A L I M E N T A T I O N A G R I C U L T U R E E N V I R O N N E M E N T

Transcription

1 Analyse par RNA-seq de l'expression sexe- dépendante dans le foie et le tissu adipeux blanc de 3 espèces : le porc, le poulet et la souris

2 Contexte Rôle des estrogènes dans l expression sexe-dépendante au niveau hépatique (M2 Nabila Moussaoui) Clodfelter et al., Mol Endo, 2006 Bryzgalova et al., Diabetologia, 2006 Gao et al., Mol Endo, 2006 ARN 4x44K

3 Contexte 3 unités INRA avec un centre d intérêt commun : le métabolisme des lipides SENAH / PHASE (Florence Gondret) GARen / GA (Sandrine Lagarrigue) ToxAlim / AlimH et SA (Pascal Martin) 3 tissus déterminants pour le métabolisme des lipides à l échelle de l organisme Le foie (synthèse (y / transformation / dégradation / stockage) g) Le tissu adipeux blanc (synthèse / stockage) Le muscle (dégradation) Métabolisme très «interconnecté», différences entre tissus, espèces et sexes. ProjetAIPBioressources SOS-RNA (2010) ANR FATinteger (Rennes)

4 Les échantillons Animaux prépubères mâles et femelles de chaque espèce (4 individus/sexe) Foie Tissu adipeux périgonadique 3 espèces x 2 sexes x 2 tissus x 4 individus/lot = 48 échantillons Extraction Trizol Digestion DNAse Purification RNeasy RIN Préparation des librairies (TruSeq Illumina) sur GeT-PlaGe (Nathalie Marsaud). Wan et al., Biostatistics 2012 Séquençage HiSeq2000 2x100 bases sur GeT- PlaGe (Olivier Bouchez) 16 lanes (1 sexe, 1 tissu, 1 indiv/espèce / lane)

5 Des données brutes de qualité en quantité 20,3 à 50, fragments/échantillons Analyse Fastqc et contamination (Gérald Salin) Résultats t sous NG6 (PF Bioinfo) i FastQC => OK (Effets random primers) IGV Integrative Genome Viewer : Robinson et al., Nat Biotech, 2011

6 Alignements Alignement sur les transcrits Ensembl r63 (bwa) #Transcrits : Mouse=93 805, Chicken=23 392, Pig= (Christophe Klopp)

7 Alignements / assemblage Christophe Klopp Yannick Lippi Alignement sur le génome (tophat) Assemblage de transcrits et comptage (Cufflinks) Bam files (3Go/file) + tdf + bai Gtf files Combinaison des résultats (Cuffcompare) Tableaux (Raw+Fpkm : >270K lignes) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 ENSMUST ENSMUST ENSMUST ENSMUST ENSMUST Analyses différentielles i (CuffDiff) >50% des lignes Exploration des résultats (CummeRbund) Trapnell et al., Nat Protocols, 2012

8 Comparaison Fpkm bwa/ensembl vs Cufflinks

9 Comparaison Fpkm bwa/ensembl vs Cufflinks

10 Gènes les plus exprimés? Albumine!! Filtrée par Cufflinks!! Major urinary proteins (Mup) Autres protéines de phase aigüe (transferrin, -2-HS-glycoprotein, Serpins, -2 microglobulin, haptoglobin, fibrinogen, hemopexin, ) Apolipoprotéines (A-I I, A-II II, C-I I, E) Métabolisme des xénobiotiques (Cyp, Gst, Ces) Assez bonne concordance entre bwa et tophat/cufflinks. Cohérence avec les principales fonctions du foie

11 Trf Gènes les plus exprimés? log

12 Filtrer les données? Pour au moins 1 groupe : Somme des Fpkm > 4 ET au moins 2 individus avec Fpkm>1 Fpkm=1 10 fragments / transcrit «moyen» de 1Kb / librairiei i de 10M % 53% % 60% Transcripts Gènes Transcripts Gènes Foie TAB Filtrés Conservés

13 Gènes différentiellement exprimés : Foie Bwa/Ensr63 + DESeq Anders & Huber, Genome Biol, 2010 Enrichissement de catégories GO GOseq : Young et al., Genome Biol, 2010 # gènes (FDR<10%) 79 Synthèse des lipides Métabolisme des hormones et tdes xénobiotiques 108 Oxydation des lipides

14 Bwa/Ensr63 + DESeq Gènes différentiellement exprimés : TAB Anders & Huber, Genome Biol, 2010 Enrichissement de catégories GO GOseq : Young et al., Genome Biol, 2010 # gènes (FDR<10%) 1017 Développement des vaisseaux / angiogénèse 1293 Biologie du muscle Contaminations tissu environnant? Hétérogénéité é éité cellulaire? l Recherche de gènes spécifiques Kouadjoet al., BMC Genomics, 2007

15 Gènes différentiellement exprimés : ChrY

16 Gènes différentiellement exprimés : Xist

17 Elovl3 Gènes différentiellement exprimés Pnpla3

18 Cufflinks Quelques observations sur les résultats de Cufflinks / Cuffdiff Réglagedesparamètres : Albumine Beaucoup (trop?) de transcrits et de gènes nouveaux Cuffcompare Beaucoup (trop!!) de transcrits avec des valeurs pour un seul individu Cuffdiff Premiers résultats assez décevants : Peu de gènes DE et presque tous identifiés par DESeq Aucun gène du chromosome Y

19 Quelques observations sur les résultats de Cufflinks / Cuffdiff Cuffdiff : Ddit4

20 Quelques observations sur les résultats de Cufflinks / Cuffdiff Cuffdiff : Cyp2b19 Forte homologie Cyp2b13, 2b9, 2b10, 2b23

21 Quelques observations sur les résultats de Cufflinks / Cuffdiff DESeq : Cyp2b9

22 Niveau gène ou niveau transcrit? UP DOWN Souris / Foie # de gènes significatifs (FDR<10%) UP DOWN Souris / TAB # de gènes significatifs (FDR<10%)

23 Bilan Technologie RNA-Seq Données brutes de qualité. Améliorer / standardiser les QC pour identifier les échantillons/valeurs aberrants et «nettoyer» les jeux de données Alignements semblent OK mais beaucoup de questions concernant l assemblage de transcrits, le comptage des reads/fragments et la combinaison des résultats de différents échantillons Analyse différentielle : CuffDiff, DESeq (edger) Transcrits alternatifs? CuffDiff, DEXSeq en cours

24 Bilan Technologie RNA-Seq

25 Remerciements Nbil Nabila Moussaoui i(phd) Sandrine Lagarrigue Colette Bétoulières Colette Désert GARen Yannick Lippi Christophe Klopp Florence Gondret Sandrine Tacher Gerald Salin Olivier Bouchez Nathalie Marsaud Financement