SURFACES : TECHNIQUES DE PRELEVEMENT AU MOYEN DE BOÎTES DE CONTACT, D ECOUVILLONS ET DE LINGETTES

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1 Service : Microbiologie Méthode technique SURFACES : TECHNIQUES DE PRELEVEMENT AU MOYEN DE BOÎTES DE CONTACT, D ECOUVILLONS ET DE LINGETTES Mise en service de la première version : Mise en application de cette version : Rédaction : BLETTNER.C Visa : Date : Vérification technique : BOCA.J Visa : Date : Vérification qualité : BRIER.M Visa : Date : Approbation : BLETTNER.C Visa : Date : Nature de la modification : / Personnes ayant lu et compris le document : NOM FONCTION DATE VISA Remarques : Diffusion du document Lieu de diffusion (et/ou personne) Mode de diffusion Interne Externe Date de diffusion Visa Date de reprise de la version Page n 1/8

2 Table des matières : 1. OBJET ET DOMAINE D APPLICATION REFERENCES DOCUMENTS ASSOCIES DEFINITION ORGANISATION MATERIEL DOCUMENTS D ENREGISTREMENT TECHNIQUES DE PRELEVEMENTS METHODES PAR EMPREINTE Milieu de culture Technique de prélèvement Incubation et lecture METHODES PAR FROTTIS Technique avec un écouvillon Technique avec une chiffonnette TRANSPORT ET CONSERVATION TRANSPORT CONSERVATION CLASSEMENT ET ARCHIVAGE... 8 Page n 2/8

3 1. OBJET ET DOMAINE D APPLICATION Le présent document a pour objet de décrire les modes opératoires de contrôle microbiologique des surfaces (prélèvement et analyse) par différentes méthodes (empreinte ou frottis) afin d évaluer sur les plans de travail ou toute autre surface : - le niveau de contamination (dénombrement flore totale ), - hygiène du personnel : prélèvements de mains, - l efficacité des protocoles de nettoyage et de désinfection, - l absence ou la présence d indicateurs d hygiène (coliformes, staphylocoques ), - l absence ou la présence de pathogènes (Salmonella, Listeria ). Ces techniques de prélèvements peuvent être appliquées aussi bien dans le milieu de l industrie agro-alimentaire que pharmaceutique, cosmétique, de l hygiène hospitalière et l environnement. 2. REFERENCES - Norme Européenne : NF ISO " Microbiologie des aliments Méthodes horizontales pour les techniques de prélèvement sur des surfaces, au moyen de boîtes de contact et d écouvillons ". - MB MT 01-1 : " Techniques générales et conditions de travail au cours de l analyse ". - Fiches techniques fournisseurs (AES, Oxoid, ATL, ). - Fiche outil ANSES "Pour un guide des bonnes pratiques d hygiène ". 3. DOCUMENTS ASSOCIES - MB PS 04 F3 : Fiche de demande d analyses «Divers» 4. DEFINITION Prélèvement : acte qui consiste à obtenir l échantillon. Fiche de prélèvement : document renseigné par le préleveur pour assurer la traçabilité complète des conditions de prélèvement. 5. ORGANISATION 5.1. Matériel Avant le départ, le préleveur doit vérifier son matériel : adapté aux prélèvements à réaliser, quantité suffisante -désinfectant alimentaire et solution d éthanol à 70%. -désinfectant pour les mains et papier essuie-mains. -chalumeau à gaz avec recharges. -marqueurs, stylos, étiquettes. -blouse, charlotte, sur-chaussures. -enceinte isotherme de transfert avec blocs réfrigérants permettant le transport des échantillons du lieu de prélèvement au laboratoire. -matériel de prélèvement (boîte de contact, bilames, lingette ). Page n 3/8

4 -gabarit. -gant stérile -boîte de contact avec milieu + neutralisant -lame gélosée avec milieu + neutralisant -Pétrifilm (pour prélèvement de surface) -Ecouvillon stérile avec milieu de transport + neutralisant -Chiffonnette stérile imprégnée + neutralisant 5.2. Documents d enregistrement Avant le départ, le préleveur doit préparer les différents documents (fiche de demande d'analyse...). Sur le formulaire de demande d'analyse devront être renseignés : -coordonnées du demandeur de l'analyse : Nom, adresse, contact, tél... -références commande, offre ( si elles existent ). -conditions de prélèvement des échantillons : nom du préleveur, date et heure. -conditions de réception des échantillons : "reçu de", par, date et heure. -caractéristiques de chaque échantillon : dénomination, endroit, état, température de l'échantillon ou enceinte Techniques de prélèvements Les prélèvements de surfaces peuvent êtres réalisés selon 3 techniques différentes en fonction : -du but de l analyse : dénombrement ou recherche -du type de surface à analyser : surface plane, irrégulière, arrondie -de l accessibilité et de la taille de la surface à analyser -des micro-organismes recherchés Méthodes par empreinte Milieu de culture Les différents matériaux sont prêt à l emploi. Le type de gélose utilsé dépend du micro-organisme Les surfaces à analyser étant susceptibles d être en contact avec des désinfectants et des antiseptiques, il est nécessaire d utiliser des des géloses avec neutralisant (cf fiche technique fabricant) Technique de prélèvement La méthode consiste à réaliser une empreinte de la contamination par utilisation d un dispositif permettant d appliquer une gélose sur la surface à analyser. Plusieurs méthodes de prélèvement existent : -boîtes de gélose contact -lames gélosées -films enduits de gélose type «Pétrifilm» Comme indiqué dans l ISO il est préconisé un temps de contact de 10 secondes avec application d une pression équivalente à celle exercée par une masse de 500g. Des applicateurs spécifiques pour les boîtes contact existent et peuvent être utilisés. Pour les autres cas (lames gélosées et films gélosés) il est important d appliquer une pression constante pendant les 10s en Page n 4/8

5 faisant attention de ne pas trop écraser la gélose (garder la structure de la gélose intacte : pas de fissure ). Procédure de prélèvement : -se désinfecter les mains -retirer le couvercle ou la membrane de protection ou sortir la lame gélosé de son étui -appliquer la face gélosée sur la surface avec une pression constante pendant 10s -refermer l échantillon (scotcher le couvercle si nécessaire) ou le remettre dans son emballage -identifier l échantillon -nettoyer et désinfecter la zone de prélèvement Incubation et lecture -Incuber directement les échantillons : la température et le temps d incubation dépendent du micro-organisme -Après incubation, dénombrer la totalité des colonies présentes sur la gélose. -Le résultat du dénombrement peut être donné en UFC/cm 2 ou par UFC/surface totale de l échantillon. En cas d absence de norme spécifique applicable se référer à la fiche technique du fabricant ou déterminer une procédure d analyse en accord avec le client Méthodes par frottis Le principe des méthodes dites par frottis est basé sur le décrochement des micro-organismes par frottement de la surface, dans deux directions perpendiculaires, avec un objet frottant qui va récupérer les bactéries de la surface échantillonnée. Cette technique peut être utilisée dans le but d un dénombrement ou d une quantification de différents micro-organismes à partir d un seul prélèvement. Deux types d objets frottant sont utilisés en fonction du type et de la taille de la surface à analyser : -Ecouvillon stérile: réservé pour les prélèvements de petites surfaces (25cm2 ou 100cm2) et aux zones difficiles d accès. -Chiffonnette stérile : permet d échantillonner de plus grandes superficies (> 100cm2) et des surfaces non planes Technique avec un écouvillon PRELEVEMENT : Afin de s assurer de la superficie échantillonnée, il est conseillé d utiliser des gabarits stériles ou à stériliser avant utilisation. Les écouvillons stériles utilisés dans le cadre de ce type de prélèvement sont en général plongés dans un milieu de transport liquide (type AMIES) permettant le transport de germes aérobies et anaérobies et d humidifier la surface lors du prélèvement afin de favoriser le décrochement des bactéries. -se désinfecter les mains -appliquer le gabarit stérile sur la surface à échantillonner -sortir l écouvillon de son étui de protection -frotter l ensemble de la surface dans un sens puis dans le sens perpendiculaire -remettre l écouvillon dans son étui et rompre le bâtonnet dans des conditions aseptiques Page n 5/8

6 -identifier l échantillon ANALYSE : Différentes techniques d analyses peuvent être appliquées pour ce type de prélèvement selon qu il s agisse d une détection ou d un dénombrement de micro-organisme. Avant analyse, homogénéiser l écouvillon par passage au vortex pendant 30s. Cela constitue la solution mère. Effectuer si nécessaire des dilutions en EPT ou Tryptone sel. -en surface : étaler 0,1ml de la solution mère et/ou de ses dilutions à la surface d une gélose sélective appropriée selon le germe recherché ou sur gélose non sélective pour un dénombrement de la flore totale. Après incubation, dénombrer les colonies présentes sur la(les) boîte(s) et calculer le résultat en tenant compte des dilutions éventuelles. Le résultat peut être donné en UFC/cm 2, UFC/surface totale. -en profondeur (dénombrement de la flore totale) : déposer 1ml de la solution mère et/ou de ses dilutions dans une boîte de Pétri stérile de 90mm puis incorporer avec une gélose PCA en surfusion à 47 C. Homogénéiser et laisser solidifier Après incubation, dénombrer les colonies présentes dans la(les) boîte(s) et calculer le résultat en tenant compte des dilutions éventuelles. Le résultat peut être donné en UFC/cm 2 ou UFC/surface totale. -Recherche de micro-organismes spécifiques (présence/absence) : Transférer l écouvillon dans un bouillon d enrichissement adéquat Après incubation, réisoler sur mileu adéquat en fonction du micro-organisme recherché Vérifier la présence ou l absence de colonies spécifiques et confirmer si nécessaire. Le résultat est rendu en présence/absence du micro-organisme / échantillon ou surface écouvillonnée (si connue). En cas d absence de norme spécifique applicable se référer à la fiche technique du fabricant ou déterminer une procédure d analyse en accord avec le client Technique avec une chiffonnette PRELEVEMENT : Les chiffonnettes sont en général imprégnées d un liquide isotonique (type EPT) et d un neutralisant permettant la neutralisation des désinfectants et antiseptiques. Page n 6/8

7 -se désinfecter les mains et mettre des gants stériles -sortir la chiffonnette de son sac -frotter la surface à échantillonner -remettre la chiffonnette dans son sac -identifier l échantillon ANALYSE : Différentes techniques d analyses peuvent être appliquées pour ce type de prélèvement selon qu il s agisse d une détection ou d un dénombrement de micro-organisme. Avant analyse, ajouter 100ml de diluant (EPT ou Tryptone sel) puis homogénéiser par passage au stomacher pendant 1min. Cela constitue la solution mère. Effectuer si nécessaire des dilutions en EPT ou Tryptone sel. -en surface : idem écouvillon. -en profondeur (dénombrement de la flore totale) : idem écouvillon. -Recherche de micro-organismes spécifiques (présence/absence) : Ajouter directement dans le sachet contenant la chiffonnette 100ml d un bouillon d enrichissement adéquat Après incubation, réisoler sur mileu adéquat en fonction du micro-organisme recherché Vérifier la présence ou l absence de colonies spécifiques et confirmer si nécessaire. Le résultat est rendu en présence/absence du micro-organisme / échantillon ou surface écouvillonnée (si connue). En cas d absence de norme spécifique applicable se référer à la fiche technique du fabricant ou déterminer une procédure d analyse en accord avec le client Transport et conservation Transport Le prélèvement ainsi réalisé doit être acheminé au laboratoire dans les plus brefs délais. Il convient dans l idéal de commencer l analyse le jour même. Durant le transport, les échantillons sont conservés dans une enceinte réfrigérée avec blocs réfrigérants. Ne pas mettre de blocs réfrigérants en contact direct avec l échantillon, car cela pourrait entraîner sa congélation. La formation de glace peut entraîner la mort de la majorité des cellules Conservation Arrivés au laboratoire et dans l attente d analyses, les échantillons alimentaires sont conservés au réfrigérateur à 5 C ± 3 C. Page n 7/8

8 Après analyse, l échantillon est conservé au réfrigérateur 5 C ± 3 C pendant une semaine et en tout cas jusqu au rendu des résultats d analyse. 6. CLASSEMENT ET ARCHIVAGE Cette MT et les documents associés sont archivés selon la PG 12. Page n 8/8