Analyse de données RNAseq sous Galaxy : l'exemple du poulet

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1 Analyse de données RNAseq sous Galaxy : l'exemple du poulet Pierre François Roux & Sandrine Lagarrigue, Laboratoire de Génétique, UMR INRA Agrocampus Ouest PEGASE Rennes/St Gilles Yvan Le Bras, Projet e Biogenouest, CNRS UMR 6074 IRISA INRIA, Rennes I. Analyse RNA seq sous Galaxy : Overview Standardisation et exploration des données Alignement des lectures sur un génome de référence

2 Nettoyage des données et statistiques d'alignement Assemblage de transcrits, trouver les gènes et transcripts différentiellement exprimés et comptage du nombre de lectures par composant (exon) Analyse de l'expression différentielle de gènes à partir de comptages

3 II. Analyse RNA seq sous Galaxy : Le cas du poulet Récupération des données #0C# Récupération des données brutes pairées dans Shared data/data libraries/1 Galaxy teaching folder/2015_rnaseqao #0D# Récupération du génome de référence, ici le chromosome 19 de Gallus gallus également dans Shared data/data libraries/1 Galaxy teaching folder/2015_rnaseqao NB : Si vos données sont hébergées quelquepart sur le cluster de GenOuest, vous pouvez également directement les importer en utilisant l'outil Genolink comme présenté ici:

4 Nettoyage et vérification de la qualité #0E# Vérifier le format des fastq avec FastQ Groomer pour mettre en format fastqsanger puis regarder la qualité des données en utilisant FastQC Le fichier de sortie est un rapport html constitué de plusieurs parties : Quelques statistiques simples sur le fichier analysé. On y trouve notamment le type d'encodage ASCII utilisé pour les valeurs de qualité, le nombre de séquences filtrées si utilisé en mode Casava ainsi que le taux de GC (régions génomiques enrichies en GC sont en moyenne enrichies en gènes, avec plus d'exons que d'introns)

5 La ligne rouge représente la valeur moyenne de score. La boîte jaune représente la répartition des valeurs inter quartiles (25 75%). Le haut et le bas des moustaches représentent les points à respectivement 90% et 10%. La ligne bleue représente la qualité moyenne par position. Les différentes parties du graphique (vert, orange, rouge) représentent respectivement des qualités très bonnes, raisonnablement bonnes et faible. Comme la qualité se dégrade en général au fur et à mesure que le run de séquençage progresse, les valeurs ont tendance à diminuer vers la droite du graphe. Un warning est mis si une des valeurs de quartile inférieur est en dessous de 10 ou si la valeur médiane d'une base est inférieure à 25. Erreur quand premier quartile<5 ou médiane<20. La répartition du nombre de séquences par scores permet de voir si un sous jeu de séquences présente une faible qualité, ce qui peut être le cas notamment si elles ont mal été capturées sur image (sur le bord du champ de vision de l'appareil par exemple). Cela peut révéler un problème systématique pendant le run correspondant à une partie de la flowcell par exemple.

6 Un warning est indiqué quand le pic est en dessous de 27 (taux d'erreur de 0.2%). Un échec quand en dessous de 20 (taux d'erreur de 1%). Dans une librairie "randomisée", nous nous attendrions à peu voire aucune différence. Quand une forte différence est observée, cela vient souvent du fait de séquences sur représentées contaminant la librairie. Un biais persistent tout au long de la séquence indiquerait plus un biais dans la librairie initiale ou un problème systématique pendant le séquençage de la librairie. Ici, l'utilisation d'amorces aléatoires lors de séquençage Illumina produit ce biais connu en début de séquence Un warning quand différence, à au moins une position, entre A et T ou G et C supérieur à 10%, une erreur à 20%. Un biais ponctuel peut indiquer une séquence sur représentée contaminant la librairie. Un biais persistent tout au long de la séquence indiquerait plus un biais dans la librairie initiale ou un problème systématique pendant le séquençage de la librairie.

7 Warning si valeur à une base diffère d'au moins 5% de la moyenne en GC, erreur à 10%. Une distribution normale du contenu en GC peut être attendu d'une librairie "randomisée" avec un pic central correspondant à la moyenne générale du contenu en GC du génome étudié. Un écart peut indiquer des contaminations ou d'autres types de biais. Un déplacement de la distribution indique plutôt des biais systématiques indépendant de la position. Warning quand la somme des déviations à la normal représente plus de 15% des reads. Une erreur pour 30%. Warning quand le contenu en N > 5% à une position, 20% pour une erreur.

8 Nous devons observer un pic unique. Si ce n'est pas le cas, un warning apparaît, une erreur si une séquence à une longueur de 0. Score établit en regardant les première séquences du fichier. Il est habituel de voir la courbe remonter à 10 car y sont répertoriés toutes les séquences présentant 10 duplications et plus. Ici, le niveau est élevé, impliquant un grand nombre de séquences avec un fort niveau de duplication. Un warning est indiqué quand les séquences non uniques représentent plus de 20% du total, 50% pour une erreur. Warning si une séquence représente plus de 0.1% du total, une erreur pour 1%. Erreur technique venant de l'étape de PCR ou biologique???

9 Graphe des top 6 hits de 5 mer en utilisant 20% des séquences. Warning quand un k mer est enrichi plus de 3 fois en tout ou 5 fois à une position donnée. Si la valeur passe à 10 fois, une erreur s'affiche. ces premières informations de qualité permettent notamment de faire des choix dans la "découpe" des séquences (début et/ou fin) via des outils de "trimming" comme le propose les outils comme FASTQ Trimmer ou Sickle. Mapping des lectures sur génome de référence NB: Si aucun génome de référence n'est présent, il faudra alors pratiquer un assemblage de novo des transcrits via par exemple le logiciel Trinity Lancer le mapping avec Tophat2 (qui utilise Bowtie) Les données sont pairées

10 On utilise un génome de référence dont le fichier fasta est dans notre historique La distance maxi entre nos pair de reads pairées est de 200pb On précisera certaines options supplémentaires: La longueur max des introns est de pb Filtre des résultats de mapping Retrait des duplicats de PCR (comparer le nombre de séquences avec et sans duplicats : ~divisé par 2) Conversion des BAM en SAM, en conservant le headers (premières lignes de commentaires). NB : Cette étape permet de pouvoir visualiser le résultat de l'alignement. Elle n'est pas nécessaire pour

11 la suite. Filtre des SAM Supprimer les reads ayant mappés à plusieurs endroits, de même pour les reads avec score d'alignement inférieur à 30. NB : Vous pouvez également directement prendre en fichier d'entrée le BAM obtenu en sortie de rmdup.

12 Faire un "mini workflow" avec les trois étapes précédentes pour les appliquer à tous les fichiers BAM (accepted hits) de sortie de Tophat2. Créer le mini workflow Editer le mini workflow (et ajouter un composant Input dataset permettant le multi input). NB : Sont représentés sur ce workflow, les 2 possibilités (à partir du BAM ou du SAM après conversion). Nous garderons ce workflow pour plus tard. En effet, avant de l'éxécuter, il faut exécuter Tophat sur toute les paires de lectures à analyser. Comme il y en a plusieurs, le plus pratique est de créer une collection de données. Pour cela, sélectionner les données forward pour les rassembler dans une

13 liste via l'option d'historique "build datasets list" disponible en sélectionant le menu "Operations on multiple datasets". Faire de même pour les données reverse. Vous pouvez désormais lancer tophat2 sur ces 2 collections Tophat2 va ainsi pouvoir se lancer sur toute les paires de lectures définies précédemment dans la collection. Cela évite de devoir relancer plusieurs fois la même exécution et donc de gagner du temps! NB : Les fichiers générés sont cachés (état hidden). Pour les utiliser par la suite, mieux vaut les "décacher" via l'option d'historique Unhide Hidden Datsets. Une méthode alternative existe, sans passer par la création de collection. Il s'agit alors de sélectionner les fichiers d'entrée après avoir activer l'option "run tool in parallel across multiple datasets" comme présenté ci dessous. NB : Il est alors essentiel de vérifier les paires de fichiers analysées pour ne pas comparer des poires et des pommes ;)

14 Maintenant que nous avons nos données de RNAseq mappées sur le génome de référence, nous allons pouvoir lancer notre beau mini workflow sur les fichiers non traités. Statistiques d'alignement avant filtre Statistiques d'alignement après filtre conversion des fichiers SAM filtrés en BAM avant d'utiliser Flagstat Statistiques via Flagstat Comparer les deux rapports de Flagstat, avant et après filtres:

15 Visualisation Visualisation sous Trackster des fichiers filtrés Créer une nouvelle visualisation Ajouter un génome de référence maison (custom build)

16 Donner un nom et une "clé" à votre nouveau génome de référence (ici GalgalChr19 et Galgal_Chr19) et choisissez le fichier fasta correspondant dans votre historique La création se fait Retourner dans le volet Analyze Data et effectuer à nouveau l'étape visualisation sous Trackster des fichiers filtrés Affecter le nouveau génome de référence aux fichiers BAM avant de les visualiser (pour ne pas avoir de point d'interrogation au niveau du champ database comme c'est le cas ici) Attributs mis à jour, plus de point d'interrogation mais Galgal_Chr19!

17 Demander à nouveau la création d'une visualisation sous Trackster Donner un nom à la visualisation. Le nouveau génome de référence est automatiquement sélectionné Après chargement, les données doivent apparaître

18 Ne pas oublier de sauvegarder la visualisation. Pour ajouter les 6 autres jeux de données au format BAM, il faut affecter à chacun d'entre eux la database adéquate(galgal_chr19) avant de les ajouter à cette visualisation. Ensuite, il est possible, comme nous l'avons fait précédemment pour le premier fichier BAM, de cliquer sur "Visualize" au niveau du dataset et choisir Trackster. Ensuite, nous allons choisir "View in saved visualization" pour l'ajouter à la visualisation existante que nous venons de suavegarder. Le chargement des données débute Puis le résultat s'affiche, une piste par jeu de donnée, soit ici 2 pistes.

19 Une seconde manière pour ajouter un jeu de données, et donc une piste, est d'utiliser directement au niveau de la visualisation, le bouton "Add tracks" Il est alors possible de sélectionner tous les jeux de données d'intérêt

20 Ne pas oublier de sauver avant de quitter Trackster! Quantification du nombre de reads mappés par gène Mesure de l'expression des gènes Etape préalable non obligatoire, trier le fichier SAM par nom de séquence puis position Start Etape préalable, convertir le format de fichier de SAM vers BAM. Ceci est obligatoire si le fichier SAM d'origine ne contient pas d'en tête (header). Quantification de l'expression par gène et exon avec htseq count en utilisant les fichiers SAM ou BAM comme inputs. NB 1 : Pour cette analyse, il est nécessaire d'utiliser un fichier d'annotation du génome considéré au format gtf ou gff. Ce fichier pourra être obtenu via l'outil UCSC Main de la section Get Data si besoin en sélectionnant le groupe Genes and Gene Predictions et la base Ensembl Genes. Ici, seul les information concernant le chromosome 19 du poulet pourront être récupérés. NB 2 : Il est essentiel que l'identifiant utilisé pour le chromosome dans le fichier de référence utilisé pour "mapper" les lectures soit le même que celui renseigné dans la première colonne du fichier d'annotation (au format gtf ou gff). Par exemple ici, dans le génome de référence, le nom de la séquence est "19", alors que dans le gtf importé de UCSC, le "Seqname" est "chr19". Pour pallier à cela, vous pouvez utiliser l'outil "Regex". Options : Library :paired end ; Mode : Intersection (nonempty) ; Stranded : No. Ici, nous conservons gene_id comme attribut d'identifiant qui sera utilisé dans le fichier de sortie

21 (identifiant ensembl : ENSGALG ). Il est également possible de représenter les données par exon en indiquant exon_id comme attribut (identifiant ensembl : ENSGALE.). Autres attributs disponibles : transcript_id, exon_number, gene_biotype. Vérifier les sorties(stdout et stderr) de vos outils. Dans le cas présent, un Warning est affiché à la sortie de htseq count. Ceci est dû au fait que certaines séquences ne présentent qu'un seul read au lieu de 2 comme attendu dans le cas de données pairées. Mais ce warning peut également intervenir en cas de mauvais formattage du fichier SAM d'origine (pas trié par nom de séquences notamment) Quantification de l'expression par transcrits après leur assemblage Quantification de l'expression par transcrit avec Cufflinks, en spécifiant la longueur max des introns a pb

22 Pour plus d'informations concernant l'utilisation de cufflinks, cuffcompare et cuffdiff, vous pouvez vous référer au tuto présent ici : Opération non obligatoire : Vérifier qu'il y a bien des gènes présentant un nombre de fragments par kilobase de transcrit par million de lectures mappés (FPKM pour Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) > O en triant (via l'outil sort) la colonne 10 comme suit: NB: A part le FPKM, il existe également le RPKM (Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads). Le FPKM est particulièrement adapté pour le RNA Seq sur données pairées, qui

23 double le nombre de lectures par fragment (2 reads par fragment d'adnc). Si dans certains cas, un seul read sur les 2 reads pairées était gardé, il y aurait eu un biais en utilisant le RPKM, qui auraient compté deux fois certains fragments et pas d'autres. Le FPKM permet de remédier à cela. Analyse d'expression différentielle entre plusieurs conditions via Cuffdiff via EdgeR : Préparation des jeux de données de sortie de htseq count pour egdger Ajout des en têtes sur chacun des jeux de données de sortie de htseq count contenant l'information de comptage par gene (ou autre feature comme exon, ). Pour cela on va commencer par créer les en têtes via l'outil Get Data / Upload File en écrivant du texte libre.

24 Il faut ensuite concaténer sous cet en tête, le fichier contenant le nom d'exon en première colonne puis les comptages correspondants à chaque individu mentionné dans l'en tête. Vous réaliserez ce fichier en utilisant les outils Join two Datasets puis cut columns. via Voom : Préparation des jeux de données de sortie de htseq count pour egdger Ajout des en têtes sur chacun des jeux de données de sortie de htseq count contenant l'information de comptage par gene (ou autre feature comme exon, ). Pour cela on va commencer par créer les en têtes via l'outil Get Data / Upload File en écrivant du texte libre.

25 Il faut ensuite concaténer sous cet en tête, le fichier contenant le nom d'exon en première colonne puis les comptages correspondants à chaque individu mentionné dans l'en tête. Vous réaliserez ce fichier en utilisant les outils Join two Datasets puis cut columns comme mentionné pour edger. via Deseq : Préparation des jeux de données de sortie de htseq count pour Deseq Ajout des en têtes sur chacun des jeux de données de sortie de htseq count contenant l'information de comptage par gene (ou autre feature comme exon, ). Pour cela on va commencer par créer les en têtes via l'outil Get Data / Upload File en écrivant du texte libre, chaque intitulé de colonne sera séparé par un espace. Pour le fichier de sortie de htseq count pour le poulet_362, cela sera:

26 NB: Ne pas oublier de sélectionner le format tabular et de cocher la conversion des espaces en tabulation. Il faut réitérer cette étape pour poulet_412, poulet_421, poulet_541, jusqu'à Poulet_920. L'étape suivante consiste à concaténer ces en têtes aux sorties de htseqcount correspondantes Este à joindre tous les fichiers par le nom de gêne puis à couper les colonnes redondantes portant le nom des gènes (outils Join puis Cut column).

27 ANNEXES 1. Pb avec Htseq count: Si le Htseq count génère une erreur de type "Malformed SAM line: RNAME == '*' although flag bit &0x0004 cleared",cela vient probablement du fait que l'on travaille sur des données pairées mais que certaines paires sont incomplètes (i.e. pour au moins un nom de séquence, une seule occurrence est trouvée au lieu de deux dans le fichier SAM d'origine). Pour y remédier, il est possible de supprimer les données pour lesquelles nous n'avons qu'un read dans le fichier SAM en procédant comme suit: Grouper les données du fichier SAM par la colonne portant le nom des reads (colonne 1) puis ajouter une opération, à savoir compter le nombre observé d'occurrence pour chaque nom de séquence. Filtrer les lignes du fichier tabulé obtenu pour ne conserver que les noms de séquences (colonne 1) pour lesquels moins ou plus de 2 occurrences ont été observées dans le fichier SAM (colonne 2) Comparer le jeu de données initial (le fichier SAM trié) avec le fichier filtré obtenu précédemment en utilisant la colonne 1 comme référence et ne conserver que les lignes du premier jeu de données n'ayant pas été retrouvées dans le second

28 2. Cuffcompare transfrag class codes: 3. Le pipeline classique utilisant Cufflinks:

29 Comparaison de méthodes d'analyse différentielle : Soneson and Deorenzi A comparison of methods for differential expression analysis of RNA seq data : BMC Bioinformatics /14/91

30 Liens d'intérêt : DESeq : EdgeR : df Voom :