immunochromatographie rapide destiné à opérer une détection combinée de la protéine riche en histidine (PfHRP-2) propre à Plasmodium falciparum ainsi que la protéine lactate-déshydrogénase propre aux plasmodies, typique de tous les agents pathogènes du paludisme. Les anticorps de capture agissant contre l antigène HRP-2 de Plasmodium falciparum et contre la LDH propre aux plasmodies sont immobilisés le long de deux bandes transversales sur la membrane de nitrocellulose située dans le boîtier de la cassette. En outre, une troisième ligne, la bande de contrôle, est reliée aux autres anticorps de capture spécifiques. De plus, les anticorps fixés sur l'or colloïdal de façon appropriée se trouvent dans la zone d application de l échantillon de sang. Une lyse des érythrocytes et la libération des antigènes plasmodiaux présents dans l échantillon se produisent après le transfert de l échantillon de sang dans l entonnoir disposé sur la cassette de test et l ajout de réactifs dans le deuxième entonnoir prévu à cet effet. Au cours de ce processus, l antigène existant (PfHRP-2 et/ou pldh) se lie aux anticorps marqués d'or, circule via la membrane de cellulose et traverse les trois bandes transversales comportant les anticorps immobilisés durant le processus. En cas d échantillons positifs, le complexe antigène-anticorps marqués d or est lié à ces anticorps immobilisés puis se condense sur une ou deux bandes de test de couleur rose (T 1 et/ou T 2 ) ainsi que sur la bande de contrôle de couleur rose (C) qui apparaît dans tous les cas. Seule la bande de contrôle de couleur rose est visible dans les échantillons de sang dépourvus de plasmodies. RIDA QUICK Malaria
4 4. Contenu du paquet Les réactifs fournis dans la trousse permettent de faire 25 tests (N7006) ou 5 tests (N7007). Cassette 25 (5) tests 25 (5) cassettes de test emballées séparément Reagent 3 (1) ml Flacons avec réactif d extraction Micro Pipet 25 (5) unités Tubes MICROSAFE 5 µl 5. Les réactifs et leur stockage La trousse peut être entreposée entre 2 et 40 C et peut être utilisée jusqu à la date de péremption imprimée sur l étiquette. Elle doit être protégée de l humidité et du gel, et être conservée dans un endroit sec. Après la date de péremption, la qualité n est plus garantie. De manière similaire, la fonctionnalité des cassettes ne peut plus être garantie si l emballage de la cassette est endommagé. 6. Matériel requis, mais non fourni - Minuteur - Conteneur de déchets avec une solution d hypochlorite de sodium à 0,5% 7. Précautions Uniquement pour le diagnostic in vitro. Toutes les cassettes de test sont à usage unique et ne doivent pas être réutilisées. Les réactifs et les cassettes issus de lots différents ne doivent pas être mélangés. Ce test doit être réalisé uniquement par un personnel de laboratoire formé. Il convient de respecter les directives de travail dans les laboratoires médicaux. Le mode d emploi du test doit être respecté à la lettre. Les réactifs contiennent de l azide de sodium comme conservateur. Cette substance ne doit pas entrer en contact avec la peau ou les membranes muqueuses. Ne pas pipeter les échantillons ou les réactifs à la bouche. Éviter tout contact avec de la peau écorchée ou les membranes muqueuses. Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons et se laver les mains une fois le test terminé. Ne pas fumer, manger, ni boire dans les zones où des échantillons sont manipulés. Tous les réactifs et matériaux entrant en contact avec des échantillons potentiellement infectieux doivent être traités avec des désinfectants adaptés (par exemple, de l'hypochlorite de sodium) ou passés en autoclave à 121 C pendant au moins une (1) heure. 8. Prélèvement et conservation des échantillons Les échantillons de sang doivent être prélevés dans des tubes standard propres ; ils peuvent être conservés jusqu'à trois (3) jours à température ambiante ou entre 2 et 8 C avant utilisation. Pour prolonger leur conservation, les échantillons de sang peuvent être congelés à - RIDA QUICK Malaria
5 20 C. Pour inhiber la coagulation, les tubes de prélèvement des échantillons de sang peuvent contenir de l'edta, du citrate ou de l'héparine. 9. Procédure du test : 9,1. Informations générales Les échantillons, les réactifs et les cassettes de test doivent être ramenés à température ambiante (20 à 25 C) avant utilisation. Les cassettes de test doivent être retirées du paquet supplémentaire peu avant leur utilisation. Après utilisation, les cassettes de test ne doivent pas être réutilisées. Le test ne doit pas être réalisé à la lumière directe du soleil Préparation de l'échantillon Les échantillons recueillis et conservés conformément au point 8, une fois à température ambiante (entre 20 C et 25 C), peuvent être utilisés non dilués dans le test. De manière similaire, le sang frais prélevé sur le bout d'un doigt préalablement désinfecté à l'alcool peut être recueilli directement à l'aide de la Micro Pipet fournie avec la trousse de tubes MICROSAFE 5-µl et utilisé en application de la procédure de test décrite ci-après. Pour garantir une utilisation appropriée des tubes MICROSAFE, respecter à la lettre les instructions y afférentes Test des échantillons Retirer la cassette de test Cassette du sachet et la placer sur une surface plane. Transférer 5 µl de sang en touchant avec précaution la membrane de test à la base de l'entonnoir contenant l'échantillon (sang) à l'aide de la pointe d'une Micro Pipet jetable contenue dans la trousse de tubes MICROSAFE ou à l'aide d'une pipette de laboratoire réglée sur 5 µl. Important : Lors de l'utilisation d'une Micro Pipet à tubes MICROSAFE, ne pas presser la poire pendant le prélèvement du sang. Le remplissage se déroule automatiquement au niveau du repère 5-µl une fois que la pointe de la pipette est immergé dans l'échantillon de sang. Si la poire est pressée, dès que la pointe de la pipette entre en contact avec la membrane de test à la base de l'entonnoir contenant l'échantillon de la cassette, 5 µl de sang seront transférés vers la membrane de test. À cette fin, il convient de respecter les instructions fournies avec les micropipettes. Un volume d'échantillon inexact risque de donner lieu à des résultats incorrects impossibles à analyser. Ensuite, selon la même procédure, pipeter quatre (4) gouttes de réactif Reagent à l'aide du flacon compte-gouttes dans l'entonnoir libellé «Réactif». Vérifier que le réactif est entièrement absorbé par la membrane. C'est le seul moyen de garantir que suffisamment de réactifs se combinent aux gouttes de sang appliquées et circulent ensemble dans la membrane afin de détecter d'éventuels agents pathogènes du paludisme. Par la fenêtre d'inspection de la cassette RIDA QUICK Malaria
6 munie des repères latéraux T 1, T 2 et C, il est possible d'observer l'écoulement du mélange par la membrane. Le repère C doit apparaître au plus tard au bout de cinq (5) minutes et une bande de couleur rose doit apparaître sur la membrane. Cela signifie que le test a été correctement réalisé et a fonctionné. Au fil du temps, la membrane initialement blanche se colore en rouge uniquement en présence du sang. Le résultat final est lu après un délai de 30 minutes. Les bandes qui apparaissent après ce délai n'influencent pas l'évaluation du test. Les motifs figurant sur les bandes sont évalués et interprétés conformément aux instructions fournies avec la trousse. 10. Contrôle qualité, signes de détérioration du réactif Le test doit être évalué uniquement si la cassette de test est intacte avant le pipetage de l'échantillon en suspension et si aucun changement de couleur ou de bande n'est visible sur la membrane de test. En outre, à l'issue d'une période d'incubation de cinq (5) minutes, les bandes de contrôle rouge-violet doivent au moins être visibles. Si elles n'apparaissent pas, vérifier les éléments suivants avant de recommencer le test : - Durée de conservation des cassettes de test et des réactifs utilisés - Procédure de test correcte - Contamination des réactifs Si, après une répétition du test avec une nouvelle cassette de test, les bandes de contrôle ne sont toujours pas visibles, prendre contact avec le fabricant ou votre agent R-Biopharm local. 11. Évaluation et interprétation Trois bandes au maximum doivent apparaître, visibles depuis la zone d'application du sang, dans l'ordre suivant : une bande de réaction de couleur rose sur la bande de test T 2 et une autre sur la bande de test T 1 ainsi que la bande de contrôle de couleur rose sur la bande de contrôle C. En l'absence de bande de contrôle C, le test ne peut pas être évalué et n'est pas valide! Les interprétations suivantes sont possibles : - Dépistage positif du paludisme : les trois bandes (T 2, T 1 et C) ou seulement une des deux bandes T sont visibles à côté de la bande C. - Dépistage négatif du paludisme : seule la bande de contrôle C est visible. - Non valide : aucune bande n'est visible ou une constellation autre que celle décrite apparaît. Les colorations apparaissant sur les bandes après plus de 30 minutes n'ont aucune valeur diagnostique et ne doivent pas être évaluées. Un aperçu de toutes les constellations possibles associées aux trois bandes spécifiques T 2, T 1 et C est disponible dans les instructions d'application fournies avec la trousse de test. RIDA QUICK Malaria
7 12. Limites de la méthode Le test RIDA QUICK Malaria est un test purement qualitatif destiné à détecter les antigènes solubles spécifiques des plasmodies présentes dans les échantillons de sang. Il n est pas possible de déduire un rapport entre l'intensité des bandes spécifiques visibles et l apparition ou la gravité des symptômes cliniques. Les résultats obtenus doivent toujours être interprétés conjointement aux signes et symptômes cliniques et à d'autres paramètres de laboratoire. Un résultat positif n exclut pas la présence d autres agents pathogènes infectieux ou d'autres causes. Un résultat négatif n'écarte pas la possibilité d'une infection par des agents pathogènes du paludisme. Elle peut être provoquée par une répartition des plasmodies dans le sang trop faible au moment du prélèvement de sang. Si l'on observe suffisamment de bases anamnestiques pour suspecter une infection par le paludisme, un deuxième test à l'aide d'un nouvel échantillon de sang frais doit être effectué environ 12 heures plus tard. Un diagnostic final doit toujours être vérifié ou confirmé par d'autres méthodes de laboratoire, comme par exemple l'examen au microscope du frottis sanguin. 13. Performances Sensibilité clinique et spécificité Lors d'une étude de prospection réalisée de janvier à décembre 2013, un total de 93 échantillons de sang ont été examinés au sein de l'institut tropical et de santé publique suisse (Swiss TPH) de Bâle à l'aide du test rapide RIDA QUICK Malaria et comparés au test défini comme norme (examen au microscope de l'étalement de sang épais et du frottis sanguin). Les échantillons provenaient de patients présumés infectés par le paludisme qui se sont présentés au TPH ou ont été aiguillés par des hôpitaux, des laboratoires et des médecins localisés partout en Suisse. Tous les échantillons ont été testés en parallèle d'un autre test rapide disponible dans le commerce. Les deux tests rapides ont permis de détecter la protéine riche en histidine (HRP2) propre à P. falciparum ainsi qu'une autre protéine pan-spécifique du paludisme sur une deuxième pour permettre la détection d'autres espèces plasmodiales. Dans le test rapide RIDA QUICK Malaria, c'est la lactate-déshydrogénase propre aux plasmodies qui se manifeste et, dans le test NOW Malaria, c'est l'aldolase propre aux plasmodies. Les résultats sont résumés dans le tableau 1. Les résultats des deux bandes sont synthétisés en un résultat général. Au microscope, il n'a pas été possible de déterminer les espèces dans 1 sur 93 échantillons originaux. Cet échantillon n'a pas été pris en compte lors de l'évaluation. RIDA QUICK Malaria
8 Tableau 1 : résultats issus de 93 échantillons de sang présumés infectés par le paludisme comparés à deux tests rapides de dépistage du paludisme disponibles dans le commerce par rapport aux méthodes de test définies comme normes de l'institut Swiss TPH de Bâle Microscopie de l'étalement de sang épais/frottis RIDA QUICK Malaria NOW Malaria * # * P. ovale, parasitémie < 0,1 % P. falciparum (1x), P. ovale (1x) parasitémie < 0,1 %, P. vivax (1x), P. malariae (1x) # 5 x contrôle thérapeutique des échantillons positifs précédemment observés au microscope ; 1 échantillon sur 6 fournit un résultat positif confirmé par PCR 4 x contrôle thérapeutique des échantillons positifs précédemment observés au microscope ; 1 échantillon sur 5 fournit un résultat positif confirmé par PCR En conséquence, les spécifications de test suivantes sont calculées pour les deux procédures de test rapide : Sensibilité : 97,7 % 90,9 % Spécificité : 87,8 % 89,8 % Sensibilité analytique La limite de détection pour le test rapide RIDA QUICK Malaria a également été définie par l'institut Swiss TPH via la dilution en série de deux échantillons de sang positifs à P. falciparum avec un échantillon de sang positif à P. vivax. Cette dilution, qui a rendu visible une légère bande sur la bande T 1 ou T 2, a été considérée comme constituant la limite de détection. Les limites de détection ainsi définies ont été déterminées uniquement pour les deux espèces plasmodiales les plus fréquemment détectées. Elles correspondaient à : P. falciparum : 45 plasmodies/µl de sang P. vivax : 100 plasmodies/µl de sang Spécificité analytique En vue de tester les éventuelles réactions croisées avec des composants potentiellement nocifs (facteur rhumatoïde (RF), anticorps antinucléaires (ANA) et anticorps humains anti-murins (AHAM)) ainsi que divers agents pathogènes, différents échantillons positifs pour ces composants et agents pathogènes ont été testés à l'aide du test RIDA QUICK Malaria. Seul un des agents pathogènes testés (VHC, VIH, VHB, virus de la dengue, virus Chikungunya, RIDA QUICK Malaria
9 schistosome) a démontré une faible réaction croisée. Tous les échantillons présentant des ANA et des AHAM ainsi que des concentrations de facteur rhumatoïde maximales de 300 IU/ml se sont révélés négatifs. À un RF de 400 IU/ml, on observe une faible coloration de la bande de test T 2. Le tableau 2 indique les résultats synthétisés. Il n'est pas possible d'exclure d'autres réactions croisées. Les résultats positifs doivent toujours être vérifiés avant d'introduire un traitement antipaludique spécifique, en recourant à une autre méthode standard de laboratoire (voir point 12 Limites de la méthode). Tableau 2 : résultats des tests de spécificité analytique Agents pathogènes/facteurs de dégradation Nombre d'échantillons testés Résultats Virus Chikungunya 10 Négatif Virus de la dengue 10 Négatif Virus de l'hépatite B 11 Négatif Virus de l'hépatite C 21 Négatif * Virus de l'immunodéficience humaine 14 Négatif Schistosome 3 Négatif Facteur rhumatoïde 6 ( IU/ml) Négatif # AHAM 2 ( ng/ml) Négatif ANA 5 (titre ) Négatif * 3 échantillons testés sur 21 ont donné lieu à un signal sur la bande de test T 2 # À 400 IU/ml, le résultat de la bande de test T 2 s'est révélé faiblement positif. RIDA QUICK Malaria
10 Annexe Symboles spécifiques au test : Cassette Reagent Cassette de test Flacons avec réactifs d'extraction Micro Pipet Tubes MICROSAFE 5 µl RIDA QUICK Malaria
11 Bibliographie 1. Gatton M.L. et al.: Pan-Plasmodium band sensitivity for Plasmodium falciparum detection in combination malaria rapid diagnostic tests and implications for clinical management Malaria Journal (2015) 14: Wilson, M.: Malaria Rapid Diagnostic Tests. Clin Infect Dis (2012) 54 (11): Fogg C. et al.: Assessment of three new parasite lactate dehydrogenase (pan-pldh) tests for diagnosis of uncomplicated malaria. Trans Roy Soc Trop Med Hyg (2008) 102: Moody, A.: Rapid Diagnostic Tests For Malaria Parasites. Clin Microbiol Rev. (2002) Jan. 15(1): Arai M. et.al.: Laboratory evaluation of the Rapid malaria P.f./PAN (pldh) immunochromatographic test for detecting the panmalarial antigen using a rodent malaria model. Am J Trop Med Hyg ( 2004) Feb.70(2): Laferi H. et al.: False Positive Dipstick Test for Malaria. Lancet (1998) 337: p Garcia M. et al.: Immunochromatographic test for malaria diagnosis. Lancet (1996) 347: p Kilian A.H.D. et al.: Comparison of two rapid, HRP2-based diagnostic tests for Plasmodium falciparum. Trans Roy Soc Trop Med Hyg (1997) 91: p Singh N. et al.: Malaria diagnosis by field workers using an immunochromatographic test. Trans Roy Soc Trop Med Hyg (1997) 91:p RIDA QUICK Malaria
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