Denis MILAN. Plateforme Génomique Génopole Toulouse Midi Pyrénées

Transcription

1 Avancées dans le domaine du génotypage et du séquençage Denis MILAN Plateforme Génomique Génopole Toulouse Midi Pyrénées

2 Les nouvelles techniques de séquençage et génotypage Séquençage

3 Les objectifs Le génome séquencé pour 1000 $ Evolution des coûts de séquençage : Génome humain (3 giga bases) : 1 milliard $ Génome mammifère : millions $ Reséquençage : 3 Gb à 10 x pour Possible grâce à : Progrès des machines Optimisation des réactions Progrès méthodologiques (BAC + shotgun, carto comparée)

4 Les nouvelles technologies Séquençage massivement parallèle : à 100 M fragments Technologies proposées : Roche 454 Solexa (Illumina) SOLID (Applied Biosystems)

5 Roche

6 Roche Injection consécutive des nucléotides (A puis T, puis G, puis C) L incorporation du nucléotide injecté induit une émission lumineuse T G Identification des puits donnant un signal (et quantification)

7 Roche Difficulté de lecture des homopolymères longs Surtout adapté à du reséquençage

8 Solexa Autre technologie proposée par Solexa (Illumina) Basée sur un séquençage massivement parallèle de petits fragments

9 Solexa

10 Solexa

11 Solexa

12 Solexa

13 Solexa

14 Solexa

15 Solexa

16 Comparaison des techniques Taille Roche 150 Mb > 1 Gb Solexa 1 Gb > 3 Gb Longueur 250 b > 500 b 35 b > 50 b Données Go To Difficultés Homopolymères Assemblage (rep., fam. Gènes) ~ OK impossible ++ (haplo) ± ++ (8 k ) + (3k ) Répétitions Détection SNP Couts SOLID (Applied) ~ Solexa

17 Applications Reséquençage de banques : Etude de transcriptome : Séquençage grande profondeur : Génotypage Génomique (microorganismes, fragments PCR Long Range) ORFéome SAGE like Séquences promotrices, interactions protéines ADN Mutations cellulaires rares (cancérologie) Epissage alternatif

18 Possibilité de "séquençage commun" Possiblité d'utiliser des tags pour identifier des échantillons différents (100 à 200) 150 Mb = 100 x bases = 100 x BAC x 5 7 x = 100 x 100 = 100 x tag 20 bases = 100 x 10 fragments LR x 10 kb x 10 x = 100 x 10 x 10

19 Les nouvelles techniques de séquençage et génotypage Séquençage Génotypage

20 D'innombrables techniques Vignal, Milan, San Cristobal, Eggen (2002), Genet Sel evol

21 10 Nombre de marqueurs 100 A ff Il l 1000 m ym I etr nfiniu ina m ix Illu SN an Pl e x qm 3000 M sa i cr o tel l i te s 2000 Go umi lde na ng ate 1000 Am P C pl if l R-R uo FL r P Ta Nombre d'individus Les techniques pour faire quoi 100,000

22 Affymetrix Hybridation Allèle spécifique Utilisation d'amorces 25 mers Surtout utilisables pour des puces commerciales Puces à façon surtout pour l'homme Coût de l'ordre de /puce (10 k façon, 1.8 M HSA) Projet prioritaire de la Plateforme Biopuces

23 Infinium II (Illumina)

24 Infinium : 1 million SNP humain

25 Nombre de marqueurs 100 A ff ra co na de 1000 m ym I etr nfiniu ina m ix Illu Go umi lde na ng ate 2000 Il l Ill Vé um i SN an Pl e x qm 3000 M sa i cr o tel l i te s Am P C pl if l R-R uo FL r P Ta Nombre d'individus Une nouvelle technique complémentaire 100,000

26 Goldengate & Veracode Technique Goldengate (extension d'amorces AS + ligation) Jeux de 96 ou 384 SNP Coûts (publics) 96 : 0.11 / génotype 384 : 0.05 / génotype Première échelle de commande : 480 individus Analyse du transcriptome (96 ou 384 gènes)

27 La Plateforme Génomique

28 La Plateforme génomique (ex CRGS) Centre de Ressources Génotypage & Séquençage Activités de : Plateforme en place dès la création de la Génopole (2000) Plateforme opérationnelle RIO en Bâtiment inauguré le 7 septembre 2007 Génotypage/séquençage PCR quantitative Gestion des banques (repiquage, dépôt sur macro & microarray)

29 L équipe plateforme Un personnel dédié : Cécile Donnadieu (IE INRA en 2006) : Resp. technique Gérald Salin (IE INRA en 2007) : Resp. informatique Julien Sarry (CDD AI jusqu en octobre 2007) : bio mol. Amandine Marty (CDD IE) : ingénieur bio. mol. X (à recruter) : Technicien Bio mol. Une adresse mail : genomique@toulouse.inra.fr

30 Les modes d accès à la plateforme Accès Standard : Mise à disposition de personnel opérationnel : Le cas du «Séquençage commun» : Formation d un Responsable Technique par laboratoire ou équipe Mise à disposition de matériel opérationnel par l'équipe plateforme Réalisation par le RT pour tous les projets de son labo Mise en place de projets avec Cécile/Amandine, et réalisation par Cécile/Amandine sous la responsabilité des équipes Réalisation des réactions de séquence par chacun Prise en charge par la plate forme (précipitation, migration, transfert sur la base de données CRGS)

31 L atelier Génotypage & Séquençage MATERIEL : 2 Robots pipeteur TECAN 8 aiguilles (1 pré PCR, PCR 1 post PCR) PCR 4 Thermocycleurs ABI blocs Tétrades MJ Research 4 blocs 96 1 Séquenceur ABI capillaires 1 Séquenceur ABI capillaires 1 Scanner Illumina BeadXPress Veracode

32 L atelier Génotypage & Séquençage APPLICATIONS : Séquençage (580 séquences / 24 h) Typage microsatellites ( génotypes / 24h) Typages AFLP, marqueurs SSCP en fluorescence, Snapshot Typage de SNP (96 ou 384), Etude d expression (96 ou 384)

33 L atelier PCR Quantitative MATERIEL : 1 Thermocycleur en temps réel ABI7900HT Bloc 96 puits Bloc 384 puits 1 Thermocycleur en temps réel Roche LC480 avec option HRM Bloc 96 puits Bloc 384 puits

34 L atelier PCR Quantitative APPLICATIONS : Analyse de l expression génique par PCR Quantitative Etude du polymorphisme SNP (TaqMan, Amplifluor) Détection de polymorphisme SNP

35 L atelier Stockage d'échantillons MATERIEL : Congélateurs 20 C & 80 C (enregistrement T C et alarmes) Lecteurs code barres 1D & 2D Imprimantes code barres 1D & 2D

36 L atelier Stockage d'échantillons APPLICATION : Conservation longue durée d'échantillons biologiques (ADN, tissus...) de façon sécurisée Traçabilité dès la réalisation des prélèvements en élevage (Sidex, SAGA)

37 L atelier Gestion des banques MATERIEL : 1 Robot piqueur de clones Biorobotics Biopick 1 Robot grideur Biorobotics Biogrid 1 Robot grideur Biorobotics Microgrid II (64 aiguilles) 1 Scanner Fujibas 5000

38 L atelier Gestion des banques APPLICATIONS : Repiquage de colonies sur boites de Petri (4000 /j) Production de Macro arrays nylon (22 x 22, spots) Production de Micro arrays nylon (2.5 x 7.5, spots) Scan de Macro/Micro arrays après hybridation radioactive

39 La Plateforme Génomique Les nouveautés de l'année

40 Traçabilité de l'activité Récupération des fichiers résultats, des fichiers Log, des fichiers programme par TraceGénomique Mise à disposition des données sur l'intranet. Intégration des code barres

41 Traçabilité des objets Identification des objets et des plaques par code barre (1D ou 2D) Saisie des identifiants CB des plaques utilisées sur les robots et intégration progressive aux fichiers Log

42 Traçabilité des objets Extension aux objets des laboratoires

43 Traçabilité des objets Extension aux objets des laboratoires

44 Détection de SNP par HRM sur LC480 Amorces standards Appareil PCR Quant Par point : Coût PCR standard dye machine

45 Détection de SNP par HRM sur LC480 Amorces standards Appareil PCR Quant Par point : Coût PCR standard dye machine

46 Détection de SNP par HRM sur LC480 Analyse de backcross recombinants 36 paires d'amorces (3 x 12) test de polymorphisme sur 8 animaux 29 profils exploitables 21 polymorphes dont 2 tri alléliques

47 Typage SNP sur BeadXPress Acquisition de la machine (la première livrée en France) Analyse de jeux de 96 ou 384 SNP Quatre projets pilotes : 0.05 / Génotype en 384 (480 ech) avec personnel compris 100 % succès pour les marqueurs déjà connus Homme (maladie auto immune) Souris (carto QTL hémochromatose) Poule (QTL portage des salmonelles) Porc (carto fine QTL engraissement)

48 Projet porc : polymorphisme 0,6 83 % Succès, 11 % à confirmer. 3 Monomorphes, MAF = 28 % 0,5 0,4 Fr é quence Landrace 0,3 Large White Meishan 0,2 0, Position sur la région

49 La Plateforme Génomique Ce qui arrive

50 Programme PRAI (programme régional d'actions innovatrices, Région + FEDER + RNG) Programme pour le "Développement des capacités d'accueil externe de la plateforme Génopole de Génomique et amélioration des équipements" 307 k dont 215 k région Faciliter l'accès des PME (40 k ) Financement du BeadXPress, LC480, équipement batiment, système CB

51 Les acquisitions du CPER Investissement de 4.3 Millions PF Génomique + Bioinformatique Renouvellement du matériel actuel Acquisition de nouveaux matériels : Atelier extraction d'adn+cq Séquenceur nouvelle génération (2009) 150 Mo à 1 Go pour 1 à 192 ech., bp Reséquençage, séquençage régional, transcriptome, cancérologie SNP Haut débit Beadstation (2010) Puces SNP 1536 SNP Goldengate Puces Infinium 550 k

52 La plateforme tourne grâce A l INRA (bâtiment, 2 postes IE permanents, CPER ) Au SAIC de l INP (CDD, gestion de la facturation) Aux Subventions de : FEDER (personnel sur 2 ans) RNG (maintenance, équipement) Région Midi Pyrénées (Bâtiment, CPER, PRAI) Aux organismes partenaires de la Génopole A la Plate forme Bioinformatique (hébergement serveur) Aux équipes qui y travaillent!!